改善治疗窗的皂苷衍生物的制作方法

本发明涉及一种基于皂苷的皂苷衍生物，所述皂苷衍生物包含三萜苷元和第一糖链和/或第二糖链，并且包含：包含已被衍生化的醛基团的苷元核心结构；和/或第一糖链，其中第一糖链包含已被衍生化的羧基基团；和/或第二糖链，其中第二糖链包含至少一个已被衍生化的乙酰氧基基团。本发明还涉及包含本发明皂苷衍生物的第一药物组合物。此外，本发明涉及包含本发明的第一药物组合物和第二药物组合物的药物组合，所述第二药物组合物包含抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-寡核苷酸缀合物或受体-配体-寡核苷酸缀合物中的任何一种或多种。本发明还涉及本发明的第一药物组合物或药物组合，其用作药物或用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关肝病、急性肝卟啉症、甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或自身免疫性疾病。此外，本发明涉及用于将分子从细胞外部转移到所述细胞内部的体外或离体方法，包括使所述细胞与所述分子和本发明的皂苷衍生物接触。发明背景靶向肿瘤疗法是使用药物靶向参与癌细胞生长和存活的特定基因和蛋白质的癌症治疗。免疫毒素是含有抗体作为靶向部分的靶向毒素，是非常有前景的，因为它们结合了针对肿瘤特异性抗原的抗体的特异性，这使得它们能够将毒素引导至目标作用点，并且可以另外引入细胞杀伤机制，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性和补体依赖性细胞毒性。为了显示其效果，需要在内化后将毒素释放到胞质溶胶中。主要的缺点是携带有效载荷的靶向部分通常不被完全内化，内化后直接再循环到表面，或在溶酶体中降解，从而阻碍有效载荷充分递送到细胞胞质溶胶中。为了确保肿瘤细胞的毒性有效载荷浓度并克服不充分的胞质溶胶进入，通常需要高血清水平的靶向毒素，从而导致严重的副作用，特别是包括免疫原性和血管渗漏综合征。因此，当用抗体-药物缀合物(ADC)治疗癌症患者时，仍然关注足够宽的治疗窗。为了解决胞质溶胶进入不足的缺点，开发了几种策略，涉及例如毒素向生物合成途径的内源性细胞膜转运复合物的重定向，核内体的破坏，核内体膜的膜完整性的减弱，或细胞穿透肽的使用。例如，在肿瘤疗法中，发现糖基化三萜(例如皂苷)作为靶向毒素(例如核糖体失活蛋白(RIP))的核内体逃逸增强剂。皂苷的结构-活性关系分析揭示，以下核心结构元素的存在似乎有利于皂苷增强RIP的细胞毒性的能力(参见式(I)，其中X1＝H或OH且X2＝多糖部分)：-在C-3位含有葡萄糖醛酸的支链三糖-在C-4位的醛-在C-28位的羧基基团-与含有乙酰基基团的至少四个糖部分的C-28位连接的多糖部分(R2)。具体地，SO1861(式II，有时也称为SPT001)，一种三萜皂苷，被鉴定为有效分子，以增强肿瘤细胞靶向毒素的核内体逃逸。假定增强剂机制的双重作用：第一，直接增加核内体逃逸导致半胱天冬酶依赖性细胞凋亡，其第二，与溶酶体介导的细胞死亡途径组合，其在组织蛋白酶和其它水解酶的释放之后在溶酶体膜的破坏之后被触发。皂苷作为核内体逃逸增强剂的应用是基于以下认识：这些皂苷具有破裂红细胞膜的能力。然而，同时，当用这种皂苷治疗受试者时，皂苷的细胞破裂活性有助于副作用(风险)，从而在限制治疗指数方面影响最佳的治疗窗。实际上，当例如考虑最佳给药方案和施用途径和频率时，当对需要抗肿瘤治疗的患者施用时，这种皂苷的细胞外和/或细胞内毒性是值得关注的。皂苷本身的化学组成的所有特征，包括三萜主链的结构，五环C30萜骨架(也称为皂苷配基或苷元)，糖侧链的数目和长度以及与主链连接的糖残基的类型和连接变体，都有助于这种皂苷的溶血潜能和/或细胞毒性。当考虑细胞的核内体和胞质溶胶时，皂苷本身不是靶标特异性的，并且皂苷以不同于靶向毒素的其它动力学出乎意料地且最经常地分布在(人)受试者中，即使当考虑相同的施用途径时。因此，在向需要其的患者施用包含例如ADC和皂苷的治疗组合后，皂苷分子可以在任何器官中被发现，这意味着特异性仅由靶向毒素介导。当与靶细胞中的特异性累积相比时，皂苷在全身中的分布需要较高的浓度来成功治疗。因此，考虑到皂苷在体内的全身应用，为了获得合适的治疗窗，修饰的皂苷的毒性需要足够低以成功应用。因此，当考虑皂苷与例如ADC共同施用时仍需要改善治疗指数：当考虑ADC的细胞毒性作用增强时，需要更好地控制(或更好地：降低)皂苷的细胞毒性，同时保持足够的功效。技术实现要素：令人惊奇的是，本发明人已经发现修饰的皂苷，即皂苷衍生物，具有-结合在皂苷的苷元的C-3位且含有修饰的葡萄糖醛酸的支链三糖部分；和/或-在皂苷的苷元的C-4位的修饰的醛；和/或-多糖部分，其结合在皂苷的苷元的C-28位，并且在所述多糖部分中包含修饰的乙酰氧基基团；其当考虑与皂苷衍生物接触的细胞的细胞活力时，具有降低的毒性，当考虑例如毒素细胞毒性或BNA介导的基因沉默的增强时，具有活性(不希望受任何理论的束缚：与修饰皂苷的类似或改进的核内体逃逸增强活性有关)和/或与未修饰的皂苷的毒性、活性和溶血活性相比具有降低的溶血活性。因此，本发明人提供了具有改善的治疗窗的皂苷衍生物，因为增加了细胞毒性的IC50值与例如毒素增强或基因沉默之间的比率，和/或因为增加了皂苷溶血活性的IC50值与例如毒素增强或基因沉默之间的比率。本发明的第一方面涉及基于皂苷的皂苷衍生物，其包含三萜苷元核心结构以及与所述苷元核心结构连接的第一糖链和第二糖链中的至少一个，其中：i.所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，所述苷元核心结构包含已被衍生化的醛基团；或ii.所述皂苷衍生物包含所述第一糖链，其中所述第一糖链包含已被衍生化的羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团；或iii.所述皂苷衍生物包含所述第二糖链，其中所述第二糖链包含至少一个已被衍生化的至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或iv.所述皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选两个衍生化i.、ii.和iii.的任何组合；其中所述第一糖链和所述第二糖链独立地选自单糖，直链寡糖和支链寡糖。一实施方案是本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷，更优选双糖链三萜糖苷。本发明的第二方面涉及第一药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物和任选的药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。本发明的第三方面涉及药物组合，其包含：·本发明的第一药物组合物；和·第二药物组合物，其包含抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-寡核苷酸缀合物或受体-配体-寡核苷酸缀合物中的任何一种或多种，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。本发明的第四方面涉及第三药物组合物，其包含本发明的皂苷衍生物并且还包含以下的任何一种或多种：抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-核酸缀合物或受体-配体-核酸缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。本发明的第五方面涉及用作药物的本发明的第一药物组合物，本发明的药物组合或本发明的第三药物组合物。本发明的第六方面涉及本发明的第一药物组合物、本发明的药物组合或本发明的第三药物组合物，其用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关肝病、急性肝卟啉症、甲状腺素介导的淀粉样变性或自身免疫性疾病。本发明的第七方面涉及一种用于将分子从细胞外部转移到所述细胞内部，优选转移到所述细胞的胞质溶胶中的体外或离体方法，所述方法包括以下步骤：a)提供细胞；b)提供用于从细胞外部转移到步骤a)中提供的细胞中的分子；c)提供根据本发明的皂苷衍生物；d)使步骤a)的细胞在体外或离体与步骤b)的分子和步骤c)的皂苷衍生物接触，从而建立所述分子从细胞外部进入所述细胞中的转移。定义术语“皂苷”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指一组两亲性糖苷，其包含一个或多个与亲脂性苷元核心结合的亲水性糖基部分，所述亲脂性苷元核心是皂苷配基。皂苷可以是天然存在的或合成的(即非天然存在的)。术语“皂苷”包括天然存在的皂苷，天然存在的皂苷的衍生物以及通过化学和/或生物技术合成路线从头合成的皂苷。术语“修饰的皂苷”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指皂苷，即皂苷衍生物，其在进行化学修饰以提供修饰的皂苷之前，在之前存在于非衍生化的皂苷中的醛基团，羧基基团，乙酸酯基团和/或乙酰基基团中的任何一个的位置处具有一个或多个化学修饰。例如，通过对修饰的皂苷所基于的皂苷中的醛基团，羧基基团，乙酸酯基团和/或乙酰基基团中的任何一个或多个的化学修饰，即提供皂苷，并且化学修饰醛基团，羧基基团，乙酸酯基团和/或乙酰基基团中的任何一个，从而提供修饰的皂苷，来提供修饰的皂苷。例如，被修饰用于提供修饰的皂苷的皂苷是天然存在的皂苷。通常，修饰的皂苷是合成皂苷，通常修饰的皂苷是对天然皂苷的修饰，并因此衍生自天然皂苷，尽管修饰的皂苷也可衍生自可具有或不具有天然对应物的合成皂苷。通常，修饰的皂苷不具有天然对应物，即修饰的皂苷不是由例如植物或树天然产生的。术语“苷元核心结构”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指皂苷的苷元核心，其不具有与其结合的一个或两个碳水化合物天线或糖链(聚糖)。例如，皂皮酸是SO1861、QS-7和QS21的苷元核心结构。通常，皂苷的聚糖是单糖或寡糖，例如直链或支链聚糖。除非另有说明，术语“QS21”是指QS21的任何一种异构体，其具有图41中所示的结构式，以及两种或更多种的混合物，例如图41中所示的所有异构体。如本领域技术人员将理解的，包含QS21的典型天然提取物将包含QS21的不同异构体的混合物。然而，通过纯化或(半)合成途径，可以分离单一异构体。术语“糖链”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指聚糖，碳水化合物天线，单个糖部分(单糖)或包含多个糖部分的链(寡糖，多糖)中的任一种。糖链可仅由糖部分组成或还可包含其它部分，例如4E-甲氧基肉桂酸、4Z-甲氧基肉桂酸和5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸中的任一种，例如存在于QS-21中。术语“化学修饰的”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指第一化学基团或第一化学部分的化学修饰，从而提供第二化学基团或第二化学部分。实例是将羰基基团化学修饰为-(H)C-OH基团，将乙酸酯基团化学修饰为羟基基团，通过化学反应提供在皂苷的醛基团处与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)部分缀合的皂苷等。术语“化学修饰的醛基团”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指通过涉及皂苷的醛基团的化学反应获得的化学反应产物，所述化学反应导致初始醛基团被新的化学基团替代。例如，由皂苷的初始醛基团形成-(H)C-OH基团。术语“化学修饰的羧基基团”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指通过涉及皂苷的羧基基团例如例如葡萄糖醛酸部分的羧基和另一个分子的化学反应获得的化学反应产物，所述化学反应导致初始羧基基团被新的化学基团替代。例如，皂苷与2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)或1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)中的任一种之间的缀合物的形成，涉及皂苷的葡萄糖醛酸的羧基。在糖链的名称的上下文中的术语“Api/Xyl-”或“Api-或Xyl-”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指包含芹菜糖(Api)部分或包含木(Xyl)部分的糖链。术语“修饰的皂苷所基于的皂苷”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指为了提供修饰的皂苷而被修饰的皂苷。通常，修饰的皂苷所基于的皂苷是天然存在的皂苷，对其进行化学修饰以提供修饰的皂苷。术语“基于皂苷的修饰的皂苷”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指已经进行化学修饰步骤从而提供修饰的皂苷的皂苷，其中制备修饰的皂苷的皂苷通常是天然存在的皂苷。术语“寡核苷酸”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指涵盖DNA、修饰的DNA、RNA、mRNA、修饰的RNA、合成的核酸的任何天然或合成的核酸串，其作为单链分子或双链分子呈现，例如BNA、反义寡核苷酸(ASO)、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等。术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指抗体(诸如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个VH结构域、单结构域抗体、VHH、骆驼科动物VH等)，和当与受试者(诸如人类患者)的细胞接触时能够发挥治疗效果的任何分子(例如活性药物成分、毒素、寡核苷酸、酶、小分子药物化合物等)的任何缀合物。术语“抗体-寡核苷酸缀合物”或“AOC”具有其常规的科学含义，并且在本文中是指抗体(诸如IgG、Fab、scFv、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段、一个或多个VH结构域、单结构域抗体、VHH、骆驼科动物VH等)，和当与受试者(诸如人类患者)的细胞接触时能够发挥治疗效果的任何寡核苷酸分子(诸如寡核苷酸)的任何缀合物，所述寡核苷酸选自天然或合成的核酸串，涵盖DNA、修饰的DNA、RNA、mRNA、修饰的RNA、合成的核酸，其以单链分子或双链分子呈现，例如BNA、反义寡核苷酸(ASO)、短或小干扰RNA(siRNA；沉默RNA)、反义DNA、反义RNA等。术语“效应物分子”或“效应物部分”当提及效应物分子作为例如共价缀合物的一部分时，具有其常规的科学含义，并且在本文中是指可选择性地结合例如以下靶分子中的任一种或多种的分子：蛋白质、肽、碳水化合物、糖(例如聚糖)、(磷酸)脂质、核酸(例如DNA)、RNA、酶，并且调节这些一种或多种靶分子的生物活性。效应物分子例如是选自小分子(例如药物分子)、毒素(例如蛋白质毒素)、寡核苷酸(例如BNA)、异核酸(xenonucleicacid)或siRNA、酶、肽、蛋白质或其任何组合中的任意一种或多种的分子。因此，例如，效应物分子或效应物部分是选自可选择性地结合以下任何一种或多种靶分子的小分子(例如药物分子)、毒素(例如蛋白质毒素)、寡核苷酸(例如BNA)、异核酸或siRNA、酶、肽、蛋白质或其任何组合中的任意一种或多种的分子：蛋白质、肽、碳水化合物、糖(例如聚糖)、(磷酸)脂质、核酸(例如DNA)、RNA、酶，并且当与所述靶分子结合时调节这些一种或多种靶分子的生物活性。通常，效应物分子可以在细胞例如哺乳动物细胞例如人细胞内，例如在所述细胞的胞质溶胶中发挥生物作用。因此，典型的效应物分子是药物分子、质粒DNA、毒素如抗体-药物缀合物(ADC)所包含的毒素、寡核苷酸如siRNA、BNA、抗体-寡核苷酸缀合物(AOC)所包含的核酸。例如，效应物分子是可以充当配体的分子，所述配体可以增加或降低(细胞内)酶活性、基因表达或细胞信号传导。术语“HSP27”涉及在细胞中沉默HSP27表达的BNA分子。术语“桥连型核酸”，或简称为“BNA”，或“锁核酸”或简称为“LNA”，具有其常规的科学含义，并且在本文中是指修饰的RNA核苷酸。BNA也称为“限制性RNA分子”或“不可接近的RNA分子”。BNA单体可以含有具有“固定的”C3’-内切糖折叠(C3’-endosugarpuckering)的五元、六元或甚至七元桥连结构。在核糖的2′，4′-位合成地并入该桥以提供2′，4′-BNA单体。可以使用本领域已知的标准亚磷酰胺化学将BNA单体并入寡核苷酸聚合物结构中。BNA是具有增加的结合亲和力和稳定性的结构刚性寡核苷酸。在说明书和权利要求书中的术语第一，第二，第三等用于区分例如类似的元素、组合物、组合物中的成分，或单独的方法步骤，并且不一定用于描述顺序或时间顺序。这些术语在适当的情况下是可互换的，并且除非另有说明，本发明的实施方案可以以不同于本文所述或所示的其它顺序操作。除非另有说明，本文描述的本发明的实施方案可以组合和协作操作。此外，各种实施方案，尽管被称为“优选的”或“例如”或“诸如”或“具体地”等，但应被解释为可以实现本发明的示例性方式，而不是限制本发明的范围。权利要求书中使用的术语“包含”不应被解释为限于例如其后列出的元素或方法步骤或组合物的成分；它不排除其它元素或方法步骤或某种组合物中的成分。需要将其解释为指定所提及的所述特征，整体，(方法)步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其它特征，整体，步骤或组份或其群组的存在或添加。因此，表述“包括步骤A和B的方法”的范围不应限于仅由步骤A和B组成的方法，而是对于本发明，该方法的唯一列举的步骤是A和B，并且进一步地，权利要求应被解释为包括那些方法步骤的等同物。因此，表述“包含组分A和B的组合物”的范围不应限于仅由组分A和B组成的组合物，而是对于本发明，组合物的唯一列举的组分是A和B，并且进一步地，权利要求应被解释为包括那些组分的等同物。此外，不定冠词“一种”或“一个”对元素或组件的提及不排除存在多于一个元素或组件的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且仅一个元素或组件。因此，不定冠词“一种”或“一个”通常意味着“至少一个(种)”。附图的简要说明图1：分子3A的合成。图2：分子6的合成。图3：分子8的合成。图4：分子9的合成。图5：分子10的合成。图6：分子11的合成。图7：分子12的合成。图8：分子14的合成。图9：分子15的合成。图10：分子16的合成。图11：分子18的合成。图12：分子19的合成。图13：分子20的合成。图14：分子21的合成。图15：分子6的质量色谱图。图16：从SO1861开始合成分子6的质量色谱图的细节。图17：从分子6开始的分子9的质量色谱图的细节。图18A：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素(dianthin)存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图18B：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图19A：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图19B：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图20A：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的毒性的IC50曲线。图20B：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的毒性的IC50曲线。图21A：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的毒性的IC50曲线。图21B：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的毒性的IC50曲线。图22：通过人红细胞溶血试验测定的皂苷衍生物的溶血活性。图23A：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图23B：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图24A：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图24B：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图25A：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的毒性的IC50曲线。图25B：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的毒性的IC50曲线。图26A：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的毒性的IC50曲线。图26B：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的毒性的IC50曲线。图27：通过人红细胞溶血试验测定的皂苷衍生物的溶血活性。图28：通过人红细胞溶血试验测定的皂苷衍生物的溶血活性。图29：通过人红细胞溶血试验测定的皂苷衍生物的溶血活性。图30A：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的活性的IC50曲线。图30B：在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下，皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的活性的IC50曲线。图31A：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(HeLa)的毒性的IC50曲线。图31B：皂苷衍生物对表达EGFR的细胞(A431)的毒性的IC50曲线。图32：通过人红细胞溶血试验测定的皂苷衍生物的溶血活性。图33A：在5pM浓度的西妥昔单抗-石竹素(Saporin)存在下，各种QS皂素级分对表达EGFR的细胞(HeLa)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图33B：在5pM浓度的西妥昔单抗-石竹素存在下，各种QS皂素级分对表达EGFR的细胞(A431)的核内体逃逸增强活性的IC50曲线。