包含新型化合物的用于抗糖尿病和抗肥胖的组合物的制作方法

1.本发明涉及一种新型化合物以及包含以该化合物作为活性成分的抗糖尿病和抗肥胖的组合物。


背景技术：

2.目前已知的约880种g蛋白偶联受体(gpcrs)是所有哺乳动物中最丰富的膜蛋白。其中，约60％与视觉、嗅觉、味觉等有关，约400种gpcrs，包括剩余的孤儿gpcrs，在体内受各种配体(如蛋白质、肽激素、氨基酸、胺和脂质)调控，并参与各种生命现象。特别是，gpcrs与诸如代谢疾病、心血管疾病、退行性疾病和癌变等疾病有关。因此，它是新药开发的一个重要药物靶点，迄今为止开发的药物中超过50％与gpcr的活性直接或间接相关。
3.另一方面，gpr39(g蛋白偶联受体39)是孤儿gpcrs中的一种，到目前为止尚未发现其内源性配体。gpr39属于ghrelin受体(ghsr，生长激素促分泌素受体)家族，已知分布于胃、肠、胰腺、肝、肾、生殖和脂肪组织(cellular and molecular life sciences，2011年1月，第68卷，第1期，第85-95页)。通过对gpr39敲除(ko)小鼠进行高脂或低脂饮食控制的体外gpr39沉默和代谢功能研究，发现gpr39与体重增加和体脂积累有关(gastroenterology 2006，131:1131-1141)。此外，通过对gpr39 ko小鼠的研究，证实gpr39 ko小鼠在高脂饮食控制下血糖水平升高，而胰岛素分泌受损并且葡萄糖依赖性胰岛素分泌(葡萄糖刺激的胰岛素分泌)减少(endocrinology 2009,150:2577-2585)。
4.以上结果表明gpr39在机体的生理功能中发挥着重要作用，而gpr39的调节剂有望成为治疗例如糖尿病、肥胖等代谢性疾病的一种新的候选药物。
5.现有技术文件
6.非专利文献
7.(非专利文献1)cellular and molecular life sciences,2011年1月，第68卷，第1期，第85-95页
8.(非专利文献2)gastroenterology 2006，131:1131-1141
9.(非专利文献3)endocrinology 2009,150:2577-2585


技术实现要素：

10.技术问题
11.本发明人通过证实由特定氨基酸序列或其变体组成的肽可以有效调节gpr39的活性以显示其抗糖尿病和抗肥胖的作用，从而完成了本发明。
12.因此，本发明的一个目的是提供由下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
13.[式1]
[0014][0015]
问题的解决方案
[0016]
为了实现上述目的，在本发明的一个方面，提供了一种下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐：
[0017]
[式1]
[0018][0019]
在式1中
[0020]
a为
–
c(-r0)-，-n＝或-n(-r1)-，
[0021]
cy为c
6-14
芳基或5至6元杂芳基，
[0022]
r1和r3各自独立地为氢、ra、氨保护基、被1至3个ra取代的c
1-6
烷基、c
3-10
环烷基或5至6元杂环基，其中，所述杂环基具有或不具有1至3个选自苯乙基和环己基乙基的取代基，
[0023]
r2为氢、ra或5至6元杂环基，
[0024]
r0为氢，或r0和r2相互连接以与它们所连接的两个碳原子一起形成苯环，
[0025]
ra各自独立地为c
3-10
环烷基或c
6-14
芳基，其中，所述芳基具有或不具有一个或多个选自卤素、-oh、被5至6元杂芳基取代的c
6-14
芳基、c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基的取代基，
[0026]
n为1到10，
[0027]
r4为氢、c
1-10
烷基或c
1-c
20
烷基羰基，
[0028]
r5为氢、卤素、cf3或c
1-6
烷基，
[0029]
r6为氢、c
1-10
烷基或-s(＝o)2oh，
[0030]
r7和r8各自独立地为氢、卤素、硝基、氨基或c
1-6
烷基，
[0031]
r9为-oh或-nh2，并且
[0032]r10
为氢、氨保护基或生物素，其中，所述杂环基和杂芳基各自独立地包含至少一个
选自n、s和o的杂原子。
[0033]
在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0034]
在本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗糖尿病的方法，包括向哺乳动物施用所述化合物或其药学上可接受的盐于。
[0035]
在本发明的另一个方面，提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗糖尿病的药物中的用途。
[0036]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或改善糖尿病的保健功能食品组合物，其包含所述化合物或其营养上可接受的盐作为活性成分。
[0037]
在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或治疗肥胖症的药物组合物，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0038]
在本发明的另一个方面，提供了一种预防或治疗肥胖症的方法，包括向哺乳动物施用所述化合物或其药学上可接受的盐。
[0039]
在本发明的另一个方面，提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗肥胖症的药物中的用途。
[0040]
在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或改善肥胖的保健功能食品组合物，其包含所述化合物或其营养上可接受的盐作为活性成分。
[0041]
在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或改善肥胖的化妆品组合物，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0042]
发明效果
[0043]
本发明的化合物或其药学上可接受的盐选择性地且特异性地作为gpr39的激动剂，激活胰腺β细胞中葡萄糖依赖性胰岛素分泌机制，并显著提高葡萄糖耐量和抗糖尿病作用，因此，可以用作改善、预防或治疗糖尿病的组合物。此外，本发明的化合物或其药学上可接受的盐作用于gpr39，从而在脂肪细胞和脂肪组织中具有脂肪分解能力，因此，可以用作改善、预防或治疗肥胖症的组合物。
附图说明
[0044]
图1示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-1的纯度。
[0045]
图2示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-2的纯度。
[0046]
图3示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-3的纯度。
[0047]
图4示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-4的纯度。
[0048]
图5示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-5的纯度。
[0049]
图6示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-6的纯度。
[0050]
图7示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-7的纯度。
[0051]
图8示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-8的纯度。
[0052]
图9示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-9的纯度。
[0053]
图10示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-10的纯度。
[0054]
图11示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-11的纯度。
[0055]
图12示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-12的纯度。
[0056]
图13示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-13的纯度。
[0057]
图14示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-14的纯度。
[0058]
图15示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-15的纯度。
[0059]
图16示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-16的纯度。
[0060]
图17示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-17的纯度。
[0061]
图18示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-18的纯度。
[0062]
图19示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-19的纯度。
[0063]
图20示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-20的纯度。
[0064]
图21示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-21的纯度。
[0065]
图22示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-22的纯度。
[0066]
图23示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-23的纯度。
[0067]
图24示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-24的纯度。
[0068]
图25示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-25的纯度。
[0069]
图26示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-26的纯度。
[0070]
图27示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-27的纯度。
[0071]
图28示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-28的纯度。
[0072]
图29示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-29的纯度。
[0073]
图30示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-30的纯度。
[0074]
图31示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-31的纯度。
[0075]
图32示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-32的纯度。
[0076]
图33示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-33的纯度。
[0077]
图34示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-34的纯度。
[0078]
图35示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-35的纯度。
[0079]
图36示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-36的纯度。
[0080]
图37示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-1的分子量。
[0081]
图38示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-2的分子量。
[0082]
图39示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-3的分子量。
[0083]
图40示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-4的分子量。
[0084]
图41示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-5的分子量。
[0085]
图42示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-6的分子量。
[0086]
图43示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-7的分子量。
[0087]
图44示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-8的分
子量。
[0088]
图45示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-9的分子量。
[0089]
图46示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-10的分子量。
[0090]
图47示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-11的分子量。
[0091]
图48示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-12的分子量。
[0092]
图49示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-13的分子量。
[0093]
图50示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-14的分子量。
[0094]
图51示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-15的分子量。
[0095]
图52示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-16的分子量。
[0096]
图53示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-17的分子量。
[0097]
图54示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-18的分子量。
[0098]
图55示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-19的分子量。
[0099]
图56示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-20的分子量。
[0100]
图57示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-21的分子量。
[0101]
图58示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-22的分子量。
[0102]
图59示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-23的分子量。
[0103]
图60示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-24的分子量。
[0104]
图61示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-25的分子量。
[0105]
图62示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-26的分子量。
[0106]
图63示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-27的分子量。
[0107]
图64示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-28的分子量。
[0108]
图65示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-29的分子量。
