一种基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于力化学反应的分子图案化表 面的制备方法。


背景技术：

2.随着微纳图案化加工技术的发展，集成电路在半导体上实现了小型化，极 大地满足了人们对电子信息设备的需求，同时也激发了科学家们将微纳图案化 加工技术应用到生物领域的热情。微纳米精度的加工技术使得调控细胞外微环 境甚至操控单个细胞成为可能，早期的探索就是将微纳制造技术加工的图案化 表面用于研究细胞的黏附、生长等基础细胞生物学研究。除此之外，还有研究 将生物分子通过微纳制造技术图案化结合到表面，小型化的生物分子阵列可以 作为微型的生化反应实验室(即生物芯片)，用于生物样品检测分析。生物分子 图案的小型化能提高检测信号密度，从而显著提高生物芯片的灵敏度。
3.早期的生物分子阵列采用微量点样等方法制备，图案精度只能控制在几十 微米。而目前最先进的极紫外光刻机精度已经达到了13nm的水平，光刻技术 具有极高的分辨率和高通量等优点，是半导体行业中最为重要的工艺技术，因 此，科学家们自然而然地将光刻技术应用于生物分子的表面图案化。光刻机直 接图案化加工的是旋涂在晶圆表面的光刻胶，而不能直接将生物分子连接到表 面上，只能先将硅烷偶联剂结合到显影后暴露衬底的图案区域，再通过后续反 应接枝生物分子。类似地还有电子束曝光技术和纳米压印技术，这些技术直接 图案化加工的是表面的抗蚀剂，暴露表面图案区域后再修饰生物分子。这两种 技术相较于光刻都有各自的优点，但由于技术原理不同，不可避免地存在一些 各自的不足。从德布罗意的物质波理论可以知道，电子是一种波长比紫外光更 短的波。根据衍射极限公式，采用电子束对抗蚀剂进行加工能将精度提高到纳 米量级。但电子束曝光存在着耗时长，产率低等缺点。使用预设纳米图案的模 板直接转印到衬底上能在保证图案分辨率的前提下，同时提高产率并降低成本。 纳米压印技术使用热塑性材料作为抗蚀剂旋涂在衬底表面，在高温下通过模板 与衬底间的接触并施加高压将图案转移到衬底表面介质上，然而刚性模板与衬 底间只要存在小颗粒或褶皱就会严重影响加工质量。因此采用弹性模板的图案 转移技术应运而生，微接触印刷技术就是采用较软的聚二甲基硅氧烷作为模板 材料，通过蘸取墨水的方式直接将墨水分子转印到衬底上。相较于上述三种加 工抗蚀剂的图案化技术，直接转移墨水分子的图案化技术避免了高温，高压和 真空等严苛条件，更适用于生物分子的图案化固定。生物分子(特别是蛋白质) 需要在模拟生理环境的缓冲溶液才能维持其生物活性，墨水溶液从模板转移到 衬底的过程中会发生严重扩散，最终导致生物分子图案精度大大降低。墨水的 扩散受溶液粘滞性，接触时间等因素影响，使用原子力显微镜探针来蘸取墨水 进行书写能精确地控制接触时间和书写速度，这种蘸水笔蚀刻技术能实现相当 于探针尖端尺寸的精度(约30nm)，但存在产率低的天然缺陷，几乎不可能实 现商用。
4.目前能进行图案化加工的技术有很多，这些技术都有着独特的优点，在特 定领域中都有着独到的优势，但是没有哪一种技术可以在兼具高图案精度，高 质量，高产率和低成本等优点的同时仍能保持生物分子的活性。从2010-2019 年全球生物芯片的相关专利数来看，美国拥有着25万件公开专利，处于绝对的 领先地位。我国虽然拥有12％的生物芯片相关学术论文发表数，但相关专利数 却不足5万件，科研成果转换率较低。新冠疫情以来，我国生物芯片的需求量 持续扩大，市场规模高速增长，因此发展生物芯片的上游制造技术迫在眉睫， 研发新型的生物分子图案化技术能推动我国生物芯片相关技术的发展。


技术实现要素：

5.针对上述缺陷，本发明提供了一种基于力化学反应的分子图案化表面的制 备方法，该技术通过模板与衬底的接触并施加压力，将溶液环境中的力响应墨 水共价结合到表面。
6.为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明的一种基 于力化学反应的分子图案化表面的制备方法，包括如下步骤：
