一种鸡胚中小分子多肽的提取方法

1.本发明涉及中药材分离提取领域，具体涉及一种鸡胚中小分子多肽的提取方法。


背景技术：

2.鸡胚为雉科动物家鸡干燥胚胎(英文名：chick embryo or embryonated egg)，家鸡蛋经37.9
±
0.5℃孵化17～18天，除去蛋壳，干燥，味甘、咸、腥，性温，归脾、胃经，具有温中益气，补精填髓的功效，用于体虚赢瘦，骨折，筋伤疼痛等，现已被2019年版《贵州省中药材民族药材质量标准》收录。此外，鸡胚中主要成分为蛋白质，且与人体胎盘中的一些成分相似，比如小分子多肽。研究表明，活性肽清除自由基的作用是治疗骨折，筋伤疼痛主要的成分之一。此外，肽类还具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老以及调节免疫活性等。正因有诸多特性，受到广泛关注。目前，相关文献已经报道了多种动物、植物中小分子多肽的提取及方法，但有提取纯度较低且提取率低等缺点。如何提高小分子多肽的提取率及纯度，对鸡胚的研究具有深远意义。
3.何首乌抗性淀粉(rs)是一种新型抗性淀粉，主要属于rs3类抗性淀粉且具有已下特点：分子量大，聚合度高，可自发形成内部体积较大“v”型腔结构。在原有酶解提取的基础上，本发明利用何首乌抗性淀粉的特性，获取了一种从鸡胚中小分子多肽的方法，该方法提取率和纯度均较高，这对于鸡胚的研究具有较大意义。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供一种鸡胚中小分子多肽的提取方法，解决了如何高效率地从鸡胚中提取小分子多肽的问题。为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
5.一种鸡胚中小分子多肽的提取方法，所述鸡胚中小分子多肽的提取方法是通过抗性淀粉自发形成内部体积较大的“v”型腔结构，将酶解后的鸡胚蛋白与抗性淀粉溶液进行包合，超声后超滤管离心，制得鸡胚小分子多肽的方法。
6.前述一种鸡胚中小分子多肽的提取方法，是按照以下步骤进行：
7.a、取何首乌抗性淀粉，加入2mol/l的koh水溶液溶解，在室温下加hcl调节ph值至6.5，加水使抗性淀粉浓度为1mg/ml，得到抗性淀粉溶液，即a品；
8.b、将鸡胚减压烘干，粉碎至细粉，以水为溶剂，加入木瓜蛋白酶，酶解，得b品；
9.c、取上述b品加入中性蛋白酶，酶解，得c品；
10.d、取上述c品加入碱性蛋白酶，酶解后离心，取上清液，得小分子多肽粗提物，即d品；
11.e、取上述d品搅拌并逐滴滴入至a品中，a品与d品的体积比为4:1～6:1，搅拌进行包合，得e品；
12.f、将上述e品离心5000rpm、10分钟，弃去上清液，沉淀物加适量水分散，再25khz超声30分钟，取超声破碎后的溶液装入80kda超滤离心管中，12000rpm，离心10分钟，滤液即为
鸡胚小分子多肽浓缩物。
13.前述步骤b中，将鸡胚在60～70℃下减压烘干，粉碎至细粉，以水为溶剂，鸡胚与水的比列为1:9～10，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，ph值为3～6、酶添加量为3％～6％、温度为40～60℃，酶解时间1.0～2.0小时，得b品。
14.更具体的，前述步骤b中,将鸡胚在60～70℃下减压烘干，粉碎至细粉，加入75％乙醇，鸡胚与水的比列为1:5～10，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，ph值为5、酶添加量为5％、温度为53℃，酶解时间1.0～2.0小时，得b品。
