无毛品系PLCD1基因敲除的转基因猪的构建方法与流程

无毛品系plcd1基因敲除的转基因猪的构建方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及无毛品系plcd1基因敲除的转 基因猪的构建方法。


背景技术：

2.由于解剖、生理生化等方面与人有较大的相似性，小型猪在生物医学研 究中的应用越来越广泛，小型猪皮肤系统与人的有较大相似性，是进行皮肤 移植、化妆品鉴定、紫外线照射，皮肤致癌、烧伤、冻伤、皮肤的老化及抗 老化等研究的良好的实验材料。目前生物医学研究中已经有无毛品系的skh1 猪和稀毛的尤卡坦小型猪被广泛应用于生发、皮肤过敏反应、皮肤移植治疗、 紫外线照射反应等研究。而国内培育的几个小型猪品系，包括五指山小型猪、 贵州小型猪、巴马小型猪、版纳微型猪以及西藏小型猪等，均有较多的被毛， 生物医学研究亟待无毛/稀毛小型猪品系的培育。
3.plcd1基因位于9号染色体，包含16个外显子，编码756kd的plcd1蛋白， 其中第7-13号外显子编码具有催化作用的x、y结构域。plcd1是磷脂酶c蛋 白的一个亚型，在胞内的磷酸肌醇信号通路中发挥重要的作用，负责调节激 素分泌神经递质的传递生长因子信号膜运输离子通道活力及细胞骨架的调节 等一系列细胞活动。现有资料显示plcd1基因缺失的猪均伴有显著的被毛稀 疏。
4.crispr/cas9系统是一种在细菌与古细菌中发现的为抵御病毒侵入的免 疫防御系统，由可特异识别靶点dna序列的sgrna与cas9核酸内切酶两部分 组成。2013年以来，crispr/cas9基因编辑技术被广泛应用到多个领域，利用 摘要iicrispr/cas9基因编辑技术制备基因工程动物具有实验过程简单、周期 短、成本低的优势，目前已经成为制备基因工程的动物的主流方法。
5.小型猪的排卵数量有限，但plcd1基因的的片段较长，且存在多个外显 子，在利用crispr/cas9系统对其进行敲除的过程中，如何避免脱靶效应的产 生，尽可能在有限的受精卵中获得更多的plcd1基因敲除的胚胎，是一直以 来难以解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供无毛品系plcd1基因敲除 的转基因猪的构建方法，还提供靶向plcd1的核苷酸、载体构建、转基因动 物细胞或其培养物以及制备非人转基因动物的方法。
7.本发明提供了：
8.靶向plcd1第二外显子的sgrna，其序列为：agaacgcttctacaagttgcagg。
9.靶向plcd1第七外显子的sgrna，其序列为：ccctaagcacgtcgcaaaagagg。
10.靶向plcd1第十外显子的sgrna，其序列为：ctcatagaaagcctgcccggggg。
11.用针对西藏小型猪plcd1基因2、7、10号外显子三个打靶位点的sgrna， 将cas9和三条sgrna的体外转录产物的混合物注射到西藏小型猪的单细胞 期受精卵胞质内，来制备
plcd1基因敲除西藏小型猪。
12.本发明提供了构建plcd1敲除转基因猪的试剂，其包括：cas9 mrna、 本发明所述的sgrna和水。
13.该试剂中具体包括：rnase-free h2o和cas9 mrna 100ng/μl、所述sgrna 各50ng/μl。
14.本发明还提供了无毛品系plcd1基因敲除转基因猪的构建方法，其包括： 将所述的试剂敲除猪的受精卵中的plcd1基因。
15.利用crispr/cas9基因编辑技术制备基因修饰猪的技术路线包括猪受精 卵的采集、cas9mrna/sgrnas的受精卵胞质内注射和胚胎移植三个环节(图 4)。
16.本发明所述的猪为西藏小型猪。为了获得足够多的用于显微注射的单细 胞受精卵，我们对西藏小型猪进行了超数排卵的实验，将超数排卵后的西藏 小型猪与成年公猪自然交配，在交配后第二天，利用手术取卵的方法从其输 卵管中冲出受精卵，再进行cas9mrna和sgrnas的显微注射。本研究对西 藏小型猪进行超数排卵的研究，按照图下的时间点对西藏小型猪进行超排药 物的注射(图5)。所述受精卵形成前，给予母猪500iu hcg促进排卵。所述 受精卵的取卵时间为配种后24～36小时。