[0109]
图66示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-30的分子量。
[0110]
图67示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-31的分子量。
[0111]
图68示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-32的分子量。
[0112]
图69示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-33的分子量。
[0113]
图70示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-34的分子量。
[0114]
图71示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-35的分子量。
[0115]
图72示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-36的分子量。
[0116]
图73示出了通过使用荧光素酶检测系统(顶部)和钙内流检测系统(底部)分析hkfy-34与gpr39受体的特异性结合的结果。
[0117]
图74示出了通过使用荧光素酶检测系统分析每个内源性配体对属于ghsr家族的ntsr1、ntsr2、ghsr、mtlr、nmur1、nmur2和trhr以及hkfy衍生物hkfy-34的结合能力的结果。
[0118]
图75示出了通过大鼠胰岛素elisa分析hkfy-34对胰岛素分泌能力的影响结果。
[0119]
图76示出了通过大鼠胰岛素elisa分析hkfy-34对葡萄糖依赖性胰岛素分泌能力的影响结果。
[0120]
图77示出了通过rt-pcr分析hkfy-34处理后irs2和ins2的mrna表达水平的结果。
[0121]
图78示出了通过蛋白质印迹分析脂肪细胞和脂肪组织中gpr39受体的表达水平的结果。
[0122]
图79示出了用hkfy-34处理3t3-l1细胞后，分析hsl、atgl和脂滴包被蛋白perilipin-a的mrna表达水平的结果。
[0123]
图80示出了用hkfy-34处理wat组织后，分析hsl、atgl和脂滴包被蛋白perilipin-a的mrna表达水平的结果。
[0124]
图81示出了用hkfy-34处理3t3-l1细胞后，分析hsl的mrna表达水平的结果。
[0125]
图82示出了用hkfy-34处理3t3-l1细胞后，分析atgl的mrna表达水平的结果。
[0126]
图83示出了用hkfy-34处理3t3-l1细胞后，分析脂滴包被蛋白perilipin-a的mrna表达水平的结果。
[0127]
图84示出了用hkfy-34处理的3t3-l1细胞和wat组织后，通过浓度分析脂肪分解能力的结果。
[0128]
图85示出了通过蛋白质印迹分析用hkfy-34处理的3t3-l1细胞中perk和ppka的表
达水平的结果。
[0129]
图86示出了通过蛋白质印迹分析用hkfy-34处理的wat组织中perk和ppka的表达水平的结果。
[0130]
图87示出了通过使用血糖仪分析用hkfy-34治疗糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量水平的结果。
[0131]
图88示出了通过使用小鼠elisa分析用hkfy-34治疗糖尿病模型小鼠的胰岛素水平的结果。
[0132]
图89示出了通过使用血糖仪分析用hkfy-34治疗肥胖症模型小鼠的葡萄糖耐量水平的结果。
[0133]
图90示出了通过使用小鼠elisa分析用hkfy-34治疗的肥胖症模型小鼠的胰岛素水平的结果。
[0134]
图91示出了通过使用血糖仪分析用hkfy-34治疗的高脂肪饮食诱导的gpr39 ko模型小鼠的葡萄糖耐量水平的结果。
[0135]
图92示出了通过使用血糖仪分析根据hkfy-34治疗的糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量水平的结果。
[0136]
图93示出了验证根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-1的1h nmr的结果。
[0137]
图94示出了验证根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-2的1h nmr的结果。
[0138]
图95示出了验证根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-34的1h nmr的结果。
[0139]
图96示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-37的纯度。
[0140]
图97示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-37的分子量。
[0141]
图98示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-38的纯度。
[0142]
图99示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-38的分子量。
[0143]
图100示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-39的纯度。
[0144]
图101示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-39的分子量。
[0145]
图102示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-40的纯度。
[0146]
图103示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-40的分子量。
[0147]
图104示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-41的纯度。
[0148]
图105示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-41的分子量。
[0149]
图106示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-42的纯度。
[0150]
图107示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-42的分子量。
[0151]
图108示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-43的纯度。
[0152]
图109示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-43的分子量。
[0153]
图110示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-44的纯度。
[0154]
图111示出了是通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-44的分子量。
[0155]
图112示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-45的纯度。
[0156]
图113示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-45的分子量。
[0157]
图114示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-46的纯度。
[0158]
图115示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-46的分子量。
[0159]
图116示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-47的纯度。
[0160]
图117示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-47的分子量。
[0161]
图118示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-48的纯度。
[0162]
图119示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-48的分子量。
[0163]
图120示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-49的纯度。
[0164]
图121示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-49的分子量。
[0165]
图122示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-50的纯度。
[0166]
图123示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-50的分子量。
[0167]
图124示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-51的纯度。
[0168]
图125示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-51的分子量。
[0169]
图126示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-52的纯度。
[0170]
图127示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-52的分子量。
[0171]
图128示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-53的纯度。
[0172]
图129示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-53的分子量。
[0173]
图130示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-54的纯度。
[0174]
图131示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-54的分子量。
[0175]
图132示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-55的纯度。
[0176]
图133示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-55的分子量。
[0177]
图134示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-56的纯度。
[0178]
图135示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-56的分子量。
[0179]
图136示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-57的纯度。
[0180]
图137示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-57的分子量。
[0181]
图138示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-58的纯度。
[0182]
图139示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-58的分子量。
[0183]
图140示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-59的纯度。
[0184]
图141示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-59的分子量。
[0185]
图142示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-60的纯度。
[0186]
图143示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-60的分子量。
[0187]
图144示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-61的纯度。
[0188]
图145示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-61的分子量。
[0189]
图146示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-62的纯度。
[0190]
图147示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-62的分子量。
[0191]
图148示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-63的纯度。
[0192]
图149示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-63的分子量。
[0193]
图150示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-64的纯度。
[0194]
图151示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-64的分子量。
[0195]
图152示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-65的纯度。
[0196]
图153示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-65的分子量。
[0197]
图154示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-66的纯度。
[0198]
图155示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-66的分子量。
[0199]
图156示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-67的纯度。
[0200]
图157示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-67的分子量。
[0201]
图158示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-68的纯度。
[0202]
图159示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-68的分子量。
[0203]
图160示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-69的纯度。
[0204]
图161示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-69的分子量。
[0205]
图162示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-70的纯度。
[0206]
图163示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-70的分子量。
[0207]
图164示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-71的纯度。
[0208]
图165示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-71的分子量。
[0209]
图166示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-72的纯度。
[0210]
图167示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-72的分子量。
[0211]
图168示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-73的纯度。
[0212]
图169示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-73的分子量。
[0213]
图170示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-74的纯度。
[0214]