图34A：QS皂苷级分对表达EGFR的细胞(HeLa)的毒性的IC50曲线。图34B：QS皂苷级分对表达EGFR的细胞(A431)的毒性的IC50曲线。图35：通过人红细胞溶血试验测定的QS皂苷级分的溶血活性。图36：分子23的合成。图37：分子25的合成。图38：分子27的合成。图39：分子28的合成。图40A：分子29的合成。图40B：QS21-Ald-EMCH(分子30)。图40C：QS21-Glu-AMPD(分子31)。图40D：QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(分子32)。图40E：QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(分子33)。图41：四种QS-21异构体的结构。图42：测定临界胶束浓度：单修饰SO1861的ANS荧光产率。图43：测定临界胶束浓度：双修饰SO1861的ANS荧光产率。图44：测定临界胶束浓度：三修饰的SO1861的ANS荧光产率。图45：测定临界胶束浓度：QS皂苷的ANS荧光产率。图46：测定临界胶束浓度：QS21的ANS荧光产率。图47A：测定临界胶束浓度：修饰QS21的ANS荧光产率。图47B：测定临界胶束浓度：单修饰QS21的ANS荧光产率。图47C：测定临界胶束浓度：双修饰QS21的ANS荧光产率。图48：SO1861或SO1861-EMCH 10pM西妥昔单抗-石竹素对A431细胞的细胞活力测定(MTS)。图49：西妥昔单抗-石竹素 300nM和4000nMSO1861-EMCH对A431细胞的细胞活力测定(MTS)。图50：西妥昔单抗-石竹素 300nM和1500nMSO1861或4000nMSO1861-EMCH对A431细胞的细胞活力测定(MTS)。图51：SO1861或SO1861-EMCH 10pMEGF石竹素对A431细胞的细胞活力测定(MTS)。图52A，B：EGF石竹素 10nM、300nM和1500nMSO1861或4829nMSO1861-EMCH对A431细胞的细胞活力测定(MTS)。图53A，B：曲妥珠单抗-石竹素或曲妥珠单抗-皂草素 1500nMSO1861或4000nMSO1861-EMCH对A431细胞的细胞活力测定(MTS)。图54：SO1861-EMCH 100nMHSP27BNA，100nM西妥昔单抗-HSP27BNA对A431细胞的HSP27mRNA基因沉默分析。图55：西妥昔单抗-HSP27BNA缀合物(DAR1.5或DAR4) 100nMSO1861-EMCH或4000nMSO1861-EMCH对A431细胞的HSP27mRNA基因沉默分析。图56：曲妥珠单抗-HSP27BNA缀合物(DAR4.4) 100nMSO1861-EMCH或4000nMSO1861-EMCH对SK-BR-3细胞的HSP27mRNA基因沉默分析。图57A，B：HSP27BNA 4000nMSO1861-EMCH对A431细胞和A2058细胞的HSP27mRNA基因沉默分析。图58：HSP27BNA或HSP27LNA 4829nMSO1861-EMCH对SK-BR-3细胞的HSP27mRNA基因沉默分析。图59：分子26的合成。图60：EMCH马来酰亚胺基团与硫醇的迈克尔加成反应的一般反应方案(如果R＝CH2-CH2-OH，则图60描述了SO1861-Ald-EMCH-封闭的(SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇)的合成)。图61：(A)SO1861-Ald-EMCH的MALDI-TOF-MS光谱和(B)SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇。(A)RP模式：m/z2124Da([M K] ，皂苷-Ald-EMCH)，m/z2109Da([M K] ，SO1861-Ald-EMCH)，m/z2094Da([M Na] ，SO1861-EMCH)。(B)RP模式：m/z2193Da([M K] ，皂苷-Ald-EMCH-巯基乙醇)，m/z2185Da([M K] ，SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇)，m/z2170Da([M Na] ，SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇)。图62：SO1861-EMCH(A)在pH3的HCl溶液中水解之前和(B)之后的MALDI-TOF-MS光谱。图63.未缀合的皂苷介导的核内体逃逸和靶细胞杀伤增强。A)用SO1861、SO1832、SO1862(SO1861的异构体)或SO1904在有或没有1.5pMEGF石竹素的情况下处理的HeLa细胞(EGFR )的细胞活力分析。B)用EGF石竹素和固定浓度的SO1861、SO1832、SO1862(SO1861的异构体)或SO1904处理的HeLa细胞(EGFR )的细胞活力分析。C)用SO1861或GE1741在有或没有1.5pMEGF石竹素的情况下处理的HeLa细胞(EGFR )的细胞活力分析。D)用各种QSmix(来自QuillaiaSaponaria的皂苷混合物)在有或没有1.5pMEGF石竹素的情况下处理的HeLa细胞(EGFR )的细胞活力分析。图64.未缀合的SO1861对比SO1861-Ald-EMCH活性。根据本发明，EGFR靶向的反义BNA寡聚物递送和在癌细胞中的基因沉默。A，B，C)用SO1861或SO1861-Ald-EMCH在有或没有1.5pMEGF石竹素的情况下处理的A431(EGFR )，HeLa(EGFR )或A2058(EGFR-)细胞的细胞活力分析。D，E)用SO1861或SO1861-L-N3(也称为SO1861-N3或SO1861-N3/叠氮化物)在有或没有1.5pMEGF石竹素的情况下处理的A431(EGFR )或HeLa(EGFR )细胞的细胞活力分析。图65.未缀合的SO1861对比SO1861-Ald-EMCH(不稳定的腙键)对比SO1861-HATU(也称为SO1861-(S)(稳定的)和SO1861-Glu-HATU)。用SO1861、SO1861-Glu-HATU(也称为SO1861-(S)(S＝HATU)和SO1861-Ald-EMCH(SO1861苷元核心和EMCH接头之间的腙键也称为“不稳定的接头”)在有或没有EGF石竹素的情况下处理的HeLa细胞(EGFR )的细胞活力分析。详细描述将参考具体实施方案描述本发明，但本发明不限于此，而仅由权利要求书来限定。出人意料地，本发明人已经发现修饰的皂苷，即皂苷衍生物，其具有以下基团：-结合在皂苷的苷元的C-3位且含有修饰的葡萄糖醛酸的支链三糖部分；和/或-在皂苷的苷元的C-4位的修饰的醛；和/或-多糖部分，其结合在皂苷的苷元的C-28位，并且在所述多糖部分中包含修饰的乙酰基基团；其当考虑与皂苷衍生物接触的细胞的细胞活力时，具有降低的毒性；当考虑例如毒素细胞毒性或BNA介导的基因沉默的增强时，具有活性(不希望受任何理论的束缚：与修饰皂苷的类似或改进的核内体逃逸增强活性有关)，如果修饰的皂苷的上述基团中的一个或两个被衍生化(即以下基团中的一个或两个：苷元中的醛基团、结合在苷元的C-3位的多糖链中的葡萄糖醛酸的羧基，和结合在苷元的C-28位的多糖链中的乙酰基基团)；和/或与未修饰的皂苷的毒性、活性和溶血活性相比具有降低的溶血活性。因此，本发明人提供了具有改善的治疗窗的皂苷衍生物，因为对于皂苷衍生物，细胞毒性低于对于它们的天然存在的对应物测定的细胞毒性，溶血活性低于所述皂苷衍生物的天然存在的对应物测定的溶血活性，并且对于单一衍生化的皂苷和对于双衍生化的皂苷，细胞毒性和例如毒素增强或基因沉默的IC50值之间的比率是类似的或增加的，和/或由于皂苷溶血活性和例如毒素增强或基因沉默的IC50值之间的比率是类似的或增加的。关于示例性皂苷衍生物的概述，结合图1-14和36-40，参考表A2，关于细胞毒性、溶血活性和核内体逃逸增强活性(“活性”)的概述，以及细胞毒性的IC50与活性的IC50之间的比率，以及溶血活性的IC50与活性的IC50之间的比率，参考表A5和表A6，如在各种细胞上测定的。本发明的第一方面涉及基于皂苷的皂苷衍生物，其包含三萜苷元核心结构(也称为‘苷元’)以及与所述苷元核心结构连接的第一糖链和第二糖链中的至少一个，其中：i.所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，所述苷元核心结构包含已被衍生化的醛基团；或ii.所述皂苷衍生物包含所述第一糖链，其中所述第一糖链包含已被衍生化的羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团；或iii.所述皂苷衍生物包含所述第二糖链，其中所述第二糖链包含至少一个已被衍生化的至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团；或iv.所述皂苷衍生物包含衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选两种衍生化i.、ii.和iii.的任何组合；其中所述第一糖链和所述第二糖链独立地选自单糖，直链寡糖和支链寡糖。一实施方案是本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物是单糖链三萜糖苷或双糖链三萜糖苷，更优选双糖链三萜糖苷。令人惊奇的是，皂苷的苷元的C-23位的醛基团，苷元的C-3位的糖部分中的羧基基团，即葡萄糖醛酸部分中的羧基基团，以及结合在皂苷的苷元的C-28位的(寡-)糖部分中的糖单元中的乙酰基基团中的任一个，两个或三个的修饰(衍生化)，当这种皂苷衍生物与细胞，即各种类型的细胞接触时，导致细胞毒性的降低。本发明人已经确定了表A2、表A3以及图1-14和36-40中所列的一系列不同的皂苷衍生物的细胞毒性降低。因此，本发明的一部分是提供具有降低的细胞毒性的这些系列的皂苷衍生物，其中细胞毒性的降低是相对于未修饰的天然存在的皂苷对应物所测定的细胞毒性。皂苷衍生物可以由这些天然存在的皂苷形成。通常，当与自然界中存在的天然存在的对应物，如SO1861和QS-21(同种型)相比时，本发明的皂苷衍生物包含一种、两种或三种衍生化。当考虑细胞毒性降低时，当提供细胞毒性降低的皂苷时，在上述皂苷分子中的所述位点处包含一个，两个或三个修饰(衍生化)的皂苷衍生物同样是合适的。此外，本发明人令人惊奇地确定，各种不同的修饰适于降低细胞毒性，降低溶血活性，并适于保持和保留足够程度的核内体逃逸增强活性。当考虑溶血活性时，类似于降低的细胞毒性，当皂苷中的一个，两个或三个所述指定的化学基团被衍生化时，溶血活性降低。这些衍生化可以具有各种性质，例如表A2、表A3以及图1-14和36-40中所列的那些衍生化。与醛基团还原成羟基基团的衍生化一样小的衍生化，并且与醛基团用EMCH衍生化一样大的衍生化，连同葡萄糖醛酸的羧基基团用AEM衍生化，均降低了细胞毒性和溶血活性。显然，为了提供在降低的细胞毒性方面具有改善的细胞毒性和在降低的溶血活性方面具有改善的溶血活性的皂苷衍生物，当与天然存在的皂苷对应物相比时，皂苷中的所述三个化学基团中的任何一个或多个，例如一个、两个或可以通过具有不同大小和/或具有不同化学性质的各种各样的不同化学基团衍生化。不希望受任何理论的束缚，假定皂苷苷元的C-3原子处的醛基团涉及和/或有助于双糖链三萜糖苷型皂苷的核内体逃逸增强活性，即例如，当在不存在此类皂苷的情况下相同剂量的(蛋白质)毒素在体外和体内与细胞接触时此类毒素的毒性相比，在这样的皂苷存在下与细胞接触时的此类毒素的毒性增加。实际上，本发明人确定在葡萄糖醛酸单元中具有衍生化的羧基基团和/或在多糖链中具有衍生化的乙酰基并且在苷元中包含游离醛基团的皂苷衍生物具有核内体逃逸增强活性。这些衍生物具有降低的溶血活性和降低的细胞毒性。例如，作为分子3A、8、11、18、19和28(表A2、表A3、表A5、表A6、图1、3、6、11、12、39)的皂苷衍生物在苷元核心中具有游离的未修饰的醛基团，并且当考虑抗体-药物缀合物(与表达所述抗体所结合的受体的各种(肿瘤)细胞接触)的细胞毒性增强时确实显示出活性。因此这些皂苷衍生物被明确地设想为本发明的实施方案。令人惊讶的是，当效应物分子的细胞毒性以配体-毒素缀合物(例如ADC)的形式提供给(肿瘤)细胞时，在苷元中具有衍生化的醛基团的皂苷衍生物(使得皂苷衍生物不包含游离的醛基团)仍然显示出特征性的核内体逃逸增强活性，并且前提条件是C-28位的多糖链中的乙酰基基团和C-23位的多糖链中的羧基基团中没有或仅有一个是衍生化的。例如，表A2、表A3和图2、4、5、8、9、13、38和40中的分子6、9、10、14、15、20、27和29所示的具有修饰的醛基团且不具有或具有单一的进一步衍生化的皂苷衍生物具有增强效应物分子的细胞毒性作用的能力，所述效应物分子在苷元中具有衍生化的醛基团的这种皂苷衍生物的存在下与肿瘤细胞接触。所有这些皂苷衍生物显示出降低的细胞毒性并显示出降低的溶血活性，因此被明确地设想为本发明的实施方案。本发明人还发现，与相应的未修饰的皂苷相比，某些修饰导致临界胶束浓度(CMC)增加。例如，表示为分子2、6、8、10、15、27和28的皂苷衍生物，优选表示为分子2、6、8、10和15的皂苷衍生物与它们相应的未衍生化的皂苷相比具有增加的CMC，因此被明确地设想为本发明的实施方案。不希望受任何理论的束缚，据信增加的CMC由于几个原因是有利的。例如，增加的CMC可以促进修饰的皂苷在随后的缀合反应中的使用，因为游离分子通常比在胶束结构中有序的分子对缀合反应更敏感。此外，在皂苷衍生物需要发挥生物功能的情况下(例如，在体内治疗或离体方法或体外方法中)，例如，在原样使用皂苷衍生物的情况下，或者甚至在它们在从载体或另一实体切割后原位释放的情况下，与未修饰的皂苷相比，增加的CMC是有利的，因为游离皂苷分子将比这些皂苷衍生物在胶束结构中有序的情况下更容易与它们的生物靶标相互作用。增加的CMC也可用于促进皂苷衍生物的大规模生产和浓度，因为在超过(以上)临界胶束浓度的浓度下，皂苷形成阻碍分离(例如使用制备型HPLC)的胶束。令人惊奇的是，对于本发明的皂苷衍生物，观察到的增加的CMC与增加的细胞毒性或溶血活性无关。CMC和细胞毒性之间的关系是不可预测的并且是复杂的，这例如可以从deGroot等人的表2中的数据看出。(“Saponininteractionswithmodelmembranesystems-Langmuirmonolayerstudies，hemolysisandformationofISCOMs”，Plantamedica82.18(2016)：1496-1512)，其显示，以α-Hederin为参照点，CMC的增加可能与一般细胞毒性的增加有关(地高辛通常就这样)，但也可能仅与细胞毒性的降低有关(如甘草皂苷和常春藤苷C(HederacosideC)通常就这样)。此外，对于表示为分子2、6、10和15的皂苷衍生物，与相应的游离皂苷相比，增加的CMC也与增加的比率：IC50溶血/IC50活性有关，使得这些皂苷衍生物是本发明特别优选的实施方案。因此，本发明人在考虑细胞毒性和/或考虑溶血活性时，以及在考虑例如毒素的增强和/或与相应的未衍生化的皂苷相比增加的CMC时，提供了具有改善的治疗窗的皂苷衍生物。本发明的这种皂苷衍生物特别适用于涉及例如用于预防或治疗例如癌症的ADC或AOC的治疗方案。当考虑细胞毒性和/或溶血活性时，特别是当将这种皂苷衍生物施用于需要例如用ADC或用AOC治疗的患者时，这种皂苷衍生物的安全性得到改善。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物包含第一糖链，其中所述第一糖链包含已被衍生化的羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团，和/或其中所述皂苷衍生物包含第二糖链，其中所述第二糖链包含至少一个已被衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团(这里也称为衍生化的乙酸酯基团)，优选地，皂苷衍生物包含已被衍生化的所述第一糖链和已被衍生化的所述第二糖链两者，更优选地，皂苷衍生物包含已被衍生化的所述第一糖链和已被衍生化的所述第二糖链两者，并且所述皂苷衍生物包含含有醛基团或已被衍生化的醛基团的苷元核心结构，最优选地，所述皂苷衍生物包含已被衍生化的所述第一糖链和已被衍生化的所述第二糖链两者，并且所述皂苷衍生物包含含有醛基团的苷元核心结构。同样优选的是这些衍生化中的两种的所有其它可能的组合，当考虑天然存在的皂苷时，使皂苷的这三个化学基团中的一个不改变。此外，皂苷中的一个，两个或三个，优选一个或两个化学基团根据表A2和表A3中列出的任何一种或多种衍生化进行衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物包含选自以下的苷元核心结构：2α-羟基齐墩果酸；16α-羟基齐墩果酸；常春藤皂苷元(23-羟基齐墩果酸)；16α，23-二羟基齐墩果酸；丝石竹皂苷元；皂皮酸；原七叶皂苷元-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-22-乙酸酯；23-氧代-玉蕊皂苷元C-2l，22-双(2-甲基丁-2-烯酸酯)；23-氧代-玉蕊皂苷元C-21(2-甲基丁-2-烯酸酯)-16，22-二乙酸酯；洋地黄皂苷配基；3，16，28-三羟基齐墩果-12-烯；丝石竹酸，以及以上的衍生物，优选地，所述皂苷衍生物包含选自皂皮酸和丝石竹皂苷元或其衍生物的苷元核心结构，更优选地，所述皂苷衍生物苷元核心结构是皂皮酸或其衍生物。由于本发明人现在发现，基于三萜糖苷型皂苷，可以提供在与这些衍生物接触的细胞的降低细胞毒性和降低的溶血方面改进的皂苷衍生物，基本上可以相应地改进由本发明人测试的具有这种核内体逃逸增强活性的任何皂苷，例如具有上述实施方案的苷元并列于表A1中的皂苷。当考虑毒素和例如BNA的增强时，降低毒性并降低溶血活性同时将活性保持到足够高的程度是本发明人在考虑单独的皂苷衍生物或与例如ADC或AOC组合的治疗窗的扩大时的重要成果。足够高剂量的衍生化的皂苷可应用于例如对有需要的癌症患者的肿瘤治疗中，而与天然皂苷对应物的应用相比，由皂苷衍生物发挥或诱导的细胞毒性副作用(的风险)和不希望的溶血活性(的风险)降低。本发明皂苷衍生物的治疗窗的改进例如对于表A5和表A6中的示例性皂苷衍生物是显而易见的：列出了细胞毒性或溶血活性的IC50与核内体逃逸增强活性的IC50之间的比率，以及溶血活性，细胞毒性和活性。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物包含选自以下的苷元核心结构：皂皮酸、丝石竹皂苷元及其衍生物，优选地，所述皂苷衍生物包含选自以下的苷元核心结构：皂皮酸及其衍生物，其中所述第一糖链当存在时与苷元核心结构的C3原子(也表示为‘C-3’原子)或C28原子(也表示为‘C-28’原子)，优选与C3原子连接，和/或其中所述第二糖链当存在时与苷元核心结构的C28原子连接。优选的是基于具有与苷元结合的两个糖链的皂苷的那些皂苷衍生物，但是通常任何显示出核内体逃逸增强活性的皂苷都适合根据本发明的衍生化，目的是提供具有较低的细胞毒性，较低的溶血活性和足够高的核内体逃逸增强活性的单、双或三，优选单或双衍生化的皂苷。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述第一糖链，如果存在的话，选自(列表S1)：GlcA-、Glc-、Gal-、Rha-(1→2)-Ara-、Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-、Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-、Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-、Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-，Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-、Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-、Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-，以及以上的衍生物，和/或其中所述第二糖链，如果存在的话，选自(列表S2)：Glc-、Gal-、Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-、Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-、Ara-、Xyl-、Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc-其中R1是4E-甲氧基肉桂酸、Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc-其中R2是4Z-甲氧基肉桂酸、Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-、Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3，4-二-OAc-Fuc-、Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc-其中R3是4E-甲氧基肉桂酸、Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-、Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-、(Ara-或Xyl-)(1→3)-(Ara-或Xyl-)(1→4)-(Rha-或Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha-或Fuc-)(1→4)]-(Rha-或Fuc-)、Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-、Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-、Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-、Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc-其中R4是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc-其中R5是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-、6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-、Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-、Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-、Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-、Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-、Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3、4-di-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-、Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-、6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-、Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xy1-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-、Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-、Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-、Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc-其中R6是5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc-其中R7是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc-其中R8是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc-其中R9是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc-其中R10是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc-其中R11是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)、Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc-其中R12是5-O-[5-O-Ara/Api-3，5-二羟基-6-甲基-辛酰基]-3，5-二羟基-6-甲基-辛酸)Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-，以及以上的衍生物。