17.并采用手术取卵的方法收集西藏小型猪受精卵，从输卵管的靠近子宫端 向输卵管伞端注射冲卵液，将受精卵冲出并收集到平皿中，冲卵示意图见图， 对手术后的西藏小型猪进行精心护理，间隔一个发情周期后可以继续用作超 数排卵的实验(图6)。所述取卵采用冲卵的方法。
18.本发明利用crispr/cas9基因编辑技术，在西藏小型猪的plcd1基因靶 点设计了特异性的sgrna，将cas9mrna和sgrna混合物共同注射到西藏 小型猪受精卵胞质内，并将注射后的基因修饰胚胎移植到代孕母猪输卵管。 为了获得足够多的用于显微注射的受精卵，本发明对西藏小型猪的超数排卵 技术进行了初步实验研究，利用pmsg hcg超排方案成功对西藏小型猪进行 了超数排卵，通过手术法从西藏小型猪输卵管冲洗并采集到单细胞期受精卵， 经超排和取卵手术后的西藏小型猪恢复良好，可以进行二次超排取卵实验。
附图说明
19.图1示超数排卵后的西藏小型猪卵巢；
20.图2示西藏小型猪单细胞期受精卵胞质内注射cas9mrna/sgrnas；
21.图3示猪早孕诊断试纸检测怀孕。左：对照；右：怀孕；
22.图4示利用crispr/cas9基因编辑技术制备基因修饰猪的技术路线；
23.图5示超排药物的注射时间表；
24.图6示取卵方法。
具体实施方式
25.本发明提供了无毛品系plcd1基因敲除的转基因猪的构建方法，本领域 技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是， 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为 包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对
本文的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
26.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例， 进一步阐述本发明：
27.实施例1
28.1.西藏小型猪受精卵的采集
29.1.1供卵母猪的准备
30.供卵母猪选择6-8月龄的健康雌性西藏小型猪，21头分三个圈饲养在单 独的实验场地，每日观察记录其发情状况，正常西藏小型猪的发情周期为 18-21天，发情期持续2-3天。观察2个情期左右，选择发情周期稳定，进食 正常，体型适中，无显著疾病的母猪用于超数排卵药物注射。母猪的发情周 期一般为18～21天，发情一般分为：发情前期、发情中期和发情后期。发情 前期表现为采食量下降，烦躁，阴门开始红肿，但不接受爬跨；发情中期表 现为具有静立反射，阴门外周呈现深红色，排出较多粘液，阴门褶皱明显增 多，接受公猪爬跨；发情后期表现为静立反射消失，阴门逐渐恢复正常，拒 绝公猪爬跨。
31.查情方法为在喂食半小时后，赶公猪进入集体饲养的母猪圈舍，观察并 记录接受公猪爬跨的母猪耳号，标记为发情第1天，观察两个发情周期，记 录每头母猪的发情日期和发情周期。
32.1.2超排处理
33.1.2.1.西藏小型猪超排条件的摸索
34.共选择21头6-8月龄的雌性西藏小型猪作为候选猪群进行发情周期的观 察，经过两个发情周期的观察，淘汰其中体型过小和发情周期不稳定的个体， 选取其中情期稳定、体型适中、发育良好的13头进行超排药物的注射，最初 的实验按照文献报道的d15注射pg-cl(两次，每次500iu)，d16注射 pmsg2000iu，d19注射hcg1000iu，d20交配两次，d21取卵的方案进行。 在实际操作中，发现采用这种超排方案，能成功使卵巢上的成熟卵泡数量增 多，说明注射pmsg在促进卵泡成熟上作用明显，但偶尔会造成巨大卵泡的 产生，这在其他文献中也有报道，在pmsg注射剂量过大时会造成卵巢囊肿， 产生巨大卵泡，使排卵数变少，因此在后续实验中我们将pmsg的注射剂量 调整到1500iu，之后不再观察到卵巢囊肿的发生；另一方面，在d19注射hcg 时，观察到有的母猪已经处于发情前期，但是到d20赶公猪配种时却拒绝交 配，因而导致取卵手术无法顺利进行，严重影响了实验进程，这种现象在其 他文献中未见报道，推测可能因为西藏小型猪对超排药物过于敏感，从而导 致发情期缩短，因此在后续实验中，为了避免这一问题，我们将实验方案调 整为不再注射pg-cl，将hcg的注射剂量调整为500iu，并且在d19开始观 察母猪是否发情，待其发情接受爬跨后即用公猪配种，配种完成后再注射 hcg，8小时后补配一次，首次配种后24-36小时进行取卵手术。采用这种改 进的超排方案后，取卵成功率得到提高。