图171示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-74的分子量。
[0215]
图172示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-75的纯度。
[0216]
图173示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-75的分子量。
[0217]
图174示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-76的纯度。
[0218]
图175示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-76的分子量。
[0219]
图176示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-77的纯度。
[0220]
图177示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-77的分子量。
[0221]
图178示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-78的纯度。
[0222]
图179示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-78的分子量。
[0223]
图180示出了通过hplc验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-79的纯度。
[0224]
图181示出了通过离子质谱验证的根据本发明的一个实施方案制备的hkfy-79的分子量。
[0225]
本发明的最佳实施方式
[0226]
以下，将更详细地描述本发明。
[0227]
在本发明的一个方面，提供了由下式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
[0228]
[式1]
[0229][0230]
在式1中
[0231]
a为
–
c(-r0)-，-n＝或-n(-r1)-，
[0232]
cy为c
6-14
芳基或5至6元杂芳基，
[0233]
r1和r3各自独立地为氢、ra、氨保护基、被1至3个ra取代的c
1-6
烷基、c
3-10
环烷基或5至6元杂环基，其中所述杂环基具有或不具有1至3个选自苯乙基和环己基乙基的取代基，
[0234]
r2为氢、ra或5至6元杂环基，和
[0235]
r0为氢，或r0和r2相互连接以与它们所连接的两个碳原子一起形成苯环，
[0236]
ra各自独立地为c
3-10
环烷基或c
6-14
芳基，其中，所述芳基具有或不具有一个或多个选自卤素、-oh、被5至6元杂芳基取代的c
6-14
芳基、c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基的取代基，
[0237]
n为1到10，
[0238]
r4为氢、c
1-10
烷基或c
1-c
20
烷基羰基，
[0239]
r5为氢、卤素、cf3或c
1-6
烷基，
[0240]
r6为氢、c
1-10
烷基或-s(＝o)2oh，
[0241]
r7和r8各自独立地为氢、卤素、硝基、氨基或c
1-6
烷基，
[0242]
r9为-oh或-nh2，并且
[0243]r10
为氢、氨保护基团或生物素，
[0244]
其中，所述杂环基和杂芳基各自独立地包含至少一个选自n、s和o的杂原子。
[0245]
在本发明的一个实施方案中，所述化合物可以为肽，所述肽可以为具有四个氨基酸序列的肽的衍生物，所述四个氨基酸序列可以为his-lys-phe-tyr(seq id no:1)。
[0246]
根据本领域使用的惯例，在本文的式中，术语“键”用于表示部分或取代基与原子核或框架结构的连接点。
[0247]
如本文所用，术语“烷基”为具有正(伯)、仲、叔或环状碳原子的烃。例如，烷基可以具有1至20个碳原子(即c
1-c
20
烷基)、1至10个碳原子(即c
1-c
10
烷基)、或1至6个碳原子(即c
1-c6烷基)。合适的烷基的例子包括甲基(me，-ch3)、乙基(et，-ch2ch3)、1-丙基(n-pr，n-丙基，-ch2ch2ch3)、2-丙基(i-pr，i-丙基，-ch(ch3)2)、1-丁基(n-bu,正丁基、-ch2ch2ch2ch3)、2-甲基-1-丙基(i-bu、异丁基、ch2ch(ch3)2)、2-丁基(s-bu、s-丁基、-ch(ch3)ch2ch3)、2-甲基-2-丙基(t-bu、t-丁基、-c(ch3)3)、1-戊基(n-戊基、-ch2ch2ch2ch2ch3)、2-戊基-ch(ch3)ch2ch2ch3)、3-戊基(-ch(ch2ch3)2)、2-甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch2ch3)、3-甲基-2-丁基(-ch
(ch3)ch(ch3)2)、3-甲基-1-丁基(-ch2ch2ch(ch3)2)、2-甲基-1-丁基(-ch2ch(ch3)ch2ch3)、1-己基(-ch2ch2ch2ch2ch2ch3)、2-己基(-ch(ch3)ch2ch2ch2ch3)、3-己基(-ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3))、2-甲基-2-戊基(-c(ch3)2ch2ch2ch3)、3-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch(ch3)ch2ch3)、4-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch2ch(ch3)2)、3-甲基-3-戊基(-c(ch3)(ch2ch3)2)、2-甲基-3-戊基(-ch(ch2ch3)ch(ch3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch(ch3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-ch(ch3)c(ch3)3和辛基(-(ch2)7ch3)，但不限于其中。
[0248]
如本文所用，术语“环烷基”是指环中仅包含碳原子的饱和单环或多环。环烷基可具有3至7个碳原子作为单环，7至12个碳原子作为双环环烷基，以及多达约20个碳原子作为多环。单环环烷基具有3至6个环原子，更典型地具有5或6个环原子。双环环烷基有7至12个环原子排列成双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系统，或9至10个环原子排列成双环[5,6]或[6,6]系统或螺稠环。单环环烷基的非限制性例子可以包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基(它们各自可以被取代或未被取代)。
[0249]
如本文所用，术语“杂环基”包括文献[paquette，leo a.；现代杂环化学原理(w.a.benjamin,纽约,1968)，特别是第1、3、4、6、7和9章；杂环化合物的化学，一系列专论”(john wiley&sons，纽约，1950年至今)，特别是第13、14、16、19和28卷；以及j.am.chem.soc.(1960)82:5566]，但不限于此。术语“杂环基”是指形成为饱和或不饱和单环或多环并具有一个或多个杂原子的芳族或非芳族环基。例如，“5至6元杂环基”可以指总共具有5至6个杂原子和/或碳原子的杂环基。如本文所用，当“杂环基”被描述为取代基时，它可以用作包括“杂环烷基”和“杂芳基”的术语。本文中，“杂环烷基”是指形成单环或多环并具有一个或多个杂原子的饱和环基团，“杂芳基”是指形成单环或多环并具有一个或多个杂原子的芳环基团，以及“杂原子”可以选自n、o和s。杂芳环的非限制性实例包括在“杂环基”的定义中列出的所有示例，包括吡啶基、吡咯基、恶唑基、吲哚基、异吲哚基、嘌呤基、呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咔唑基、咪唑基、噻唑基、异恶唑基、吡唑基、异噻唑基、喹啉基、异喹啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基(其可以是取代的或未取代的)等。
[0250]
如本文所用，术语“杂芳基”是指在环中具有一个或多个杂原子的芳族杂环基。可包含在芳环中的合适杂原子的非限制性实例包括氧、硫和氮。杂芳环的非限制性实例包括“杂环基”定义中列出的所有示例，包括吡啶基、吡咯基、恶唑基、吲哚基、异吲哚基、嘌呤基、呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咔唑基、咪唑基、噻唑基、异恶唑基、吡唑基，异噻唑基、喹啉基、异喹啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基(其可以是取代的或未取代的)等。
[0251]
如本文所用，术语“烷氧基”是指具有式-o-烷基的基团，其中，如上定义的烷基通过氧原子与母体化合物连接。烷氧基的烷基部分可以具有1至20个碳原子(即c
1-c
20
烷氧基)、1至12个碳原子(即c
1-c
12
烷氧基)、或1至6个碳原子(即c
1-c6烷氧基)。合适的烷氧基的例子包括甲氧基(-o-ch3或-ome)、乙氧基(-och2ch3或-oet)、叔丁氧基(-o-c(ch3)3或-o-tbu)等，但不限于此。
[0252]
如本文所用，术语“烷羰基”是指具有式-c(＝o)-烷基的基团，其中如上定义的烷基通过碳原子连接至母体化合物。烷羰基的烷基部分可以具有1至20个碳原子(即c
1-c
20
烷羰基)或5至17个碳原子(即c
5-c
17
烷羰基)。合适的烷羰基的例子包括辛酸(-c(＝o)(ch2)6ch3)、癸酸(-c(＝o)(ch2)8ch3)、月桂酸(-c(＝o)(ch2)
10
ch3)、豆蔻酸(-c(＝o)(ch2)
12
ch3)、棕榈酸(-c(＝o)(ch2)
14
ch3)等，但不限于此。
[0253]
涉及烷基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基(例如环烷基)等的术语“取代的”，例如，“取代的烷基”、“取代的芳基”、“取代的杂芳基”、“取代的杂环基”和“取代的碳环基(例如取代的环烷基)”是指烷基、芳基、杂芳基、杂环基、碳环基(例如环烷基)，其中一个或多个氢原子各自独立地被非氢取代基取代。典型的取代基包括-x、-r、-o-、＝o、-or、-sr、-s-、-nr2、-n r3、＝nr、-c(x)3、-cn、-ocn、-scn、-n＝c＝o、-ncs、-no、-no2、＝n-oh、＝n2、-n3、-nhc(＝o)r、-c(＝o)r、-c(＝o)nrr-s(＝o)2o-、-s(＝o)2oh、-s(＝o)2r、-os(＝o)2or、-s(＝o)2nr、-s(＝o)r、-op(＝o)(or)2、-c(＝o)r、亚烷基-c(＝o)r、-c(s)r、-c(＝o)or、亚烷基-c(＝o)or、-c(＝o)o-、亚烷基-c(＝o)o-、-c(＝s)or、-c(＝o)sr、-c(＝s)sr、-c(＝o)nrr、亚烷基-c(＝o)nrr、-c(＝s)nrr、-c(-nr)nrr(其中，每个x独立地为卤素：f、cl、br或i，r独立地为h、烷基、芳基、芳烷基或杂环)，但不限于此。亚烷基、亚烯基和亚炔基也可以被类似地取代。
[0254]
此外，本发明包括本发明化合物的药学上可接受的盐和加成盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐或三氟乙酸盐以及钠盐、钾盐和镁盐，但不限于此。
[0255]
本领域普通技术人员将理解，当诸如“烷基”、“芳基”、“杂环基”的部分被一个或多个取代基取代时，它可以任选地被称为诸如“亚烷基”、“亚芳基”、“亚杂环基”的部分(即，意味着母体“烷基”、“芳基”、“杂环基”部分的一个或多个氢原子被如上所述的取代基取代)。当诸如“烷基”、“芳基”、“杂环基”等部分在本文中被称为“取代的”或在附图中显示为被取代(或任选地被取代，例如，当取代基的数目从0到正数)，术语“烷基”、“芳基”、“杂环基”等应理解为与“亚烷基”、“亚芳基”、“杂环基”等可互换。
[0256]
本领域普通技术人员应该理解，应选择式1化合物的取代基和其它部分，以提供足够稳定的化合物，从而提供可以配制成可接受的稳定药物组合物的药学上有用的化合物。具有这种稳定性的式1的化合物被认为包括在本发明的范围内。
[0257]
如本文所用，术语“任选取代的”是指具有一个、两个或更多个取代基的式1化合物的特定部分。
[0258]
在本发明中，由式1表示的化合物可以为l-型或d-型的光学异构体。
[0259]
在本发明中，式1表示的化合物中，a可以为-c(-r0)-或-n(-r1)-，r1可以为氢，可以为氢，但不限于此。此外，r0可以为氢，r2可以为氢，可以为氢，r0和r2可以彼此连接并与它们所连接的两个碳原子一起形成苯环，但不限于此。另外，r3可以为选自由
组成的组中的一个，并且优选地，它可以为但不限于此。
[0260]
此外，n可以为3或4，r4可以为庚基羰基，r5可以为甲基或cf3，r6可以为氢或s(＝o)2oh，并且r7和r8可以各自独立地为氢或氨基。此外，r7和r8可以各自独立地为氢，r9可以为-oh，并且r
10
可以为氢、对甲苯磺酰基(p-ts)、叔丁氧羰基(t-boc)或生物素，但不限于此。此外，r5、r7和r8在苯环上被取代的位置没有特别限制。例如，r5可以在邻位(o-)、间位(m-)或对位(p-)被取代。
[0261]
它可以是选自由以下组成中的任何一种：
[0262]
1)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0263]
2)生物素-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0264]
3)his(苄基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0265]
4)d-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0266]
5)his(4-甲基三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0267]
6)his(damp-3)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0268]
7)his(damp-5)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0269]
8)his(damp-2)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0270]
9)his(2-苯乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0271]
10)his(2-萘-1-甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0272]
11)his(2-环己基乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0273]
12)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe-tyr，
[0274]
13)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-tyr，
[0275]
14)d-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-d-tyr，
[0276]
15)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-d-tyr，
[0277]
16)his(三苯甲基)-d-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-tyr，
[0278]
17)his(3,3-二苯乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0279]
18)his(fm)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0280]
19)his(苯乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0281]
20)his(4-甲氧基二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0282]
21)his(4-氯二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr,
[0283]
22)his(4-甲基二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0284]
23)his(金刚烷-1-基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0285]
