转录因子CsS40基因在促进茶树咖啡碱合成调控中的应用

转录因子css40基因在促进茶树咖啡碱合成调控中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，涉及一个转录因子css40基因在促进茶树咖啡碱合成调控中的应用。


背景技术：

2.茶树[camellia sinensis(l.)o.kuntze]是自然界为数不多的富含咖啡碱的高等植物。从茶树咖啡碱合成路径的基础研究方面来说，尽管近年来国内外研究在茶树咖啡碱生物合成代谢路径及关键基因克隆等方面取得了令人瞩目的成就，但仍有很多重要科学问题亟待阐明。在基因水平上对于启动子与转录因子的相互作用，引起基因转录效应的激活或抑制的相关调控机制研究，咖啡碱合成酶基因(tcs)上游顺式作用元件与转录因子的相关研究报道较少。叶片衰老是细胞死亡前叶片发育的最后阶段，这一过程的特点是细胞物质降解并重新生长叶片、发育种子，衰老不是一个混乱的分解，而是一个需要特定基因表达的高度有序的过程。目前为止，s40基因家族已有较多研究，大麦hvs40基因和拟南芥ats40-3基因在自然衰老和处理过程中也被诱导，水稻中的oss40-1、oss40-2、oss40-12和oss40-14基因在非生物、生物和发育性衰老之间具有潜在的相互调控作用。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于提供一个转录因子css40基因在促进茶树咖啡碱合成调控中的应用。css40在植物衰老过程中起着重要的调控作用，然而本发明通过过表达载体，转化实验表明css40对咖啡碱的合成调控起促进作用。本发明对进一步利用机制来调控现有的茶树品种咖啡碱的合成和衰老机制具有重要作用，也为了解茶树应对非生物胁迫的分子机制提供新的思路与见解。
[0004]
转录因子css40在促进茶树咖啡碱合成调控中的应用，所述转录因子css40编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0005]
转录因子css40在茶树茶叶品质改善的基因工程育种中的应用，所述转录因子css40编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0006]
所述转录因子css40的核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0007]
所述应用为所述转录因子css40结合tea022575(tcs4)基因启动子，进而激活tcs4基因的表达，从而提高咖啡碱含量。
[0008]
所述应用为构建转录因子css40的重组载体，将该载体转入茶树中使其过表达茶树愈伤，可以提高咖啡碱含量。
[0009]
所述重组载体以psh737-35s为原始载体，在psh737-35s的多克隆位点插入转录因子css40。
[0010]
优选的，所述转录因子cshsf24插入在原始载体psh737-35s上的xba i和kpn i酶切位点之间，命名为psh737-35s-css40。
[0011]
所述重组载体采用以下方法制备获得：以茶树叶片cdna为模板，结合引物对获得
css40的pcr产物；psh737-35s通过xba i和kpn i进行双酶切，回收后连接，得到重组载体，命名为cshsf24-psh737-35s，所述引物对为primer f：cacaacaacttctccagctttg，primer r：cagcatctcgttgtctctcttc。
[0012]
本发明的有益效果：本发明提供了一个参与茶树咖啡碱合成调控的转录因子css40，属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，所述css40具有seq id no.1所示的核苷酸序列。本发明中，所述转录因子css40能够结合咖啡碱合成酶tcs4基因启动子，激活tcs4基因的表达，进而促进茶树咖啡碱含量的积累。经过验证，采用遗传转化技术过量表达css40基因可以增加茶树咖啡碱物质含量，异源过表达烟草，css40基因能够有效促进烟草衰老。
附图说明
[0013]
图1为启动子诱饵载体，
[0014]
图2为诱饵菌落自激活检测结果，
[0015]
图3为tcs基因启动子文库筛选效率，其中从左到右稀释倍数分别是10倍，100倍，1000倍，
[0016]
图4为阳性克隆转化子点板，
[0017]
图5为css40基因启动子顺式作用元件分布图，
[0018]
图6为css40保守结构域，
[0019]
图7为css40相对分子质量、等电点，
[0020]
图8为css40亚细胞定位预测，
[0021]
图9为css40的亚细胞载体图谱，
[0022]
图10为css40蛋白在烟草叶片细胞的亚细胞定位，
[0023]
图11为茶树转录因子css40与tcs4启动子相互作用检测情况，
[0024]
图12为css40的过表达载体图谱，
[0025]
图13为茶树css40转基因茶树愈伤，
[0026]
图14为css40茶树愈伤gus染色，其中wt：野生型茶树愈伤，
[0027]
图15为css40茶树愈伤pcr鉴定，其中tp：过表达茶树愈伤，wt：野生型愈伤，p：质粒阳性对照，
[0028]
图16为野生型和转基因愈伤咖啡碱含量，
[0029]
图17为css40基因烟草的遗传转化，其中a:共培；b:愈伤分化；c:形成再生芽；d:烟草生根；e:烟草的移栽(左一：野生型，左二起转基因株系)，
[0030]
图18为css40转基因烟草gus染色，其中wt：野生型烟草植株；1-20：转基因烟草植株1-20，
[0031]
图19为css40转基因烟草pcr鉴定，
[0032]
图20为转基因烟草的黄嘌呤含量，
[0033]
图21为转基因烟草的次黄嘌呤含量，
[0034]