35.因此，超数排卵药物注射的时间包括：，在发情第15天早上9:00颈后肌 肉注射500iu氯前列烯醇(pg-cl)，间隔8h后再次注射500iupg-cl，发情 第16天早上9:00颈后肌肉注射1000-2000iu孕马血清促性腺激素(pmsg)， 在发情第19天早上9:00颈后肌肉注射500iu-1000iu人绒毛膜促性腺激素 (hcg)，注射hcg24小时后进行查情，在发情中期选取体重大小适宜的健康 公猪进行配种，8小时后补配一次。
36.1.3受精卵采集
37.1.3.1.手术取卵方法的探索
38.为了了解猪的输卵管结构，顺利将受精卵冲出，预实验采用了将卵巢输 卵管摘下的离体取卵法，在离体条件下从输卵管顺了冲出了受精卵，但是由 于摘掉卵巢后的母猪不能再次用于取卵，实验成本太大，因此在正式实验中 采用不破坏卵巢在活体内冲卵的方法，采用之前方法中所示的冲卵装置，顺 利冲出了受精卵，且经过取卵手术后的母猪，术后7天恢复良好，取卵手术 后的下一个发情期正常发情，间隔一个情期后，对其进行超排药物注射，并 进行二次取卵手术，虽然出现轻微的输卵管粘连，但是并不影响取卵效果， 也能顺利取到受精卵。目前共进行了11次取卵实验，有5次成功取到受精卵， 平均每次取卵8.8枚(图1)。
39.耳号超排药物注射发情周期取卵时间取卵数量卵巢情况160618pmsg-hcg19第21天下午7多卵泡，未破裂160633pmsg-hcg17第19天下午8多卵泡，未破裂160605pmsg-hcg19第21天下午4多卵泡，未破裂160704pmsg-hcg19第21天下午9卵泡破裂160721pmsg-hcg19第20天下午16卵泡破裂
40.而由于西藏小型猪具有良好的术后恢复能力，抗感染能力强，所有11次 取卵手术均未发生术后感染等引起的小型猪死亡。
41.1.3.2.取卵时间的选择
42.猪体内受精卵的第一次卵裂发生在排卵后19-24小时，受精一般发生在输 卵管上半段，而48小时后受精卵则进入子宫角，进入子宫角时，胚胎已经发 育到四细胞期。受精卵存在于输卵管的时间很短，为了取到单细胞期受精卵 用于显微注射，安排取卵手术的时间非常重要，取卵过早，则卵母细胞未排 出，取卵过晚则受精卵已经卵裂并进入子宫角。在本研究的初期实践中，有 三次取卵实验，看到卵巢中成熟卵泡数量很多，但是卵泡未破裂，卵母细胞 未排出的现象，也有三次取卵实验，看到卵巢上有数个红体，未冲到受精卵， 怀疑为取卵时间太晚，受精卵已经到达子宫角所致。因此在后期实践中，采 用在猪发情后尽早配种，在第一次配种后24-36小时进行取卵手术的方案，取 卵的效果得到提高。
43.具体的，取卵包括：
44.1)术前准备：取卵手术前一天，准备好手术器械、手术衣、铺巾等，将其
45.高温高压灭菌，烘干备用。手术开始之前，开启手术室紫外灯，紫外灭 菌20-30分钟。在供卵母猪首次配种后24～36小时，通过外科手术法从输卵管 冲出受精卵。供卵母猪手术前12小时禁食。
46.2)母猪的麻醉：麻醉方法采用速眠新ii和戊巴比妥钠联合麻醉的方法， 首先用速眠新ii按0.1ml/kg体重肌肉注射进行麻醉，待动物四肢无力、无法 行走的时候，将猪固定，通过耳缘静脉注射3％的戊巴比妥钠，注射剂量一般 为0.2ml/kg体重，边注射边观察母猪状态，待母猪睫毛、角膜反应迟钝，肌 肉松弛，皮肤夹捏反应减弱或消失后，将其抬到手术台进行保定，用小动物 用留置针在其耳缘静脉建立静脉通道，用医用胶带固定留置针，以便于手术 过程中需要时可以补打麻药。
47.3)手术部位消毒：用一次性剃毛器将母猪下腹部皮肤上的毛剃掉，用碘酒 消毒下腹部皮肤，然后用酒精脱碘，铺上洞巾。
48.4)开腹：从下腹部倒数第二和第三乳头之间，沿腹中线切开一个6cm左 右的切口，用刀柄或大的止血钳小心钝性分离切口两侧的脂肪和肌肉层，当 腹膜露出时，用钝头剪刀剪开腹膜。用手探入腹腔，找到子宫，顺势找到卵 巢，将卵巢和连着的子宫角慢慢牵引出腹腔，撕开囊膜暴露卵巢，检查卵巢 的排卵状况，观察并记录残留卵泡数量、残留卵泡大小、排卵点的数量、黄 体数。用浸有37℃生理盐水的纱布给卵巢和子宫保温保湿。