24)his(三苯甲基)-lys(癸酸)-phe-tyr，
[0286]
25)his(三苯甲基)-lys(月桂酸)-phe-tyr，
[0287]
26)his(三苯甲基)-lys(豆蔻酸)-phe-tyr，
[0288]
27)his(三苯甲基)-lys(棕榈酸)-phe-tyr，
[0289]
28)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(氟)-tyr，
[0290]
29)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(溴)-tyr，
[0291]
30)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0292]
31)d-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0293]
32)his(1,3-二氟二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0294]
33)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr，
[0295]
34)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0296]
35)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(so3h)，
[0297]
36)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(2,6-二甲基)，
[0298]
57)his(2-苯基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0299]
58)his(1-苯基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0300]
59)his(1,2-二苯基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0301]
60)his(2-(4-叔丁基)苯基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0302]
61)his(1-(4-叔丁基)苯基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0303]
62)d-his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0304]
63)his(噻吩)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0305]
64)his(4-甲氧基二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0306]
65)his(4-羟基二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0307]
66)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr-nh2，
[0308]
67)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3-氯)，
[0309]
68)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3-硝基)，
[0310]
69)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3,5-硝基)，
[0311]
70)his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3-氨基)，
[0312]
71)his(二苯甲基)-orn(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0313]
72)生物素-his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0314]
73)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-3pal-tyr，
[0315]
74)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-2nal-tyr，
[0316]
75)his(甲苯磺酰基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，
[0317]
76)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-cf3)-tyr，
[0318]
77)his(叔丁硫醇)-lys(辛酸)-d-phe(4-cf3)-tyr，
[0319]
78)boc-trp-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr，和
[0320]
79)his(二苯甲基)lys(辛酸)。
[0321]
在本发明中，所述化合物可以是(x1)-(x2)-[his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr]，其中x1和x2可以各自独立地为选自20种氨基酸中的任意一种氨基酸或其衍生物，具体地，它可以为37)gly-ser-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(seq id no:2)。
[0322]
在本发明中，在由式1表示的化合物中，1至10个氨基酸或其衍生物可以进一步结合到该化合物的c-末端。具体地，该化合物可以为[his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr]-(x3)
a-(x4)
b-(x5)
c-(x6)
d-(x7)
e-(x8)
f-(x9)g，其中x3至x9可以各自独立地为选自20种氨基酸中的任何一种氨基酸或其衍生物，并且a至g可以为0或1，且它们中的至少一个可以为1。更具体地，所述化合物可以为选自由以下组成的组中的任何一种：38)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-ser-asp-gln-gln-ala-arg-phe(seq id no:3)，39)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-ser-gln-asn-gly-ala-arg-phe(seq id no:4)，40)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-ser-his-gln-gln-ala-arg-phe(seq id no:5)，41)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-gln-asn-gly-ala-arg-phe(seq id no:6)，42)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-his-gln-gln-ala-arg-phe(seq id no:7)，43)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-gln-asn-gln-ala-arg-phe(seq id no:8)，和44)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-trp(seq id no:9)。
[0323]
在本发明的另一方面，提供了一种化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由[his(三苯甲基)-lys(辛酸)]-(x
10
)
h-(x
11
)i组成，其中x
10
至x
11
可以各自独立地是选自20种氨基酸中的任何一种氨基酸或其衍生物，h和i可以为0或1，并且它们中的至少一个可以为1。具体地，所述化合物可以是选自以下组中的任意一种45)生物素-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-ala(联苯)-tyr(seq id no:10)，46)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-trp(seq id no:11)，47)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-tyr-phe(seq id no:12)，48)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-tyr-tyr(seq id no:13)，49)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe，50)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-ser(seq id no:14)，和51)his(三苯甲基)-lys(辛酸)-leu-tyr(seq id no:15)。
[0324]
在本发明的另一方面，提供了选自由以下各项组成的组中的任一种52)his(三苯甲基)-phe-tyr-asp-gln-gln-ala-arg-phe(seq id no:16)，53)his(三苯甲基)-gly-ser-lys(辛酸)-phe-tyr(seq id no:17)，54)lys(辛酸)-phe-tyr，55)lys(辛酸)-his(三苯甲基)-phe-tyr(seq id no:18)，56)his(三苯甲基)-lys(己酸)-phe-tyr-asp-gln-gln-ala-arg-phe(seq id no:19)和79)his(二苯甲基)lys(辛酸)。
[0325]
在本发明中，所述化合物可以以l-型和d-型氨基酸的混合物存在(例如，其可以为选自由his、lys、phe、tyr、ser、asp、gln、ala、arg和asn组成的组中的任一种氨基酸，但不限于此)，其中“d”是指d型氨基酸。
[0326]
在本发明中，“trt”为三苯甲基，“boc”为叔丁氧羰基，“tbu”为叔丁基，“fmoc”为9-芴基甲氧羰基，“dde”为1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基，并且“bip”是联苯丙氨酸。
[0327]
在本发明中，“生物素”为一种动植物生长所需的复合维生素b。天然的为d-型异构体，其中两个五元环的键是顺式构型。其他七种异构体，如顺式l-生物素或反式异生物素，
不显示辅酶活性。
[0328]
在本发明中，“氨保护基”可以为选自叔丁氧基羰基(boc)、对甲苯磺酰基(ts)、芴基甲氧基羰基、苄基、三苯基甲基和羧苄基的保护基，优选为对甲苯磺酰基或叔丁氧基羰基。
[0329]
在本发明中，当由式1表示的化合物中的r
10
为生物素时，生物素可以为由下式2表示的化合物。
[0330]
[式2]
[0331][0332]
式2中，n可以为1～10，优选为4，但不限于此。
[0333]
另外，在本发明中，式1表示的化合物可由下式3表示，当a为-n＝时，r2为氢，r3为n为4，r4为庚羰基，cy为苯基，r5为甲基，r6为s(＝o)2oh，r7、r8和r10各自独立地为氢，并且r9为-oh，并且seq id no：1的氨基酸可以为取代的形式，例如his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr。下式3表示的化合物的iupac名称为((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基))丙酰胺基)-6-辛酰胺基六酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸，在本发明的一个实施例中，命名为hkfy-34。
[0334]
[式3]
[0335][0336]
在本发明的一个实施方案中，证实了根据本发明的具有式1结构的化合物的肽衍生物选择性和特异性地结合gpr39(g蛋白偶联受体39)，孤儿g蛋白偶联受体(孤儿gpcr)之一，其为膜蛋白(表3至5以及图73和74)。
[0337]
此外，在本发明的一个实施方案中，当用根据本发明的肽衍生物处理大鼠胰岛素瘤细胞或大鼠胰岛细胞时，葡萄糖依赖性胰岛素分泌能力通过gpr39受体增强(图75至77)。此外，证实了当用根据本发明的肽衍生物治疗糖尿病小鼠模型和肥胖症小鼠模型时，葡萄糖耐量降低，胰岛素水平增加，并且抗糖尿病效果优异(图87至90和92)。此外，当用根据本发明的肽衍生物处理gpr39 ko小鼠时，未观察到显著的葡萄糖耐量(图91)。因此，证实了根据本发明的肽衍生物特异性地作用于与葡萄糖耐量有关的gpr39。
[0338]
因此，在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗糖尿病的药物组合物，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0339]
如本文所用，术语“糖尿病”为一类代谢性疾病，例如胰岛素分泌不足或不能正常发挥作用。糖尿病的特征为高血糖，其中血液中的葡萄糖浓度升高，高血糖引起各种症状和体征，并引起尿液中葡萄糖的排泄。糖尿病分为1型和2型。1型糖尿病，以前称为“青少年糖尿病”，为一种完全无法产生胰岛素的疾病。胰岛素相对缺乏的2型糖尿病以胰岛素抵抗为特征。2型糖尿病似乎很大程度上是由饮食西化、缺乏运动、压力等环境因素引起的，如高热量、高脂肪、高蛋白饮食，但除此之外，糖尿病还可能由以下因素引起，特定基因的缺陷，也可能由胰腺手术、感染或药物引起。在本发明中，“糖尿病”可以包括1型或2型，并且可以指由缺乏胰岛素引起的葡萄糖耐量的慢性疾病。
[0340]
此外，本发明提供一种预防或治疗糖尿病的方法，包括给哺乳动物施用所述化合物或其药学上可接受的盐。
[0341]
此外，本发明提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗糖尿病的药物中的用途。
[0342]“药物组合物”可以口服、肌内或皮下给药。用于口服给药的制剂可以采取多种形式，例如糖浆、片剂、胶囊、乳膏和锭剂。糖浆制剂通常包含化合物或其盐在液体载体例如乙醇、花生油、橄榄油、甘油或水中的悬浮液或溶液，并且任选地包含甜味剂或着色剂。当组合物为片剂形式时，可以使用通常用于制备固体制剂的任何药物载体。这种载体的例子包括硬脂酸镁、白土、滑石、明胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。当组合物为胶囊形式时，可以使用任何常规的包封方法，例如，载体可以包含在硬明胶胶囊壳中。当组合物以软明胶胶囊壳的形式配制时，可以使用通常用于制备分散体或悬浮液的任何药物载体，并且这种载体为水性树胶、纤维素、硅酸盐或油。用于肌内或皮下给药的制剂可以制备成液体形式，例如溶液、悬浮液和乳液，包括水性溶剂，例如水、生理盐水和林格氏溶液；或亲脂性溶剂，如脂肪油、芝麻油、玉米油和合成脂肪酸酯。
[0343]
该组合物优选配制成特定患者的特定剂型。
[0344]
对于口服给药的每个单位剂量，优选包含式1的化合物或其在药物上可接受的盐，其含量为0.1mg/kg至500mg/kg,1mg/kg至100mg/kg，或10mg/kg至50mg/kg。
[0345]
适于口服给药的日给药剂量为约0.01至40mg/kg式1化合物或其药学上可接受的盐，并且可以根据患者的状况每天给药1至6次。
[0346]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或改善糖尿病的保健功能食品组合物，其包含所述化合物或其营养学上可接受的盐作为活性成分。
[0347]
本发明的保健功能食品可以为粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料的形式，并且可以为糖果、巧克力、口香糖、茶、复合维生素、保健补充食品等。
[0348]
在这种情况下，保健功能食品中所含的本发明的化合物或其药学上可接受的盐的含量通常可以为食品总重量的0.01～50重量％，或0.1～20重量％。另外，在保健饮料组合物的情况下，相对于保健饮料组合物100ml，可以含有0.02～10g、或0.3～1g的量。
[0349]
该食品可以进一步包括营养上可接受的食品补充添加剂以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐。
[0350]
在本发明的一个实施方案中，证实了当用根据本发明的肽衍生物处理3t3-l1细胞和白色脂肪组织细胞(wat细胞)时，脂肪分解能力优异(图78至84)，并且通过分析脂解的机制，证实它与调节脂肪细胞主要脂解的β-肾上腺素能受体具有相同的信号传导和脂解调节机制(图85和86)。
[0351]