7.(1)模板与基底的修饰：将一端为力响应官能团，另一端为具有生物亲和 性的二元结构分子作为打印墨水分子；将生物亲和分子修饰的模板作为力化学 打印的图案模板，可用以富集墨水分子；将力响应官能团修饰的基底作为图案 转移对象，可与力响应墨水发生力化学反应，制得图案化表面；
8.(2)力化学压印：在墨水环境中将模板与基底接触，施加压力使墨水分子 与官能化基底力促共价结合，从而将墨水分子按模板的图案化固定到基底上。
9.进一步地，在步骤(1)中，对于硅和氮化硅模板，首先用丙酮对其表面进 行清洗，再将其依次浸泡在70-100℃的铬酸和食人鱼洗液中，纯水冲洗再吹干 后依次修饰氨基硅烷化试剂的乙醇溶液和戊二醛水溶液，随后再用链霉亲和素 或含镍亲和树脂对其进行修饰；对于聚二甲基硅氧烷模板，首先用乙醇对其表 面进行清洗后置于紫外臭氧环境中处理，随后用盐酸多巴胺包覆在其表面，最 后再修饰链霉亲和素或含镍亲和树脂；对于硅基底而言，首先将其置于丙酮中 进行超声清洗，再将其依次浸泡在70-100℃的铬酸和食人鱼洗液中，纯水冲洗 再吹干后依次修饰氨基硅烷化试剂。
10.进一步地，在步骤(2)中，力化学压印：将具有力响应端和生物亲和端的 墨水分子溶解在模拟生理环境的缓冲溶液中，将其浸入步骤(1)所述的官能化 模板和基底之间，施加压力使墨水分子结合到基底上，释放使模板重新富集墨 水分子，再反复压印以提高表面墨水分子结合量。
11.进一步地，对步骤(2)制备的图案化表面进行表征：图案化结合了墨水分 子的表面可以通过原子力显微镜或荧光显微镜等手段表征，对于原子力显微镜 表征，直接将得到的图案化表面进行冲洗吹干即可进行扫图表征；对于荧光显 微镜表征，需先用牛血清白蛋白或吐温20等试剂将图案化表面上的非特异性结 合位点进行封闭，再用荧光标记的链霉亲和素或量子点进行荧光染色，最后再 用荧光显微镜进行表征。
12.进一步地，在步骤(1)中，所述的模板通过生物亲和作用富集墨水的。
13.进一步地，在步骤(1)中，所述的生物亲和作用包括：
14.s1生物素和链霉亲和素的亲和作用；
15.s2组氨酸标签和含镍亲和树脂的亲和作用。
16.以上两种生物亲和作用早有报道并被广泛应用，而采用生物亲和作用来富 集墨水分子是本发明首次提出的。
17.更进一步地，在步骤(1)中，所述的模板的材料为硅、氮化硅或聚二甲基 硅氧烷。
18.进一步地，在步骤(2)中，所述的图案转印过程涉及力化学反应的。
19.进一步地，在步骤(2)中，所述的力化学反应涉及官能团包括：
20.s1马来酰亚胺和氨基的力化学反应
[0021][0022]
s2碳碳双键和巯基的力化学反应
[0023][0024]
s3碳碳三键和巯基的力化学反应；
[0025][0026]
s4苯硼酸和羟基的力化学反应
[0027][0028]
更进一步地，在步骤(2)中，所述的基底材料为硅或聚二甲基硅氧烷。
[0029]
本发明中采用对聚二甲基硅氧烷(pdms)为道康宁公司的sylgard 184， 其中包含基本组分和固化剂。制备方法如下：
[0030]
s1按10:1的重量比称取基本组分和固化剂并在容器中混匀，放入真空干 燥器中抽真空以除去气泡；
[0031]
s2将混合液倒入玻璃培养皿中，置于真空干燥器中出去多余气泡；
[0032]
s3放入100℃加热固化35分钟，取出冷却后脱模。
[0033]
有益效果：本发明具有低成本，高通量的特点，该技术制备的分子图案分 辨率高，稳定性高，并且能保持生物分子的活性。本发明可采用不同软硬程度 的模板以适应不同需求。
[0034]
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0035]
(1)本发明中所采用的模板可通过光刻，电子束曝光和刻蚀等技术制备， 模板可重复使用；本发明中采用的加压装置非常简单，在技术步骤(2)所述的 力化学压印中，只需要微量的墨水分子溶液。这些特征都使得本发明具有低成 本的优点。
[0036]
(2)本发明中步骤(2)所述的力化学压印过程仅需30s即可得到图案化 表面，速度