通常，当细胞与皂苷和毒素接触时，增强毒素细胞毒性的皂苷具有一个或两个这样的与苷元结合的单糖链或多糖链。优选的是那些选择用于衍生的包含两个糖链的皂苷。表A1中提供了特别优选的皂苷的概述，当应将核内体逃逸增强活性保持到足够高的程度时，使这种皂苷进行单、双或三衍生化，优选进行单或双衍生化。当然，这种皂苷的结构变体同样适用于根据本发明的衍生化，如果这种皂苷对例如毒素，BNA等表现出核内体逃逸增强活性的话。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物包含所述第一糖链并且包含所述第二糖链，其中所述第一糖链包含一个以上的糖部分并且所述第二糖链包含一个以上的糖部分，并且其中所述苷元核心结构是皂皮酸或丝石竹皂苷元，其中以下的一项、两项或三项，优选一项或两项：i.所述苷元核心结构中的醛基团已被衍生化。ii.所述第一糖链包含已被衍生化的葡萄糖醛酸部分的羧基，和iii.所述第二糖链包含至少一个已被衍生化的乙酰氧基(Me(CO)O-)基团。以下概述说明了合适的衍生化：根据本发明，皂苷可以包含三种衍生化，并且仍然显示出足够高的核内体逃逸增强活性。具体地，当细胞毒性和/或溶血活性的降低大于增强效应物分子在细胞内的作用和活性的能力的(潜在的或明显的)降低时，所述效应物分子例如与效应物分子和衍生化的皂苷接触的肿瘤细胞中的毒素或BNA。因此，当考虑苷元的醛基团时，当考虑C-3位的多糖中的葡萄糖醛酸单元中的羧基基团(如果存在)时，以及当考虑C-28位的多糖链中的乙酰基基团(如果存在)时，本发明提供了包含单种、两种或三种衍生化的衍生化的皂苷。优选具有一个或两个修饰的皂苷衍生物。适于改善效应物分子如毒素或BNA的核内体逃逸的是例如具有游离醛基团和在糖链中具有一种或两种衍生化的皂苷衍生物。如前所述，具有衍生化的醛基团的皂苷衍生物同样也是合适的。在衍生化时在苷元中不具有游离醛基团的这种皂苷衍生物，仍然显示出足够的且有效的核内体逃逸增强活性。不希望受任何理论束缚，由于核内体和(哺乳动物)细胞如人细胞的溶酶体中的酸性条件，在最初结合到皂苷的醛基团上的部分被pH驱动切割时，醛基团可以再次在细胞内形成，以提供在C-23位具有衍生化的苷元的皂苷衍生物。可以在核内体或溶酶体中再次形成的具有修饰的醛基团的皂苷衍生物的实例是包含腙键的皂苷衍生物，所述腙键在醛的羰基基团和例如与苷元结合的化学基团中的酰肼部分(例如N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH))之间形成，或EMCH和与马来酰亚胺基团结合的巯基乙醇形成硫醚键。这种皂苷衍生物的实例在图8和图9中提供，并且在下文显示为分子2和分子3。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物是选自以下皂苷的皂苷的衍生物：皂树皮皂苷、川续断皂苷B、柴胡皂苷A、柴胡皂苷D、灰毡毛忍冬皂苷A、商陆皂苷A、商陆皂苷元、七叶皂苷、AS6.2、NP-005236、AMA-1、AMR、α-Hederin、NP-012672、NP-017777、NP-017778、NP-017774、NP-018110、NP-017772、NP-018109、NP-017888、NP-017889、NP-018108、SA1641、AEX55、NP-017674、NP-017810、AG1、NP-003881、NP-017676、NP-017677、NP-017706、NP-017705、NP-017773、NP-017775、SA1657、AG2、SO1861、GE1741、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1904、SO1862、QS-7、QS1861、QS-7api、QS1862、QS-17、QS-18、QS-21A-apio、QS-21A-xylo、QS-21B-apio、QS-21B-xylo、β-Aescin、AescinIa、茶籽皂苷I、茶籽皂苷J、阿萨姆皂苷F、洋地黄皂苷、报春花酸1和AS64R，以上的立体异构体及以上的组合，优选地，所述皂苷衍生物选自QS-21衍生物、SO1861衍生物、SA1641衍生物和GE1741衍生物，更优选地，所述皂苷衍生物选自QS-21衍生物和SO1861衍生物，最优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物。这些皂苷基本上是如发明人所确定的表现出核内体逃逸增强活性的皂苷，或者在结构上与已经确定了核内体逃逸增强活性的皂苷高度相似。这些皂苷的结构概述总结在表A1中。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物是由分子1表示的皂皮酸皂苷或丝石竹皂苷元的衍生物：其中第一糖链A1代表氢、单糖或直链或支链寡糖，优选A1代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S1)，更优选A1代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S1)，并且A1包含葡萄糖醛酸部分或由葡萄糖醛酸部分组成；第二糖链A2代表氢、单糖或直链或支链的寡糖，优选A2代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S2)，更优选A2代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S2)，并且A2包含至少一个乙酰氧基(Me(CO)O-)基团，例如一个，两个，三个或四个乙酰氧基基团，优选一个，其中A1和A2中的至少一个不是氢，优选A1和A2都是寡糖链；并且R是在丝石竹皂苷元中的氢或在皂皮酸中的羟基；其中所述皂苷衍生物对应于由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种：i.皂皮酸或丝石竹皂苷元的C23位的醛基团已被衍生化；ii.当A1代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S1)并且A1包含葡萄糖醛酸部分或由葡萄糖醛酸部分组成时，A1的葡萄糖醛酸部分的羧基基团已经被衍生化；和iii.当A2代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S2)并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的一个或多个(优选全部)乙酰氧基基团已经被衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中A1代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S1)，并且包含葡萄糖醛酸部分或由葡萄糖醛酸部分组成，并且其中A1的葡萄糖醛酸部分的羧基基团已经被衍生化和/或其中A2代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S2)，并且A2包含至少一个乙酰氧基基团，并且其中A2的至少一个乙酰氧基基团已经被衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中由分子1表示的皂苷是双糖链三萜皂苷。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物对应于由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种，优选存在以下衍生化中的一种或两种，更优选一种：i.皂皮酸或丝石竹皂苷元的C23位的醛基团通过以下已经被衍生化；-还原成醇；-转化成腙键，优选通过与酰肼反应；ii.当A1代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S1)并且A1包含葡萄糖醛酸部分或由葡萄糖醛酸部分组成时，A1的葡萄糖醛酸部分的羧基基团已经通过转化成酰胺键，优选通过与胺反应而衍生化；和iii.当A2代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S2)并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的一个或多个，优选全部乙酰氧基基团已经通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物对应于由分子1表示的皂苷，其中存在以下衍生化中的至少一种，优选存在以下衍生化中的一种或两种，更优选一种：i.皂皮酸或丝石竹皂苷元的C23位的醛基团通过以下已经被衍生化；-还原成醇；-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键，由此提供皂苷-Ald-EMCH，例如SO1861-Ald-EMCH或QS-21-Ald-EMCH，其中EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生；ii.当A1代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S1)并且A1包含葡萄糖醛酸部分或由葡萄糖醛酸部分组成时，A1的葡萄糖醛酸部分的羧基基团已经通过与2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化成酰胺键而被衍生化，由此提供皂苷-Glu-AMPD如QS-21-Glu-AMPD或SO1861-Glu-AMPD或皂苷-Glu-AEM如QS-21-Glu-AEM或SO1861-Glu-AEM；和iii.当A2代表如上文对于本发明的某些实施方案所定义的糖链(列表S2)并且A2包含至少一个乙酰氧基基团时，A2的一个糖部分或两个或更多个糖部分的一个或多个，优选全部乙酰氧基基团已经通过脱乙酰化转化为羟基基团(HO-)而衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中A1是Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA和/或A2是Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc，优选地，由分子1表示的皂苷是3-O-β-D-吡喃半乳糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖醛基团皂皮酸28-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-β-D-吡喃木糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)-4OAc-β-D-吡喃喹诺基-(1→4)]-β-D-吡喃岩藻糖苷，更优选SO1861、GE1741、SA1641和/或QS-21，最优选SO1861。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物选自以下的衍生物：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、Quillajasaponin、Saponinumalbum、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、以上的立体异构体以及以上的组合，优选地，所述皂苷衍生物选自SO1861衍生物、GE1741衍生物、SA1641衍生物、QS-21衍生物及以上的组合，更优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS21衍生物，最优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物是包含单一衍生化的SO1861衍生物，其中所述单一衍生化是SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团的转化，例如通过将1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)结合至SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团(参见图59)，或通过将(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯(BOP)结合至SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，或其中所述皂苷衍生物是由分子2表示的SO1861衍生物，其表示在皂皮酸苷元核心结构的指示位置C23处包含醛基团的SO1861衍生物，所述醛基团已经通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化：或者其中所述皂苷衍生物是由分子3表示的SO1861衍生物，其表示在皂皮酸苷元核心结构的指示位置C23处包含醛基团的SO1861衍生物，所述醛基团已经通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化，其中所述EMCH的马来酰亚胺基团用巯基乙醇衍生化，由此形成硫醚键：由分子2表示的皂苷适合用作与包含游离巯基基团的另一分子进行缀合反应的前体。显示为分子2的皂苷衍生物的马来酰亚胺基团可以与这样的游离巯基基团形成硫醚键。例如，分子2的皂苷衍生物可以共价偶联到包含游离巯基基团的肽或蛋白质，例如具有游离巯基基团的半胱氨酸。这样的蛋白质是例如抗体或其结合片段或结合结构域，如Fab、scFv、单结构域抗体，如VHH，例如骆驼科动物VH。分子2的皂苷衍生物在与例如包含游离巯基基团的抗体的偶联反应中的应用，提供了当抗体(或其结合结构域或片段)是特异性结合靶细胞表面分子(例如存在于肿瘤细胞上的受体)的抗体时，用于将皂苷靶向递送到细胞中和细胞内的缀合物。优选地，皂苷衍生物与能够结合肿瘤细胞特异性表面分子(例如受体，例如HER2、EGFR、CD71)的抗体或VHH偶联。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，条件是所述皂苷衍生物不是包含单一衍生化的SO1861衍生物，其中所述单一衍生化是通过1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)与SO1861的葡萄糖醛酸的羧基基团的反应转化SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，或其中所述皂苷衍生物是由分子2表示的SO1861衍生物，其表示在皂皮酸苷元核心结构的指示位置C23处包含醛基团的SO1861衍生物，所述醛基团已经通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应而转化成腙键：一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中i.所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中所述苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：-还原成醇；-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键，其中EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；ii.所述第一糖链包含羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团，所述羧基基团通过与2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应而转化成酰胺键而衍生化；iii.所述第二糖链包含乙酰氧基(Me(CO)O-)，其已经通过脱乙酰化转化成羟基基团(HO-)而衍生化；或iv.所述皂苷衍生物包含两个或三个衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选两个衍生化i.、ii.和iii.的任何组合；优选地，所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中所述苷元核心结构包含已经通过与EMCH反应转化成腙键而被衍生化的醛基团，其中EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而被衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中所述苷元核心结构包含醛基团，并且其中所述第一糖链包含羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团，其已经通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化成酰胺键而被衍生化。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，条件是当苷元核心结构中的醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化并且皂苷是SO1861时，葡萄糖醛酸和乙酰氧基基团(Me(CO)O-)中的至少一个也被衍生化，并且条件是当皂苷是SO1861并且SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团通过1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)与SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团的反应衍生化时，醛基团和乙酰氧基基团(Me(CO)O-)中的至少一个也被修饰。一实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，条件是当皂苷衍生物的苷元核心结构中的醛基团通过与EMCH反应而被衍生化并且皂苷是SO1861时，葡萄糖醛酸和乙酰氧基(Me(CO)O-)中的至少一个也被衍生化，并且条件是当皂苷是SO1861并且SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团通过结合HATU而被衍生化时，醛基团和乙酰氧基(Me(CO)O-)中的至少一个也被衍生化。本文中称为实施方案D1的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是SA1641，其中所述苷元核心结构包含醛基团，所述醛基团已经通过与式(A1)的化合物反应转化(例如通过还原胺化)成胺而被衍生化：也就是说，本文中称为实施方案D1的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于其不是SA1641和式(A1)的化合物之间的反应的结果。因此，实施方案D1是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于其不是通过至少一个SA1641分子还原胺化成式(A1)化合物的偶联的结果。本文中称为实施方案D2的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中所述苷元核心结构包含醛基团，所述醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化，其中所述EMCH的马来酰亚胺基团任选地通与硫醇形成硫醚键而被衍生化，并且其中在皂苷上不存在其它衍生化，优选地，其特征在于皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中苷元核心结构包含通过与N-ε-马来酰亚胺基己酰肼(EMCH)反应转化成腙键而衍生化的醛基团，其中所述EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与硫醇形成硫醚键而被衍生化。