软组织的染色方法及人造肉模型生成方法

1.本发明属于食品加工领域，特别涉及一种软组织的染色方法及基于micro-ct的人造肉结构可视化模型生成方法，该方法可应用于食品模型的3d打印。
技术背景
2.由于世界人口的持续增长，全球肉类消费总量一再攀升，畜牧业被证实是大气中甲烷的最主要来源，严重加剧了温室效应，并且过量食用红肉会增加患有结肠直肠癌的风险。同时，由于海水污染不断加剧、海洋资源掠夺性开发严重，海洋鱼类生存环境急剧恶化。这些原因共同促进了人造肉食品制造技术的兴起。然而，大多数的公司或实验室的生产技术重在模仿肉类产品的色泽、风味以及整体质构，却忽略了肉制品肌肉复杂的多级层次结构，导致产品缺少肉制品独有的咀嚼性、多汁性和纤维口感。
3.目前，3d打印作为一种通过层层堆积生产食物的新兴技术，为细胞培养支架和植物基的肉产品类似物生产提供了一种可行的方法，但目前大部分的研究多聚焦于打印材料的开发与优化，所使用的3d打印模型大多是简单的几何模型，并不具有真实肉制品的微观肌肉结构。由于肉制品的口感质构与其内部组织结构关系密切，还原其微观层次结构并进行3d打印将有助于构建在口感和结构上更加真实的人造肉产品。
4.micro-ct采用锥形x射线，分辨率可达百纳米级，可以更好地还原肉制品肌肉的层次结构，结合3d打印技术使得制造具有真实结构的人造肉产品成为可能。但是肌肉、结缔组织等软组织对x射线的反应度较低，对比区分度不明显，并且micro-ct扫描的二维切片图像无法直接进行应用于3d打印。


技术实现要素：

5.为了解决这一问题，本发明提出了一种软组织的染色方法，该方法为：将软组织(真实肉品)浸泡于染色液中，所述染色液为3～5wt％的碘-碘化钾溶液。相较于磷钨酸、四氧化锇等对比增强剂，本发明使用的碘制剂毒性低、组织渗透能力强、对肌肉亲和性高。本发明将浸泡时间控制在5-14天，染色时间过短，将导致样品对比度弱，无法精确区分组织，而染色时间过长会导致组织严重缩水，样品微观结构被破坏。
6.进一步地，本发明提供了上述染色液的配制方法：所述染色液是按照如下方法配制的：将碘化钾以1g/ml的浓度溶解于少量蒸馏水中，加入碘化钾一半质量的碘搅拌使碘完全溶解，继续加入5-10倍的蒸馏水，即可得到所需染色液。该配制方法不仅能保证有效的碘的浓度，还能避免引入干扰性强的显色试剂，保证肉品等软组织纤维、胶质等细节的原始形貌与结构。
7.进一步地，所述染色液的体积v取决于软组织的ph与肌肉含量，满足v＝254*m*[100k-(7.2-ph)]，其中k为预先测定的肉品中的肌肉含量，m为样品质量，ph为样品的ph。通过染色液的定量控制，能够有效的还原1-100μm尺度的肌肉组织空间结构，最小尺度可达百纳米级别。
[0008]
基于上述染色方法，本发明还提供一种人造肉模型生成方法，对软组织进行染色后，然后通过micro-ct扫描获取真实肉品二维切片图像，从而生成三维模型。由于染色对不同组织实体构成(如肌纤维、脂肪等)、孔隙等的区分性好，使得micro-ct扫描具有良好对比度，可以分辨不同部位肌肉的组织结构特点。
[0009]
本发明还包括根据所述三维模型，通过3d打印获得实体模型。
[0010]
本发明的优势在于：
[0011]
(1)本发明针对肉体软组织的化学组成与空间构成，筛选了目标针对性的显色干扰性弱、组织渗透能力强、染色传质效率高、组织间强度区分明显、肌肉亲和性高的试剂组合，同时根据样品肌肉量、整体质量与酸碱度等指标从数理联系上确定了染色液调试区间。通过染色液的有效筛选与定量控制，有效还原1-100μm尺度的肌肉组织空间结构，最小尺度可达百纳米级别，充分还原肉品等软组织纤维、胶质等原始形貌与结构细节，为精准的数字化建模奠定了相关基础。
[0012]