因此，在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或治疗肥胖症的药物组合物，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0352]
这里所说的“肥胖”是指体内脂肪组织过多的状态，长时间消耗的营养物质超过能量消耗时，能量不平衡就会导致肥胖。有时是由于特定基因的基因突变导致食欲不振的功能出现问题，或者是由库欣综合征等内分泌疾病和各种增加食欲的药物引起的，但一般来说，它是因为能量摄入量大于能量消耗量。总的来说，肥胖是由遗传和环境影响共同造成的。特别是，现代生活环境富含高热量食物，即使较少的身体活动也不会造成不便，这导致了肥胖症的爆炸性增长。
[0353]
此外，本发明提供了一种预防或治疗肥胖症的方法，包括给哺乳动物施用该化合物或其药学上可接受的盐。
[0354]
此外，本发明提供了该化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗肥胖症的药物中的用途。
[0355]
在本发明的另一方面，提供了一种用于预防或改善肥胖的保健功能食品组合物，其包含所述化合物或其营养上可接受的盐作为活性成分。
[0356]
在本发明的另一个方面，提供了一种用于预防或改善肥胖的化妆品组合物，其包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0357]
本发明的实施方式
[0358]
在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明不限于以下实施例。
[0359]
实施例1hkfy衍生物的制备
[0360]
实施例1.1hkfy-1的制备
[0361]
为了制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸，hkfy-1)，将fmoc-tyr(叔丁基)和dmf(二甲基甲酰胺)加入到三苯甲基树脂上以制备fmoc-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，fmoc-phe-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中以制备fmoc-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。
[0362]
将含有2％nh2nh2·
h2o的dmf加入到fmoc-lys(dde)-oh中，并除去dde以制备fmoc-lys-oh。将含有辛酸，hobt以及dic的dmf加入到fmoc-lys-oh中以制备fmoc-lys(辛酸)-oh。
[0363]
将含有20％哌啶的dmf加入到fmoc-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中，并将hobt(羟基-苯并三唑)加入到fmoc-lys(辛酸)-oh中，以制备fmoc-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁
基)-三苯甲基树脂。
[0364]
将含有20％哌啶的dmf加入到fmoc-lys(叔丁基)-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中，并加入boc-his(三苯甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)以制备boc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。
[0365]
从boc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂上裂解保护基团，然后纯化以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr。
[0366]
hkfy-1的纯度、分子量和1h nmr分别如图1，图37和图93所示。
[0367]
实施例1.2hkfy-2的制备
[0368]
为了制备生物素((s)-3-([1,1'-联苯]-4-基)-2-((s)-6-辛酰胺基-2-((s)-2-(5-((3as，4s，4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)己酰胺基)丙酰基)-l-酪氨酸，将含有20％哌啶的dmf加入到实施例1.1得到的fmoc-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中，且加入fmoc-his(三苯甲基)-oh以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。以相同的方式将d-生物素加入到树脂中，以制备d-生物素-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。
[0369]
裂解树脂的保护基团，然后纯化以制备生物素-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(na-(5-((3as，4s，6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰基)-nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)。
[0370]
hkfy-2的纯度、分子量和1h nmr分别如图2，图38和图94所示。
[0371]
实施例1.3hkfy-3的制备
[0372]
以相同的方式制备his(苄基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-苄基-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，不同的是使用boc-his(苄基)-oh代替在实施例1.1的制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0373]
hkfy-3的纯度和分子量分别如图3和图39所示。
[0374]
实施例1.4hkfy-4的制备
[0375]
以相同方式制备d-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-d-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-d-his(三苯甲基)代替了实施例1.1制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0376]
hkfy-4的纯度和分子量分别如图4和图40所示。
[0377]
实施例1.5hkfy-5的制备
[0378]
以相同方式制备his(4-甲基三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-(二苯基(对甲苯基)甲基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(4-甲基三苯甲基)-oh代替实施例1.1的制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0379]
hkfy-5的纯度和分子量分别如图5和图41所示。
[0380]
实施例1.6hkfy-6的制备
[0381]
以相同的方式制备his(damp-3)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-((s)-2-氨基-3-(1，3-二苯乙基-2，3-二氢-1h-咪唑-4-基)丙酰基)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(damp-3)-oh代替实施例1.1的制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0382]
hkfy-6的纯度和分子量分别如图6和图42所示。
[0383]
实施例1.7hkfy-7的制备
[0384]
以相同的方式制备his(damp-5)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-((s)-2-氨基-3-(3-(2-环己基乙基)-2，3-二氢-1h-咪唑-4-基)丙酰基)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(damp-5)-oh代替实施例1.1的制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0385]
hkfy-7的纯度和分子量分别如图7和图43所示。
[0386]
实施例1.8hkfy-8的制备
[0387]
以相同的方式制备his(damp-2)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-((s)-2-氨基-3-(1，3-双(2-环己基乙基)-2，3-二氢-1h-咪唑-4-基)丙酰基)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(damp-2)-oh代替实施例1.1的制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0388]
hkfy-8的纯度和分子量分别如图8和图44所示。
[0389]
实施例1.9hkfy-9的制备
[0390]
以相同方式制备his(damp-2)-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-苯乙基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(2-苯乙基)-oh代替实施例1.1的制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0391]
hkfy-9的纯度和分子量分别如图9和图45所示。
[0392]
实施例1.10hkfy-10的制备
[0393]
以相同的方式制备his(2-萘-1-甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-(萘-1-亚甲基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(2-萘-1-甲基)-oh代替实施例1.1制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0394]
hkfy-10的纯度和分子量分别如图10和图46所示。
[0395]
实施例1.11hkfy-11的制备
[0396]
以相同方式制备his(2-环己基乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-(2-环己基乙基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(2-环己基乙基)-oh代替实施例1.1的制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0397]
hkfy-11的纯度和分子量分别如图11和图47所示。
[0398]
实施例1.12hkfy-12的制备
[0399]
为了制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-d-苯丙氨酰-l-酪氨酸，hkfy-12)，将fmoc-tyr(叔丁基)和dmf(二甲基甲酰胺)负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，式8的fmoc-d-phe-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中以制备fmoc-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。
[0400]
将fmoc-lys(辛酸)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)加入到fmoc-d-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中以制备fmoc-lys(辛酸)-d-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf加入到fmoc-lys(辛酸)-d-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中，并加入boc-his(三苯甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)以制备boc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)d-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。
[0401]
从boc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂上裂解保护基团，然后纯化以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe-tyr。
[0402]
hkfy-12的纯度和分子量分别如图12和图48所示。
[0403]
实施例1.13hkfy-13的制备
[0404]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-(非-1-烯-2-基氨基)己酰胺基)-3-(4-氯苯基)丙酰基)-l-酪氨酸，hkfy-13)，除了使用fmoc-d-phe(4-氯)-oh代替实施例1.6的制备过程中得到的fmoc-d-phe-oh。
[0405]
hkfy-13的纯度和分子量分别如图13和图49所示。
[0406]
实施例1.14hkfy-14的制备
[0407]
以相同的方式制备fmoc-d-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂，除了使用fmoc-d-tyr(叔丁基)-oh代替实施例1.13制备过程中得到的fmoc-tyr(叔丁基)-oh。在随后的过程中，boc-his(三苯甲基)-oh变为boc-d-his(三苯甲基)-oh，以制备d-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-cl)-d-tyr((r)-2-((s)-2-((r)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(4-氯苯基)丙酰基)-d-酪氨酸)。
[0408]
hkfy-14的纯度和分子量分别如图14和图50所示。
[0409]
实施例1.15hkfy-15的制备
[0410]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-d-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(4-氯苯基)丙酰基)-d-酪氨酸)，除了使用boc-his(三苯甲基)-oh代替在实施例1.14的制备过程中获得的boc-d-his(三苯甲基)-oh
[0411]
hkfy-15的纯度和分子量分别如图15和图51所示。
[0412]
实施例1.16hkfy-16的制备
[0413]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-d-lys(辛酸)-d-phe(4-氯)-tyr(((r)-2-((r)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基))-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(4-氯苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了在制备过程中使用fmoc-d-lys(辛酸)-oh代替fmoc-lys(dde)-oh及fmoc-d-lys(dde)-oh,使用fmoc-lys(辛酸)-oh代替实施例1.13的制备过程中得到的fmoc-lys(dde)-oh。
[0414]
hkfy-16的纯度和分子量分别如图16和图52所示。
[0415]
实施例1.17hkfy-17的制备
[0416]
以相同的方式制备his(3，3-二苯乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-(2，2-二苯乙基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(3，3-二苯乙基)-oh代替实施例1.1制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0417]
hkfy-17的纯度和分子量分别如图17和图53所示。
[0418]
实施例1.18hkfy-18的制备
[0419]