本文中称为实施方案D3的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中所述苷元核心结构包含醛基团，所述醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化，其中所述EMCH的马来酰亚胺基团通过与硫醇形成硫醚键而被衍生化，所述硫醇选自以下各项中的一个，优选全部：·巯基乙醇，·具有乙二胺核心的聚(酰氨基胺)树状聚体，所述乙二胺核心已经用至少2-亚氨基噻吩衍生化，·-花色素苷-3和具有乙二胺核心的聚(酰胺基胺)树状聚体的缀合物，所述乙二胺核心进一步用至少2-亚氨基噻吩衍生化，·G4树枝状分子(dendron)，其已经用至少2-亚氨基噻吩衍生化，·花色素苷-5和G4树枝状分子的缀合物，所述G4树枝状分子进一步用至少2-亚氨基噻吩衍生化，·牛血清白蛋白(BSA)，和·具有序列SESDDAMFCDAMDESDSK[SEQIDNO：1]的肽。并且其中在皂苷上不存在其它衍生化。如本领域技术人员将理解的，表述“G4树枝状分子”应被解释为意指式(A2)的化合物：本文中称为实施方案D4的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中羧基基团通过与花色素苷-3和具有乙二胺核心的聚(酰氨基胺)树状聚体的任选进一步衍生化的缀合物反应转化成酰胺而被衍生化。并且其中在皂苷上不存在其它衍生化，优选地，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中羧基基团通过与花色素苷-3和具有乙二胺核新的聚(酰氨基胺)树状聚体的任选进一步衍生化的缀合物反应转化成酰胺而被衍生化。本文中称为实施方案D5的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中所述苷元核心结构包含醛基团，所述醛基团已经通过与花色素苷-3和具有乙二胺核心的聚(酰氨基胺)树状聚体的缀合物反应转化(例如通过还原胺化)成胺而被衍生化，并且其中在皂苷上不存在其它衍生化，优选地，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中所述苷元核心结构包含醛基团，所述醛基团已经通过与花色素苷-3和具有乙二胺核心的聚(酰氨基胺)树状聚体的缀合物反应转化(例如通过还原胺化)成胺而被衍生化。本文中称为实施方案D6的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不包含毒素，微小RNA或编码蛋白质的多核苷酸，优选地其特征在于，所述皂苷衍生物不包含药物活性物质，例如毒素，药物，多肽和/或多核苷酸，更优选地其特征在于所述皂苷衍生物不包含效应物分子。本文中称为实施方案D7的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不包含选自以下的聚合结构或寡聚结构·聚(胺)或寡聚(胺)，例如聚乙烯亚胺和聚(酰胺基胺)，·聚乙二醇，·聚(酯)或寡聚(酯)，例如聚(丙交酯)，·聚(内酰胺)，·聚交酯-共-乙交酯共聚物，·聚糖或寡糖，例如环糊精和聚右旋糖，·聚(氨基酸)或寡(氨基酸)，例如蛋白质和肽，以及·核酸及其类似物，例如DNA、RNA、LNA(锁核酸)和PNA(肽核酸)；优选地，其特征在于皂苷衍生物不包含聚合结构或寡聚结构，所述聚合结构或寡聚结构是结构上有序的形态，例如聚合物，寡聚物，树状聚体，树枝状聚合物或树枝状寡聚物，或者它是组装的聚合结构，例如水凝胶，微凝胶，纳米凝胶，稳定的聚合胶束或脂质体，更优选地，其特征在于所述皂苷衍生物不包含聚合结构或寡聚结构。本文中称为实施方案D8的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不包含主要或完全由至少2个相同或相似的键合在一起的单元构成的分子结构。本文中称为实施方案D9的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是式(A3)的化合物，其是SO1861和N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸酯N-氧化物(HATU)的反应产物：优选地，其特征在于所述皂苷衍生物不是活化酯。参见图59。本文中称为实施方案D10的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中羧基基团通过转化成酰胺键或酯键而被衍生化，并且其中在所述皂苷上不存在其它衍生化，优选地，其特征在于所述皂苷衍生物不是皂苷，特别是SO1861，其中羧基基团通过转化成酰胺键或酯键而被衍生化。本文中称为实施方案D11的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物不包含石竹素部分。本文中称为实施方案D12的优选实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物包含单一皂苷部分。本文中称为实施方案D13的优选实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生物具有小于2500g/mol，优选小于2300g/mol，更优选小于2150g/mol的分子量。本文中称为实施方案D14的优选实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其特征在于所述皂苷衍生化的分子量小于400g/mol，优选小于300g/mol，更优选小于270g/mol。皂苷衍生化的分子量对应于不包括苷元核心以及一个(对于单糖链苷元)或两个(对于双糖链苷元)糖基(糖)链的皂苷衍生物的分子量。本领域技术人员将理解，在皂苷衍生物具有比其相应的未衍生化的皂苷更低的分子量的情况下(例如，对于通过脱乙酰化衍生化的SO1861的SO1861-Ac-OH通常就是这样)，皂苷衍生化不会带来分子量的任何增加，因此符合皂苷衍生化具有实施方案D14的小于400g/mol，优选小于300g/mol，更优选小于270g/mol的分子量的要求。如本领域技术人员将理解的，实施方案D1-D14可以彼此组合，以及与本申请中描述的其它实施方案组合。例如，在本发明的实施方案中，提供了实施方案D1-D14的以下组合：·D12以及D1-D11、D13中的一个或多个；·D13以及D1-D12中的一个或多个；·D12、D13以及D1-D11中的一个或多个；·D1、D2、D10和D12；·D1、D3、D7、D9和优选D13；或·D3、D9、D12和D13。本领域技术人员将理解，实施方案D1-D14的这些组合可以再次与例如根据本发明的其它实施方案组合，并且优选地与实施方案D14组合。特别优选的实施方案对应于实施方案D3、D9、D12以及D13和D14之一或二者的组合。换句话说，特别优选的实施方案是根据本发明的皂苷衍生物，其中所述皂苷衍生物包含单一皂苷部分，其中所述皂苷衍生物的分子量小于2500g/mol，优选小于2300g/mol，更优选小于2150g/mol，并且其中所述皂苷衍生物·不是皂苷，特别是SO1861，其中苷元核心结构包含醛基团，所述醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化，其中EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而被衍生化，并且其中优选地在皂苷上不存在其它衍生化；和·不是活化酯，其是SO1861和N-[(二甲基氨基)-1H-1，2，3-三唑并-[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸酯N-氧化物(HATU)的反应产物。本发明的第二方面涉及第一药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物和任选的药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。一实施方案是根据本发明的第一药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物，优选药学上可接受的稀释剂，并且进一步包含：·药学上可接受的盐，优选药学上可接受的无机盐，例如铵，钙，铜，铁，镁，锰，钾，钠，锶或锌盐，优选NaCl；和/或·药学上可接受的缓冲体系，例如含有磷酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，碳酸盐，组氨酸，乳酸盐，氨丁三醇，葡糖酸盐，天冬氨酸盐，谷氨酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苹果酸盐，延胡索酸盐，乙酸盐和/或酮戊二酸盐的缓冲体系。一实施方案是根据本发明的第一药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物和药学上可接受的稀释剂，优选水，其中所述组合物在25℃的温度下是液体并且具有在2-11范围内，优选在4-9范围内，更优选在6-8范围内的pH。一实施方案是根据本发明的第一药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物和药学上可接受的稀释剂，优选水，其中所述组合物在25℃的温度下是液体，并且其中所述皂苷衍生物的浓度在10-12至1mol/l的范围内，优选在10-9至0.1mol/l的范围内，更优选在10-6至0.1mol/l的范围内。通常，这样的第一药物组合物适合与例如ADC或AOC组合使用。例如，在施用ADC或AOC之前，与ADC或AOC一起，或在向需要这种ADC或AOC疗法的患者施用ADC或AOC之后(不久)，向需要施用ADC或AOC的患者施用第一药物组合物。例如，将第一药物组合物与包含ADC或AOC的药物组合物混合，并将合适剂量的所得混合物施用于需要ADC或AOC疗法的患者。根据本发明，当皂苷衍生物和ADC或AOC共同定位在靶细胞如肿瘤细胞内时，第一药物组合物包含的皂苷衍生物增强了这种ADC或AOC包含的效应物分子的功效和效力。与在不存在皂苷衍生物的情况下使相同的细胞与相同剂量的ADC或AOC接触相比，在皂苷衍生物的影响下，效应物分子以更高的程度释放到靶细胞的胞质溶胶中。因此，当效应物分子与第一药物组合物的皂苷衍生物一起共定位于靶细胞内时，与在递送包含ADC或AOC的效应物分子的细胞内不存在皂苷衍生物的情况下实现相同功效所需的剂量相比，在较低的ADC或AOC剂量下可获得类似的功效。一实施方案是本发明的第一药物组合物，其中所述皂苷衍生物是由分子2表示的皂苷衍生物：或SO1861衍生物，其包含单一衍生化，其中所述单一衍生化是通过1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)与SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团反应转化SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，或者所述皂苷衍生物是由分子3表示的皂苷衍生物：本发明的第三方面涉及药物组合，其包含：ο本发明的第一药物组合物；和ο第二药物组合物，其包含抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-寡核苷酸缀合物或受体-配体-寡核苷酸缀合物中的任何一种或多种，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。本发明的第四方面涉及第三药物组合物，其包含本发明的皂苷衍生物并且还包含以下的任何一种或多种：抗体-毒素缀合物、受体-配体-毒素缀合物、抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-核酸缀合物或受体-配体-核酸缀合物，并且任选地包含药学上可接受的赋形剂和/或稀释剂。一实施方案是本发明的药物组合或本发明的第三药物组合物，其中所述第二药物组合物或所述第三药物组合物包含抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-寡核苷酸缀合物或受体-配体-寡核苷酸缀合物中的任何一种或多种，其中所述药物是例如毒素，例如皂草素和石竹素，并且其中所述寡核苷酸是例如siRNA或BNA，其例如用于载脂蛋白B或HSP27的基因沉默。一实施方案是本发明的药物组合或本发明的第三药物组合物，其中所述皂苷衍生物是选自以下的衍生物的皂苷衍生物：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、Quillajasaponin、Saponinumalbum、QS-18、Quil-A、Gypl、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、以上的立体异构体以及以上的组合，优选地，所述皂苷衍生物选自SO1861衍生物、GE1741衍生物、SA1641衍生物、QS-21衍生物及以上的组合，更优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS21衍生物，最优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物，甚至更优选由分子2或分子3表示的皂苷衍生物。一实施方案是根据本发明的第三药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物，优选药学上可接受的稀释剂，并且进一步包含：·药学上可接受的盐，优选药学上可接受的无机盐，例如铵，钙，铜，铁，镁，锰，钾，钠，锶或锌盐，优选NaCl；和/或·药学上可接受的缓冲体系，例如含有磷酸盐，硼酸盐，柠檬酸盐，碳酸盐，组氨酸，乳酸盐，氨丁三醇，葡糖酸盐，天冬氨酸盐，谷氨酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苹果酸盐，延胡索酸盐，乙酸盐和/或酮戊二酸盐的缓冲体系。一实施方案是根据本发明的第三药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物和药学上可接受的稀释剂，优选水，其中所述组合物在25℃的温度下是液体并且具有在2-11范围内，优选在4-9范围内，更优选在6-8范围内的pH。一实施方案是根据本发明的第三药物组合物，其包含根据本发明的皂苷衍生物和药学上可接受的稀释剂，优选水，其中所述组合物在25℃的温度下是液体，并且其中所述皂苷衍生物的浓度在10-12至1mol/l的范围内，优选在10-9至0.1mol/l的范围内，更优选在10-6至0.1mol/l的范围内。本发明的第五方面涉及用作药物的本发明的第一药物组合物、本发明的药物组合或本发明的第三药物组合物。在优选的实施方案中，提供了用作药物的本发明的第一药物组合物，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成，提供了用作药物的本发明的药物组合，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成，或提供了用作药物的本发明的第三药物组合物，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成。在本发明的另一方面，提供了用作药物的本文所述的皂苷衍生物，优选SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU。本发明的第六方面涉及本发明的第一药物组合物、本发明的药物组合或本发明的第三药物组合物，其用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关肝病、急性肝卟啉症、甲状腺素介导的淀粉样变性或自身免疫性疾病。在优选的实施方案中，提供了本发明的第一药物组合物，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成，提供了本发明的药物组合，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成，或提供了本发明的第三药物组合物，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成，其用于治疗或预防癌症、感染性疾病、病毒感染、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症、血友病A、血友病B、α-1抗胰蛋白酶相关肝病、急性肝卟啉症、甲状腺素介导的淀粉样变性或自身免疫性疾病。本发明的第七方面涉及用于将分子从细胞外部转移到所述细胞内部，优选转移到所述细胞的胞质溶胶中的体外或离体方法，所述方法包括以下步骤：a)提供细胞；b)提供用于从细胞外部转移到步骤a)中提供的细胞中的分子；c)提供根据本发明的皂苷衍生物；d)使步骤a)的细胞在体外或离体与步骤b)的分子和步骤c)的皂苷衍生物接触，从而建立所述分子从细胞外部进入所述细胞中的转移。一实施方案是本发明的方法，其中所述细胞是人细胞，例如T细胞、NK细胞、肿瘤细胞，和/或其中步骤b)的分子是以下中的任何一种：抗体-药物缀合物、受体-配体-药物缀合物、抗体-寡核苷酸缀合物或受体-配体-寡核苷酸缀合物，其中所述药物是例如毒素，并且其中所述寡核苷酸是例如siRNA或BNA，和/或其中所述皂苷衍生物是选自以下的衍生物：SO1861、SA1657、GE1741、SA1641、QS-21、QS-21A、QS-21A-api、QS-21A-xyl、QS-21B、QS-21B-api、QS-21B-xyl、QS-7-xyl、QS-7-api、QS-17-api、QS-17-xyl、QS1861、QS1862、Quillajasaponin、Saponinumalbum、QS-18、Quil-A、Gyp1、丝石竹皂苷A、AG1、AG2、SO1542、SO1584、SO1658、SO1674、SO1832、SO1862、SO1904、以上的立体异构体以及以上的组合，优选地，所述皂苷衍生物选自SO1861衍生物、GE1741衍生物、SA1641衍生物、QS-21衍生物及以上的组合，更优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物或QS21衍生物，最优选地，所述皂苷衍生物是SO1861衍生物；或者其中所述皂苷衍生物是包含单一衍生化的SO1861衍生物，其中所述单一衍生化是通过与胺反应，例如通过将1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)结合至SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，或通过将(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯(BOP)结合至SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，来将SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团转化为酰胺键，或其中所述皂苷衍生物是由分子2表示的SO1861衍生物，其表示在皂皮酸苷元核心结构的指示位置C23处包含醛基团的SO1861衍生物，所述醛基团已经通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化：或者其中所述皂苷衍生物是由分子3表示的SO1861衍生物，其表示在皂皮酸苷元核心结构的指示位置C23处包含醛基团的SO1861衍生物，所述醛基团已经通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化，其中所述EMCH的马来酰亚胺基团用巯基乙醇衍生化，从而形成硫醚键：；或者所述皂苷衍生物是这样的衍生物，条件是所述皂苷衍生物不是包含单一衍生化的SO1861衍生物，其中所述单一衍生化是通过1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)与SO1861的葡萄糖醛酸的羧基基团的反应转化SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团，或其中所述皂苷衍生物是由分子2表示的SO1861衍生物，其表示在皂皮酸苷元核心结构的指示位置C23处包含醛基团的SO1861衍生物，所述醛基团已经通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应而转化成腙键：；或其中所述皂苷衍生物是衍生物，其中i.所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中所述苷元核心结构包含已通过以下衍生化的醛基团：-还原成醇；-通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键，其中EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；-通过与N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼(BMPH)反应转化成腙键，其中BMPH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；或-通过与N-[κ-马来酰亚胺基十一酸]酰肼(KMUH)反应转化成腙键，其中KMUH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而衍生化；ii.所述第一糖链包含羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团，所述羧基基团通过与2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇(AMPD)或N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应而转化成酰胺键而衍生化；iii.所述第二糖链包含乙酰氧基(Me(CO)O-)，其已经通过脱乙酰化转化成羟基基团(HO-)而衍生化；或iv.所述皂苷衍生物包含两种或三种衍生化i.、ii.和iii.的任何组合，优选两种衍生化i.、ii.和iii.