15.前述步骤c中，取上述b品加入中性蛋白酶ph 5～7、酶添加量为3％～4％、温度为45～55℃，酶解时间为1.0～1.5小时，得c品。
16.更具体的，前述步骤c中，取上述b品加入中性蛋白酶ph 6、酶添加量为4％、温度为52℃，酶解时间为1.0～1.5小时，得c品。
17.前述一种鸡胚中小分子多肽的提取方法，其特征在于：所述步骤d中，取上述c品加入碱性蛋白酶ph 7.8～8.2、酶添加量5％～6％、温度为49～53℃，酶解后采用1000rpm离心5分钟，取上清液，得小分子多肽粗提物，即d品。
18.更具体的，前述步骤d中，取上述c品加入碱性蛋白酶ph8.2、酶添加量5％、温度为49℃，酶解后采用1000rpm离心5分钟，取上清液，得小分子多肽粗提物，即d品。
19.前述步骤e中，取上述d品，在60～70℃、200～300rpm下搅拌并逐滴滴入至a品中，a品与b品的体积比为4:1～6:1，搅拌3～6小时进行包合，得e品；
20.更具体的，前述步骤e中，取上述d品，在60℃、200～300rpm下搅拌并逐滴滴入至a品中，a品与b品的体积比为6:1，搅拌3小时进行包合，得e品；
21.本发明有益效果是：
22.该方法在传统方法的基础上，优化出鸡胚中小分子多肽提取时最佳酶解条件，再利用何首乌抗性淀粉特有的内部体积较大的v螺旋腔包合，从而得到纯度更高的小分子多肽，得率明显高于酶解法制备的小分子多肽。
附图说明
23.图1粉碎浸渍提取法液相图谱；
24.图2酶解浸渍提取法液相图谱；
25.图3粉碎-酶解-抗性淀粉包合超声法液相图谱；
26.图4鸡胚中小分子多肽分子量分布图；
27.图5大鼠软骨he染色结果；
28.图6包裹鸡胚中小分子多肽的抗性淀粉电镜图像
29.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
具体实施方式
30.实施例1：
31.a、取何首乌抗性淀粉，加入2mol/l的koh水溶液溶解，在室温下加hcl调节ph值至6.5，加水使抗性淀粉浓度为1mg/ml，得到抗性淀粉溶液，即a品；
32.b、将鸡胚在60～70℃下减压烘干，粉碎至细粉，以水为溶剂，鸡胚与水的比列为1:9，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，ph值为5、酶添加量为5％、温度为53℃，酶解时间1.5小时，得b品；
33.c、取上述b品加入中性蛋白酶ph 6、酶添加量为4％、温度为52℃，酶解时间为1.2小时，得c品；
34.d、取上述c品加入碱性蛋白酶ph8.2、酶添加量5％、温度为49℃，酶解后采用1000rpm离心5分钟，取上清液，得小分子多肽粗提物，即d品；
35.e、取上述d品，在60℃、200～300rpm下搅拌并逐滴滴入至a品中，a品与b品的体积比为6:1，搅拌3小时进行包合，得e品；
36.f、将上述e品离心5000rpm、10分钟，弃去上清液，沉淀物加适量水分散，再25khz超声30分钟，取超声破碎后的溶液装入80kda超滤离心管中，12000rpm，离心10分钟，滤液即为鸡胚小分子多肽浓缩物。
37.制剂工艺：取鸡胚小分子多肽浓缩物100g，加入制成量10％的可溶性淀粉混合均匀，用75％的乙醇制粒，干燥，整粒，填装胶囊，即得胶囊剂。
38.用法用量：用开水冲服，一次3g，一日3次。
39.功效：用于治疗骨关节炎。
40.实施例2
41.a、取何首乌抗性淀粉，加入2mol/l的koh水溶液溶解，在室温下加hcl调节ph值至6.5，加水使抗性淀粉浓度为1mg/ml，得到抗性淀粉溶液，即a品；