以相同方式制备his(fm)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-(9h-芴-9-基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(fm)-oh代替在实施例1.1的制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0420]
hkfy-18的纯度和分子量分别如图18和图54所示。
[0421]
实施例1.19hkfy-19的制备
[0422]
以相同的方式制备his(苯乙基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-苯乙基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(苯乙基)-oh代替在实施例1.1的制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0423]
hkfy-19的纯度和分子量分别如图19和图55所示。
[0424]
实施例1.20hkfy-20的制备
[0425]
以相同的方式制备his(甲氧基二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-((4-甲氧基苯基)(苯基)甲基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(甲氧基二苯甲基)-oh代替实施例1.1制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0426]
hkfy-20的纯度和分子量分别如图20和图56所示。
[0427]
实施例1.21hkfy-21的制备
[0428]
以相同的方式制备his(4-氯二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-((r)-(4-氯苯基)(苯基)甲基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，只是使用boc-his(4-氯二苯甲基)-oh代替实施例1.1制备过程中得到的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0429]
hkfy-21的纯度和分子量分别如图21和图57所示。
[0430]
实施例1.22hkfy-22的制备
[0431]
以相同的方式制备his(甲基二苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-((r)-苯基(对甲苯基)甲基)-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(甲基二苯甲基)-oh代替实施例1.1制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0432]
hkfy-22的纯度和分子量分别如图22和图58所示。
[0433]
实施例1.23hkfy-23的制备
[0434]
以相同方式制备his(金刚烷-1-基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(nt-(金刚烷-1-基)-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(金刚烷-1-基)-oh代替在实施例1.1的制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0435]
hkfy-23的纯度和分子量分别如图23和图59所示。
[0436]
实施例1.24hkfy-24的制备
[0437]
以相同方式制备his(三苯甲基)-lys(癸酸)-phe-tyr(n6-癸酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸，hkfy-24)，除了使用癸酸代替辛酸加入到实施例1.1制备过程中得到的fmoc-lys-oh中。
[0438]
hkfy-24的纯度和分子量分别如图24和图60所示。
[0439]
实施例1.25hkfy-25的制备
[0440]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-lys(月桂酸)-phe-tyr(n6-十二烷酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸，hkfy-25)，除了使用月桂酸代替辛酸加入到在实施例1.1的制备过程中获得的fmoc-lys-oh中。
[0441]
hkfy-25的纯度和分子量分别如图25和图61所示。
[0442]
实施例1.26hkfy-26的制备
[0443]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-lys(豆蔻酸)-phe-tyr(n6-十四酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸，hkfy-26)，除了使用豆蔻酸代替辛酸加入到在实施例1.1的制备过程中获得的fmoc-lys-oh中。
oh代替在实施例1.1的制备过程中获得的boc-his(三苯甲基)-oh。
[0465]
hkfy-33的纯度和分子量分别如图33和图69所示。
[0466]
实施例1.34hkfy-34的制备
[0467]
为了制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸，hkfy-34)，将fmoc-tyr(叔丁基)和dmf(二甲基甲酰胺)负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，fmoc-d-phe(4-甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中以制备fmoc-d-phe(4-甲基)-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。
[0468]
将含有2％nh2nh2·
h2o的dmf加入到fmoc-lys(dde)-oh中，并除去dde以制备fmoc-lys-oh。将含有辛酸、hobt和dic的dmf加入到fmoc-lys-oh中以制备fmoc-lys(辛酸)-oh，并且将boc-his(三苯甲基)-oh用于制备boc-his(二苯甲基)-oh。
[0469]
将含有20％哌啶的dmf加入到fmoc-d-phe(4-甲基)-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中，并将hobt(羟基-苯并三唑)加入到fmoc-lys(辛酸)-oh中，以制备fmoc-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf加入到fmoc-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂中，并加入boc-his(二苯甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)以制备boc-his(二苯甲基)-lys(辛酸)d-phe(4-甲基)-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂肽。
[0470]
从boc-his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(叔丁基)-三苯甲基树脂上裂解保护基团，然后纯化以制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr-oh。
[0471]
hkfy-34的纯度、分子量和1h nmr分别如图34，图70和图95所示。
[0472]
实施例1.35hkfy-35的制备
[0473]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr((so3h)-oh(s)-2-((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰胺基)-3-(4-(磺氧基)苯基)丙酸)，除了使用fmoc-tyr(so3h)-oh代替实施例1.34制备过程中获得的fmoc-tyr(叔丁基)-oh。
[0474]
hkfy-35的纯度和分子量分别如图35和图71所示。
[0475]
实施例1.36hkfy-36的制备
[0476]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr((2，6-二甲基)-oh s)-2-((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰胺基)-3-(4-羟基-2，6-二甲基苯基)丙酸)，除了使用fmoc-tyr(2，6-二甲基)-oh代替实施例1.34的制备过程中得到的fmoc-tyr(叔丁基)-oh。
[0477]
hkfy-36的纯度和分子量分别如图36和图72所示。
[0478]
实施例1.37hkfy-37的制备
[0479]
将含有20％哌啶的dmf加入在实施例1.1的制备过程中获得的fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-oh-三苯甲基树脂中。，并将hobt(羟基-苯并三唑)加入到fmoc-ser(叔丁基)-oh中以制备fmoc-ser(叔丁基)-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-oh-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf加入到树脂中，并将hobt(羟基-苯并三唑)加入到fmoc-gly-oh中，以制备fmoc-gly-ser(叔丁基)-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-oh-三苯甲
基树脂。
[0480]
从fmoc-gly-ser(叔丁基)-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-oh-三苯甲基树脂上裂解保护基团，然后纯化制备gly-ser-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(n2-(na-甘氨酰-l-丝氨酰-nt-三苯甲基-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)。
[0481]
hkfy-37的纯度和分子量分别如图96和图97所示。
[0482]
实施例1.38hkfy-38的制备
[0483]
为了制备hkfy-38((3s,6s,9s,12s,15s)-15-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-12-苄基-3-(((6s,9s,12s,15s)-1,18-二氨基-6-((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酰基)-12-(3-氨基-3-丙酰基)-1-亚氨基-9-甲基-8,11,14,18-四氧代-2,7,10,13-四氮杂十八烷-15-基)氨基甲酰基)-9-(4-羟基苄基)-6-(羟甲基)-5,8,11,14,21-五氧代-4,7,10,13,20-五氮十八烷酸)，fmoc-phe-oh和dmf(二甲基甲酰胺)负载到三苯甲基树脂制备fmoc-phe-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，fmoc-arg(pbf)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-phe-三苯甲基树脂中以制备fmoc-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，fmoc-ala-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂中以制备fmoc-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。fmoc-gln(三苯甲基)-oh、fmoc-gln(三苯甲基)-oh、fmoc-asp(叔丁基)-oh、fmoc-ser(叔丁基)-oh、fmoc-tyr(叔丁基)-oh、fmoc-phe-oh以与上述相同的方式依次加入以制备fmoc-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0484]
从实施例1.1获得的含有20％哌啶的dmf和fmoc-lys(辛酸)-oh，和hobt(羟基-苯并三唑)加入树脂中以制备fmoc-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0485]
从实施例1.1获得的含有20％哌啶的dmf和fmoc-his(三苯甲基)-oh，和hobt(羟基-苯并三唑)加入树脂中制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0486]
从fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂上裂解保护基团，然后纯化以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-ser-asp-gln-gln-ala-arg-phe。
[0487]
hkfy-38的纯度和分子量分别如图98和图99所示。
[0488]
实施例1.39hkfy-39的制备
[0489]
为了制备hkfy-39((3s,6s,9s,12s,15s,18s)-3-((2-(((s)-1-(((s)-1-(((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-18-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-(3-氨基-3-氧代丙基)-15-苄基-12-(4-羟基苄基)-9-(羟甲基)-5,8,11,14,17,24-六氧代-4,7,10,13,16,23-六氮杂三十烷酸)，将含有20％哌啶的dmf，fmoc-gly-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到由实施例1.38获得的fmoc-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂中以制备fmoc-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，fmoc-asn(三苯甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树
脂中以制备fmoc-asn(三苯甲基)-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。fmoc-gln(三苯甲基)-oh、fmoc-ser(叔丁基)-oh、fmoc-tyr(叔丁基)-oh、fmoc-phe-oh以与上述相同的方式依次加入以制备fmoc-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-gln(三苯甲基)-asn(三苯甲基)-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh，和hobt(羟基-苯并三唑)加入到树脂中以制备fmoc-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-gln(三苯甲基)-asn(三苯甲基)-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0490]
从实施例1.1获得的含有20％哌啶的dmf和fmoc-his(三苯甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)加入树脂中以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-gln(三苯甲基)-asn(三苯甲基)-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0491]
从fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-gln(三苯甲基)-asn(三苯甲基)-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂上裂解保护基团，然后纯化以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-ser-gln-asn-gly-ala-arg-phe。
[0492]
hkfy-39的纯度和分子量分别如图100和图101所示。
[0493]
实施例1.40hkfy-40的制备
[0494]