49.5)冲卵：将玻璃吸管的细端用酒精灯烧弯，并保证其边缘光滑，制作弯头 玻璃吸管，以便于将其细端从输卵管伞部插入输卵管，用手将输卵管和玻璃 吸管固定，吸管的另一端接一个干净的平皿来收集冲卵液，在输卵管的另一 端连接的子宫角处用动脉夹或者止血钳夹住，在输卵管一侧用留置针小心扎 入输卵管内部，拔掉留置针的金属针部分，留塑料的针鞘部分在输卵管内， 20ml注射器内装满37℃预热的dpbs作为冲卵液，从留置针的一端注入，将 输卵管内的受精卵冲出，从玻璃吸管一侧收集冲卵液，冲洗两遍后取下玻璃 管，再用冲卵液冲洗玻璃管，收集好的冲卵液放在带有热台的体视显微镜下， 用口吸管捡取受精卵。对另一侧卵巢做同样的处理。将取到的受精卵用口吸 管吸到一个无菌的直径3.5cm培养皿的猪卵母细胞操作液液滴中。将采集到 的受精卵保温运回实验室，受精卵的运输方法参见刘随才所述的方法，将所 有受精卵用口吸管装到一端封口的麦管中，然后用烧热的镊子封口另一端， 将密封的麦管置于装有37℃温水的保温杯中，保温运回实验室，小心将麦管 中的受精卵取出，重新置于覆盖有石蜡油的pzm3培养液液滴中，置于co2细胞培养箱内，38.5℃培养，于取卵当天2-4小时内进行受精卵显微注射。
50.6)缝合：冲卵完成后，用37℃预热的生理盐水清洗输卵管和创口上的血 迹，将卵巢重新用输卵管伞包住，将卵巢和子宫重新还纳于腹腔，为了防止 肠粘连，在腹腔涂膜石蜡油，然后逐步缝合创口处的腹膜、肌肉层、脂肪层 和皮肤。在缝合肌肉层时撒粉状青霉素。缝合好创口后在手术部位涂碘酊消 毒，然后肌肉注射一支青霉素防止感染。
51.7)术后护理：手术完成后的母猪单笼饲养，连续三天注射青霉素消炎，手 术当天仅喂水不喂食，术后第二天开始赶母猪站起活动，并饲喂拌水的软料。 术后7-10天母猪伤口基本恢复，可以赶至圈舍与其他猪一起饲养。
52.实施例2
53.1.生物信息学方法
54.1)基因信息的获取：从esemble(http://ensembl.org.index.html)网站获取猪 的plcd1基因的完整序列；找到猪的转录本、编码框、编码蛋白等信息；
55.2)sgrna设计：在sgrna设计网站http://crispr.mit.edu/针对猪的 plcd1基因设计sgrna；
56.3)序列比对：在ncbi网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/进行序列比对；
57.4)引物设计：在ncbi网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools /primer-blast/index.cgi？link_loc＝blasthomea
58.d进行引物设计。
59.5)酶切位点分析：使用dna club软件对酶切位点进行分析。
60.2.猪plcd1基因打靶质粒的设计与构建
61.2.1sgrna设计
62.从esemble网站分别找到猪plcd1基因的信息，找到各自的2、7、10
sgrna空白载体才能 用于后续实验。
77.2.5连接
78.反应条件：室温30min～2h；
79.反应体系：
80.组分体积线性化puc57-sgrna空白载体，50ng/μl0.5μl退火的双链dna，50ng/μl2μlt4 ligase(neb，m0202)1μlt4 ligation buffer(10
×
)1μlddh2o5.5μltotal10μl
81.注意：加样顺序为先加入退火的双链dna，再加入线性化载体，最后加 t4连接酶。需要设置不加退火的双链dna的连接反应作为阴性对照。 t4ligasebuffer需要分装后-20℃保存，不可反复冻融。连接后的产物可于-20℃ 长期保存，用于转化。
82.2.6转化与阳性克隆的获得
83.将5μl的连接反应液加入50μl感受态dh5α中进行转化、铺板，12 小时后每个平板各挑取5个克隆进行摇菌，送菌液样品到艾基公司进行质粒 的提取和测序。根据测序结果确认成功插入目的片段的质粒，为构建成功的 puc57-sgrna载体(简称sgrna载体)。
84.3.sgrna的体外转录
