鼻腔黏膜来源间充质干细胞的制备方法与流程

1.本发明涉及一种鼻腔黏膜来源间充质干细胞的制备方法，属于间充质干细胞的培养技术领域。


背景技术：

2.间充质干细胞(mesenchymal stem cell，mscs)一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中，可以在体外条件下进行培养扩增。在特定的诱导条件下，mscs可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。mscs的免疫原性较弱，异体移植不会引起严重的免疫排斥反应。移植后的mscs能够主动迁移到组织损伤部位，参与免疫调节和组织损伤修复。这些特性赋予了mscs在组织工程和再生医学领域广阔的应用前景，使其成为细胞治疗领域最具临床应用价值的干细胞。
3.mscs最早来源于骨髓。1970年，friedenstein首先发现骨髓中有一组贴壁生长的细胞，其形状与成纤维细胞相似，呈克隆性增殖，称为骨髓间充质干细胞(friedenstein a.j.；1970.)。除骨髓外，mscs也可来自脂肪、牙周和牙髓等其他成体组织。此外，新生儿附属组织，诸如脐带和胎盘等，也是mscs的另一类来源。不同来源的mscs蛋白质表达谱系不同，其特性和在治疗中发挥的功能也有差异。例如，牙髓来源的mscs，更多地用于牙龈骨缺陷的再生(zha k,et al 2022.)；肠道来源的mscs，在肠道炎症和损伤过程中，通过特异调控肠道干细胞微环境的rspo1-wnt信号，参与肠道上皮组织的损伤修复(wu,n.et al.2021.)。然而，鼻腔黏膜组织是否存在mscs、有哪些功能、有哪些临床应用，还知之甚少。
4.mscs常用的分离培养方法是酶消化法和组织块贴壁培养法。酶消化法可以获得大量原代细胞，但是由于提取过程中消化酶的破坏，细胞贴壁效果、形态较差，且消化时间在大规模生产过程中难于统一量化，且分离提取成本较高，处理时间相对较长。传统的组织块培养法的缺点是组织块经常贴壁不牢，加培养基后容易漂浮。
5.变应性鼻炎(allergic rhinitis，ar)，俗称“过敏性鼻炎”，是临床常见的鼻部炎症疾病，由于环境污染等因素，全球发病率逐年上升，且具有低龄化倾向。过敏性鼻炎因其易复发性，严重干扰人们的工作、生活和社交，给患者造成精神状态低下、失眠、心理障碍等负面影响。目前过敏性鼻炎的治疗方法主要有药物治疗和特异性免疫治疗。药物治疗(比如激素)只能控制症状，不能逆转免疫失衡状态；特异性免疫治疗周期长，但首先要明确过敏源，然后对患者进行脱敏，以阻止病情发展。
6.近年来有人提出免疫反应失衡学说，认为过敏性鼻炎发病主要由于th1/th2细胞免疫失衡，同时存在调节性t细胞(treg细胞)数量和/或功能的缺陷(li c,et al.2017；sun li,et al.2020)。zhao等报道静脉注射小鼠骨髓来源的mscs，在ar动物模型中可以调节自身免疫平衡，减轻变应性鼻炎的症状(zhao n,et al.2016.)。研究还发现，mscs可以迁移并定植到鼻腔黏膜，通过免疫调节恢复th1/th2免疫平衡和上调treg细胞，从而纠正细胞免疫失衡。
7.临床上，鼻中隔偏曲或鼻甲肥大手术中的鼻黏膜组织，通常被当作医疗废弃物丢
弃，造成了资源的浪费。为合理利用生物资源，有必要研发一种鼻腔黏膜间充质干细胞的培养方法。