快，通量高；本发明可以通过重复步骤(2)的压印过程以提高表面 墨水结合量。
[0037]
(3)本发明制备的分子图案可达100nm甚至更高的精度；本发明制备的 图案化分子通过共价键与基底表面连接，稳定性高；本发明在生物分子溶液中 进行，能很好地保持生物分子活性。
附图说明
[0038]
图1为本发明的基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法的机理图。
[0039]
图2为本发明的采用硅模板压印制造图案化生物素表面及荧光表征。
[0040]
图3为本发明的探究墨水分子结合稳定性。
[0041]
图4为本发明的验证重复压印富集墨水增加墨水分子结合量。
[0042]
图5为本发明的基于力化学反应的图案化技术直接加工多种蛋白。
[0043]
图6为本发明的采用聚二甲基硅氧烷模板进行图案转印。
[0044]
图7为本发明的采用氮化硅材质模板进行图案转印。
[0045]
图8为本发明的采用刚性模板探究图案化技术的精度。
具体实施方式
[0046]
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更加全面的描述， 附图中给出了本发明的若干实施例，但是本发明可以通过不同的形式来实现， 并不限于文本所描述的实施例，相反的，提供这些实施例是为了使对本发明公 开的内容更加透彻全面。
[0047]
下面结合附图对发明内容作进一步详细说明。
[0048]
实施例1
[0049]
如图1所示，此种新型基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法从设 计原理上具有以下特征：
[0050]
特征1.此种新型生物分子图案化技术基于表面力化学反应：将能发生力化 学反应的官能团分别修饰在基底和墨水分子上，在受力条件下墨水分子和基底 上的力响应官能团会发生力化学反应，而在表面不受力区域则不发生反应。采 用表面预设好图案的模板来施加压力，凸起的图案区域会与基底接触并产生压 力，而凹陷的非图案区域不产生压力，因此可以将墨水分子图案化结合到表面 (如图2所示)。
[0051]
特征2.此种基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法中墨水分子与基 底间形成稳定的共价连接：可采用多种能发生力化学反应的力响应官能团对基 底和墨水分子，包括马来酰亚胺与氨基，苯硼酸与硅羟基以及双键与巯基。上 述力响应官能团在受力下发生力化学反应，形成比生物亲和作用强的共价相互 作用，从而将生物分子稳定地连接在表面(如图3所示)。
[0052]
特征3.此种新型基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法采用生物亲 和作用来富集墨水：以提高表面墨水分子结合量。将生物亲和受体和配体分别 修饰在模板和墨水分子上，在墨水环境中模板上的受体通过与墨水分子的配体 结合来富集墨水分子，而在压印过程中墨水分子与表面形成共价连接，较弱的 生物亲和作用会在移开模板的过程中断开，从而在图案区域留下大量墨水分子。 上述生物亲和作用包括链霉亲和素和生物素的亲和作用，含镍亲和树脂和组氨 酸标签的作用等。
[0053]
特征4.此种新型基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法可通过多次 压印来提高表面墨水分子结合量：根据特征3所述模板可通过生物亲和作用富 集墨水，因此可在一次压印步骤后释放模板，使其重新结合墨水环境中的墨水 分子，再次压印到同一位置以提高图案区域的墨水分子结合量。此种重复压印 的步骤可进行多次循环(如图4所示)。
[0054]