的任何组合；优选地，所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中所述苷元核心结构包含已经通过与EMCH反应转化成腙键而被衍生化的醛基团，其中EMCH的马来酰亚胺基团任选地通过与巯基乙醇形成硫醚键而被衍生化；或者其中所述皂苷衍生物包含苷元核心结构，其中所述苷元核心结构包含醛基团，并且其中所述第一糖链包含羧基基团，优选葡萄糖醛酸部分的羧基基团，所述羧基基团已经通过与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺(AEM)反应转化成酰胺键而被衍生化；或者其中所述皂苷衍生物是这样的衍生物，条件是当苷元核心结构中的醛基团通过与N-ε-马来酰亚胺基己酸酰肼(EMCH)反应转化成腙键而被衍生化并且所述皂苷是SO1861时，所述葡萄糖醛酸和所述乙酰氧基(Me(CO)O-)中的至少一个也被衍生化，并且条件是当皂苷是SO1861并且SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团通过1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)与SO1861的葡萄糖醛酸的羧基基团的反应而被衍生化时，醛基团和乙酰氧基(Me(CO)O-)中的至少一个也被修饰；或者其中所述皂苷是这样的衍生物，条件是当皂苷衍生物的苷元核心结构中的醛基团通过与EMCH反应而被衍生化并且皂苷是SO1861时，葡萄糖醛酸和乙酰氧基基团(Me(CO)O-)中的至少一个也被衍生化，并且条件是当皂苷是SO1861并且SO1861的葡萄糖醛酸部分的羧基基团是通过结合的HATU而被衍生化时，醛基团和乙酰氧基基团(Me(CO)O-)中的至少一个也被衍生化。在具体的实施方案中，提供了本文所述的用于将分子从细胞外部转移到所述细胞内部，优选转移到所述细胞的胞质溶胶中的体外或离体方法，其中所述皂苷衍生物包含SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇、SO1861-L-N3或SO1861-Glu-HATU，优选由其组成。虽然已经根据几个实施方案描述了本发明，但是可以想到，在阅读了说明书和研究了附图之后，本发明的替换，修改，置换和等同物对本领域技术人员将变得显而易见。本发明不以任何方式限于所说明的实施方案。可以在不脱离由所附权利要求限定的范围的情况下进行改变。上面已经参考多个示例性实施方案描述了本发明。修改是可能的，并且包括在所附权利要求所限定的保护范围内。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为以任何方式限制本发明。实施例和示例性实施方案材料：SO1861、SO1832、SO1862(异构体)和SO1904通过AnalyticonDiscoveryGmbH从得自肥皂草(SaponariaofficinalisL.)QS21(纯的)、QS18(级分)、QS17(级分)、QS7(级分)的粗植物提取物中分离和纯化，QS21(级分)购自DesertKingInternational，SanDiego。曲妥珠单抗(Tras，Roche)、西妥昔单抗(Cet，MerckKGaA)购自药房。EGF石竹素根据标准程序由大肠杆菌产生。西妥昔单抗-皂草素缀合物由AdvancedTargetingSystems(SanDiego，CA)产生和购买。三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP，98％，Sigma-Aldrich)、5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，Ellman的试剂，99％，Sigma-Aldrich)，ZebaTMSpin脱盐柱(2mL，Thermo-Fisher)、NuPAGETM4-12％Bis-Tris蛋白凝胶(Thermo-Fisher)、NuPAGETMMESSDS运行缓冲液(Thermo-Fisher)、NovexTMSharp预染色蛋白标准品(Thermo-Fisher)、PageBlueTM蛋白染色溶液(Thermo-Fischer)、PierceTMBCA蛋白测定试剂盒(Thermo-Fisher)、N-乙基马来酰亚胺(NEM，98％，Sigma-Aldrich)、1，4-二硫苏糖醇(DTT，98％，Sigma-Aldrich)、SephadexG25(GEHealthcare)、SephadexG50M(GEHealthcare)、Superdex200P(GEHealthcare)、异丙醇(IPA，99.6％，VWR)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris，99％，Sigma-Aldrich)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris.HCl，Sigma-Aldrich)、L-组氨酸(99％，Sigma-Aldrich)、D-( )-海藻糖脱水物(99％，Sigma-Aldrich)、聚乙二醇脱水山梨醇单月桂酸酯(TWEEN20，Sigma-Aldrich)、杜伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Thermo-Fisher)、盐酸胍(99％，Sigma-Aldrich)、乙二胺四乙酸二钠二水合物(EDTA-Na2，99％，Sigma-Aldrich)、无菌过滤器0.2μm和0.45μm(Sartorius)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC，·Thermo-Fisher)、VivaspinT4和T15浓缩器(Sartorius)、Superdex200PG(GEHealthcare)、四(乙二醇)琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(PEG4-SPDP，Thermo-Fisher)、[O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N，N-四甲基脲鎓-六氟磷酸酯](HATU，97％，Sigma-Aldrich)、二甲基亚砜(DMSO，99％，Sigma-Aldrich)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(AEM，98％，Sigma-Aldrich)、L-半胱氨酸(98.5％，Sigma-Aldrich)、去离子水(DI)新鲜取自超纯实验室水系统(MilliQ，Merck)、镍-次氮基三乙酸琼脂糖(Ni-NTA琼脂糖，Protino)、甘氨酸(99.5％，VWR)、5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(Ellman的试剂，DTNB，98％，Sigma-Aldrich)、S-乙酰基巯基琥珀酸酐荧光素(SAMSA试剂，Invitrogen)、碳酸氢钠(99.7％，Sigma-Aldrich)、碳酸钠(99.9％，Sigma-Aldrich)、具有SephadexG-25树脂的PDMiniTrap脱盐柱(GEHealthcare)、PD10G25脱盐柱(GEHealthcare)、0.5、2、5和10mL的ZebaSpin脱盐柱(Thermo-Fisher)、Vivaspin离心过滤器T410kDaMWCO，T4100kDaMWCO和T15(Sartorius)、Bioseps3000aSEC柱(Phenomenex)、Vivacell超滤单元10和30kDaMWCO(Sartorius)、Nalgene快速流动过滤器(Thermo-Fisher)。缩略词AEM：N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐AMPD：2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇BOP：(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸酯DIPEA：N，N-二异丙基乙胺DMF：N，N-二甲基甲酰胺EMCH.TFA：N-(ε-马来酰亚胺基己酸)酰肼，三氟乙酸盐HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯Min：分钟NMM：4-甲基吗啉r.t.：保留时间TCEP：三(2-羧乙基)膦盐酸盐Temp：温度TFA：三氟乙酸分析方法LC-MS方法1设备：WatersIClass；Bin.Pump：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2ESI，质量范围取决于产物neg或neg/pos的分子量在1500-2400或2000-3000范围内；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：AcquityC18，50×2.1mm，1.7μmTemp：60℃，流速：0.6mL/min，梯度取决于产物的极性：At0＝2％A，t5.0min＝50％A，t6.0min＝98％ABt0＝2％A，t5.0min＝98％A，t6.0min＝98％A后置时间：1.0min，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：10mM碳酸氢铵的水溶液(pH＝9.5)。LC-MS方法22设备：WatersiClass；Bin.Pump：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2ESI，质量范围取决于产物的分子量：pos/neg100-800或neg2000-3000；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：WatersXSelectTMCSHC18，50×2.1mm，2.5μm，Temp：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3min，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液(pH＝9.5)。LC-MS方法3设备：WatersiClass；Bin.Pump：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2ESI，质量范围取决于产物pos/neg的分子量105-800、500-1200或1500-2500；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃；柱：WatersXSelectTMCSHC18，50×2.1mm，2.5μm，Temp：40℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3min，洗脱液A：0.1％甲酸的乙腈溶液，洗脱液B：0.1％甲酸的水溶液。LC-MS方法4设备：WatersiClass；Bin.Pump：UPIBSM，SM：具有SO的UPISMFTN；UPCMA，PDA：UPPDATC，210-320nm，SQD：ACQ-SQD2ESI，质量范围取决于产物的分子量：POS/neg100-800或neg2000-3000；ELSD：气压40psi，漂移管温度：50℃柱：WatersAcquityShieldRP18，50×2.1mm，1.7μm，Temp：25℃，流速：0.5mL/min，梯度：t0min＝5％A，t2.0min＝98％A，t2.7min＝98％A，后置时间：0.3min，洗脱液A：乙腈，洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液(pH＝9.5)。制备方法制备型MP-LC方法1，仪器类型：RevelerisTM制备MPLC；柱：WatersXSelectTMCSHC18(145×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱液A：10mM碳酸氢铵水溶液，pH＝9.0)；洗脱液B：99％乙腈 1％10mM碳酸氢铵水溶液；梯度：At0min＝5％B，tlmin＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％BBt0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝20％B，t17min＝60％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B；检测UV：210、235、254nm和ELSD。制备型MP-LC方法2仪器类型：RevelerisTM制备MPLC；柱：PhenomenexLUNAC18(3)(150×25mm，10μm)；流速：40mL/min；柱温：室温；洗脱液A：0.1％(v/v)甲酸水溶液，洗脱液B：0.1％(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度：At0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝20％B，t17min＝60％B，t18min＝100％B.t23min＝100％BBt0min＝2％B，t1min＝2％B，t2min＝2％B，t17min＝30％B，t18min＝100％B，t23min＝100％BCt0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝10％B，t17min＝50％B，t18min＝100％B，t23min＝100％BDt0min＝5％B，t1min＝5％B，t2min＝5％B，t17min＝40％B，t18min＝100％B，t23min＝100％B；检测UV：210、235、254nm和ELSD。制备型LC-MS方法3MS仪器类型：AgilentTechnologiesG6130BQuadrupole；HPLC仪器类型：AgilentTechnologies1290制备型LC；柱：WatersXSelectTMCSH(C18，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱液A：100％乙腈；洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液pH＝9.0；梯度：At0＝20％A，t2.5min＝20％A，t11min＝60％A，t13min＝100％A，t17min＝100％ABt0＝5％A，t2.5min＝5％A，t11min＝40％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESIpos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集。制备型LC-MS方法4MS仪器类型：AgilentTechnologiesG6130BQuadrupole；HPLC仪器类型：AgilentTechnologies1290制备型LC；柱：WatersXBridgeProtein(C4，150×19mm，10μm)；流速：25ml/min；柱温：室温；洗脱液A：100％乙腈；洗脱液B：10mM碳酸氢铵水溶液pH＝9.0；梯度：At0＝2％A，t2.5min＝2％A，t11min＝30％A，t13min＝100％A，t17min＝100％ABt0＝10％A，t2.5min＝10％A，t11min＝50％A，t13min＝100％A，t17min＝100％ACt0＝5％A，t2.5min＝5％A，t11min＝40％A，t13min＝100％A，t17min＝100％A；检测：DAD(210nm)；检测：MSD(ESIpos/neg)质量范围：100-800；基于DAD的级分收集快速层析法GraceRevelerisC-815Flash；溶剂递送系统：3柱塞泵，其具有自动引发，4个独立通道，在单次运行中具有多达4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管线；最大泵流速250mL/min；最大压力50bar(725psi)；检测：UV200-400nm，组合多达4个UV信号和扫描整个UV范围，ELSD；柱尺寸：在仪器上4-330g，luer类型，750g，至多3000g，具有任选的保持器。实施例1：皂苷衍生物的合成基于天然存在的SO1861合成以下修饰的SO1861皂苷，即皂苷衍生物，如表A2中所概述：参考以下对SO1861衍生物的合成的描述，参考表A2和附图。SO1861-Ald-EMCH(分子2)的合成；参见图60，图61A将来自肥皂草的SO1861(59mg，31.7μmol)和EMCH(301mg，888μmol)置于带有搅拌器的圆烧瓶中，并溶解在13mL甲醇中。将TFA(400μL，约)添加到溶液中，并将反应混合物在RCTB磁力搅拌器(IKALabortechnik)上以800rpm和室温搅拌3h。搅拌3h后，将混合物用MilliQ水或PBS稀释，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por7)对MilliQ水或PBS彻底透析24h。透析后，将溶液冻干，得到白色粉末。产量62.4mg(95％)。干燥的等分试样进一步被用于通过1HNMR和MALDI-TOF-MS进行表征。1HNMR(400MHz，甲醇-D4)(SO1861)：δ＝0.50-5.50(m，皂苷三萜系化合物和糖骨架质子)，9.43(1H，s，皂苷的醛质子，Ha)。1HNMR(400MHz，甲醇-D4)(SO1861-AlD-EMCH，PBS处理)：δ＝0.50-5.50(m，皂苷三萜系化合物和糖骨架质子)，6.79(2H，s，马来酰亚胺质子，Hc)，7.62-7.68(1H，m，腙质子，Hb)。MALDI-TOF-MS(RP模式)：m/z2124Da([M K] ，皂苷-EMCH)，m/z2109Da([M K] 、SO1861-AlD-EMCH)，m/z2094Da([M Na] ，SO1861-Ald-EMCH)。参见图61A。MALDI-TOF-MS(RN模式)：m/z2275Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2244Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)，2222Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)、2178Da([M-H]-、皂苷-EMCH缀合物)、2144Da([MH]-、皂苷-EMCH缀合物)、2122Da([MH]-、皂苷-EMCH缀合物)、2092Da([M-H]-，皂苷-EMCH缀合物)、2070Da([M-H]-，SO1861-A1D-EMCH)、2038Da([M-H]-，SO1832-EMCH)、1936Da([M-H]-，SO1730-EMCH)、1861Da([M-H]-，SO1861)。SO1861-ALD-EMCH由分子2(化学式：C93H143N3O48，精确质量：2069.88)表示：为了测试腙键的pH依赖性水解，将SO1861-Ald-EMCH溶解在pH为3的HCl溶液中，并在两个不同的时间点记录MALDI-TOF-MS光谱(图62)。如图62A和62B所示，在m/z2070Da处对应于SO1861-Ald-EMCH的峰的明显降低趋势在图61B中可见。由于在水解过程中产生SO1861，因此记录了在m/z1861Da处峰的增加，伴随在m/z2070Da处的降低趋势。这些结果显示，腙键对水解有响应，并且即使其连接在SO1861上也会被裂解。SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇(分子3；SO1861-Ald-EMCH封闭的)的合成；参见图60和图61B当在6.5-7.5的pH范围内进行时，SO1861-Ald-EMCH的马来酰亚胺基团与硫醇进行快速且特异的迈克尔加成反应。向SO1861-Ald-EMCH(0.1mg，48nmol)中加入200μL巯基乙醇(18mg，230μmol)，并将溶液在ThermoMixerC(Eppendorf)上以800rpm和室温下摇动1h。摇动1h后，用甲醇稀释溶液，并使用MWCO为1kDa的再生纤维素膜管(Spectra/Por7)对甲醇彻底透析4h。透析后，提供SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇(分子3)，取出等分试样并通过MALDI-TOF-MS分析。MALDI-TOF-MS(RP模式)：m/z2193Da([M K] ，SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇)，m/z2185Da([M K] ，SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇)，m/z2170Da([M Na] ，SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇)。参见图61B。SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇由分子3(化学式：C95H149N3O49S，精确质量：2147.90)表示：SO1861-Glu-AMPD(分子3A)的合成；参见图1将SO1861(28.8mg，0.015mmol)、AMPD(8.11mg，0.077mmol)和HATU(17.6mg，0.046mmol)溶解于DMF(1.00mL)和NMM(8.48μL，0.077mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜。接着，通过使用制备型LC-MS3再纯化产物。立即将对应于产物的级分汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(20.2mg，67％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝93％(化学式：C87H139NO47，精确质量：1949,85。LRMS(m/z)：1949[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.451BSO1861-Ald-OH(分子6)的合成；参见图2将SO1861(20.0mg，10.7μmol)溶解于甲醇(1.00mL)中。接下来，加入硼氢化钠(4.06mg，0.107mmol；NaBH4)。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物用水(0.50mL)稀释，并进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(15.9mg，79％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为97％(化学式：C83H132O46，精确质量：1864，80)。LRMS(m/z)：1865[M-1]1-(参见图15和16)LC-MSr.t.