技术实现要素：

8.针对上述现有技术，本发明提供了一种鼻腔黏膜来源间充质干细胞的制备方法。
9.本发明是通过以下技术方案实现的：
10.一种鼻腔黏膜来源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
11.(1)取人鼻腔黏膜组织样本，清洗，剪成0.5～3mm3大小的组织块；
12.进一步地，所述鼻腔黏膜组织样本，是手术后获得的，在医院伦理批准及病人知情同意的情况下，将手术后获得的鼻腔黏膜组织样本迅速置于高糖的dmem培养基(gibco)中，于4～25℃下保存并运回实验室；
13.进一步地，所述清洗的具体方式为：将鼻腔黏膜组织样本放入培养皿中，用含有10
×
青霉素-链霉素-两性霉素b(gibco)的dpbs(赛维尔)清洗3～5遍，彻底去除黏膜上可能粘附的灰尘或细菌，确保样本无污染；
14.(2)将组织块放入dmem完全培养基中，浸润3～5秒后取出(注意：组织块润洗后其表面带有的培养基要适量，液体太少组织会脱水引起细胞死亡，液体太多倒置培养时，组织块不能贴壁)，置于t25细胞培养瓶(thermo)底部，相邻组织块的间距控制在0.3～0.7cm，将t25培养瓶倒置于37℃、5％co2培养箱中贴壁培养；
15.(3)贴壁培养6～8小时，将倒置的t25培养瓶正置，加入间充质干细胞完全培养基，重新放入37℃、5％co2培养箱中培养；
16.所述间充质干细胞完全培养基选自yinfeng bio间充质干细胞培养基，该培养基化学成分明确，无血清，对mscs有选择性；
17.(4)待细胞从组织块爬出后换液，以后每隔3天吸弃旧培养基，加入新鲜培养基，在相差显微镜下逐日观察细胞形态和生长情况，培养至细胞80％～90％融合时，即可用胰酶消化传代，传代细胞继续扩大培养或冻存。
18.利用上述方法培养即可快速获得大量鼻腔黏膜来源间充质干细胞，并且能长时间维持间充质干细胞的增殖和分化能力，冻存仍然具有干细胞活性。该方法获得的细胞满足2006年国际细胞治疗协会(isct)对msc的定义标准：
①
可贴壁生长；
②
细胞表面表达特定的特异性标记物；
③
具有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化的能力。
19.本发明的鼻腔黏膜来源间充质干细胞的制备方法，既可减少酶消化法对于原代细胞的损伤，又能避免传统组织块培养法细胞不容易贴壁的缺点，简单，可重复性强，操作简单易行，成功率高，为鼻腔黏膜来源间充质干细胞未来应用于基础科研和临床治疗奠定基础。
20.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
21.图1：形态学结果鉴定示意图。
22.图2：表面标志物鉴定的结果示意图。
23.图3：三系分化能力鉴定的结果示意图(骨细胞)。
24.图4：三系分化能力鉴定的结果示意图(脂肪细胞)。
25.图5：三系分化能力鉴定的结果示意图(软骨细胞)。
26.图6：小鼠体内鼻腔黏膜来源间充质干细胞的示踪示意图。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
28.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
29.实施例1鼻腔黏膜来源间充质干细胞的制备
30.(一)细胞的分离培养：
31.(1)在医院伦理批准及病人知情同意的情况下，将手术后获得的鼻腔黏膜组织样本迅速置于高糖的dmem培养基(gibco)中，于4～25℃下保存并运回实验室；
32.在生物安全柜内，将鼻腔黏膜样本放入培养皿中，用含有10
×
青霉素-链霉素-两性霉素b(gibco)的dpbs(赛维尔)清洗5遍，彻底去除黏膜上可能粘附的灰尘或细菌，确保样本无污染；
33.在培养皿中用无菌剪刀将清洗干净的鼻腔黏膜组织样本剪成1mm3大小的组织块；
34.(2)将组织块放入dmem完全培养基中，浸润5秒后取出(注意：组织块润洗后其表面带有的培养基要适量，液体太少组织会脱水引起细胞死亡，液体太多倒置培养时，组织块不能贴壁)，置于t25细胞培养瓶(thermo)底部，相邻组织块的间距控制在0.5cm，将t25培养瓶倒置于37℃、5％co2培养箱中贴壁培养；