(2)相比与现在使用较多的简单几何模型，通过本发明方法可精细化且数字化描述真实肉制品的微观肌肉结构，并将肌肉、脂肪等组织结构细节转化为可打印模型，同时利用软件算法降噪、分割、渲染等分析结构主次与信息简化重构、路径优化，实现从真实结构到仿真模型的精准输出。经验证实验表明，本发明的肌肉结构仿真3d打印模型具有高度实操性。
附图说明
[0013]
图1为本发明基于micro-ct的3d打印人造肉模型生成方法工艺流程图；
[0014]
图2为样品染色后的显微镜显示图；(a)为染色前的三文鱼组织结构图；(b)为基于样品1-1染色后的三文鱼组织结构图；(c)为三文鱼肌肉微观结构的连续二维切片图像
[0015]
图3为基于样品1-1～1-4以及样品2和3的高分辨率micro-ct扫描图像处理后的三文鱼组织结构图；(a)为基于样品1-1染色后的三文鱼组织结构图；(b)为基于样品1-2染色后的三文鱼组织结构图；(c)为基于样品1-3染色后的三文鱼组织结构图；(d)为基于样品1-4染色后的三文鱼组织结构图；(e)为基于样品2染色后的三文鱼组织结构图；(f)为基于样品3染色后的三文鱼组织结构图；
[0016]
图4为基于样品1-1导出的.stl格式的三维数字模型图；(a)为根据肌肉组织阈值提取的三维模型图；(b)为根据脂肪与结缔组织提取的三维模型图。
[0017]
图5为图4模型的3d打印结果图；
[0018]
图6为牛肉样品1和牛肉样品2的高分辨率micro-ct扫描图像；(a)为基于样品1染色后的牛肉组织结构图；(b)为基于样品2染色后的牛肉组织结构图；
[0019]
图7为不同部位三文鱼的三维可视化图。(a)为三文鱼背部组织的可视化图；(b)为三文鱼腹部组织的可视化图；(c)为三文鱼尾部组织的可视化图
具体实施方式
[0020]
本发明通过有效染色，毒性低、组织渗透能力强、对肌肉亲和性高，结合micro-ct扫描从真实肉品的微观组织结构中获取二维切片图像，并通过数字化工具进一步分析处理生成3d模型，有助于生产具有咀嚼感和多汁口感的人造肉产品。在具体实施过程中，可以采
用如下步骤：
[0021]
(1)肉类样品扫描：将修剪至合适大小的肉品样品于组织固定液中固定24h，固定完成后取出样品使用生理盐水洗涤，称重并使用染色液进行染色。染色完成后，使用75％酒精洗去表面附着的染色液，进行ct扫描。
[0022]
(2)扫描图像处理：将步骤(1)得到的所述肉品的二维图像进行可视化、降噪、阈值分割、体积渲染。
[0023]
(3)三维模型导出：对步骤(2)处理后的数据通过设定算法与程序步骤建立.stl格式的肉品样品3d可打印数字模型。
[0024]
(4)打印三维模型：将步骤(3)中生成的3d数模导入3d打印机，选取合适材料进行打印，以生成符合真实肉品结构的人造肉产品。
[0025]
优选的，在步骤(2)中所用的具体方法包括：通过高斯滤波对原始数据剔除噪声；通过背景亮度失真校正对由于x射线硬化产生的同一组织亮度不均情况进行校正改善；通过动态阈值分割对肉品肌肉、脂肪及结缔组织进行分割渲染；在不影响主体结构的前提下，手动对渲染模型中的小尺度噪点与空洞进行调整。
[0026]
优选的，在步骤(3)中所用的具体方法包括：通过纤维柱体关联分析对肌纤维进行归一化互关，使肌纤维的结构更加清晰规则；通过识别二值化图像的阈值分水岭，对相邻的肌纤维进行分离；在模型中生成网格化表面，进一步圆滑化处理导出为.stl格式模型。
[0027]
为使本实施例的目的、技术方案和有点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方法进行完整、清晰地描述。显然，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动成果前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0028]