将含有20％哌啶的dmf，fmoc-gln(三苯甲基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加实施例1.39获得的fmoc-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂中以制备fmoc-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0495]
fmoc-gln(三苯甲基)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh、fmoc-ser(叔丁基)-oh、fmoc-tyr(叔丁基)-oh、fmoc-phe()-oh以与上述相同的方式依次加入以制备fmoc-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-his(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0496]
从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh和fmoc-his(三苯甲基)-oh依次加入在树脂中fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-his(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。
[0497]
从fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-ser(叔丁基)-his(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂裂解保护基团，再纯化制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-ser-his-gln-gln-ala-arg-phe((s)-2-((2s,5s,8s,11s,14s)-2-((1h-咪唑-4-基)甲基)-14-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-11-苄基-8-(4-羟基苄基)-5-(羟甲基)-4,7,10,13,20-五氧代-3,6,9,12,19-五氮杂七氨基)-n1-((s)-5-氨基-1-(((s)-1-(((s)-1-(((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1，5-二氧戊-2-基)戊二酰胺)。
[0498]
hkfy-40的纯度和分子量分别如图102和图103所示。
[0499]
实施例1.41hkfy-41的制备
[0500]
将含有20％哌啶的dmf，fmoc-gly-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到由实施例1.39制备的fmoc-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂中以制备fmoc-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。fmoc-asn(三苯甲基)-oh、fmoc-gln(三苯甲基)-oh、fmoc-tyr(叔丁基)-oh、fmoc-phe-oh、由实施例1.1.制得fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh以与上述相同的方式依次加入树脂中，制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁
基)-gln(三苯甲基)-asn(三苯甲基)-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-gln-asn-gly-ala-arg-phe((3s,6s,9s,12s,15s,18s)-3-((2-((((s)-1-(((s)-1-(((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯丙-2-基)氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酰基)-18-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-(3-氨基-3-氧丙基)-15-苄基-12-(4-羟基苄基)-9-(羟甲基)-5,8,11,14,17,24-六氧代-4,7,10,13,16,23-六氮杂苯三十烷酸)。
[0501]
hkfy-41的纯度和分子量分别如图104和图105所示。
[0502]
实施例1.42hkfy-42的制备
[0503]
将含有20％哌啶的dmf,fmoc-gln(三苯甲基)和hobt(羟基-苯并三唑)添加到由实施例1.39获得的fmoc-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂中以制备fmoc-gly-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。fmoc-gln(三苯甲基)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh、fmoc-tyr(叔丁基)-oh、fmoc-phe-oh、从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh以相同方式依次加入树脂中，制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-his(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。该树脂的保护基团被裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-his-gln-gln-ala-arg-phe((s)-2-((2s,5s,8s,11s)-2-((1h-咪唑-4-基)甲基)-11-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-8-苄基-5-(4-羟基苄基)-4,7,10,17-四氧代-3,6,9,16-四氮杂二十四胺基)-n1-((s)-5-氨基-1-(((s)-1-(((s)-1-(((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1,5-二氧戊环-2-基)戊二酰胺)。
[0504]
hkfy-42的纯度和分子量分别如图106和图107所示。
[0505]
实施例1.43hkfy-43的制备
[0506]
以相同的方式制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr(叔丁基)-gln(三苯甲基)-asn(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂，除了在实施例1.41的组成氨基酸中使用fmoc-gln(三苯甲基)-oh代替fmoc-gly-oh之外。该树脂的保护基团被裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-gln-asn-gln-ala-arg-phe((s)-n1-((s)-1-(((s)-1-(((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基)-5-胍基-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代丙烷-2-基)-2-((2s,5s,8s,11s,14s)-2-(2-氨基-2-氧乙基)-14-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-5-(3-氨基-3-氧丙基)-11-苄基-8-(4-羟基苄基)-4,7,10,13,20-五氧代-3,6,9,12,19-五氮杂七氨基)戊二酰胺)。
[0507]
hkfy-43的纯度和分子量分别如图108和图109所示。
[0508]
实施例1.44hkfy-44的制备
[0509]
为了制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-trp，将fmoc-trp(boc)-oh和dmf负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-trp(boc)-三苯甲基树脂。将含有20％哌啶的dmf，fmoc-tyr(叔丁基)-oh和hobt(羟基-苯并三唑)添加到fmoc-trp(boc)-三苯甲基树脂中以制备fmoc-tyr(叔丁基)-trp(boc)-三苯甲基树脂。将fmoc-phe-oh、从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh以相同的方式依次添加到树脂中，以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛基)-phe-tyr(叔丁基)-trp(boc)-三甲基树脂。将树脂的保护基团裂解
以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-tyr-trp(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酰-l-色氨酸)。
[0510]
hkfy-44的纯度和分子量分别如图110和图111所示。
[0511]
实施例1.45hkfy-45的制备
[0512]
以相同的方式制备d-生物素-his(三苯甲基)-k(辛酸)-ala(联苯基)-tyr(boc)-三苯甲基树脂，除了在实施例1.2的制备过程中使用fmoc-ala(联苯)-oh代替fmoc-phe-oh。裂解树脂的保护基团，制备生物素-his(三苯甲基)-k(辛酸)-ala(联苯基)-tyr((s)-3-([1,1
’‑
联苯基]-4-基)-2-((s)-6-辛酰胺基-2-((s)-2-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)己酰胺基)丙酰基)-l-酪氨酸)。
[0513]
hkfy-45的纯度和分子量分别如图112和图113所示。
[0514]
实施例1.46hkfy-46的制备
[0515]
将fmoc-phe-oh和dmf负载到从实施例1.44获得的fmoc-trp(boc)-三苯甲基树脂上，以制备fmoc-trp(boc)-三苯甲基树脂。从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh以相同的方式依次加入到树脂中，以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-trp(boc)-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-trp(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-色氨酸)。
[0516]
hkfy-46的纯度和分子量分别如图114和图115所示。
[0517]
实施例1.47hkfy-47的制备
[0518]
为了制备n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-酪氨酰-l-苯丙氨酸，将fmoc-phe-oh和dmf负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-phe-三苯甲基树脂。将fmoc-tyr(boc)-oh，从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh以相同的方式依次加入到树脂中，以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-tyr(boc)-phe-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-tyr-phe(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-酪氨酰-l-苯丙氨酸)。
[0519]
hkfy-47的纯度和分子量分别如图116和图117所示。
[0520]
实施例1.48hkfy-48的制备
[0521]
为了制备hkfy-48(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-酪氨酰-l-酪氨酸)，将fmoc-tyr(boc)-oh和dmf负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-tyr(boc)-三苯甲基树脂。fmoc-tyr(boc)-oh，从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-his(三苯甲基)-oh以相同的方式依次加入到树脂中，以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-tyr(boc)-tyr(boc)-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-tyr-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-酪氨酰-l-酪氨酸)。
[0522]
hkfy-48的纯度和分子量分别如图118和图119所示。
[0523]
实施例1.49hkfy-49的制备
[0524]
为了制备hkfy-49(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酸)，从实施例1.1获得fmoc-lys(辛酸)-oh，和fmoc-his(三苯甲基)-oh依次加入到从实施例1.47获得的fmoc-phe-三苯甲基树脂中，以同样的方式制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛
酸)-phe-三苯甲基树脂。树脂的保护基团被裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe。
[0525]
hkfy-49的纯度和分子量分别如图120和图121所示。
[0526]
实施例1.50hkfy-50的制备
[0527]
为了制备hkfy-50(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-丝氨酸)，将fmoc-ser(叔丁基)-oh和dmf负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-ser(叔丁基)-三苯甲基树脂。fmoc-phe-oh，从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh和fmoc-his(三苯甲基)-oh以相同的方式依次加入到树脂中，以制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-ser-三苯甲基树脂。树脂的保护基团被裂解以制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-phe-ser。
[0528]
hkfy-50的纯度和分子量分别如图122和图123所示。
[0529]
实施例1.51hkfy-51的制备
[0530]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-leu-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰)-l-赖氨酰-l-亮氨酰-l-酪氨酸)，除了使用fmoc-leu-oh代替在实施例1.48的组成氨基酸中fmoc-tyr(boc)-oh。
[0531]
hkfy-51的纯度和分子量分别如图124和图125所示。
[0532]
实施例1.52hkfy-52的制备
[0533]
fmoc-asp(叔丁基)-oh、fmoc-tyr(boc)-oh、fmoc-phe-oh和fmoc-his(三苯甲基)-oh依次添加到从实施例1.38获得的fmoc-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。以同样的方式制备fmoc-his(三苯甲基)-phe-tyr(boc)-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备his(三苯甲基)-phe-tyr-asp-gln-gln-ala-arg-phe((6s,9s,12s,15s,18s)-1-氨基-6-((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酰基)-18-((s)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-3-苯丙酰胺基)-3-(4-羟基苯基)丙酰胺基)-12，15-双(3-氨基-3-氧代丙基)-1-亚氨基-9-甲基-8,11,14,17-四氧-2,7,10,13,16-五氮杂二十碳-20-酸)。