35.(3)贴壁培养6～8小时，将倒置的t25培养瓶正置，加入yinfeng bio间充质干细胞培养基，重新放入37℃、5％co2培养箱中培养；
36.(5)待细胞从组织块爬出后换液，以后每隔3天吸弃旧培养基，加入新鲜培养基，在相差显微镜下逐日观察细胞形态和生长情况，培养至细胞80％～90％融合时，即可用胰酶消化传代，传代细胞继续扩大培养或冻存。
37.(二)鼻腔黏膜来源间充质干细胞的鉴定
38.a、形态学鉴定：培养3、5、10天的形态如图1所示，从组织块爬出的细胞贴壁生长，形态类似成纤维细胞，呈梭形；随着细胞增殖密度增大呈旋涡状排列。
39.b、表面标志物鉴定：通过流式细胞仪检测cd34(biolegend)、cd73、cd44、cd45、cd90、cd105和hla-dr等基因在细胞里的表达，结果如图2所示，由图可知，符合间充质干细胞表面标志物鉴定。
40.c、三系分化能力鉴定
41.①
成骨分化：用poly-l-lysine(2μg/cm2)六孔板包被过夜，按10000个细胞/cm2种mscs到包被的平板中；37℃，5％co2培养箱中孵育，当细胞长到100％融合时，更换成骨分化培养基(sciencell)诱导分化，并在这一天开始计时；六孔板每4～5天更换一次培养基；在诱导成骨分化过程中，细胞容易因培养基的改变从板上脱落，在换液时需要非常小心；分化
14～16天时，细胞可固定，用茜素红染色，镜下观察、拍照。结果如图3所示，由图可知，鼻腔黏膜间充质干细胞具有成骨分化潜能。
42.②
成脂分化：用poly-l-lysine(2μg/cm2)六孔板包被过夜，按10000个细胞/cm2种mscs到包被的平板中；37℃，5％co2培养箱中孵育，当细胞长到100％融合时，更换成脂分化培养基(sciencell)诱导分化，并在这一天开始计时；六孔板每3天更换一次培养基；在诱导成脂分化过程中，细胞容易因培养基的改变而从板上脱落，换液时需要非常小心；分化诱导6天，可初见脂滴，分化18～21天后，细胞可固定，油红o染色。镜下观察、拍照。结果如图4所示，由图可知，鼻腔黏膜间充质干细胞具有成脂分化潜能。
43.③
成软骨分化：将2.5x105个mscs转移到15ml离心管中，室温下150g离心5min；加入0.5ml成软骨诱导分化培养液(sciencell)重悬，拧松离心管管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5％co2培养箱中培养；当细胞团出现聚拢现象时(一般为24h或者48h)，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底，悬浮在培养液中；每隔2～3天更换成软骨诱导分化培养液，每管约0.5ml；换液后，轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中；21～28天后，4％中性福尔马林固定，石蜡包埋切片，阿利新蓝染色，镜下观察和拍照。结果如图5所示，由图可知，鼻腔黏膜间充质干细胞具有成骨分化潜能。
44.(三)小鼠体内鼻腔黏膜来源间充质干细胞的示踪
45.(1)将1x106个mscs复苏至t75培养瓶中，37℃，5％co2培养箱中培养，当细胞长到60％融合时，使用gfp-fluc慢病毒以moi＝100来感染mscs；
46.(2)感染72h后，荧光显微镜下成像，根据gfp阳性细胞评估感染效率；
47.(3)慢病毒感染72h后，胰酶消化，收集mscs；
48.(4)将收集的mscs移植到肺纤维化模型小鼠体内，进行治疗；
49.(5)移植4天后，小鼠注射荧光素底物进行活体成像，可以定位移植后mscs在小鼠体内的位置。结果如图6所示，由图可知，鼻腔黏膜间充质干细胞可以先体外标记，移植后通过活体成像追踪其存活并分布于呼吸道，揭示其将来用于呼吸系统疾病干细胞治疗的潜力。
50.给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。