85.3.1 sgrna体外转录模板的获得
86.3.1.1构建好的sgrna载体线性化
87.用dra i内切酶将构建好的sgrna载体线性化。
[0088][0089]
取5μl酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(taebuffer，110v25min)鉴 定酶切是否完全。若酶切完全，则出现1621bp和1152bp两个条带，若酶切 不完全，则再出现一条2812bp的载体条带。只有酶切完全的产物才能用来作 为体外转录的模板。
[0090]
3.1.2体外转录模板的纯化
[0091]
1)将20μg的puc57-sgrna质粒酶切产物收集到一个ep管中，加入等 体积的酚氯仿异戊醇混合液，混匀后放置五分钟，然后13000rpm室温离心5 分钟。小心吸取上层液体到另一干净的ep管中。
[0092]
2)加两倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mm醋酸钠，上下颠倒混匀使 dna变成沉淀，-80℃放置30分钟使沉淀尽量析出，13000rpm4℃离心30分 钟。可以看到管底有白色沉淀，小心弃上清。
[0093]
3)用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，然后离心5分钟，弃上清。
[0094]
4)用1ml75％的乙醇重复洗涤沉淀一次。
[0095]
5)用200μl无水乙醇洗涤一次，去掉残留的水分。
[0096]
6)将沉淀风干10分钟，除去残余的乙醇和异丙醇。
[0097]
7)最后用一定体积的depc水溶解沉淀，将纯化后的质粒浓度调整为1 μg/μl以上，用于体外转录模板。
[0098]
注意：以上操作要在超净台中进行，严格防止rna酶的污染，所使用 的ep管、枪头、试剂都要严格去除rna酶。
[0099]
3.2体外转录
[0100]
3.2.1 sgrna的体外转录
[0101]
冰上解冻megashortscript
tm
kit(ambion)试剂盒中相关液体，按如下反 应体系加样。
[0102][0103]
注意：体外转录buffer含有亚精胺，会导致dna模板发生沉淀，应当最 后加。
[0104]
反应条件：将反应混合物充分混匀，37℃孵育2-4小时进行体外转录反应。 加2μltubrodnase到20μl反应体系，37℃孵育15分钟去除模板dna。
[0105]
3.2.2 sgrna转录的鉴定
[0106]
取0.5μl以上产物，进行2％琼脂糖凝胶电泳(tae buffer,110v 15min)， 鉴定转录完的sgrna的质量，高质量的sgrna条带应当是清晰无拖尾，大 小在120bp左右。
[0107]
3.2.3 sgrna的纯化
[0108]
1)将20μl体外转录产物转移到一个新的1.5mlep管中，加入500μl的 depc水稀释转录产物，然后加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液，充分混 匀后13000rpm4℃离心5分钟，小心吸取上层液到另一干净的ep管中。
[0109]
2)加两倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mm醋酸钠，上下颠倒混匀使 rna变成沉淀，-80℃放置30分钟使沉淀尽量析出，13000rpm4℃离心30分 钟。可以看到管底有白色沉淀，小心弃上清。
[0110]
3)用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，然后离心5分钟，弃上清。
[0111]
4)用1ml75％的乙醇重复洗涤沉淀一次。
[0112]
5)用200μl无水乙醇洗涤一次，去掉残留的水分。
[0113]
6)将沉淀风干10分钟，除去残余的乙醇和异丙醇。
[0114]
7)最后用一定体积的胚胎级别的蒸馏水将沉淀溶解到1μg/μl的浓度， 分装，置于-80℃保存，用于接下来的显微注射。
[0115]
注意：sgrna体外转录和纯化的所有操作要在超净台中进行，在4℃冰 上操作，严格防止rna酶的污染，所使用的ep管、枪头、试剂都要严格去 除rna酶。
[0116]
4.cas9体外转录