(min)：1.951BSO1861-Ac-OH(分子8)的合成；参见图3向SO1861(9.30mg，4.99μmol)中加入氢氧化钠(2.00mg，0.050mmol)在水(0.25mL)和甲醇(0.25mL)中的溶液。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(8.86mg，97％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝97％(化学式：C81H128O45，精确质量：1820,77)。LRMS(m/z)：1820[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：1.831BSO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(分子9)的合成；参见图4将SO1861-Ald-OH(9.37mg，5.02μmol)、AMPD(2.64mg，0.025mmol)和BOP(6.66mg，0.015mmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(5.52μL，0.050mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(6.32mg，64％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝95％(化学式：C87H141NO47，精确质量：1951,87。LRMS(m/z)：1952[M-1]1-(参见图17)LC-MSr.t.(min)：2.451BSO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(分子10)的合成；参见图5向SO1861-Ald-OH(26.8mg，0.014mmol)中加入氢氧化钠(5.74mg，0.144mmol)在水(0.50mL)和甲醇(0.50mL)中的溶液。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(24.2mg，92％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝98％。(化学式：C81H130O45，精确质量：1822,79)LRMS(m/z)：1822[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：1.811BSO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(分子11)的合成；参见图6将SO1861-Ac-OH(14.3mg，7.84μmol)、AMPD(4.12mg，0.039mmol)和BOP(10.4mg，0.024mmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(8.62μL，0.078mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜。接着，通过首先使用制备型MP-LC2，随后使用制备型LC-MS3，再纯化产物。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(9.47mg，63％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝98％(化学式：C85H137NO46，精确质量：1907,84)。LRMS(m/z)：1908[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.311BSO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(分子12)的合成；参见图7将SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.57mg，4.70μmol)、AMPD(42.58mg，0.025mmol)和BOP(6.57mg，0.015mmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(5.17μL，0.047mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜。接着，通过再次使用制备型MP-LC2再纯化产物。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(7.21mg，80％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝97.8％，化学式：C85H139NO46，精确质量：1909，86)LRMS(m/z)：1910[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.211BSO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(分子14)的合成；参见图8将SO1861-Glu-AMPD(10.6mg，5.43μmol)和EMCH.TFA(9.22mg，0.027mmol)溶解在甲醇(超干的，0.50mL)中。接着，加入TFA(1.66μL，0.022mmol)。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC1。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜。接着，通过使用制备型LC-MS3再纯化产物。将对应于产物的级分汇集在一起。使用甲酸中和所得溶液，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(2.61mg，22％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝95％(化学式：C97H152N4O49，精确质量：2156,95)。LRMS(m/z)：2156[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.641BSO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)(分子15)的合成；参见图9将SO1861-Ac-OH(9.05mg，4.97μmol)和EMCH.TFA(8.43mg，0.025mmol)溶解在甲醇(超干的，0.50mL)中。接着，加入TFA(1.52μL，0.022mmol)。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC1。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(6.58mg，65％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝97％(化学式：C91H141N3O47，精确质量：2027,87)。LRMS(m/z)：2028[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：1.961BSO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(分子16)的合成；参见图10将SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(6.00mg，3.14μmol)和EMCH.TFA(5.33mg，0.016mmol)溶解在甲醇(超干的，0.50mL)中。接着，加入TFA(0.96μL，0.013mmol)。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC1。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜。接着，通过使用制备型LC-MS3再纯化产物。将对应于产物的级分汇集在一起。使用甲酸中和所得溶液，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(1.04mg，16％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝94％(化学式：C95H150N4O48，精确质量：2114,94)。LRMS(m/z)：2115[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.551BSO1861-Glu-AEM(分子18)的合成；参见图11将SO1861(10.4mg，5.58μmol)、AEM(7.10mg，0.028mmol)和HATU(6.36mg，0.017mmol)溶解于DMF(1.00mL)和NMM(6.13μL，0.056mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(7.82mg，71％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝95％(化学式：C89H136N2O47，精确质量：1984,83)。LRMS(m/z)：1985[M-1]1-LC-MSr.t.(min)：2.621BSO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(分子19)的合成；参见图12将SO1861-Ac-OH(9.02mg，4.95μmol)、AEM(7.10mg，0.028mmol)和HATU(5.65mg，0.015mmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(5.44μL，0.050mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(7.16mg，74％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝96％(化学式：C87H134N2O46，精确质量：1942,82)。LRMS(m/z)：1944[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.471BSO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)(分子20)的合成；参见图13将SO1861-Ald-OH(9.38mg，5.03μmol)、AEM(6.39mg，0.025mmol)和HATU(5.73mg，0.015mmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(5.53μL，0.050mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(8.63mg，86％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝95％(化学式：C89H138N2O47，精确质量：1986,85)。LRMS(m/z)：1987[M-1]1-LC-MSr.t.(min)：2.621BSO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)(分子21)的合成；参见图14将SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.92mg，4.89μmol)、AEM(6.54mg，0.026mmol)和HATU(5.65mg，0.015mmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(5.38μL，0.049mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(8.92mg，94％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度＝97％(化学式：C87H136N2O46，精确质量：1944,84)。LRMS(m/z)：1944[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.461BSO1861-L-N3(分子23)的合成；参见图36化学式：C94H151N5O50，精确质量：2149,94SO1861-L-NHS(分子25)的合成；参见图37将SO1861-L-N3(7.71mg，3.58μmol)和DBCO-NHS(2.88mg，7.17μmol)溶解于无水DMF(0.50mL)中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物滴加至乙醚(40mL)中。离心(7800RPM，5min)后，倒出上清液，将沉淀重悬于乙醚(20mL)中，再次离心。倒出上清液后，将残余物溶解于水/乙腈(3∶1，v/v，3mL)中，将所得溶液直接冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(8.81mg，96％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为84％。含有14％的水解的NHS酯(化学式：C117H169N7O55，精确质量：2552,06)。LRMS(m/z)：2551[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.76/2.782(由于异构体引起的双峰)SO1861-Glu-HATU(分子26)的合成；参见图59为了产生SO1861-Glu-HATU，SO1861的羧基基团经由肽偶联化学中使用的试剂活化以产生活性酯，即1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯(HATU)。得到的SO1861的活性酯显示在图59中。基于天然存在的QS-21合成以下修饰的QS-21皂苷，即皂苷衍生物：QS21-Ald-OH(分子27)的合成；参见图38将QS21(9.41mg，4.73μmol)溶解于甲醇(0.50mL)中。接着，加入硼氢化钠(1.79mg，0.047mmol)。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。30分钟后，将反应混合物用水(0.50mL)稀释，并进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(4.68mg，50％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为99％(精确质量：1990，4种异构体：Api/Xyl(2∶1))。LRMS(m/z)：1990[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：1.25/2.311B(双峰，17/83UV-面积％，由于QS21是混合物)QS21-Glu-AEM(分子28)的合成；参见图39将QS-21(2.42mg，1.22μmol；图41)、AEM(1.68mg，6.61μmol)和HATU(1.48mg，3.89μmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(1.34μL，0.012mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(1.80mg，70％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为92％(精确质量：2110，4种异构体：Api/Xyl(2∶1))。LRMS(m/z)：2110[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.84/2.931B(双峰，10/90UV-面积％，由于QS21是混合物)OS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)(分子29)的合成；参见图40A将QS-21-Ald-OH(1.92mg，0.964μmol)、AEM(1.29mg，5.08μmol)和HATU(1.10mg，2.89μmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(1.06μL，9.64μmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(1.46mg，72％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为92％(精确质量：2112，4种异构体：Api/Xyl(2∶1))。LRMS(m/z)：2112[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.83/2.921B(双峰，7/93UV面积％，由于QS21是混合物)QS21-Ald-EMCH的合成(图40B；分子30)将QS21(4.82mg，2.42μmol)和EMCH.TFA(4.11mg，0.012mmol)溶解于甲醇(超干的，0.25mL)中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜。接着，通过使用制备型MP-LC2A再纯化产物。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(2.78mg，52％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为96％。LRMS(m/z)：2196[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.441B(由于QS21是混合物而产生多个峰)QS21-Glu-AMPD的合成(图40C；分子31)将QS21(4.89mg，2.46μmol)、AMPD(1.29mg，0.012mmol)和BOP(3.26mg，7.37μmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(2.70μL，0.025mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(3.76mg，74％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为94％。LRMS(m/z)：2076[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.781B(由于QS21是混合物而产生多个峰)QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)的合成(图40D；分子32)将QS21-Glu(2.47mg，1.19μmol)和EMCH.TFA(2.02mg，5.95μmol)溶解于甲醇(超干的，100μL)中。接着，加入TFA(0.36μL，4.76μmol)。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。2小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(2.25mg，83％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为95％。LRMS(m/z)：2283[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.881B(由于QS21是混合物而产生多个峰)OS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)的合成(图40E；分子33)将QS21-(Ald-OH)(4.90mg，2.46μmol)、AMPD(1.29mg，0.012mmol)和BOP(3.26mg，7.37μmol)溶解于DMF(0.50mL)和NMM(2.70μL，0.025mmol)的混合物中。将反应混合物摇动1min并在室温下静置。1小时后，将反应混合物进行制备型MP-LC2A。将对应于产物的级分立即汇集在一起，冷冻并冻干过夜，得到标题化合物(2.16mg，42％)，为白色蓬松固体。基于LC-MS的纯度为96％。LRMS(m/z)：2077[M-1]1-。LC-MSr.t.(min)：2.771B(由于QS21是混合物而产生多个峰)实施例2：皂苷衍生物的活性-初步研究发现本文所述的皂苷修饰基本上不干扰皂苷增强核内体逃逸的能力(修饰的皂苷或从不含核内体内的缀合物释放的皂苷)。实验结果总结在下表Ex2中。化学修饰的皂苷SO1861在基于细胞的生物测定中确实显示反应性，相对细胞活力作为读数。将HeLa细胞与以下构建体一起孵育72小时，并在孵育72小时之前和之后评估细胞活力。在实验中，将细胞暴露于1.5pM石竹素-EGF缀合物。阴性对照是与缓冲媒介和10微克/ml皂苷孵育的细胞，不含石竹素-EGF。将对照(其中省略了皂苷和EGF-石竹素)的细胞活力设定为100％。阳性对照是10μg/ml的未修饰的皂苷SO1861 石竹素-EGF。72小时后细胞活力基本上为0％。对于化学修饰的皂苷变体，与1.5pM石竹素-EGF组合测试了10μg/ml皂苷。SO1861-Ald-EMCH在10μg/ml时降低细胞活力。这些数据表明皂苷可以在游离醛基团或游离羰基基团上被修饰而不丧失核内体逃逸增强活性。表Ex2.SO1861和SO1861衍生物与靶向毒素(EGF石竹素)共同施用时的细胞杀伤活性( 或-)。与未处理的表达EGFR的细胞的对照(例如A431，HeLa)相比，共同施用导致增强的细胞杀伤。实施例3：皂苷衍生物的活性-详细研究将各种皂苷(例如SO1861，QS-21)作为“游离的”未缀合分子与配体毒素融合物(例如EGF-石竹素)或抗体-蛋白质毒素缀合物一起共同施用至细胞，导致靶表达细胞的细胞杀伤活性增强。本发明人在分子内的不同位置(单、双或三修饰)化学修饰SO1861(从皂角草(Saponariaofficinalis)的根提取物中分离和纯化)和QS21(从皂皮树(QuillajaSaponaria)，DesertKing中分离和纯化)，从而提供了表A2和A3所列的一系列皂苷衍生物。测试皂苷衍生物的1)配体毒素(修饰的SO1861/QS21滴定 5pMEGF石竹素)对表达EGFR的细胞(HeLa和A431)的核内体逃逸增强活性；2)对HeLa和A431的固有细胞毒性(修饰的SO1861/QS21滴定)；以及3)人红细胞溶血活性(对人红细胞的修饰的SO1861/QS21滴定)。