图22为野生型和转基因烟草生理指标的变化，其中a:叶绿素含量；b：超氧化物歧化酶活性；c:丙二醛含量；d:脂氧合酶活性，
[0035]
图23为转基因烟草中css40基因的表达量，其中wt1-3代表不同的野生型烟草，
tp1-20代表不同的转基因植株
[0036]
图24为转基因烟草的离体培养，其中序号1-20代表不同的转基因植株；
[0037]
图25为野生型烟草的离体培养，其中序号1-3代表不同的野生型烟草。
具体实施方式
[0038]
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0039]
本发明通过tcs4基因(tea022575)启动子phis2-575诱饵表达载体构建，转化y187酵母菌株，成功获得诱饵菌株。利用酵母单杂交试验筛从tcs4筛选得到9个阳性克隆，检测阳性克隆得到一个茶树未知蛋白，命名css40。
[0040]
本发明提供了一种参与茶树咖啡碱合成调控的转录因子css40，所述css40的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述转录因子css40属于细胞衰老调节器s40家族。
[0041]
本发明中，所述css40的pcr扩增模板优选为茶树cdna；所述茶树cdna优选的采用茶树总rna逆转录合成；本发明对茶树cdna的合成方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物cdna合成方法即可，在本发明具体实施过程中，采用takara试剂盒进行合成。
[0042]
本发明提供了上述方案所述转录因子css40编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述蛋白质含有212个氨基酸；所述蛋白质具有senescnece_reg结构域。
[0043]
本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子css40的重组载体；所述重组载体优选的以psh737-35s为原始载体，在psh737-35s的多克隆位点插入转录因子css40；所述css40插入在原始载体psh737-35s上的xbai和kpni酶切位点之间。
[0044]
本发明中，所述重组载体优选的采用以下方法制备获得：以cdna为模板，结合引物对获得css40的pcr产物；psh737-35s通过xbai和kpni进行双酶切，回收后连接，得到psh737-35s-css40，所述引物对为primer f：cacaacaacttctccagctttg，primer r：cagcatctcgttgtctctcttc。
[0045]
本发明中，所述回收优选的采用takara的凝胶回收试剂盒进行；所述连接的试剂盒优选的采用vazyme的一步克隆试剂盒进行。
[0046]
本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物；所述重组微生物优选的以农杆菌为原始微生物，在农杆菌中转入重组载体psh737-35s-css40；本发明对所述转入的方法没有特殊限制，采用本领域常规转化方法即可，本发明的具体实施过程中，采用冻融法进行转化。
[0047]
本发明中，所述转录因子css40能够结合参与茶树咖啡碱合成的咖啡碱合成酶tcs4基因启动子，进而激活tcs4基因的表达。
[0048]
本发明还提供了上述方案所述的转录因子css40在茶树育种中的应用；所述应用优选为转录因子css40在茶叶品质改善的基因工程育种中的应用。
[0049]
下面结合实施例对本发明提供的一个参与茶树咖啡碱合成调控的转录因子css40及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0050]
相关培养基配制：
[0051]
(1)lb培养基：10g/l胰蛋白胨 10g/l氯化钠 5g/l酵母提取物 7.5g/l琼脂粉
[0052]
(2)yep固体培养基：10g/l蛋白胨 10g/l酵母提取物 5g/l氯化钠 7.5g/l琼脂粉
[0053]
(3)yep液体培养基：10g/l酵母提取物 10g/l蛋白胨 5g/l氯化钠
[0054]
(4)烟草共培培养基：4.432g/l ms 1.00mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 30g/l蔗糖 7.5g/l琼脂粉
[0055]
(5)烟草筛选培养基：4.432g/l ms 1.00mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 30g/l蔗糖 7.5g/l琼脂粉 100mg/l替门汀 100mg/l卡那霉素
[0056]
(6)烟草生根培养基：2.216g/l ms 20g/l蔗糖 7.5g/l琼脂粉 100mg/l替门汀 100mg/l卡那霉素
[0057]
(7)茶树共培培养基：4.432g/l ms30 g/l蔗糖 0.5mg/l 6-ba 1.0mg/l naa 7.5g/l琼脂粉
[0058]
(8)茶树愈伤筛选培养基：4.432g/l ms 30g/l蔗糖 0.5mg/l 6-ba 1.0mg/l naa 7.5g/l琼脂粉 200mg/l替门汀 30mg/l卡那霉素
[0059]
(9)酵母缺陷培养基：8g/lsd-tl/sd-tlh 20g/l琼脂粉 40g/l葡萄糖
[0060]
下述实验中涉及到的生物材料均为市售。
[0061]
实施例1tcs4基因启动子互作转录因子的筛选
[0062]
(一)实验方法
[0063]
1.tcs4基因启动子序列诱饵载体构建
[0064]