[0117]
4.1体外转录模板的获得
[0118]
4.1.1 cas9载体线性化
[0119]
将cas9载体pst1374-nls-flag-linker-cas9用限制性内切酶age i进 行线性化，产生的9317bp大小的片段用于cas9体外转录模板。
[0120][0121]
取5μl酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳(taebuffer，110v25min)鉴 定酶切是否完全。若酶切完全，则出现9317一个条带，若酶切不完全，则再 出现一条环状质粒的条带。只有酶切完全的产物才能用来作为体外转录的模 板。
[0122]
4.1.2体外转录模板的纯化
[0123]
1)将10μg的cas9质粒酶切产物收集到一个ep管中，加入等体积的酚 氯仿异戊醇混合液和dna混合，混匀后放置五分钟，然后13000rpm室温离 心5分钟。小心吸取上层液到另一干净的ep管中。
[0124]
2)加两倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mm醋酸钠，上下颠倒混匀使 dna变成沉淀，-80℃放置30分钟使沉淀尽量析出，13000rpm4℃离心30分 钟。可以看到管底有白色沉淀，小心弃上清。
[0125]
3)用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，然后离心5分钟，弃上清。
[0126]
4)用1ml75％的乙醇重复洗涤沉淀一次。
[0127]
5)用200μl无水乙醇洗涤一次，去掉残留的水分。
[0128]
6)将沉淀风干10分钟，除去残余的乙醇和异丙醇。
[0129]
7)最后用一定体积的depc水溶解沉淀，将纯化后的质粒浓度调整为200 μg/μl以上，用于体外转录模板。
[0130]
注意：以上操作要在超净台中进行，严格防止rna酶的污染，所使用的 ep管、枪头、试剂都要严格去除rna酶。
[0131]
4.2体外转录
[0132]
4.2.1 cas9rna的体外转录
[0133]
冰上解冻mmessagemmachinet7ultrakit(ambion)试剂盒中相关液体，按 如下反应体系加样。
[0134][0135]
注意：t7reactionbuffer含有亚精胺，会导致dna模板发生沉淀，应当 最后加。
[0136]
反应条件：将反应混合物充分混匀，37℃孵育2-4小时进行体外转录反应。 加2μltubrodnase到20μl反应体系，37℃孵育15分钟去除模板dna。 取0.5μl，电泳查看转录效果(1％琼脂糖凝胶，产物约4300kbp)；回收mrna。 添加polya序列，回收得到可用于显微注射的cas9mrna(添加polya序列 可增强mrna的稳定性和翻译效率)。
[0137]
cas9mrna加polya的反应体系：
[0138][0139]
4.2.2 cas9rna转录的鉴定
[0140]
取0.5μl以上产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳(taebuffer)，100v，15 分钟。鉴定转录完的cas9rna的质量，高质量的cas9rna条带应当是清晰 无拖尾，大小在4300bp左右。
[0141]
4.2.3cas9rna的纯化
[0142]
1)将体外转录产物转移到一个新的1.5mlep管中，加入500μl的depc 水稀释转录产物，然后加入等体积的酚氯仿异戊醇混合液，充分混匀后 13000rpm4℃离心5分钟，小心吸取上层液到另一干净的ep管中。
[0143]
2)加两倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mm醋酸钠，上下颠倒混匀使 rna变成沉淀，-80℃放置30分钟使沉淀尽量析出，13000rpm4℃离心30分 钟。可以看到管底有白色沉淀，小心弃上清。
[0144]
3)用1ml75％的乙醇洗涤沉淀，然后离心5分钟，弃上清。
[0145]
4)用1ml75％的乙醇重复洗涤沉淀一次。
[0146]
5)用200μl无水乙醇洗涤一次，去掉残留的水分。
[0147]
6)将沉淀风干10分钟，除去残余的乙醇和异丙醇。