为了测定核内体逃逸增强活性，在表达EGFR的细胞(HeLa和A431)上，在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下滴定修饰的SO1861(参见图18A-B和19A-B)。此外，还测定了在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素存在下滴定的皂苷衍生物的核内体逃逸增强活性(对于SO1861与SO1861-Ald-EMCH和SO1861-Ald-EMCH-封闭的比较，参见图23A-B，以及对于SO1861与SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)和SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)的比较，参见图24A-B)。这揭示了与SO1861相比具有单修饰的修饰皂苷在以下浓度下显示出活性：SO1861-Ald-OH对HeLa：IC50＝600nM和对A431：IC50＝600nM，SO1861-Glu-AMPD对HeLa：IC50＝600nM和对A431：IC50＝600nM，SO1861-Ac-OH对HeLa：IC50＝1000nM和A431：IC50＝800nM，SO1861-Glu-AEM对HeLa：IC50＝1500nM和对A431：IC50＝2000nM以及SO1861-Ald-EMCH对HeLa：IC50＝2000nM和对A431：IC50＝2000nM，以及双修饰显示出具有以下IC50值的活性：SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)对HeLa：IC50＝3000nM和对A431：IC50＝3000nM，SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)对HeLa：IC50＝4000nM和对A431：IC50＝4000nM，SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)对HeLa：IC50＝4000nM和对A431：IC50＝5000nM，SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)对HeLa：IC50＝8000nM和对A431：IC50＝4000nM，SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)对HeLa：IC50＝8000nM和对A431：IC50＝10.000nM，SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)对HeLa：IC50＝40.000nM和对A431：IC50＝20.000nM。测试的三修饰在当前浓度下没有显示活性。使用未修饰的SO1861对照，获得以下IC50值：在HeLa：IC50＝100nM，和在A431：IC50＝200nM。通过在表达EGFR的细胞上，在存在非有效固定浓度的5pMEGF-石竹素的情况下滴定皂苷衍生物来测定修饰的QS21的核内体逃逸增强(参见图30A和30B)。这揭示了与未修饰的QS21相比，以下修饰的QS21在以下浓度下显示出活性：QS21对HeLa：IC50＝200nM和对A431：IC50＝200nM，QS21-Ald-OH对HeLa：IC50＝600nM和对A431：IC50＝600nM，QS21-Glu-AEM对HeLa：IC50＝600nM和对A431：IC50＝700nM，QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)对HeLa：IC50＝1500nM和对A431：IC50＝3000nM。总之，未修饰的SO1861和QS21在HeLa和A431细胞中在IC50＝200nM下均有效。单一SO186l/QS21修饰(SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH封闭的、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Ald-OH、SO1861-Ac-OH、SO1861-Glu-AEM、QS21-Ald-OH、QS21-Glu-AEM)在HeLa或A431中显示出IC50＝600nM-2000nM的活性(表A5和表A6)，而双SO1861/QS21修饰在Hela或A431细胞中显示IC50＝1500-40.000nM的活性(表A5和表A6)。对于SO1861的三修饰，高达20,000nM没有观察到活性。如上所述，为了测定核内体逃逸增强活性，在表达EGFR的细胞(HeLa和A431)上，在非有效固定浓度的5pMEGF石竹素存在下滴定SO1861衍生物，QS21衍生物及其非衍生化的对应物。这揭示了非衍生化的SO1861和非衍生化的QS21以及QS21衍生物QS21-Glu-AMPD在HeLa和A431细胞中在IC50＝200nM下是有效的。单一SO1861/QS21修饰(SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH(封闭的))(SO1861-Ald-EMCH(巯基乙醇)、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-(Ald-OH)、SO1861-Ac-OH、SO1861-Glu-AEM、QS21-Ald-EMCH、QS21-(Ald-OH)、QS21-Glu-AEM)在HeLa或A431中显示出IC50＝600nM-2000nM的活性(表A5和A6)，而双SO1861修饰和双QS21修饰在Hela或A431细胞中显示出IC50＝1500-40.000nM的活性(表A5和A6)。对于SO1861的三修饰，高达20,000nM没有观察到活性。对于毒性测定，将修饰的SO1861滴定在HeLa细胞(参见图20A和21A)和A431细胞(参见图20B和21B)上。图25A和25B描绘了SO1861、SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH-封闭的毒性测试的细节，图26A和26B显示了SO1861、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)和SO1861-(Ald)-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)的细节。这揭示了未修饰的SO1861对HeLa细胞显示最强的固有毒性：IC50＝2000nM，而单修饰的SO1861-Ac对HeLa细胞显示IC50＝10.000nM的毒性。对于所有其它SO1861-衍生物，对HeLa细胞的固有毒性(IC50)高于20，000nM。在A431细胞中，在IC50：1000nM下观察到未修饰的SO1861的毒性，而单修饰SO1861-Ac-OH、SO1861-Ald-OH、SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Ald-EMCH分别显示出IC50＝2000nM、IC50＝7000nM、IC50＝20.000nM和IC50＝30.000nM的毒性。为了测定修饰的QS21的毒性，在HeLa细胞(参见图31A)和A431细胞(图31B)上滴定皂苷衍生物。这揭示了QS21对HeLa细胞显示毒性：IC50＝6000nM和对A431细胞显示毒性：IC50＝3000nM，QS21-Ald-OH对HeLa细胞显示毒性：IC50＝20.000nM和对A431细胞显示毒性：IC50＝20.000nM，QS21-Glu-AEM对HeLa细胞显示毒性：IC50＝＞100.000nM和对A431细胞显示毒性：IC50＝＞100.000nM，QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)对HeLa细胞显示毒性：IC50＝＞100.000nM和对A431细胞显示毒性：IC50＝＞100.000nM，对于SO1861或QS21双修饰和SO1861三修饰，高达100.000nM没有观察到毒性。如上所述，在HeLa和A431细胞上滴定未修饰或修饰的SO1861或QS21。这揭示未修饰的SO1861在IC50＝1000nM(HeLa)和IC50＝2000nM(A431)下显示毒性，而QS21在IC50＝6000nM(HeLa)(IC50＝3000nM(A431)下显示毒性以及QS21-Glu-AMPD在IC50＝9000nM(HeLa)和IC50＝5000nM(A431)下显示毒性(表A5和A6)。对HeLa细胞，对于单一SO1861修饰和单一QS21修饰，SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ald-EMCH(封闭的)、SO1861-(Ald-OH)、SO1861-Glu-AEM、QS21-Ald-EMCH、QS21-Glu-AEM在高达100.000nM没有显示出毒性，而SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Ac-OH、QS21-(Ald-OH)分别在IC50＝20.000nM、IC50＝10.000nM、IC50＝20.000nM显示出毒性(表A5和A6)。在A431细胞中，SO1861-Glu-AEM和QS21-Glu-AEM在高达100.000nM没有显示出毒性，而对于SO1861-Ald-EMCH(IC50＝30.000nM)、SO1861-Ald-EMCH(阻断的)(IC50＝30.000nM)、SO1861-(Ald-OH)(IC50＝7000nM)、SO1861-Ac-OH(IC50＝2000nM)、SO1861-Glu-AMPD(IC50＝20.000nM)、QS21-Ald-EMCH(IC50＝30.000nM)、QS21-(Ald-OH)(IC50＝20.000nM)可以观察到毒性(表A5和A6)。对于SO1861双修饰或QS21双修饰和SO1861三修饰，高达100.000nM没有观察到毒性(表A5和A6)。此外，未修饰和修饰的SO1861的溶血活性通过人红细胞溶血试验测定(参见图22，图27，图28和图32)。这揭示了未修饰的SO1861在IC50＝8000nM下显示活性，而未修饰的QS21在IC50＝3000nM下显示活性。单修饰SO1861-Ald-EMCH在高达1.000.000nM没有显示溶血活性，而对于SO1861-Ald-EMCH封闭的(IC50＝300.000nM)、SO1861-Ald-OH(IC50＝30.000nM)、SO1861-Ac-OH(IC50＝20.000nM)、SO1861-Glu-AMPD(IC50＝20.000nM)、SO1861-Glu-AEM(IC50＝30.000nM)、QS21-A1d-OH(IC50＝20.000nM)和QS21-Glu-AEM(IC50＝10.000nM)可观察到人红细胞的溶血活性(表A5和表A6)。对于SO1861或QS21双修饰，对于SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)和QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)没有观察到溶血活性(高达1.000.000nM)，而对于SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50＝100.000)、SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50＝200.000)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50＝140.000)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(IC50＝100.000)观察到溶血活性。对于SO1861三修饰，在高达100,000nM都观察不到溶血。溶血测定显示未修饰的SO1861在IC50＝8000nM下的溶血活性和未修饰的QS21在IC50＝3000nM下的溶血活性以及修饰的QS21-Glu-AMPD在IC50＝3000nM下的溶血活性。单修饰SO1861-Ald-EMCH在高达1.000.000nM没有显示溶血活性，而对于SO1861-Ald-EMCH(封闭的)(IC50＝300.000nM)、SO1861-(Ald-OH)(IC50＝30.000nM)、SO1861-Ac-OH(IC50＝20.000nM)、SO1861-Glu-AMPD(IC50＝20.000nM)、SO1861-Glu-AEM(IC50＝30.000nM)、QS21-Ald-EMCH(IC50＝30.000nM)、QS21-(Ald-OH)(IC50＝20.000nM)和QS21-Glu-AEM(IC50＝10.000nM)可观察到人红细胞的溶血活性(表A5和A6)。对于SO1861双修饰或QS21双修饰，对于SO1861-Ald-EMCH-(Glu-AMPD)、SO1861-(Ac-OH)-EMCH、SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AEM)、QS21-Ald-EMCH-(Glu-AMPD)和QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)未观察到溶血活性(高达1.000.000nM)，而对于SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50＝100.000nM)、SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50＝200.000nM)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50＝140.000nM)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AEM)(IC50＝100.000nM)和QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50＝40.000nM)观察到溶血活性(表A5和A6)。对于SO1861三修饰，高达100.000nM也没有观察到溶血(表A5和A6)。测试各种QS皂苷级分的核内体逃逸增强活性(在HeLa和A431细胞上滴定皂苷 5pM西妥昔单抗-皂草素，参见图33A-B)、毒性(在HeLa和A431细胞上滴定皂苷，参见图34A-B)和溶血活性(在人红细胞上滴定皂苷，参见图32和图35)。这揭示了QS21(级分)、QS17(级分)、QS18(级分)在HeLa细胞和A431细胞中在200nM下显示活性，而QS7(级分)在IC50＝6000nM(HeLa)和10.000nM(A431)下显示活性。当观察到在测定毒性期间，QS21(级分)、QS17(级分)、QS18(级分)在HeLa细胞和A431细胞中在IC50＝10.000nM下显示毒性，而QS7(级分)在IC50＝20.000nM下显示毒性(图34)。接下来，进行溶血测定，这揭示了QS21(级分)在IC50＝3000nM，QS17(级分)、QS18(级分)在IC50＝5000nM下的溶血活性，而对于QS7(级分)，高达20.000nM都不能检测到溶血活性(图35)。测试各种SO皂苷(SO1862(异构体)、SO1832、SO1904)以及抗体-SO1861缀合物(西妥昔单抗-SO1861(DAR4)、曲妥珠单抗-SO1861(DAR4))的溶血活性。这揭示SO1862(异构体)、SO1832，SO1904)的溶血活性与SO1861相当(IC50＝10.000nM)(图29)。西妥昔单抗-SO1861(DAR4)缀合物在高达60.000nM没有显示出溶血活性，而曲妥珠单抗-SO1861(DAR4)显示从60.000nM开始向前的初始溶血活性(IC50＝200.000nM)(图29)。当比较SO1861、SO1861-Ald-EMCH和SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇(SO1861-Ald-EMCH-封闭的)的细胞毒性，溶血活性和核内体逃逸增强活性时，后两者具有类似或基本相同的细胞毒性，溶血活性和在核内体逃逸增强活性生物测定中的活性，并且后两者比SO1861具有更低的细胞毒性和更低的溶血活性。还参见表A5和表A6。细胞活力测定根据制造商的说明(AqueousOneSolutionCellProliferationAssay，Promega)通过MTS分析确定细胞活力。将MTS溶液在不含酚红并补充有10％FBS(PAN-BiotechGmbH)的DMEM(PAN-BiotechGmbH)中稀释20×。每孔用200μLPBS洗涤细胞一次，然后每孔加入100μL稀释的MTS溶液。将板在37℃下孵育大约20-30分钟。随后，在ThermoScientificMultiskanFC读板机(ThermoScientific)上测量492nm处的光密度。为了量化，在将未处理孔的背景校正信号除以处理孔的背景校正信号计算未处理/处理细胞的比率之前，从所有其他孔中减去‘仅培养基’孔的背景信号。FACS分析在10cm培养皿中，将细胞以500,000c/板接种在补充有10％胎牛血清(PAN-BiotechGmbH)和1％青霉素/链霉素(PAN-BiotechGmbH)的DMEM(PAN-BiotechGmbH)中，并孵育48hr(5％CO2，37℃)，直到汇合度达到90％。接下来，细胞被胰蛋白酶消化(TryplEExpress，GibcoThermoScientific)成单细胞。将0.75×106个细胞转移到15mLfaIcon管中并离心(1,400rpm，3min)。弃去上清液，同时让细胞沉淀物浸没。通过在涡旋振荡器上轻轻敲击falcon管使沉淀分离，并用4mL冷PBS(不含Mg2 和Ca2 ，2％FBS)洗涤细胞。洗涤后，将细胞重新悬浮在3mL冷PBS(不含Mg2 和Ca2 ，2％FBS)中，并在3个圆底FACS管(1mL/管)上等分。细胞再次离心并重悬于200μL冷PBS(不含Mg2 和Ca2 ，2％FBS)或200μL抗体溶液中；在195μL冷PBS(不含Mg2 和Ca2 ，2％FBS)中含有5μL抗体。将APC小鼠IgG1，κ同种型CtrlFC(#400122，Biolegend)用作同种型对照，并使用APC抗人EGFR(#352906，Biolegend)。样品在滚筒混合器上在4℃下孵育30min。然后，将细胞用冷PBS(不含Mg2 和Ca2 ，2％FBS)洗涤3×，并在室温下使用2％PFA的PBS溶液固定20min。细胞用冷PBS洗涤2×，并重新悬浮在250-350μL冷PBS中用于FACS分析。用BDFACSCantoII流式细胞术系统(BDBiosciences)和FlowJo软件分析样品。FACS分析的结果总结在表A4中。表A4.EGFR和HER2在各种细胞系中的细胞表面表达水平(平均荧光强度(MFI))溶血测定使用Ficoll梯度从血沉棕黄层分离红细胞(RBC)。将获得的RBC沉淀(～4-5ml)用50mlDPBS(不含Ca2 /Mg2 ，PAN-BiotechGmbH)洗涤2次。通过在室温下，800xg离心10min使细胞沉淀。计数RBC，并基于总细胞计数以500.000.000c/ml重悬于DPBS(不含Ca2 /Mg2 )中。在DPBS(具有Ca2 /Mg2 ，PAN-BiotechGmbH)中以1.11X最终强度制备皂苷稀释液。对于阳性裂解对照，在DPBS / 中制备0.02％Triton-X100溶液。在所有化合物溶液中，在96孔V型底平板中每孔分配135μL。向该15μlRBC悬浮液中加入并立即混合(10秒-600rpm)。将平板在室温下孵育30分钟，同时轻轻搅拌。然后将平板以800xg旋转10分钟以沉淀RBC，并将100-120μl上清液转移至标准96wp(96孔板)。随后，在ThermoScientificMultiskanFC读板器(ThermoScientific)上测量405nm处的OD。为了定量，从所有其它孔中减去“仅DPBS / ”孔的背景信号，之后通过将处理孔的背景校正信号除以0.02％Triton-X100孔(x100)的背景校正信号，与0.02％Triton-X100相比计算溶血百分比之前。表A5.用SO1861、SO1861衍生物、QS-21衍生物和QS-21处理的红细胞和HeLa细胞。参见分子3，也称为SO1861-Ald-EMCH-巯基乙醇或SO1861-Ald-EMCH(巯基乙醇)表A6.用SO1861、SO1861衍生物、QS-21衍生物和QS-21处理的红细胞和A431细胞实施例4：皂苷衍生物的临界胶束浓度(CMC)材料和方法通过DeVendittis等人的方法(Afluorimetricmethodfortheestimationofthecriticalmicelleconcentrationofsurfactants，AnalyticalBiochemistry，第115卷第2期，1981年8月，第278-286页)，如下测定来源于肥皂草(SO)(表A7)和来源于皂皮树(QS)(表A8和表A9)的皂苷的临界胶束浓度(CMC)。在1-1400μM的皂苷干重浓度下测定纯净水(MQ)或PBS(杜伯克氏PBS / )中的8-苯胺基萘-1-磺酸(ANS)的发射光谱，以涵盖低于和高于CMC的范围。在CMC以上，由于荧光染料分配到胶束中，ANS的荧光产量增加并且最大发射波长降低。在FluoroskanAscentFL(ThermoScientific)上在355nm的激发波长和460nm的发射波长下记录荧光产量。75.86μM的ANS的浓度下，每个样品和测量使用6μg。结果SO1861皂苷官能团醛(Ald)、葡萄糖醛酸(Glu)的化学修饰和乙酰基(Ac)的去除对相应皂苷的胶束性质显示出影响。如图42所示，SO1861皂苷上的各个官能团的单修饰显著影响了所获得的ANS的相对荧光值的斜率中所示的胶束形成能力。对葡萄糖醛酸的修饰(SO1861-Glu-AMPD、SO1861-Glu-AEM)清楚地导致更陡的斜率(图42)，导致对于185μM的天然SO1861获得的更低的CMC值。对于SO1861-Ald-EMCH封闭的样品已经获得了类似的观察结果。然而，对醛和乙酰基上的修饰(SO1861-Ald-OH、SO1861-Ald-EMCH、SO1861-Ac-OH)导致显著更平的斜率(图42)，导致相对于天然SO1861更高的CMC值。SO1861-Ald-EMCH样品是特别令人感兴趣的，因为所获得的斜率几乎是平的，并且即使对于高达800μM的浓度也不能确定CMC。对于SO1861皂苷的双修饰(图43)和三修饰(图44)，已经获得了关于修饰位点的类似观察结果。