为将tcs4基因启动子序列(seq id no.3)构建到酵母单杂交的诱饵载体phis2上，需对含有目的基因的载体pmd18-t-tcs(1(基因载体的构建由上海华津生物科技有限公司完成)。进行酶切，获得该克隆片段，并与相应酶切的酵母单杂交诱饵载体phis2连接，用于片段和载体酶切的试剂为ecor i、sac i双酶切(takara公司内切酶)，用于酶切产物回收的试剂为胶回收试剂盒(axygen公司)，用于片段和载体连接的试剂为dna ligation kit(toyobo公司)，诱饵载体构建完成后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
[0065]
2.酵母感受态制备及转化，
[0066]
1)酵母感受态制备：
[0067]
a)从ypda平板上挑取y187酵母单菌落接种至4ml的ypda液体培养基种，在恒温培养箱种以温度30℃，转速225rpm条件下，振荡培养18-20h，培养至菌液的od600大于1.5，一般为4左右。
[0068]
b)将培养后的ydpa培养基转接至50ml的ypda液体培养基，使菌液的初始od600为0.2，然后在恒温培养箱种以温度30℃，转速225rpm条件下，振荡培养4-5h，培养至菌液的od600等于0.6。
[0069]
c)将培养好的酵母菌离心后收集酵母菌，离心条件为：室温，1000g，5min。
[0070]
d)用20ml无菌水重悬混匀收集的菌体，离心后收集菌体，弃上清液，离心条件为：室温，1000rpm，5min。
[0071]
e)用5ml 0.1m lioac重悬混匀菌体，离心后收集菌体，弃上清液，离心条件为：室温，1000rpm，5min。
[0072]
f)用500μl 0.1m lioac重悬混匀菌体，分装至1.5ml微型离心管中，每管微型离心管中加入50μl液体，即y187酵母菌感受态
[0073]
2)酵母诱饵菌株的转化:
[0074]
a)取上一步的含有酵母感受态的1.5ml微型离心管中依次加入240μl 50％的peg3350，36μl 1m的lioac，5μl鲑鱼精dna(10mg/ml)，5μl质粒dna(300ng/μl)，用枪头轻轻吹打后，使用振荡器剧烈振荡至所有试剂和菌液完全混匀，震荡时间为1min左右。
[0075]
b)30℃水浴孵育，30min。
[0076]
c)42℃水浴热激，25min。
[0077]
d)30℃水浴复苏，1h。
[0078]
e)离心收菌，离心条件为：室温，700rpm，5min，弃上清。
[0079]
f)每个转化后的离心管中加入200μl无菌水轻轻用枪头吹打，以温和地悬浮混匀菌液，涂布至sd-t缺陷型平板。
[0080]
g)在恒温培养箱中在30℃条件下恒温培养3-4天。
[0081]
3)阴性对照和阳性对照转化方法同酵母诱饵菌株的转化方法，只是将ad，bd质粒同时加入，涂布相应的缺陷型平板，质粒信息，转化平板和检测平板见表1。
[0082]
表1阴性对照和阳性对照酵母菌株转化相关信息
[0083][0084]
3.自激活检测
[0085]
分别从tcs4基因启动子，阴性对照和阳性对照转化反应的平板上各随机挑取3个单菌落，用无菌水稀释后涂板至不添加his、添加50nm3at，添加100nm 3at的sd-tlh缺陷型平板上，在恒温培养箱中在30℃条件下恒温3天。拍照记录每块平板上的菌落生长状况。
[0086]
4.酵母单杂交筛库
[0087]
酵母单杂交文库构建，选用的材料是茶树叶片。酵母菌感受态是用含有正确phis2诱饵质粒的y187酵母转化子来制备的，将构建好的文库质粒pgadt7(酵母单杂交文库由本课题组其他同学构建)转入这三个酵母菌感受态中，在加入50mm 3at的sd-trp-leu-his缺陷培养基平板上涂布培养。文库dna具体转化方法如下：
[0088]
a)将sd-t平板上正常生长的单克隆菌挑取种接至50ml液体sd-t培养基然后在恒温培养箱种以温度30℃，转速225rpm条件下，振荡培养18h。
[0089]
b)将菌落生长正常的50mlsd-t液体培养基转接至500ml的ypda液体培养基中，使菌液的初始od600为0.2，在恒温培养箱种以温度30℃，转速225rpm条件下，振荡培养4-5h，直到菌液的od600等于0.6。
[0090]
c)将培养好的酵母菌离心后收集酵母菌，弃上清液。离心条件：室温，1000rpm，5min。
[0091]
d)用30ml无菌水重悬混匀收集的菌体，离心后收集菌体，弃上清液，离心条件：室温，1000rpm，5min。
[0092]
e)用20ml 0.1m lioac重悬重悬混匀收集的菌体，离心后收集菌体，弃上清液，离心条件：室温，1000rpm，5min。
[0093]
f)用10ml 0.1m lioac重悬重悬混匀收集的菌体，离心后收集菌体，弃上清液，离心条件：室温，1000rpm，5min。至此含有正确phis2诱饵质粒的y187酵母已经被制备成感受
态。
[0094]
g)向含有酵母感受态的离心管中依次加入9.6ml的50％peg3350，1.44ml的浓度为1mlioac，3mg的单链鲑鱼精dna，以及25μg的文库质粒dna，用枪头轻轻吹打后，使用振荡器剧烈振荡至所有试剂和菌液完全混匀，震荡时间为1min左右。
[0095]
h)30℃水浴孵育，30min。
[0096]
i)42℃水浴热激，25min。
[0097]
j)30℃水浴复苏1h。
[0098]
k)将培养好的酵母菌离心后收集酵母菌，弃上清液。离心条件：室温，1000rpm，5min。每个转化后的离心管中加入8ml无菌水轻轻用枪头吹打，以温和地悬浮混匀菌液，从中取20μl的菌液培养物梯度稀释后涂效率平板sd-tl 4块。将200μl的菌液培养物涂布添加50mm3at的sd-tlh缺陷型平板，总共涂布40块平板。
[0099]
l)在恒温培养箱中在30℃条件下恒温培养3-4天，观察sd-tl效率平板的转化结果，记录转化效率。