[0148]
7)最后用一定体积的胚胎级别的蒸馏水将沉淀溶解到1μg/μl的浓度， 分装，
[0149]
置于-80℃保存，用于接下来的显微注射。
[0150]
注意：体外转录和纯化的所有操作要在超净台中进行，在4℃冰上操作， 严格防止rna酶的污染，所使用的ep管、枪头、试剂都要严格去除rna酶。
[0151]
实施例3
[0152]
1.显微注射
[0153]
1.1显微注射用混合物的制备
[0154]
将实施例2转录完成的cas9mrna和sgrna进行纯化，纯化后稀释为 500ng/μl的储存液置于-80℃备用。按照如下组分配制显微注射用混合物：
[0155][0156][0157]
将混合物混匀，放置于冰上，用于显微注射。
[0158]
1.2胞质内注射
[0159]
取实施例1手术冲卵法得到的受精卵放入猪卵母细胞操作液中洗3次， 用猪卵母细胞操作液做100μl的覆盖石蜡油的液滴，将洗好的受精卵放入备 用。准备一个无菌的直径3.5cm培养皿的上盖，中间滴入50μl猪卵母细胞操 作液然后盖石蜡油，用于显微注射。将制备好cas9mrna和sgrna混合物用 无rna酶的10μl枪头注入注射针，将注射针和固定针安装到显微操作仪上， 将受精卵移入操作液滴中，每批操作30-50个受精卵。用固定针吸取受精卵， 调整好注射针的位置，将注射针穿破透明带和细胞膜扎入细胞质(图2)，注 意避开极体防止破坏核物质，注射后受精卵应有明显膨胀。注射完毕后，缓 缓回撤注射针，将受精卵释放，操作完的受精卵放入pzm3培养液中，置于 38.5℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中进行培养。
[0160]
2.胚胎移植
[0161]
在供卵母猪交配当天或者取卵手术当天，从猪群中挑选处于发情中期的 经产母猪作为代孕母猪，胚胎移植手术可以安排在取卵手术的当天或次日， 对代孕母猪进行麻醉、绑定，在下腹部的一侧进行切口，开口约5-8cm，沿切 口钝性分离脂肪和肌肉层，露出腹膜，小心剪开腹膜，用手探入腹腔将子宫 拉出，沿子宫找到卵巢，打开输卵管伞部，观察卵巢表面的排卵状况，从输 卵管伞部找到输卵管的入口，将显微注射后的基因修饰胚胎吸入胚胎移植管 中，沿输卵管入口插入输卵管，用手将输卵管捋直使胚胎移植管插入到输卵 管第2个自然弯曲处，吹入胚胎。然后将胚胎移植管缓缓退出，用输卵管伞 部包裹好卵巢，将卵巢和子宫还纳于腹腔，涂膜石蜡油防止肠粘连，然后采 用对代孕母猪进行缝合和术后护理。代孕母猪在手术后一直单圈饲养，注意 观察其是否返情，如果返情则证明胚胎移植失败，如果无返情，在术后20-30 天用猪早孕诊断试纸(北京万华生物)检测是否怀孕，对怀
孕的代孕母猪定 期用b超监测胎儿发育情况，直至仔猪的出生(图3)。
[0162]
3.基因型分析
[0163]
观察获得的子代西藏小型猪是否出现掉毛现象，并提取f0代西藏小型猪dna，通过对猪plcd1打靶位点进行测序分析，来确定出生的西藏小型猪是 否出现了靶位点的基因敲除。
[0164]
3.1仔猪基因组dna提取仔猪出生1周后，用灭菌的剪刀剪取少量耳组 织，进行基因组dna的提取。
[0165]
3.2 pcr扩增
[0166]
仔猪plcd1基因2、7、10号外显子根据西藏小型猪plcd1基因序列， 设计如下引物分别pcr扩增西藏小型猪plcd1基因2号外显子和7-10号外 显子，对pcr产物使用各自的正向引物进行测序，将测序为单峰的结果在 ncbi-blast网站与参考序列进行比对，将测序结果为套峰的相应猪pcr产 物进行ta克隆，再使用各自的正72向引物进行测序，将测序结果在 ncbi-blast网站与参考序列进行比对，获得具体的碱基插入、缺失、置换 情况。
[0167][0168]
4.胚胎移植
[0169]
取到的受精卵通过保温装置运输到实验室，进行显微操作，显微镜下可 见猪受精卵为单细胞期，状态良好，挑选状态良好的单细胞期受精卵进行胞 质内注射，将显微注射完存活的胚胎进行胚胎移植，共进行三次胚胎移植实 验，分别移植9、10、16个基因修饰的胚胎到代孕母猪。
[0170]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。