实施例1
[0029]
一种基于micro-ct的3d打印人造肉模型生成方法，具体包括如下步骤：
[0030]
(1)配制染色液：
[0031]
1号染色液：将10g碘化钾溶解于少量蒸馏水中，加入5g碘搅拌使碘完全溶解，继续加入蒸馏水使蒸馏水体积为100ml，即可得到质量分数为3％的iki溶液[(m
碘化钾
m
碘
)/总质量＝3％]。
[0032]
2号染色液：bouin染色液
[0033]
3号染色液：改良番红o-固绿软骨染色液
[0034]
(2)称取100g的三文鱼(肌肉含量为21％)，测得其ph为6.9。进行如下平行试验：
[0035]
浸泡于45.72ml的1号染色液中5天，获得测试样品1-1；
[0036]
浸泡于45.72ml的1号染色液中14天，获得测试样品1-2；
[0037]
浸泡于30ml的1号染色液中14天，获得测试样品1-3；
[0038]
浸泡于60ml的1号染色液中14天，获得测试样品1-4；
[0039]
浸泡于45.72ml的2号染色液中14天，获得测试样品2；
[0040]
浸泡于45.72ml的3号染色液中14天，获得测试样品3；
[0041]
(3)利用skyscan1272型号micro-ct设备对上述测试样品以3μm/pixel的分辨率进行扫描，获取有关三文鱼肌肉微观结构的连续二维切片图像(图2c),200μm的标尺下，显示了高精度染色。三文鱼肌肉微观结构的光学照片如图2a和2b所示。
[0042]
(4)使用gaussian filter对扫描得到的二维数据进行滤波处理；使用volume rendering对数据集进行初步三维渲染并通过crop editor将数据裁剪至合适大小；通过interactive thresholding对数据进行动态阈值分割，确定了各组分的阈值分布，对肌纤维的进行提取。图4通过对不同区域的选择，可以得到肌肉纤维打印模型(a)，以及脂肪/胶原纤维打印模型(b)。
[0043]
(5)在不影响纤维主体的前提下，通过image segmentation对小尺度噪点进行去除，对小尺度空洞进行填补；使用separate objects对相邻肌纤维进行分割；使用generate surface对三维模型表面进行平滑处理，以.stl格式导出得到三维模型。
[0044]
(6)选取合适的材料，使用上述生成的.stl格式模型进行3d打印，即可得到实体模型，实体3d打印模型如图5所示。
[0045]
上述实施例中，通过光学显微镜和扫描电镜对染色前后的肌肉组织结构进行观察对比，染色过程对肌肉纤维微结构破坏较小，在micro-ct扫描结果中显示出了良好的组织完整度和对比度，说明本方法构建的模型符合真实鱼肉肌肉微观结构，为研究肉类的三维结构及可视化提供了参考。
[0046]
上述micro-ct数据的处理方法中，使用三维渲染并对不重要的数据部分进行裁剪以提高程序运行速度和处理效率；对相邻肌纤维进行分割防止模型在3d打印时被切片程序识别为整体影响打印效果。本方法生成的三维模型与真实三文鱼肉微观结构一致并可以直接用于3d打印，为食品3d打印数字模型构建提供了新思路。
[0047]
实施例2
[0048]
一种基于micro-ct的3d打印人造肉模型生成方法，具体包括如下步骤：
[0049]
(1)配制染色液：
[0050]
1号染色液：将10g碘化钾溶解于少量蒸馏水中，加入5g碘搅拌使碘完全溶解，继续加入蒸馏水使蒸馏水体积为100ml，即可得到质量分数为5％的iki溶液。
[0051]
2号染色液：bouin染色液
[0052]
(2)称取100g的牛肉(肌肉含量为26％)，测得其ph为5.6。进行如下平行试验：
[0053]