42.b、将鸡胚在60～70℃下减压烘干，粉碎至细粉，以水为溶剂，鸡胚与水的比列为1:5，搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，ph值为3、酶添加量为3％、温度为40℃，酶解时间1.0小时，得b品；
43.c、取上述b品加入中性蛋白酶ph 5、酶添加量为3％、温度为45℃，酶解时间为1.0小时，得c品；
44.d、取上述c品加入碱性蛋白酶ph 7.8、酶添加量5.5％、温度为52℃，酶解后采用1000rpm离心5分钟，取上清液，得小分子多肽粗提物，即d品；
45.e、取上述d品，在65℃、200～300rpm下搅拌并逐滴滴入至a品中，a品与b品的体积比为4:1，搅拌4小时进行包合，得e品；
46.f、将上述e品离心5000rpm、10分钟，弃去上清液，沉淀物加适量水分散，再25khz超声30分钟，取超声破碎后的溶液装入80kda超滤离心管中，12000rpm，离心10分钟，滤液即为鸡胚小分子多肽浓缩物。
47.制剂工艺：取鸡胚小分子多肽浓缩物100g，加10％淀粉混合，用65％的乙醇为湿润剂制粒，干燥，压片，薄膜包衣，即得片剂。
48.用法用量：用开水冲服，一次3g，一日3次。
49.功效：用于治疗骨关节炎。
50.实施例3
51.a、取何首乌抗性淀粉，加入2mol/l的koh水溶液溶解，在室温下加hcl调节ph值至6.5，加水使抗性淀粉浓度为1mg/ml，得到抗性淀粉溶液，即a品；
52.b、将鸡胚在70℃下减压烘干，粉碎至细粉，以水为溶剂，鸡胚与水的比列为1:10，
搅拌均匀，加入木瓜蛋白酶，ph值为6、酶添加量为6％、温度为60℃，酶解时间2.0小时，得b品；
53.c、取上述b品加入中性蛋白酶ph 7、酶添加量为4％、温度为55℃，酶解时间为1.2小时，得c品；
54.d、取上述c品加入碱性蛋白酶ph 8.0、酶添加量6％、温度为53℃，酶解后采用1000rpm离心5分钟，取上清液，得小分子多肽粗提物，即d品；
55.e、取上述d品，在70℃、200～300rpm下搅拌并逐滴滴入至a品中，a品与b品的体积比为6:1，搅拌6小时进行包合，得e品；
56.f、将上述e品离心5000rpm、10分钟，弃去上清液，沉淀物加适量水分散，再25khz超声30分钟，取超声破碎后的溶液装入80kda超滤离心管中，12000rpm，离心10分钟，滤液即为鸡胚小分子多肽浓缩物。
57.制剂工艺：取鸡胚小分子多肽浓缩物100g，加入2倍量的蔗糖混合后，用80％乙醇为润湿剂制颗粒，制成颗粒后于80℃干燥，再过16目筛1次，并用60目筛分出细粉，即得颗粒剂。
58.用法用量：用开水冲服，一次15g，一日3次。
59.功效：用于治疗骨关节炎。
60.发明人进行了大量的实验，以下是本发明所述提取方法的研究：
61.1仪器与材料
62.1.1仪器
63.phs-3c ph计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；tu-1810紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；al204电子天平(美国梅特勒托利多公司)；fd冷冻干燥机(上海拓纷机械设备有限公司)；粉碎机(浙江大鹏机械有限公司)；磁力搅拌器(艾卡(ika)公司)；高压蒸汽灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司)；高速离心机(艾本德(eppendorf)公司)；超声波破碎仪(上海力辰科技有限公司)；奥林巴斯光学显微镜(日本olympus公司，型号：bx43 dp26)；eg1150石蜡包埋机(德国leica公司)；rm2245轮转式切片机(德国leica公司)；tky-tka摊片烤片机(湖北泰康公司)。