特征5.此种新型基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法可将生物分 子作为墨水直接图案化加工：如上所述，墨水分子是修饰了力响应官能团和生 物亲和配体的二元架构分子，而连接力响应端和生物亲和端的分子链可以是聚 乙二醇，也可以是多肽，蛋白质和dna等生物分子。因此可以通过此种基于力 化学反应的分子图案化表面的制备方法直接图案化加工到表面(如图5所示)。
[0055]
特征6.此种新型基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法加工的生物 分子图案精度取决于模板：相较于微接触印刷技术而言，此种新型生物分子图 案化技术的原理并非墨水的转移，而是图案区域的墨水分子受力发生力化学反 应从而共价结合到表面，因此不存在墨水扩散的问题。此种新型生物分子图案 化技术加工的图案尺寸取决于模板中的图案凸起与基底之间的接触面积。对于 弹性模板而言，压强越大则模板形变量越大，因此模板上每个微图案与基底的 接触面积增大，最终使得墨水分子图案随之变大(如图6所示)；对于刚性模板 而言，压强变化不会显著改变模板上微图案与基底的接触面积，因此最终得到 的墨水分子图案可以完全复制模板上的图案(如图7所示)。模板上图案精度越 高，则最终墨水分子图案的精度也越高(如图8所示)。
[0056]
实施例2
[0057]
本发明的此种新型图案化技术的流程包括模板与基底的修饰，力化学压印 和图案化表面的表征，步骤如下：
[0058]
在步骤(1)中，模板与基底的修饰：对于硅和氮化硅模板，首先用丙酮对 其表面进行清洗，再将其依次浸泡在80℃的铬酸和食人鱼洗液中，纯水冲洗再 吹干后依次修饰氨基硅烷化试剂的乙醇溶液和戊二醛水溶液，随后再用链霉亲 和素或含镍亲和树脂对其进行修饰；对于聚二甲基硅氧烷模板，首先用乙醇对 其表面进行清洗后置于紫外臭氧环境中处理，随后用盐酸多巴胺包覆在其表面， 最后再修饰链霉亲和素或含镍亲和树脂；对于硅基底而言，首先将其置于丙酮 中进行超声清洗，再将其依次浸泡在80℃的铬酸和食人鱼洗液中，纯水冲洗再 吹干后依次修饰氨基硅烷化试剂；
[0059]
所述的模板通过生物亲和作用富集墨水的。
[0060]
所述的生物亲和作用包括：
[0061]
s1生物素和链霉亲和素的亲和作用；
[0062]
s2组氨酸标签和含镍亲和树脂的亲和作用。
[0063]
所述的模板的材料为硅、氮化硅或聚二甲基硅氧烷。
[0064]
在步骤(2)中，力化学压印：将具有力响应端和生物亲和端的墨水分子溶 解在模拟生理环境的缓冲溶液中，将其浸入(1)所述的官能化模板和基底之间， 施加压力使墨水分子结合到基底上，释放使模板重新富集墨水分子，再反复压 印以提高表面墨水分子结合量；
[0065]
图案化表面的表征：图案化结合了墨水分子的表面可以通过原子力显微镜 或荧光显微镜等手段表征，对于原子力显微镜表征，直接将步骤(2)中得到的 图案化表面进行
冲洗吹干即可进行扫图表征；对于荧光显微镜表征，需先用牛 血清白蛋白或吐温20等试剂将图案化表面上的非特异性结合位点进行封闭，再 用荧光标记的链霉亲和素或量子点进行荧光染色，最后再用荧光显微镜进行表 征。
[0066]
所述的图案转印过程涉及力化学反应的。
[0067]
所述的力化学反应涉及官能团包括：
[0068]
s1马来酰亚胺和氨基的力化学反应
[0069][0070]
s2碳碳双键和巯基的力化学反应
[0071][0072]
s3碳碳三键和巯基的力化学反应
[0073][0074]
s4苯硼酸和羟基的力化学反应
[0075]
所述的基底材料为硅或聚二甲基硅氧烷。
[0076]
本发明中采用道康宁公司sylgard 184制备pdms，包含基本组分和固 化剂。制备方法如下：
[0077]
按10:1的重量比称取基本组分和固化剂并在容器中混匀，放入真空干燥器 中抽真空以除去气泡；
[0078]
将混合液倒入玻璃培养皿中，置于真空干燥器中出去多余气泡；
[0079]
放入100℃加热固化35分钟，取出冷却后脱模。
[0080]
本发明所述的聚二甲基硅氧烷在基于力化学反应的分子图案化表面中应 用。
[0081]
实施例3
[0082]