虽然对葡萄糖醛酸的修饰(SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)、SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)、SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD))导致了更陡的ANS荧光产量斜率，以及因此更低的CMC值，但对醛和乙酰基位置的修饰(SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)、SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH))导致平的ANS荧光产量斜率，并因此导致相对于天然SO1861的增加的CMC值(表A7)。当比较三修饰的皂苷SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)和SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)时，在SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)处对葡萄糖醛酸的修饰导致相应ANS荧光产量的更平的斜率，同时在SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)处对葡萄糖醛酸的修饰导致相对于天然SO1861的相应ANS荧光产量的更陡的斜率(图44)。这些结果表明在考虑CMC的情况下在醛和/或乙酰氧基位置进行修饰的重要性，因为即使在Glu修饰的衍生物(其具有比游离皂苷更低的CMC)中，当考虑CMC时，所述醛和/或乙酰氧基修饰可以增加CMC，至少部分地减轻Glu修饰的负面影响。表A7.PBS中测定的SO皂苷的CMC值QS皂苷对于来源于皂皮树(QS)的皂苷，QS7、QS17、QS18、QS21Frac和QS21SP的CMC值，已经测定了表A8中所示的。如图45所示，相应的QS皂苷的ANS荧光产量的斜率与得到的CMC值相对应。所获得的CMC值显示出从49μM的最高CMC值的QS21SP开始，到QS-17、QS-18和QS-21Frac的下降趋势，其全部显示出在约70μM处的类似的CMC。最后，对于QS-7，获得了230μM的CMC值。当比较在纯净水(MQ)和PBS中测量的QS21SP的ANS荧光产量时，纯净水(MQ)中的斜率略微更陡，导致纯净水中预期略微更高的CMC值(图46，表A9)。对于单修饰的QS21皂苷QS21-Ald-EMCH(分子30；图40B)、QS21-Glu-AEM、QS21-(Ald-OH)和QS21-Glu-AMPD(图47A，图47B)，仅在葡萄糖醛酸上的AMPD修饰(QS21-Glu-AMPD，图47B)导致ANS荧光产量相对于天然QS21的更陡的斜率，导致40μM的更低CMC值(表A9)。在葡萄糖醛酸(QS21-Glu-AEM)和醛位置(QS21-(Ald-OH)、QS21-Ald-EMCH)上的所有其它QS21单修饰导致比天然QS21更平的ANS荧光产量斜率(图47B)。与对肥皂草皂苷SO1861进行双修饰的发现类似，对QS21皂苷的AldGlu修饰(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)，图40E，分子33，图47C)也导致ANS荧光产量相对于天然QS21的更陡的斜率，导致39μM的更低的CMC值(表A9)。在葡萄糖醛酸和醛位置的所有其它QS21双修饰(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)、QS21-Ald-EMCH-(Glu-AEM)，图47C)产生比天然QS21更平的ANS荧光产量斜率。表A8.在纯净水(MQ)中测定的QS皂苷的CMC值皂苷CMC(μM)QS7230±25QS21(Frac)75±8QS1770±7QS1868±7QS21(SP)49±5表A9.在PBS中测定的修饰的QS21皂苷的CMC值实施例5：SO1861和SO1861-Ald-EMCH的核内体逃逸增强活性测试SO1861和SO1861-Ald-EMCH(也称为SO1861-EMCH，例如在图48-58中)的增强靶蛋白质毒素的核内体逃逸的能力。为此，将SO1861或SO1861-Ald-EMCH滴定到表达EGFR的细胞(A431)上的固定浓度的10pM西妥昔单抗-皂素(与蛋白质毒素，皂草素缀合的西妥昔单抗，具有DAR4)上。这揭示了SO1861(IC50＝800nM)和SO1861-Ald-EMCH(IC50＝2000nM)与10μM西妥昔单抗-皂草素组合诱导A431细胞的有效细胞杀伤，而单独的SO1861或SO1861-Ald-EMCH没有显示出细胞杀伤活性(图48)。接着，在各种固定浓度的SO1861或SO1861-Ald-EMCH上滴定西妥昔单抗-石竹素或西妥昔单抗-皂苷。这揭示了在4000nMSO1861-Ald-EMCH、4829nMSO1861-Ald-EMCH或1500nMSO1861存在下，用低pM浓度的西妥昔单抗-石竹素(IC50＝1pM，图49)或西妥昔单抗-皂苷(IC50＝0.5pM，图50)的有效的细胞杀伤。用300nMSO1861或300nMSO1861-Ald-EMCH未观察到这种细胞杀伤作用(图49和50)。接下来，将SO1861或SO1861-Ald-EMCH滴定到表达EGFR的细胞(A431)上的固定浓度的10pMEGF石竹素(EGFR靶向的融合蛋白质毒素)上。这揭示了SO1861(IC50＝800nM)和SO1861-Ald-EMCH(IC50＝2000nM)与10μMEGF石竹素组合诱导A431细胞的有效的细胞杀伤，而单独的SO1861或SO1861-Ald-EMCH未显示出细胞杀伤活性(图51)。接着，在各种固定浓度的SO1861或SO1861-Ald-EMCH上滴定EGF石竹素。这揭示了在4829nMSO1861-Ald-EMCH或1500nMSO1861存在下，用低pM浓度的EGF石竹素(IC50＝0.1pM，图52)的有效的细胞杀伤。用10nMSO1861或300nMSO1861未观察到这种细胞杀伤作用(图52)。接着，将曲妥珠单抗-石竹素或曲妥珠单抗-皂草素(与蛋白质毒素，皂草素缀合的曲妥珠单抗，具有DAR4)滴定到表达HER2的细胞(SK-BR-3)上的固定浓度的1500nMSO1861或4000nMSO1861-Ald-EMCH上。这揭示了在1500nMSO1861或4000nMSO1861-Ald-EMCH的存在下，用低pM浓度的曲妥珠单抗-石竹素(IC50＝0.1pM)或曲妥珠单抗-皂草素(IC50＝0.1pM)的有效的细胞杀伤(图53)。图48-53中概述的所有这些结果显示SO1861-Ald-EMCH有效地增强了靶向蛋白质毒素的核内体逃逸和细胞质递送，从而将靶向蛋白质毒素的有效浓度从nM范围显著降低到低的pM范围。测试SO1861-Ald-EMCH增强针对HSP27mRNA的反义寡核苷酸(BNA，桥连型核酸)的核内体逃逸的能力。为此，将SO1861-Ald-EMCH滴定到表达EGFR/HER2的细胞(A431)上的固定浓度的100nMHSP27BNA、100nM西妥昔单抗-HSP27BNA(与HSP27BNA缀合的西妥昔单抗，具有DAR4)或100nM曲妥珠单抗-HSP27BNA(与HSP27BNA缀合的曲妥珠单抗，具有DAR4)。这揭示了SO1861-Ald-EMCH(IC50＝700nM)与100nMHSP27BNA、100nM西妥昔单抗-HSP27BNA(图54)或100nM曲妥珠单抗-HSP27BNA(未显示)组合在A431细胞中诱导有效的HSP27基因沉默细胞。单独的SO1861-Ald-EMCH没有显示出HSP27基因沉默活性(图54)。接下来，将西妥昔单抗-HSP27BNA(DAR1.5或DAR4)、曲妥珠单抗-HSP27BNA(DAR4.4)滴定到表达EGFR(A431)或HER2(SK-BR-3)的细胞中的各种固定浓度的SO1861-Ald-EMCH上。这揭示了在存在4000nMSO1861-Ald-EMCH的情况下，用较低nM浓度的西妥昔单抗-HSP27BNA(IC50＝0.5nM，图55)在A431细胞中有效的HSP27基因沉默，而单独的西妥昔单抗-HSP27BNA或西妥昔单抗-HSP27BNA 100nMSO1861-Ald-EMCH在非常高的浓度下没有显示出基因沉默活性或仅显示轻微的活性(IC50＞100nM；图550)。在SKBR-3细胞中，曲妥珠单抗-HSP27BNA(IC50＝0.5nM，图56)在4000nMSO1861-Ald-EMCH存在下显示出有效的HSP27基因沉默活性，而单独的曲妥珠单抗-HSP27BNA或曲妥珠单抗-HSP27BNA 100nMSO1861-Ald-EMCH仅显示出轻微的基因沉默活性(IC50＞100nM；图56)。接着，在各种细胞系中，在固定浓度的SO1861-Ald-EMCH上滴定非靶向的HSP27BNA。这揭示了在4000nM或4829nMSO1861-Ald-EMCH存在下，用低nM浓度的HSP27BNA(IC50(SK-BR3)＝2nM；IC50(A431)＝10nM；IC50(A2058)＝10nM)在A431、A2058和SK-BR3中有效的HSP27基因沉默，而单独的HSP27BNA在高得多的浓度下才诱导基因沉默(IC50(SK-BR3)＝300nM；IC50(A431)＝1000nM；IC50(A2058)＞1000nM)(图57和58)。当将HSP27BNA的该活性(有和没有SO1861-Ald-EMCH的情况下)与HSP27LNA(LNA，锁核酸)活性比较时，本发明人观察到核内体逃逸/基因沉默增强因子与HSP27BNA相当，但是在较高的HSP27LNA浓度下(图58)。所有这些都表明SO1861-Ald-EMCH有效地增强靶向反义BNA寡聚物以及非靶向BNA/LNA寡聚物的核内体逃逸和细胞质递送，从而将靶向和非靶向反义寡聚物的有效浓度从μM范围显著降低至低nM范围。材料曲妥珠单抗(Tras，Roche)，西妥昔单抗(CET，MerckKGaA)。从Proteogenix，France产生并购买石竹素-cys，根据标准程序，从大肠杆菌产生EGF石竹素。西妥昔单抗-皂草素和曲妥珠单抗-皂草素缀合物是从AdvancedTargetingSystems(SanDiego，CA)产生和购买的。方法快速层析法GraceRevelerisC-815Flash；溶剂递送系统：3柱塞泵，其具有自动引发，4个独立通道，在单次运行中具有多达4种溶剂，当溶剂耗尽时自动切换管线；最大泵流速250mL/min；最大压力50bar(725psi)；检测：UV200-400nm，组合多达4个UV信号和扫描整个UV范围，ELSD；柱尺寸：在仪器上4-330g，luer类型，750g，至多3000g，具有任选的保持器。HSP27BNA寡聚序列HSP27BNA寡聚物(5′-GGCacagccagtgGCG-3′)，根据Zhang等人(2011)[YZhang，ZQu，SKim，VShi，BLiaol，PKraft，RBandaru，YWu，LMGreenbergerandIDHorak，Down-modulationofcancertargetsusinglockednucleicacid(LNA)-basedantisenseoligonucleotiddeswithouttransfection，GeneTherapy(2011)18，326-333])([SEQ-IDNO：2])，在Bio-SynthesisInc.(Lewisville，Texas)订购，有或没有5’-硫醇C6接头。在Bio-SynthesisInc.(Lewisville，Texas)订购了HSP27LNA寡聚物(5′-ggcacagccagtggcg-3′)([SEQ-IDNO：3])。RNA分离和基因表达分析根据标准方案(Biorad)分离和分析来自细胞的RNA。使用的qPCR引物如表A10所示。表A10.用于qPCR的引物如下所示曲妥珠单抗-皂草素和西妥昔单抗-皂草素合成从AdvancedTargetingSystems(SanDiego，CA)产生和购买定制的mAb-皂草素缀合物。曲妥珠单抗-石竹素和西妥昔单抗-石竹素合成使用VivaspinT15过滤管(3,000g，20℃，10分钟)通过超滤浓缩石竹素-Cys(17.0ml，～9.6mg)。所得3.25ml等分试样用zeba10ml旋转柱凝胶过滤，用TBSpH7.5洗脱。用DPBSpH7.5将曲妥珠单抗(mAb)或西妥昔单抗(mAb)(0.30ml，～10mg)稀释至10mg/ml，通过zeba5ml旋转柱用DPBSpH7.5洗脱脱盐并归一化至2.50mg/ml。向mAb的等分试样中加入新鲜制备的在DMSO中的SMCC溶液(1.00mg/ml，4.20摩尔当量，13.9×10-5mmol)的等分试样，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育60分钟，进行辊式混合。之后，通过加入新鲜制备的在DPBSpH7.5中的甘氨酸溶液(2.0mg/ml，5.0摩尔当量，69.5×10-5mmol)的等分试样来淬灭反应。使用zeba10ml旋转柱，用TBSpH7.5洗脱，凝胶过滤后获得mAb-SMCC(4.27mg，2.80×10-5mmol，1.514mg/ml)。向石竹素-Cys(7.54mg，25.3×10-5mmol，2.258mg/ml)中加入新鲜制备的在TBSpH7.5中的TCEP溶液(1.00mg/ml，0.5摩尔当量，12.6×10-5mmol)的等分试样，将混合物短暂涡旋，然后在20℃下孵育60分钟，进行辊式混合。然后，使用zeba10ml旋转柱，用TBSpH7.5洗脱，通过凝胶过滤获得石竹素-SH(6.0mg，20.2×10-5mmol，1.722mg/ml，石竹素：SH＝1.1)。向主体mAb-SMCC中加入石竹素-SH的等分试样(7.20摩尔当量)，将混合物短暂涡旋，然后在20℃孵育过夜。16小时后，通过加入新鲜制备的在TBSpH7.5中的NEM溶液(2.50mg/ml，5.0摩尔当量，101×10-5mmol)的等分试样淬灭反应。将反应混合物过滤至0.45μm，然后通过使用VivaspinT15过滤管超滤浓缩至＜2ml(3，000g，20℃，15分钟)。通过使用1.6×35cmSuperdex200PG柱，用DPBSpH7.5洗脱，进行凝胶过滤来纯化缀合物。抗体-(L-HSP27BNA)n[在HSP27BNA二硫化物上]曲妥珠单抗-(L-HSP27)4、西妥昔单抗-(L-HSP27)4，经由PEG4-SPDP合成(具有DAR4)，以及西妥昔单抗-(L-HSP27)2经由PEG4-SPDP合成(具有DAR2)曲妥珠单抗，西妥昔单抗，在下文中称为“Ab”。Ab通过四(乙二醇)琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(PEG4-SPDP)接头与HSP27BNA二硫化物缀合，从而在Ab和HSP27BNA之间形成不稳定的(L)二硫键。该程序针对曲妥珠单抗-(L-HSP27BNA)4进行了示例性描述：使HSP27BNA二硫化物寡聚物(2.7mg，470nmol，6.10mg/ml)与TCEP(10摩尔当量，4.7μmol，1.34mg，50mg/ml)在20℃下反应30分钟，同时进行辊式混合。之后，通过PD10G25脱盐柱洗脱到TBSpH7.5中将寡聚物-SH纯化，并迅速使用。获得寡聚物-SH(2.48mg，90％，1.24mg/ml，SH与寡聚物比率＝0.8)。将曲妥珠单抗(1.5mg，10.3nmol，2.50mg/ml)与新鲜制备的在DMSO中的PEG4-SPDP溶液(6.81摩尔当量，70.1nmol，39μg)(1mg/ml)的等分试样在20℃下反应60分钟，同时进行辊式混合。之后，用甘氨酸(15.1μl2mg/ml新鲜制备的在TBSpH7.5中的溶液)淬灭反应，然后通过zeba脱盐柱，用TBSpH7.5洗脱进行脱盐。取出所得Tras-S-PEG4-SPDP的等分试样并通过UV-Vis分析测试。使用TCEP释放吡啶-2-硫酮(PDT)并通过在343nm的UV-vis分析测定SPDP并入(SPDP与Ab比率：4)。将剩余的Tras-(S-PEG4-SPDP)4与新鲜制备的HSP27寡核苷酸(寡聚物-SH)(8摩尔当量，82.4nmol，1.24mg/ml)的等分试样反应，并在20℃下孵育过夜，同时进行辊式混合。17小时后，通过UV-vis分析分析缀合物以通过在343nm处置换吡啶-2-硫酮(PDT)来确定HSP27的并入。使用1.6×33cmSephadexG50柱，用DPBSpH7.5洗脱来纯化粗缀合物。得到的曲妥珠单抗-(L-HSP27)4为单一级分。产量：n.d.。纯度：96％，HSP27BNA与Ab比率＝4.4实施例6-皂苷的核内体逃逸增强活性以前，将各种皂苷(SO1861，SA1642)的功效作为“游离的”未缀合的分子与配体毒素融合物(例如EGF石竹素)或抗体-蛋白质毒素缀合物一起共同施用于细胞，导致表达靶标的细胞的细胞杀伤活性增强。这里，在HeLa(EGFR )细胞上，在存在和不存在非有效固定浓度的1.5pMEGF石竹素的情况下，滴定分离自肥皂草的根提取物的三种不同的皂苷分子(SO1861、SO1862(SO1861的异构体)、SO1832和SO1904)。这揭示了与不含EGF石竹素的处理相比，所有测试的皂苷变体的细胞杀伤活性的强增强(IC50＝300nM；图63A)。接着，用固定浓度的皂苷(～1000nM)滴定EGF石竹素，并且这揭示了对所有使用的皂苷SO1861、SO1862(SO1861的异构体)、SO1832和SO1904均观察到的在低浓度的EGF石竹素下强的靶向细胞杀伤增强(IC50＝0.4pM；图63B)。单独的EGF-石竹素只能在非常高的浓度下诱导细胞杀伤(IC50＝10.000pM)。这表明这些特定类型的皂苷，在仅有非常少量的可用靶向毒素的情况下，都具有有效诱导核内体逃逸的固有能力。为了扩展该测试，分析了来自其它来源的皂苷。从缕丝花(GypsophilaelegansM.Bieb.)的根提取物中纯化的皂苷(GE1741)在存在和不存在1.5pMEGF石竹素的情况下，在HeLa细胞上滴定，并与纯化的SO1861进行比较。GE1741也增强了EGF石竹素诱导的HeLa细胞杀伤，但是与SO1861相比显示出稍低的功效。(GE1741IC50＝800nM；图63C)以及还显示出较高的一般毒性(在不存在EGF石竹素的情况下IC50＝5.000nM；图63C)。类似的试验，其中在HeLa细胞上共同施用不同的部分纯化的皂皮树皂苷混合物(QSmix1-3)与1.5pMEGF石竹素，显示出3种中的2种(QSmix1和QSmix3)与SO1861类似的活性(IC50QSmix1/QSmix3＝300nM；图63D)。QSmix(2)在增强1.5pMEGF石竹素诱导的细胞杀伤中效率较低(IC50＝2000nM；图63D)，然而，没有观察到一般毒性。这表明也在QS提取物中，可以获得特定类型的皂苷，其有效地诱导靶向配体毒素EGF石竹素的核内体逃逸。因此，在本实施例中描述的皂苷，例如皂皮树皂苷GE1741、SO1861、SO1862、SO1832和SO1904是特别吸引人的根据本发明进行衍生的皂苷。实施例7-皂苷和皂苷衍生物的核内体逃逸增强活性不稳定的/酸敏感的衍生化(Ald-EMCH或SO1861-L-N3(也称为SO1861-N3和SO1861-叠氮化物或SO1861-N3/叠氮化物)通过醛基团应用到SO1861上，产生SO1861-Ald-EMCH或SO1861-L-N3。为了验证SO1861-Ald-EMCH的活性，在表达EGFR(A431、HeLa)和非表达的细胞(A2058)上，在存在和不存在固定的非有效(1.5pM)的EGF石竹素浓度的情况下滴定分子。在所有三个细胞系中，单独的SO1861显示出强的细胞活力降低，而作为单一化合物的SO1861-Ald-EMCH显示出高达25.000nM的毒性(图64A-C)。当SO1861-Ald-EMCH与1.5pMEGF石竹素组合时，在EGFR A431和HeLa细胞中观察到强的靶特异性细胞活力降低(IC50＝3.000nM；图64A，B)，而EGFR-A2058细胞根本不受影响(图64C)。对于SO1861-L-N3获得了类似的结果。SO1861-L-N3与1.5pMEGF石竹素共同施用也显示出对A431和HeLa细胞的有效细胞杀伤(IC50＝3.000nM)，但没有EGF石竹素，在高于10.000nM时观察到一般毒性(图64D，64E)。HATU通过SO1861的羧酸基团与SO1861缀合，产生SO1861-(S)，也称为SO1861-HATU和SO1861-Glu-HATU。为了测定活性，将不同浓度的SO1861-(S)与1.5pMEGF石竹素共同施用，并测试在表达EGFR的HeLa细胞中的细胞杀伤活性。SO1861-(S)显示出与SO1861类似的活性，表明与羧酸基团的缀合不影响该分子的核内体逃逸增强效力，类似于用SO1861-Ald-EMCH所观察到的(图65)。序列表<110>萨普雷米科技有限公司(SAPREMETECHNOLOGIESB.V.)夏里特柏林大学医学院(CHARITE-UNIVERSITaTSMEDIZINBERLIN)<120>改善治疗窗的皂苷衍生物<130>P6092645PCT<150>NL2025904<151>20200624<150>NL2023568<151>20190725<150>PCT/EP2019/084210<151>20191209<150>PCT/EP2019/084290<151>20191209<150>PCT/EP2019/084292<151>20191209<160>5<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221><222><223>定制的肽<400>1SerGluSerAspAspAlaMetPheCysAspAlaMetAspGluSerAsp151015SerLys<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221><222><223>HSP27BNA寡聚物<400>2ggcacagccagtggcg16<210>3<211>16<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221><222><223>HSP27LNA寡聚物<400>3ggcacagccagtggcg16<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221><222><223>HSP27引物正向<400>4gcagtccaacgagatcacca20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><221><222><223>HSP27引物反向<400>5taaggctttacttggcggca20当前第1页12