64.1.2药品与试剂
65.鸡胚(贵州水族药物开发有限责任公司)；何首乌(北京本草方源药业)；普鲁兰酶(阿拉丁试剂(上海)有限公司)；木瓜蛋白酶(广西南宁市庞博生物有限公司)；中性蛋白酶(上海翼菁实业有限公司)；碱性蛋白酶(苏州卓鑫生物科技有限公司)；二甲苯(天津恒兴试剂有限公司)；动物sd小鼠，spf级，体重18-22g(由中国人民解放军第三军医大学医学实验动物中心提供，许可证号：scxk(军)2020-0013)；水合氯醛(天津市科密欧，批号：20160913)。
66.2制备方法
67.2.1何首乌抗性淀粉的制备
68.2.1.1何首乌淀粉制备
69.取何首乌药材粗粉，以水为提取溶剂，药液比为1:10(何首乌占0.1)，在室温下100rpm搅拌3小时，过滤，弃上清收集沉淀，水洗沉淀两次，60摄氏度减压干燥。
70.2.1.2何首乌抗性淀粉制备
71.以水为溶剂，配制15％浓度的淀粉液，盐酸调节ph4.5，沸水浴搅拌30min预糊化，121℃高压15min后降温至60℃，加普鲁兰酶4npun/g酶解6h，酶解后沸水浴20min使酶灭活，缓慢降至室温，放入冰箱冷藏24h，冷冻干燥。
72.2.2鸡胚小分子多肽提取方法中酶解ph、酶添加量、温度和酶解时间的确定
73.2.2.1鸡胚酶解种类以及酶解ph、酶添加量、温度和酶解时间
74.经过预试验结果，酶解时间为3小时最佳，再将鸡胚60℃减压烘干，粉碎至细粉，加入水搅拌均匀，料液比为1：10，分别依次加入木瓜蛋白酶酶、枯草杆菌中性蛋白酶、碱性蛋白酶酶解，取1ml采用bca法求出小分子多肽含量。从而得出不同温度、ph、加酶量下木瓜蛋白酶酶、枯草杆菌中性蛋白酶、碱性蛋白酶的最佳加入量。
75.表1不同温度、ph、加酶量下木瓜蛋白酶对鸡胚中小分子多肽的提取影响
[0076][0077]
表2不同温度、ph、加酶量下枯草杆菌中性蛋白酶对鸡胚中小分子多肽的提取影响
[0078]
[0079][0080]
表3不同温度、ph、加酶量下碱性蛋白酶对鸡胚中小分子多肽的提取影响
[0081][0082]
最终确定木瓜蛋白酶的ph为5、酶添加量为5％、温度为53℃；枯草杆菌中性蛋白酶ph 6、酶添加量为4％、温度为52℃；碱性蛋白酶为ph 8.2、酶添加量5％、温度为49℃。
[0083]
3结果对比实验
[0084]
3.1提取方法对提取率和纯度的影响
[0085]
3.1.1实验方法
[0086]
对本专利所得鸡胚小分子多肽采用柱前衍生物试剂方法进行含量测定。取本专利所得的鸡胚小分子多肽0.2g加5ml水使溶解，再加6mol/l盐酸，105℃烘6小时，挥干，加2ml 0.1mol/l盐酸溶解，吸取800μl加入1mol/l三乙胺乙腈溶液、0.1mol/l pitc溶液各400μl，避光反应1小时，正己烷萃取2次，每次3ml，弃去正己烷层，得样品溶液。检测波长为：214nm，进样量为：10μl，色谱条件见表1：对鸡胚中小分子多肽的氨基酸进行测定。同法对粉碎浸渍提取法、酶解浸渍提取法进行测定。
[0087]
表4小分子多肽色谱条件
[0088][0089]
3.1.2实验结果
[0090]
本发明在传统方法的基础上，优化出鸡胚中小分子多肽提取时最佳酶解条件，再利用何首乌抗性淀粉特有的内部体积较大的v螺旋腔包合，从而得到纯度更高的小分子多肽，得率明显高于酶解法制备的小分子多肽。