浸泡于25.4ml1号染色液中14天，获得测试样品1；
[0054]
浸泡于25.4ml2号染色液中14天，获得测试样品2；
[0055]
(3)利用skyscan1272型号micro-ct设备对上述测试样品以3μm/pixel的分辨率进行扫描，获取有关牛肉肌肉微观结构的连续二维切片图像。如图6所示，从图中可以看出，采用本发明的1号染色液比市购的2号染色液具有更高的染色精度，可能是其扫描射线吸收率高且差异显著，不同组织区分度好，将肉片中细微的软组织进行了高精度染色。
[0056]
(4)使用gaussian filter对扫描得到的二维数据进行滤波处理；使用volume rendering对数据集进行初步三维渲染并通过crop editor将数据裁剪至合适大小；通过interactive thresholding对数据进行动态阈值分割，确定了各组分的阈值分布，对肌纤维的进行提取。
[0057]
(5)在不影响纤维主体的前提下，通过image segmentation对小尺度噪点进行去除，对小尺度空洞进行填补；使用separate objects对相邻肌纤维进行分割；使用generate surface对三维模型表面进行平滑处理，以.stl格式导出得到三维模型。
[0058]
(6)选取合适的材料，使用上述生成的.stl格式模型进行3d打印，即可得到实体模
型。
[0059]
上述实施例中，通过光学显微镜和扫描电镜对染色前后的肌肉组织结构进行观察对比，染色过程对肌肉纤维微结构破坏较小，在micro-ct扫描结果中显示出了良好的组织完整度和对比度，说明本方法构建的模型符合真实鱼肉肌肉微观结构，为研究肉类的三维结构及可视化提供了参考。
[0060]
上述micro-ct数据的处理方法中，使用三维渲染并对不重要的数据部分进行裁剪以提高程序运行速度和处理效率；对相邻肌纤维进行分割防止模型在3d打印时被切片程序识别为整体影响打印效果。本方法生成的三维模型与真实牛肉微观结构一致并可以直接用于3d打印，为食品3d打印数字模型构建提供了新思路。
[0061]
实施例3
[0062]
(1)将碘化钾以1g/ml的浓度溶解于蒸馏水中，加入碘化钾一半质量的碘搅拌使碘完全溶解，继续加入九倍的蒸馏水，即可得到所需染色液。
[0063]
(2)将三文鱼不同位(腹部、背部、尾部)分别处理成3-4cm2，保证质量为100g，至于步骤1的染色液中进行浸泡染色7天。。
[0064]
(3)利用skyscan1272型号micro-ct设备对3-4cm2的不同部位(腹部、背部、尾部)三文鱼块以10μm/pixel的分辨率进行扫描，获取有关三文鱼肌肉微观结构的连续二维切片图像，如图7所示。
[0065]
(2)使用gaussian filter对扫描得到的二维数据进行滤波处理；使用volume rendering对数据集进行初步三维渲染并通过crop editor将数据裁剪至合适大小；通过interactive thresholding对数据进行动态阈值分割，确定了各组分的阈值分布，分别对肌纤维、脂肪以及结缔组织的进行提取；通过对volume rendering的渲染效果进行设置，对上述不同组织结构进行渲染。
[0066]
上述实施例中，通过对不同组织的可视化渲染，可以明显观察到不同部位三文鱼肌肉的组织特点：腹部脂肪组织较多，形成了特色的大理石纹；背部肌纤维与结缔组织腹部较为均匀；尾部肌纤维较短并且肌间结缔组织分布更加密集，说明本方法可以用于观察不同部位肌肉组织差异并进行可视化。
[0067]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些改动和变型属千本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。