实施例3与实施例2的区别在于：在步骤(1)中，模板与基底的修饰：对 于硅和氮化硅模板，首先用丙酮对其表面进行清洗，再将其依次浸泡在100℃ 的铬酸和食人鱼洗液中，纯水冲洗再吹干后依次修饰氨基硅烷化试剂的乙醇溶 液和戊二醛水溶液，随后再用链霉亲和素或含镍亲和树脂对其进行修饰；对于 聚二甲基硅氧烷模板，首先用乙醇对其表面进行清洗后置于紫外臭氧环境中处 理，随后用盐酸多巴胺包覆在其表面，最后再修饰链霉亲和素或含镍亲和树脂； 对于硅基底而言，首先将其置于丙酮中进行超声清洗，再将其依次浸泡在100℃ 的铬酸和食人鱼洗液中，纯水冲洗再吹干后依次修饰氨基硅烷化试剂；
[0083]
下面对本发明各项特征进行实施例试验：
[0084]
试验例1
[0085]
本发明可基于力化学反应实现分子图案化。
[0086]
根据步骤(1)，在方形阵列模板和硅基底上分别修饰链霉亲和素和氨基。 将通过聚乙二醇连接生物亲和端和力响应端分别为生物素和马来酰亚胺的分子 作为墨水分子，进行步骤(2)所述力化学压印，转印生物素图案的基底经过所 述荧光染色后进行荧光成像，如图2c所示。模板上的图案经过此种分子图案化 技术成功地转印到了基底上，而在图案外区域无明显荧光信号。
[0087]
试验例2
[0088]
本发明制造的生物分子图案稳定性良好。
[0089]
用酸性，碱性及巯基乙醇溶液对实施例1中所获得的图案化荧光蛋白表面 进行处理，如图3b所示，荧光信号并未发生明显衰减，验证了生物分子图案的 稳定性良好。如图3c，将通过步骤(1)获得的氨基官能化表面经过压印墨水分 子。如图3d所示，相较于只是简单的物理吸附墨水而言，压印墨水后表面氮元 素的n1s谱出现仲胺的结合能峰，表明氨基与马来酰亚胺之间发生了加成反应， 直接验证了墨水分子与表面的共价连接。
[0090]
试验例3
[0091]
本发明可通过重复压印步骤提高墨水分子结合量。
[0092]
如图4a所示，可以通过重复步骤(2)所述力化学压印过程，从而将模板 多次富集的墨水分子结合到同一图案区域，使得图案区域结合的墨水分子大大 提高。采用与实施例1相同的实验条件，在力化学压印过程中重复压印释放1， 3，6次，在经过荧光染色后统计不同条件下荧光图案的荧光强度。如图4b所示， 随着重复次数的增加，图案的荧光强度也随之增加，表明了重复压印提高了表 面墨水分子结合量。
[0093]
试验例4
[0094]
本发明可直接图案化加工多种蛋白质。
[0095]
如特征5所述，此种生物分子图案化技术可将生物分子作为墨水直接进行 图案化加工。如图5a所示，在步骤(1)中采用马来酰亚胺和含镍亲和树脂分 别对基底和两种模板进行修饰，在步骤(2)中将含组氨酸标签的红色荧光蛋白 和绿色荧光蛋白作为墨水分子依次压印到基底上，图案化的多蛋白阵列通过步 骤(3)所述的荧光染色步骤采用量子点进行染色。如图5b所示，通过此种新 型基于力化学反应的分子图案化表面的制备方法成功将两种蛋白按不同图案固 定在同一表面。
[0096]
试验例5
[0097]
本发明可实现百纳米的精度。
[0098]
如特征6所述，此种生物分子图案化技术制造的生物分子图案精度取决于 模板精度和材质。采用聚二甲基硅氧烷作为弹性模板的材料，按步骤(1)所述 的方法在其表面修饰链霉亲和素，在600kpa压强下实施步骤(3)所述力化学 压印，采用墨水以及后续染色表征方法与实施例1相同。如图6所示，荧光图 案尺寸相较于弹性模板有所增大，表明弹性模板在压力下发生了形变。而采用 氮化硅作为刚性模板的材料，按实施例1的方法步骤获得的荧光图案与模板的 图案尺寸相符，表明刚性模板未发生显著形变(如图7所示)。采用硅作为刚性 模板的材料制备了百纳米精度的模板，如图8所示，按实施例1中的方法步骤 得到了百纳米精度的荧光图案。
[0099]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简
化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。