一种小麦2A染色体特异细胞学探针及其应用

一种小麦2a染色体特异细胞学探针及其应用
技术领域
1.本发明属于分子遗传领域，具体涉及一种小麦2a染色体特异细胞学探针及其应用。


背景技术：

2.小麦是世界上第一大粮食作物，在我国也是仅次于水稻的第二大粮食作物。小麦为异源六倍体作物(基因组为aabbdd)，基因组巨大(约为17g)且重复序列多，结构复杂。因此，对小麦进行基因组测序成本非常高，且在重复序列丰富区域常常不能正确组装。单染色相较于整个基因组而言，数据量小(常为数百兆)，因此测序成本低。而且，对单染色体测序，可有效避免其他染色体的干扰，组装准确度更高。因此，单染色体测序对于小麦而言具有重要意义。
3.但是，准确分选出需要测序的目标染色体是进行单染色体测序的前提。单染色体分选可基于染色体大小和荧光标记强度两种方式进行。对于小麦而言，由于a、b、d组内染色体大小差异较小，直接按染色体大小进行分选难以获得高纯度目标染色体，从而无法进行后续的单染色体测序。如果开发单染色体特异探针，则可使目标染色体携带特异的荧光信号，从而达到高纯度分选的目的。但目前尚未出现任何关于小麦2a染色体特异探针的相关报告。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种小麦2a染色体特异细胞学探针及其应用。
5.为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种探针，所述探针的核酸序列如seq in no.1所示。
6.相应的，一种探针，所述探针的核酸序列如seq in no.1所示，所述探针上连接有荧光基团。
7.优选的，所述探针的3’端和/或5’端和/或第27号胸腺嘧啶上连接有荧光基团。
8.相应的，所述探针在小麦选育中的应用。
9.相应的，所述探针在小麦基因测序中的应用。
10.相应的，所述探针在小麦高纯度分选中的应用。
11.相应的，所述探针在小麦单染色体测序中的应用。
12.优选的，利用权利要求1所述探针对小麦细胞进行杂交。
13.优选的，所述杂交使用的杂交缓冲液为：利用柠檬酸钠缓冲液和te缓冲液对探针粉末稀释后获得。
14.优选的，柠檬酸钠缓冲液和te缓冲液的体积比为1:1。
15.相应的，利用所述探针制备的试纸、试剂、试剂盒。
16.相应的，包含所述探针制备的试纸、试剂、试剂盒。
17.本发明具有以下有益效果：本发明提出了一种全新的小麦2a染色体特异探针dna，
针对性和特异性极强。本发明还进一步提出的荧光基团连接方式进行连接荧光基团，可使该探针信号显著放大，为后续小麦2a染色体的高纯度流式分选提供坚实的理论基础和技术保证。
附图说明
18.图1为以oligo-2a(仅在5’端连接荧光基团fam)为探针，曝光时间2.8秒的荧光原位杂交图的荧光原位杂交图；
19.图2为以oligo-psc119.2和oligo-pta535为探针在图1相同的染色体分裂相上进行杂交的荧光原位杂交图；
20.图3为以oligo-2a
plus
(在5’端、3’端和第27位碱基——胸腺嘧啶上连接荧光基团fam)为探针，曝光时间2.8秒的荧光原位杂交图；
21.图4为以oligo-psc119.2和oligo-pta535为探针在图3相同的染色体分裂相上进行杂交的荧光原位杂交图。
具体实施方式
22.本发明提供了一种小麦2a染色体特异细胞学探针，所述探针的核酸序列如seq in no.1所示，从左到右为从5’端到3’端。
23.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
24.实施例：探针在锚定六倍体小麦中的2a染色体的效果展示