[0100]
m)根据效率平板的转化子数量，计算筛库效率。
[0101]
n)为了消除背景生长菌落对阳性克隆的干扰，在培养到第3天时，用自制的绒布影印器对添加50mm 3at的sd-tlh缺陷型平板进行影印清除，继续在30℃条件下恒温培养7-14天。挑取在新平板上再次长出的转化子菌落接到sd-tl缺陷型平板培养2-3天中等待下一步检测。
[0102]
o)培养14天后，将sd-tl缺陷型平板上生长的阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点板至sd-tl和添加300mm 3at的sd-tlh缺陷平板上进行阳性克隆his报告基因的检测，在恒温培养箱中在30℃条件下恒温培养3-4天。
[0103]
5.酵母阳性克隆dna提取和测序比对
[0104]
首先，将通过阳性克隆his报告基因的检测的阳性克隆菌株分别接入sd-tl液体培养基，在恒温培养箱种以温度30℃，转速225rpm条件下，振荡培养18h后采用酵母小量抽提试剂盒(索莱宝)抽提酵母质粒。然后，将抽提得到的酵母质粒转化至大肠杆菌top10新鲜感受态进行扩增。
[0105]
大肠杆菌top10新鲜感受态制备步骤：
[0106]
a)种子液的制备：将lb平板上正常生长的大肠杆菌top10单克隆接种到3ml lb液体培养基中，在恒温培养箱种以温度37℃，转速220rpm条件下，过夜振荡培养16h。
[0107]
b)将培养好的种子液接种1ml到100ml lb液体培养基中，在恒温培养箱种以温度37℃，转速220rpm条件下，振荡培养2h。
[0108]
c)将菌液从恒温培养箱中取出，等待降至室温后离心收菌，或冰浴一段时间后离心收菌，弃上清液，离心条件：4℃，5000rpm，5min。
[0109]
d)用10ml的0.1m mgcl2悬浮收集到的菌体，使用枪头轻轻吹打，使其充分混匀，然后放置于冰上，冰浴10min-1h。
[0110]
e)离心收菌，弃上清液。离心条件为；4℃，5000rpm，5min。
[0111]
f)用4ml的0.1m cacl2悬浮收集到的菌体，使用枪头轻轻吹打，使其充分混匀。然后放置于冰上，冰浴30min。至此，感受态制备完成，将4ml的感受态分装至1.5ml的微型离心管中，每个离心管分装100μl的感受态。
[0112]
h)每个酵母抽提出的质粒用100μl的感受态进行转化。
[0113]
将筛选出的含有阳性克隆的top10菌落转接含有amp的lb液体培养扩增后使用axygen质粒小量抽提试剂盒抽提质粒，将质粒送到武汉金开瑞生物工程有限公司进行dna测序。
[0114]
6.阳性克隆测序结果生物信息学分析
[0115]
阳性克隆序列首先使用blast 在茶树基因数据中比对到完整的序列结果，完整序列分别提交至conserved domain database(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和pfam(http://pfam.xfam.org/)分析其保守结构域，planttfdb数据库比对确认是否为转录因子，利用expasy-protparm tool(http://www.expasy.org/protparam)分析筛选得到蛋白的基本理化性质及其氨基酸组成。
[0116]
(二)实验结果
[0117]
1.诱饵载体构建
[0118]
将tcs4启动子序列进行扩增得到目的片段，结果显示目的片段符合预期大小。将tcs4基因启动子片段插入phis2质粒中，进而成功构建表达载体(图1)phis2-tcs575。公司测序结果显示测序片段正确，说明诱饵载体构建正确，通过热激法将测序片段正确的phis2质粒转入y187酵母菌，获得诱饵酵母菌株，三个诱饵酵母菌株均可在sd-trp缺陷培养基上存活，证明trp基因表达，phis2质粒已成功转入y187酵母菌株，可以进行下一步实验。
[0119]
2.诱饵载体自激活检测
[0120]
3at是酵母his蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制his基因的泄露表达。将携tcs4启动子的载体转入到y187酵母菌后，需要检测转化子的数量和计算生长率，结果如下(图2)：tcs575阴性对照在添加50mm和100mm3at的sd-tlh平板生长率为0，表明在添加50mm和100mm 3at的sd-tlh平板上，tcs4的转化子生长都明显受到抑制，生长比例与阴性对照的生长比例相同，均为0，显示his报告基因表达泄露在50mm的3at下能够得到抑制，因此在50mm 3at的基础上进行酵母单杂交筛库。
[0121]
3.酵母单杂交筛库效率计算
[0122]
在排除自激活现象后，用含有正确phis2-172nx诱饵质粒的y187酵母转化子作为受体菌制备感受态，将构建成功的文库质粒分别转入含有phis2-tea022575，诱饵载体的酵母菌株并且涂板，根据效率平板转化子生长数据计算三个转化的筛库效率(图3，表2)：phis2-tea022575诱饵载体转化效率为4.44
×
104/ug。clontech公司的yeast protocols handbook中推荐当筛库效率高于1.0
×
104/μg时可以继续筛选阳性克隆。两个诱饵载体的筛库效率均高于1.0
×
104/μg，可以进行下一步实验。
[0123]
表2tcs基因启动子文库筛选效率平板转化子数目及转化效率
[0124]
[0125]
注：总转化数目计算公式＝(10倍转化子数目/20 100倍转化子数目/2 1000倍稀释后转化子数目/0.2)/3*8000
[0126]
转化效率计算公式＝总转化子数目/25μg
[0127]
4.阳性克隆his报告基因的检测
[0128]