[0091]
对所得鸡胚小分子多肽采用柱前衍生物试剂方法进行含量测定。采用柱前衍生化方法，对鸡胚中小分子多肽的氨基酸进行测定。通过对比粉碎浸渍提取法、酶解浸渍提取法、粉碎-酶解-抗性淀粉包合超声法(本发明)三种提取液的液相图谱并进行含量测定，可知本发明所涉及的方法，相对于传统方法，提取得率和纯度显著提高。
[0092]
比较结果见图1、2、3及下表5：
[0093]
表5不同提取方法实验结果
[0094][0095][0096]
3.2人工生物膜透过性
[0097]
鸡胚具有具有温中益气，补精填髓的功效，用于体虚赢瘦，骨折，筋伤疼痛等，其主要成分为蛋白质，为研究鸡胚中蛋白质的透皮情况，采用单室franz扩散池法进行体外透皮释放试验。取一定量采用本法提取后小分子多肽涂于strat-m膜上，透皮24小时后取2ml采用bca法测定小分子多肽透皮累积渗透量。通过体外透皮吸收试验得出，采用本法提取的小分子多肽24小时后透皮累积渗透量可达到403.41
±
9.58μg/cm2，对比粉碎浸渍提取法、酶解浸渍提取法，粉碎-酶解-抗性淀粉包合超声法(本发明)制备的小分子多肽的24小时内透皮累积渗透量最多，表明本法制备的小分子多肽易透过皮肤屏障。结果如下表6。
[0098]
表6不同提取方法的提取物透皮效率测定结果
[0099][0100]
3.分子量测定
[0101]
为了进一步对鸡胚小分子多肽进行研究，测定鸡胚中小分子多肽的分子量分布。取适量本方法提取后的鸡胚小分子多肽在涡旋混合仪上充分混匀、离心，多功能梯度pcr仪95℃变性5分钟，以4.5％的浓缩胶和12.5％的分离凝胶进行sds-page电泳，通过电泳得出，采用本法得出鸡胚多肽分子量在11～67kda之间，试验结果见图4(图中1为maker；2、3、4、5、6为鸡胚小分子多肽sds-page凝胶电泳。)所示。
[0102]
4.鸡胚多肽药效学试验
[0103]
4.1鸡胚多肽对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
[0104]
4.1.1实验方法
[0105]
取spf级小鼠60只，随机分为鸡胚多肽高剂量组、鸡胚多肽中剂量组、鸡胚多肽低剂组，扶他林组、模型组、空白组，每组10只。(鸡胚采用蒸馏水溶剂)。每天给药，连续2天，于末次给药1h后，将40μl二甲苯均匀涂抹于各组小鼠右耳的两面致炎，小鼠的左耳不涂作为对照，30min后脱颈椎处死，剪下两耳，采用6mm直径打孔器于左右耳对称部位打下耳片，用精密电子天平称取各鼠耳质量，并计算鼠耳肿胀率[肿胀率＝(右耳质量-左耳质量)/左耳质量
×
100％]。得出涂耳剂量。
[0106]
4.1.2检测结果
[0107]
由实验结果可知，模型组与空白组具有极显著差异(p《0.01)，表明造模成功。与模型组肿胀度相比，鸡胚多肽低剂量组具有显著性差异(p《0.05)，扶他林组具有极显著差异(p《0.01)，其余各给药组的肿胀度也有低于模型组肿胀度的趋势，表明鸡胚多肽具有一定的抗炎作用，详见表7。
[0108]
表7鸡胚多肽对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(n＝10)
[0109][0110]
*与模型组比较，p《0.05；**与模型组比较，p《0.01
[0111]
4.2鸡胚多肽对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响