25.1、合成探针。按seq in no.1所示，交由核酸合成公司合成探针oligo-2a。分别在序列3’端、5’端和序列seq in no.1的第27号胸腺嘧啶(t)上连接荧光基团fam，合成探针oligo-2a
plus
。
26.2、获得小麦原材料。将六倍体小麦种子放于湿润滤纸上，在23℃条件下培养24h。随后再将种子转于4℃条件下培养24h。随后再将种子转于23℃条件下培养直至其发根。
27.待小麦根长至1～2cm时，取根，将其置于湿润的0.5ml的ep管中，ep管置于冰上。ep管的盖子上预先戳出一个直径约为3mm的小洞，以便对根尖进行笑气(n2o)处理。将装有根的ep管放入笑气罐中，笑气罐通笑气(0.9mpa)处理2h。
28.随后取出ep管置于冰上，加入约0.4ml的90％乙酸(以将根完全浸没为准)，固定根尖8～10min。随后用ddh2o洗根两次。再往ep管中加70％乙醇，并放于-20℃中，即可对根长期保存备用。
29.3、制片。将ep管中根用ddh2o清洗2次，以去除根上的乙醇。随后切下根尖部分置于酶液中(1％果胶酶，质量体积比；2％纤维素酶，质量体积比，以0.01m、ph＝5.5的柠檬酸缓冲液进行配制)，37℃条件下酶解1h。再用70％乙醇冲洗根尖2次，将酶液洗尽。倒出ep管中的大部分乙醇，留少量乙醇，用灭菌针尖将根尖捣碎，离心(4000rmp、2min)后将ep管倒置，控干乙醇。再往ep管中加入15～50μl乙酸，涡旋获得根尖细胞悬浮液。将载玻片放于湿润的纸盒，用移液枪吸取10μl细胞悬浮液，并将其滴于载玻片上。
30.4、杂交。配制工作液：将步骤1合成的探针粉末用杂交缓冲液稀释成工作液，工作液终浓度为1nmol/100μl(探针粉末/杂交缓冲液)。使用时，吸取2μl/片的工作液，再加入8μl/片杂交缓冲液，混匀，制成杂交液。在每张片子上滴加10μl杂交液。杂交缓冲液配方：2
×
ssc(柠檬酸钠缓冲液)：1
×
te(10mm tris-hcl、1mm edta)＝1：1(v:v),ph＝7.0。随后在37℃的黑暗环境中杂交3h。杂交完成后，dapi染色，盖上盖片，在leica荧光显微镜dm2500下镜检。使用黑白制冷ccd照相，荧光信号附伪色。
31.结果如图1～4所示。图1为以oligo-2a(仅在5’端连接荧光基团fam)为探针，曝光时间2.8秒的荧光原位杂交图(图1中箭头指出的白点位置)；图2为以oligo-psc119.2(图2中比较亮的白点位置)和oligo-pta535为探针(图2中亮度较浅的灰点位置)的荧光原位杂交图。图3为以oligo-2a
plus
(在5’端、3’端和第27位碱基——胸腺嘧啶(t)上连接荧光基团fam)为探针，曝光时间2.8秒的荧光原位杂交图(图3中箭头指出的白点位置)；图4为以oligo-psc119.2(图4中比较亮的白点位置)和oligo-pta535为探针(图4中亮度较浅的灰点位置)的荧光原位杂交图。oligo-psc119.2探针和oligo-pta535探针来自发明人课题组的在先技术，相关专利公开号为：cn111118002a。需要说明的是：因专利要求提供黑白图片，所以对图1～4分别进行了去色处理。
32.结果显示：探针oligo-psc119.2和oligo-pta535可识别2a染色体，而本发明提供的探针oligo-2a及oligo-2a
plus
只在2a染色体中部着丝粒区域特异杂交，特异性强。且在相同的曝光条件下，oligo-2a
plus
的信号强度明显高于oligo-2a(图4的白点亮度远高于图1)。发明人发现：相较于只在探针端部添加荧光基团，同时在探针端部和中间添加荧光基团对信号放大效果更好；在探针中间添加荧光基团时，添加在胸腺嘧啶上成本更低。
33.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。