为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第3天时，用绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7-14天。从筛库平板中共挑取了354个阳性克隆转化子转接到sd-tl缺陷型平板中继续培养2-3天。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。将长出来的转化子分别用无菌水稀释后点板至sd-tl和sd-tlh 300mm 3at缺陷平板，30℃恒温培养3-4天，得到阳性克隆转化子。phis2-tea022575筛库获得的17个初始阳性克隆，转接到sd-tl平板上培养，然后将这17个正常生长阳性克隆，阴性对照和阳性对照分别在sd-tl和sd-tlh 300nm3at的筛选平板上点板培养，结果如图4所示，所有菌落在sd-tl筛选平板上都能正常生长，而阴性对照由于不会激活his报告基因，因此在sd-tl筛选平板上可以正常生长，但在缺少histidine并添加300nm 3at的筛选平板上不能正常生长，因此，初始阳性克隆中，能在添加3at的筛选平板上生长旺盛的是激活了his报告基因。
[0129]
鉴定结果如图4所示，phis2-tea022575筛库获得17个阳性克隆中有12个在缺少histidine并添加300nm 3at 3at的筛选平板上正常生长，通过了his报告基因检测1，2，5，6，14，24号菌株不能正常生长无法通过his报告基因检测；
[0130]
因此，通过酵母单杂筛到tcs4基因共得到9个阳性克隆转化子。为了鉴定筛选到的这9个阳性克隆，将这些阳性克隆质粒从酵母细胞中回收出来进行dna提取和测序，并与genbank数据库中的序列进行blast比对分析。首先，将阳性克隆菌株分别接入sd-tl液体培养基，振荡培养过夜后采用酵母小量抽提试剂盒(索莱宝公司)抽提酵母质粒。然后，将抽提得到的酵母质粒转化大肠杆菌top10新鲜感受态进行扩增。经过对从文库筛选到的9个酵母阳性菌落抽提阳性克隆质粒，并进行dna测序及blast比对，结果显示这9个阳性克隆分别属于9种不同蛋白的编码基因。测序结果如下所示(表3)：
[0131]
表3阳性克隆测序结果(tea022575)
[0132]
[0133][0134]
实施例2茶树css40基因生物信息学分析
[0135]
(一)实验方法
[0136]
利用tbtool上的blast功能，结合茶树基因组(http://tpia.teaplant.org)及ncbi((http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库确定css40基因的cds序列、蛋白序列；将css40基因的启动子起始密码子上游2000bp的序列分别提交至在线分析软件plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和softberry(http://linux1.soft berry.com/all.htm)进行启动子区域可能含有的顺式作用元件和
转录起始位点的预测；将蛋白序列上传到ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线软件分析其保守结构域；通过expasy(http://web.expasy.org/compute_pi/)在线鉴定其相对分子质量、等电点；最后通过亚细胞定位分析软件wolf psort ii(https://www.genscript.com/tools/wolf-psort)预测该蛋白在细胞的定位情况。
[0137]
(二)实验结果
[0138]
其结果如图5-图8、表4所示，利用生物信息学方法对css40基因的基本信息、启动子顺式作用元件、保守结构域、相对分子质量、等电点、亚细胞定位进行了预测。结果发现：css40基因在ncbi中编号为loc114277741，茶树基因组中编号为css0010485.1，同源性为100％，长度是1211bp，由212个氨基酸组成；css40基因启动子序列中含有与环境相关的1个are元件(厌氧诱导调控)、1个circadian元件(昼夜节律调控)；与激素相关的2个abre元件(脱落酸应答)、1个gare-motif元件(参与赤霉素应答)、1个tga-element元件(参与生长素应答)与光调控相关的1个ae-box元件、1个g-box元件、1个gap-box元件、1个i-box元件和1个tct-motif元件；css40基因在第289至825位氨基酸构成一个senescnece_reg结构域，属于细胞衰老调节器s40家族；css40基因的相对分子质量、等电点为23369.73da和5.98；css40基因定位于细胞核中。
[0139]
表4css40基因启动子序列顺式作用元件分析
[0140][0141]
实施例3茶树css40基因亚细胞定位
[0142]
(一)实验方法
[0143]
1.所使用的烟草为本氏烟草。
[0144]
2.融合表达载体构建
[0145]
通过css40 orf设计具有酶切位点的引物(表5)，以css40基因orf正确的克隆产物提取质粒，基因用kpni进行酶切，载体用xbai进行酶切，通过t4 dna连接酶连接到pcambia1300-35s-gfp载体上，将获得的连接产物转化到dh5a感受态细胞，经过pcr扩增、酶切筛选以及测序验证正确后，筛选阳性克隆并提取质粒，获得gfp与目的基因的融合表达载体(图9)pcambia1300-css40-35s-gfp。亚细胞定位载体构建由武汉转导生物实验室有限公司合成。
[0146]
表5扩增引物名称及序列
[0147][0148]
3.烟草瞬时转化步骤
[0149]
(1)将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；
[0150]