[0112]
4.2.1实验方法
[0113]
小鼠随机分成6组，每组20只。随机分为空白组、鸡胚多肽高剂量组、鸡胚多肽中剂
量组、鸡胚多肽低剂组，扶他林组、模型组，采用小鼠右侧足爪皮下注射1％的角叉菜胶150μl致炎，鸡胚多肽高、中、低剂量组(鸡胚多肽给药剂量同“2.4.3.1”)及扶他林组在致炎0.5h、1h、2h时后给药，采用容积测定仪测量致炎足爪的容积(ml)，用千分尺测量致炎足爪的厚度(mm)然后每间隔1h测量一次，共测6次。通过计算致炎前后足爪容积和厚度的差值肿胀度从而得出各用药组对肿胀的抑制率。抑制率的计算公式如下：
[0114]
抑制率(％)＝阴性对照组数值－用药组数值/阴性对照组数值
×
100％
[0115]
4.2.2实验结果
[0116]
结合表8可知，与空白组相比，模型组足肿胀度明显增加，具有极显著性差异(p《0.01)，说明造模成功。与模型组相比，鸡胚多肽高、中、低剂量组及扶他林组在致炎0.5h、1h、2h时，足肿胀度下降趋势明显，具有显著性差异，说明鸡胚多肽具有抑制角叉菜胶致大鼠足肿胀的作用。
[0117]
表8鸡胚多肽不同时间对大鼠足肿胀度的影响(n＝10)
[0118][0119]
同空白组相比，#p《0.01；同模型组相比，**p《0.01,*p《0.05
[0120]
5鸡胚多肽对木瓜蛋白酶诱导大鼠骨关节炎的保护作用
[0121]
5.1实验方法
[0122]
将spf级40只小鼠，随机分成6组，空白对照组、模型组、鸡胚多肽组、阳性对照组各10只。模型组(10％木瓜蛋白酶 0.03mol/l l-半胱氨酸)，鸡胚多肽组5.5g/kg。将10％木瓜蛋白酶与0.03mol/l的l-半胱氨酸按1∶1混合静置30min后备用。在实验第0、4、8天，模型组、鸡胚多肽组给药组大鼠膝关节腔注入0.3ml混合溶液诱导骨关节炎模型，空白对照组注射等体积生理盐水。在末次注射木瓜蛋白酶混合溶液后，分别给予鸡胚多肽受试药物，模型组、正常对照组给予等体积的生理盐水，每天一次，共计2周。最后一次采用7％水合氯醛麻醉大鼠，将组织采用苏木精-伊红(he)染色，对软骨定性分析。
[0123]
5.2软骨定性分析病理结果：
[0124]
空白对照组：关节表面被覆薄层透明软骨，关节囊腔光滑，未见明显组织增生、炎细胞浸润，未见其他明显病理改变(图5a)。
[0125]
模型组：关节表面透明软骨被破坏，纤维组织增生致关节大部分区域纤维化，见大量炎细胞浸润(图5b)。
[0126]
鸡胚多肽组：关节表面被覆薄层透明软骨，未见明显组织增生，偶见炎细胞浸润(图5c)。
[0127]
阳性对照组：关节表面透明软骨偶见纤维组织增生，见少量炎细胞浸润，见图5(a.空白对照组b.模型组c.鸡胚多肽组d.阳性对照组)。
[0128]
5.3软骨组织病理学分级mankin’s评分结果
[0129]
软骨组织病理学分级mankin’s评分结果和评分标准见表9、表10；
[0130]
表9：软骨组织病理学分级mankin’s评分结果
[0131]
组别及编号结构细胞基质染色潮线的完整性空白对照组-10000空白对照组-20000空白对照组-31000模型组-24231模型组-31111模型组-45221高剂量组-10010高剂量组-20000高剂量组-31000中剂量组-11100中剂量组-21101中剂量组-31111低剂量组-12110低剂量组-22111低剂量组-33221阳性对照组-13121阳性对照组-24121阳性对照组-33121
[0132]
表10；mankin’s评分标准
[0133]
[0134]