(2)取1-1.5ml菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；
[0151]
(3)8000rpm，2min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1ml渗透液，悬浮菌体；
[0152]
(4)重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；
[0153]
(5)取少量悬浮菌液稀释10倍，测定od600值，并乘以10，作为悬浮菌液的od600值；
[0154]
(6)确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0ml，od600为0.4(根据需要0.1-0.8，不要超过1)，通常0.5-1.0ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；
[0155]
(7)在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，室温静置1至3小时，准备侵染；
[0156]
(8)侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1h，使其气孔打开；
[0157]
(9)选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；
[0158]
(10)用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；
[0159]
(11)侵染前，用记号笔标记待转区域；
[0160]
(12)将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中；
[0161]
(13)将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；
[0162]
(14)然后将叶片喷水，套上保鲜袋，将侵染后的烟草放回培养室，黑暗放置过夜。
[0163]
(15)第二天打开保鲜袋，注射后2-3天表达量最高。
[0164]
(16)切取侵染区域，撕表皮制片，荧光显微镜观察。
[0165]
(二)实验结果
[0166]
如图10所示，pcambia1300-css40-35s-gfp融合蛋白和带有gfp的空载在烟草叶片细胞的细胞核、细胞质中能检测到荧光信号，证明css40基因在细胞核、细胞质中有表达。
[0167]
实施例4点对点验证css40与tcs4启动子之间的互作
[0168]
(一)实验方法
[0169]
连在载体pgadt7上的转录因子与连在载体phis2上的启动子共转化酵母菌株y187中，将菌液稀释后涂布于酵母选择培养基sd-trp/-leu平板上。置于28℃恒温培养箱培养3-4d待长出菌落后挑取酵母单菌落于选择液体培养基sd-trp/-leu中，用摇床以28℃，200rpm培养至od值为0.8-1.0之间，用移液枪吸取2μl的量滴于缺陷型培养基sd
‑‑
trp/-leu/-his 3-at(50mm、100mm、150mm、200mm、250mm)上，而后将平板放于28℃恒温培养箱培养3-4天的时间，以观察酵母生长情况，并分析其转录激活作用。
[0170]
(二)实验结果
[0171]
如图11所示，将成功构建的载体pgadt7-css40与连在载体phis2上的启动子共转
化酵母菌株y187中，后点板于缺陷型培养基sd
‑‑
trp/-leu/-his 3-at(50mm、100mm、150mm、200mm、250mm)上，结果表明：在3-at浓度为(50mm、100mm、150mm、200mm、250mm)三缺培养基上酵母仍能够继续生长，说明转录因子对基因有绑定结合作用。
[0172]
实施例5css40基因在茶树愈伤中的功能分析
[0173]
(一)实验方法
[0174]
1.实验材料
[0175]
材料为贵州大学茶学院的
‘
福鼎大白’茶树幼嫩茎段，用做农杆菌介导的遗传转化外植体。
[0176]
2.构建植物表达载体
[0177]
构建植物表达载体以初始载体psh737为基础，设计并构建psh737-35s-css40植物表达载体(图12)。根据测序结果选择上游酶切位点为xbai，下游酶切位点为kpni，设计含有酶切位点的css40扩增引物，扩增的css40与psh737均进行双酶切并纯化，使用dna连接酶连接粘性末端，重组质粒转化感受态大肠杆菌(dh5α)，使用kan 100mg/l筛选阳性克隆，提取重组质粒使用xbai和kpni进行双酶切验证。酶切验证结果呈阳性的重组质粒转化农杆菌菌株lba4404感受态细胞，以kan 100mg/l、rif 20mg/l筛选农杆菌阳性菌株，使用引物对阳性菌株进行菌落pcr检测，pcr结果呈阳性的农杆菌菌株扩大培养-80℃保种。将含有表达载体psh737-35s-css40的质粒通过冻融法转化农杆菌株lba4404以制备工程菌株。取-80℃保存的lba4404感受态细胞置于冰中解冻10min；向每支感受态细胞中加入5μl质粒dna，轻轻弹动混匀后冰浴30min；液氮速冻5min后，立即37℃水浴2min；加入900μl 37℃预热yep液体培养基，28℃，200rpm振荡培养3h；室温，4000
×
g离心1min后，弃上清；向菌体中加入100μl yep液体培养基，用枪头吸打使之混匀；取适量菌液涂布于含有100mg/l kan和20mg/l rif的yep平板培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中培养2d，-80℃保存菌液。
[0178]
3.茶树css40过表达载体遗传转化茶树茎段形成愈伤组织
[0179]
通过农杆菌介导的遗传转化法，用茶树植株茎段为外植体,将含有psh-css40的农杆菌菌液对茶树茎段进行遗传转化，暗培养2d后转入筛选培养基上，每14天更换培养基，待出现较为膨大愈伤组织(图13)。
[0180]
用剪刀裁剪超表达转基因茶树愈伤将取下的愈伤完全浸没于gus染液中并将染液放置37℃恒温培养箱中，染色24～48小时。染色结束后将叶片转入95％乙醇中直至材料完全脱色,之后将叶片放在体式显微镜下观察并用拍照，如图14所示。选取野生型愈伤和gus组织化学染色的阳性愈伤提取dna，通过css40基因特异性引物进行pcr扩增，产物用1％琼脂凝胶检测(图15)。
[0181]
4.茶树愈伤咖啡碱含量测定
[0182]
将css40过表达载体和基因编辑载体侵染茶树茎段后，每14天更换培养基，待其愈伤长至较膨大状态时，收取每个愈伤组织并进行杀青处理，杀青后烘干至恒重，研磨成粉状，低温保存备用。
[0183]
取愈伤于蒸汽杀青1min，后80℃烘至足干，研磨成茶粉备用。通过高效液相色谱法测定过表达茶树愈伤咖啡碱含量，参考gb/t8313-2013的方法测定咖啡碱含量。
[0184]
(二)实验结果
[0185]
如图16所示，通过高效液相色谱法测定茶树过表达愈伤咖啡碱含量。结果显示：野
生型愈伤的咖啡碱含量为2.17％，转基因愈伤的咖啡碱含量为4.09％，转基因愈伤的咖啡碱含为野生型的1.88倍。说明css40基因可以提高茶树的咖啡碱含量。
[0186]
实施例6css40基因在烟草中的功能分析
[0187]
1.实验材料
[0188]
所使用的烟草为本课题组所保存的
‘
三星’烟草无菌苗。
[0189]
2.构建植物表达载体
[0190]
构建方法参照实施例4。
[0191]
3.css40过表达载体遗传转化烟草
[0192]
遗传转化方法参照实施例4。通过农杆菌介导的叶盘转化法，用烟草植株叶片为外植体,将含有psh-css40的农杆菌菌液对烟草叶片进行遗传转化,共培养2d后转入筛选培养基(tim、kan)上培养14d左右，待叶缘出现绿色的愈伤组织后，再经继代培养诱导产生抗性芽，将2cm左右的抗性芽切下置于生根培养基上诱导生根,待再生苗长至3-6cm后炼苗并移栽至花盆中培养,获得具有卡那霉素(kan)抗性的转基因再生苗，获得转基因株系20株。农杆菌介导法各阶段如图17所示，转基因植株染色、pcr鉴定如图18-19所示。
[0193]
4.转基因烟草css40基因的表达量分析
[0194]
(1)烟草样品总rna的提取
[0195]
取转基因植株(20株)叶位相同，长势一样的叶片，利用液氮速冻后-80℃保存待用。植物样品rna用ctab法提取，具体步骤如下：
[0196]
1.材料研磨：取叶片约0.1g置于液氮中研磨成细粉，置于加有1ml的rna提取液。
[0197]
2.65℃水浴10min，每隔2min混匀一次。
[0198]
3.冷却至室温。12000rpm/min，离心5min，上清液转移至新离心管中。
[0199]
4.加入等体积的水饱和酚：氯仿(25：24)，再加800μlnacl(5mol/l)混匀，室温放置3min，25℃，12000rpm/min，离心5min。
[0200]
5.上清液转至新离心管中，加入等体积的异丙醇和2倍体积的nacl(5mol/l),混匀，放-80℃过夜沉淀。
[0201]
6.4℃，12000rpm/min，离心5min，沉淀用5ml75％乙醇洗2次，室温下晾干，约5min；加适量rnafress h2o，将产物置于-80℃冰箱保存使用。
[0202]
7.通过核酸浓度测定仪检测rna浓度。
[0203]
(2)cdna的合成
[0204]
提取获得的rna经第一链cdna合成试剂盒反转录为cdna，用于后期的定量分析，反应体系如表6所示:
[0205]
表6第一链cdna的合成
[0206][0207][0208]
轻轻混匀，如用oligo(dt)
18
或基因特异引物(gsp)42℃孵育30-50min(如产物用于qpcr，42℃孵育15-20min)；如用random primer，25℃孵育10min，42℃孵育30-50min(如产物用于qpcr，42℃孵育15-20min)。85℃加热5min失活truescript h-rtase。得到的cdna产物可立即用于pcr或qpcr反应，或在-20℃保存，并在半年内使用；长期存放建议分装后在-80℃保存。cdna应避免反复冻融。
[0209]
(3)css40基因表达量检测
[0210]
合成的cdna，用于荧光定量pcr检测，以确定css40基因的表达情况，利用primer premier 5.0软件设计css40基因的特异性引物(引物由北京擎科生物科技有限公司重庆分公司合成)，以烟草肌动蛋白基因(actin)作为内参(表7)。qrt-pcr试验在bio rad cfx connecttm实时定量pcr仪(bio-rad公司)上进行操作。qrt-pcr所用为南京诺唯赞通用型高灵敏度染料法定量pcr检测试剂盒，根据试剂盒上的使用说明，进行qrt-pcr反应体系配置，10μl体系如下表8所示，qrt-pcr反应程序如表9所示。
[0211]
表7荧光定量pcr引物序列
[0212][0213]
表8荧光定量pcr反应体系
[0214]
[0215]
表9荧光定量pcr反应程序
[0216][0217]
5.转基因烟草黄嘌呤、次黄嘌呤测定
[0218]
准确称取样品2.0g，加50％乙醇40ml超声提取25min，转入50ml容量瓶中，定容，过滤。取滤液1ml于10ml容量瓶中，加水定容，过滤，滤液供色谱分析用，每个样品3次重复。参考刘松青等(1994)的方法测定黄嘌呤、次黄嘌呤含量。条件:流动相为甲醇：0.01mol/l磷酸二氢铵为7：93，检测波长254nm，流速1.2ml/min，进样量10μl，柱温32℃。标准溶液配制:精确称取一定量黄嘌呤、次黄嘌呤标准品,置于容量瓶中加水溶解定容，黄嘌呤、次黄嘌呤浓度为50ug/ml、100ug/ml，分别取上述溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml容量瓶中，加水定容，摇匀进样求出峰面积。回归方程如下：
[0219]
黄嘌呤：c＝-0.08119 3.23*10-4x
[0220]
次黄嘌呤：c＝-0.03382 4.46*10-4x
[0221]
6.诱导转基因烟草衰老
[0222]
分别取8～10周的转基因和野生型烟草植株叶片，经过0.5％～0.8％次氯酸钠浸泡30s，流水冲洗数次，去离子水冲3遍。用剪刀剪取约2*2cm大小的叶片，混匀后转入具塞锥形瓶内，用300mg
·
l-1的乙烯利溶液处理，置于恒温箱中进行暗培养。对照组以等量蒸馏水代替。处理后第0d、1d、3d、5d、7d取样测定各项指标。每次3个平行，所有试验在相同条件下重复3次。诱导转基因烟草衰老的相关指标测定，参照李玉帅(2021)的方法测定叶绿素含量；丙二醛(mda)含量测定；参考李亚坤(2020)的方法测定丙二醛含量；参照孙红梅(2020)的方法测定超氧化物歧化酶活性；参照郝瑞丽(2018)的方法测定脂氧合酶活性。
[0223]
7.转基因烟草离体培养
[0224]
分别取转基因烟草和野生型烟草叶位相同、完全展开的叶片，叶柄根部用湿棉花包裹放在有湿滤纸的培养瓶中，保湿离体培养，(25
±
2)℃下光照16h/d，置于组培间内，观察烟草的衰老情况。
[0225]
(二)实验结果
[0226]
如图20-21所示，转基因植株的黄嘌呤含量在0.32～1.85mg/g之间，野生型植株为1.10mg/g，转基因株系tp17、tp13、tp01、tp19、tp20、tp18、tp09比野生型的高，含量分别为1.85、1.84、1.72、1.59、1.57、1.51、1.42mg/g。并且tp01、tp13、tp17的黄嘌呤含量呈极显著(p＜0.01)，tp09、tp18、tp19、tp20转基因株系为显著(p＜0.05)。tp03、tp04、tp05、tp06、tp08、tp10、tp12、tp14、tp15、tp16比野生型的低，并且tp03、tp05、tp06、tp08、tp10、tp14的黄嘌呤含量呈极显著(p＜0.01)，tp04、tp12、tp15、tp16转基因株系为显著(p＜0.05)，其余无显著性差异；转基因植株的次黄嘌呤在0.05～0.23mg/g之间，野生型植株的次黄嘌呤为0.12mg/g，转基因株系tp01、tp17、tp19、tp20、tp18、tp13、tp09、tp03比野生型的高，含量分别为0.23、0.21、0.19、0.17、0.16、0.15、0.14、0.12mg/g并且tp01、tp17的次黄嘌呤含量呈
极显著(p＜0.01)，tp13、tp18、tp19、tp20转基因株系为显著(p＜0.05)。tp05、tp06、tp08、tp10、tp11、tp12、tp14、tp16比野生型的低，并且tp05、tp08的次黄嘌呤含量呈极显著(p＜0.01)，tp06、tp10、tp11、tp12、tp14、tp16转基因株系为显著(p＜0.05)，其余无显著性差异。综合以上可以得出转基因烟草中tp01、tp13、tp17株系的黄嘌呤含量的黄嘌呤、次黄嘌呤含量都有所增加；转基因烟草中tp05、tp08株系的黄嘌呤含量的黄嘌呤、次黄嘌呤含量都有所减少。
[0227]
如图22所示，转基因烟草的叶绿素含量在0、3、5、7d时比野生型烟草低，在0d时无显著性差异，第5d时叶绿素含量极显著(p＜0.01)，其余时间叶绿素含量显著(p＜0.05)，转基因烟草的叶绿素平均含量比野生型的降低了14.30％，说明css40基因加速了叶绿素的降解；野生型烟草和转基因烟草的sod活性在第1d时极显著(p＜0.01)，5、7d时sod含量显著(p＜0.05)，第三天时急剧下降，转基因烟草在0、3、5、7d时比野生型烟草低，第0d时sod含量无显著性差异，说明由于css40基因在植物衰老时表达，降低了其活性氧清除能力；野生型烟草和转基因烟草的mda活性在第1d时极显著(p＜0.01)，0、5、7d时mda含量显著(p＜0.05)，第三天时急剧下降，转基因烟草在0、1、3、7d时比野生型烟草高，而植物叶片中积累过多的mda，会增加细胞的受损程度；野生型烟草和转基因烟草的lox活性在第3d时极显著(p＜0.01)，0、1、5、7d时lox活性显著(p＜0.05)，诱导衰老至第7d时lox活性转基因烟草比野生型烟草高56.25％，而植物叶片中lox活性越高，会造成植物营养质量的下降。综合以上结果可以说明转基因烟草比野生型烟草能够有效促进衰老。
[0228]
为了解转基因烟草css40基因的表达量，取转基因植株(20株)、取野生型植株(3株)通过ctab法提取其rna，设计css40基因特异性引物后进行rt-qpcr,，测定其相对表达量(图23)。结果显示：转基因烟草的css40基因表达量均比野生型的高，转基因烟草的css40基因表达量均比野生型的高，依次为tp20、tp19、tp09、tp13、tp17、tp18、tp07、tp03、tp01、tp06、tp02、tp12、tp11、tp16、tp15、tp04、tp14、tp10、tp05、tp08。
[0229]
如图24-25所示，转基因植株tp1、tp2、tp8、tp18叶缘发黄，并萎焉，但是失水不多；转基因植株tp9、tp11、tp12、tp13、tp14、tp15、tp17、tp19已经失绿，发黄程度较严重；转基因植株tp3、tp4、tp5、tp6、tp7、tp10、tp16、tp20都已枯萎、黄化，甚至已经干枯。而野生型植株边缘略有发黄，但仍保持绿色状态。综合以上结果可以说明转基因烟草比野生型烟草能够有效促进衰老。