[0534]
hkfy-52的纯度和分子量分别如图126和图127所示。
[0535]
实施例1.53hkfy-53的制备
[0536]
从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、fmoc-ser(叔丁基)-oh、fmoc-gly-oh和fmoc-his(三苯甲基)-oh依次加入到从实施例1.47获得的fmoc-phe-tyr(boc)-三苯甲基树脂中，以同样的方式制备fmoc-his(三苯甲基)-gly-ser(叔丁基)-lys(辛酸)-phe-tyr(boc)-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备his(三苯甲基)-gly-ser-lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-n2-(nt-三苯甲基-l-组氨酰甘氨酰-l-丝氨酸基)-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)。
[0537]
hkfy-53的纯度和分子量分别如图128和图129所示。
[0538]
实施例1.54hkfy-54的制备
[0539]
从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh、dmf和hobt加入到从实施例1.47获得的fmoc-phe-tyr(boc)-三苯甲基树脂中，以制备fmoc-lys(辛酸)-phe-tyr(boc)-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备lys(辛酸)-phe-tyr(n6-辛酰基-l-赖氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)。
[0540]
hkfy-54的纯度和分子量分别如图130和图131所示。
[0541]
实施例1.55hkfy-55的制备
[0542]
fmoc-his(三苯甲基)-oh和从实施例1.1获得的fmoc-lys(辛酸)-oh依次加入到从实施例1.47获得的fmoc-phe-tyr(boc)-三苯甲基树脂中，以同样的方式制备fmoc-lys(辛酸)-his(三苯甲基)-phe-tyr(boc)-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解以制备lys(辛酸)-his(三苯甲基)-phe-tyr(na-(n6-辛酰基-l-赖氨酰)-nt-三苯甲基-l-组氨酰-l-苯丙氨酰-l-酪氨酸)。
[0543]
hkfy-55的纯度和分子量分别如图132和图133所示。
[0544]
实施例1.56hkfy-56的制备
[0545]
以相同的方式制备fmoc-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂，除了使用fmoc-asp(叔丁基)-oh代替在实施例1.38的制备过程中fmoc-ser(叔丁基)-oh。将含有2％nh2nh2·
h2o的dmf加入到fmoc-lys(dde)-oh中，并除去dde以制备fmoc-lys-oh。将含有己酸的dmf，hobt以及dic加入到fmoc-lys-oh中以制备fmoc-lys(己酸)-oh。
[0546]
依次加入fmoc-lys(己酸)-oh和fmoc-his(三苯甲基)-oh，制备fmoc-his(三苯甲基)-lys(己酸)-phe-tyr(boc)-asp(叔丁基)-gln(三苯甲基)-gln(三苯甲基)-ala-arg(pbf)-phe-三苯甲基树脂。将树脂的保护基团裂解制备his(三苯甲基)-lys(己酸)-phe-tyr-asp-gln-gln-ala-arg-phe((6s,9s,12s,15s,18s)-1-氨基-6-(((s)-1-氨基-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酰基)-18-((s)-2-((s)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-(非1-烯-2基-氨基)己酰胺基)-3-苯丙酰胺基)-3-(4-羟基苯基)丙酰胺基)-12，15-双(3-氨基-3-氧代丙基)-1-亚氨基-9-甲基-8,11,14,17-四氧代-2,7,10,13,16-五氮杂二十碳-20-酸)。
[0547]
hkfy-56的纯度和分子量分别如图134和图135所示。
[0548]
实施例1.57hkfy-57的制备
[0549]
his(2-苯基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr(((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(2-苯基)-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)以相同的方式制备，除了boc-his(2-苯基)-oh用于代替实施例1.34的组成氨基酸中的boc-his(二苯甲基)-oh。
[0550]
hkfy-57的纯度和分子量分别如图136和图137所示。
[0551]
实施例1.58hkfy-58的制备
[0552]
以相同的方式制备his(1-苯基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr((r)-2-((s)-2-((s))-2-氨基-3-(1-苯基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(1-苯基)-oh代替在实施例1.34的组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0553]
hkfy-58的纯度和分子量分别如图138和图139所示。
[0554]
实施例1.59hkfy-59的制备
[0555]
以相同的方式制备his(1,2-二苯基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr(((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1.2-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(1,2-二苯基)-oh代替在实施例
1.34的组成氨基酸中的boc-his(二苯甲基)-oh。
[0556]
hkfy-59的纯度和分子量分别如图140和图141所示。
[0557]
实施例1.60hkfy-60的制备
[0558]
以相同的方式制备his(2-(4-叔丁基)苯基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr(((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(2-(4-(叔丁基)苯基)-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(2-(4-叔丁基)苯基)-oh代替在实施例1.34的组成氨基酸中的boc-his(二苯甲基)-oh。
[0559]
hkfy-60的纯度和分子量分别如图142和图143所示。
[0560]
实施例1.61hkfy-61的制备
[0561]
以相同的方式制备his(1-(4-叔丁基)苯基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-(4-(叔丁基)苯基)-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(1-(4-叔丁基)苯基)-oh代替在实施例1.34的组成氨基酸中的boc-his(二苯甲基)-oh。
[0562]
hkfy-61的纯度和分子量分别如图144和图145所示。
[0563]
实施例1.62hkfy-62的制备
[0564]
以相同的方式制备d-his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr((r)-2-((s)-2-((r)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-d-his(二苯甲基)-oh代替在实施例1.34的组成氨基酸中的boc-his(二苯甲基)-oh。
[0565]
hkfy-62的纯度和分子量分别如图146和图147所示。
[0566]
实施例1.63hkfy-63的制备
[0567]
以相同的方式制备his(噻吩)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(2-(噻吩-2-基)-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(噻吩)-oh代替在实施例1.34组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0568]
hkfy-63的纯度和分子量分别如图148和图149所示。
[0569]
实施例1.64hkfy-64的制备
[0570]
以相同的方式制备his(4-甲氧基二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr(((2r)-2-((2s)-2-((2s)-2-氨基-3-(1-((4-甲氧基苯基)(苯基)甲基)-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(4-甲氧基二苯甲基)-oh代替在实施例1.34组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0571]
hkfy-64的纯度和分子量分别如图150和图151所示。
[0572]
实施例1.65hkfy-65的制备
[0573]
以相同的方式制备his(4-羟基苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(甲基)-tyr((2r)-2-((2s)-2-((2s)-2-氨基-3-(1-((4-羟基苯基)(苯基)甲基)-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(4-羟基苯甲基)-oh代替在实施例1.34组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0574]
hkfy-65的纯度和分子量分别如图152和图153所示。
[0575]
实施例1.66hkfy-66的制备
[0576]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr-nh2，(n-((s)-5-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-(((r)-1-(((s)-1-氨基-3-(4-羟基苯基)-1-氧代丙烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-(对甲苯基)丙烷-2-基)氨基)-6-氧代己基)辛酰胺)，除了使用fmoc-tyr-wang树脂代替在实施例1.34组成氨基酸中的树脂。
[0577]
hkfy-66的纯度和分子量分别如图154和图155所示。
[0578]
实施例1.67hkfy-67的制备
[0579]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3-氯)((s)-2-((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰胺基)-3-(3-氯-4-羟基苯基)丙酸)，除了使用fmoc-tyr(3-氯)代替实施例1.34组成氨基酸中的fmoc-tyr(叔丁基)。
[0580]
hkfy-67的纯度和分子量分别如图156和图157所示。
[0581]
实施例1.68hkfy-68的制备
[0582]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3-硝基)((s)-2-((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰胺基)-3-(4-羟基-3-硝基苯基)丙酸)，除了使用fmoc-tyr(3-硝基)代替实施例1.34组成氨基酸中的fmoc-tyr(叔丁基。
[0583]
hkfy-68的纯度和分子量分别如图158和图159所示。
[0584]
实施例1.69hkfy-69的制备
[0585]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3，5-硝基)((s)-2-((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰胺基)-3-(4-羟基-3，5-二硝基苯基)丙酸)，除了使用fmoc-tyr(3，5-硝基)代替实施例1.34组成氨基酸中的fmoc-tyr(叔丁基)。
[0586]
hkfy-69的纯度和分子量分别如图160和图161所示。
[0587]
实施例1.70hkfy-70的制备
[0588]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(3-氨基)((s)-2-((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰胺基)-3-(3-氨基-4-羟基苯基)丙酸)，除了使用fmoc-tyr(3-氨基)代替实施例1.34组成氨基酸中的fmoc-tyr(叔丁基)。
[0589]
hkfy-70的纯度和分子量分别如图162和图163所示。
[0590]
实施例1.71hkfy-71的制备
[0591]
以相同的方式制备his(二苯甲基)-orn(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-5-辛酰胺基戊酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了在实施例1.33的组成氨基酸中使用fmoc-orn(dde)代替fmoc-lys(dde)。
[0592]
hkfy-71的纯度和分子量分别如图164和图165所示。
[0593]
实施例1.72hkfy-72的制备
[0594]
以实施例1.2的d-生物素合成相同的方法制备生物素-his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr((s)-2-((s)-2-((s)-3-(1-二苯甲基-1h-咪唑-4-基)-2-(5-((3as,4s,6ar)-2-氧代六氢-1h-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基)戊酰胺基)丙酰胺基)-6-辛酰
胺基戊酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，使用实施例1.34的his(二苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr-oh。
[0595]
hkfy-72的纯度和分子量分别如图166和图167所示。
[0596]
实施例1.73hkfy-73的制备
[0597]
以相同的方式制备h(三苯甲基)lys(辛酸)-d-3pal-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(吡啶-3-基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用fmoc-d-3pal代替在实施例1.12的组成氨基酸中fmoc-d-phe-oh。
[0598]
hkfy-73的纯度和分子量分别如图168和图169所示。
[0599]
实施例1.74hkfy-74的制备
[0600]
以相同的方式制备h(三苯甲基)lys(辛酸)-d-2nal-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(萘-2-基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用fmoc-d-2nal代替在实施例1.73的组成氨基酸中fmoc-d-3pal。
[0601]
hkfy-74的纯度和分子量分别如图170和图171所示。
[0602]
实施例1.75hkfy-75的制备
[0603]
以相同方式制备his(甲苯磺酰基)-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-甲苯磺酰基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯磺酰基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(甲苯磺酰基)-oh代替在实施例1.34的组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0604]
hkfy-75的纯度和分子量分别如图172和图173所示。
[0605]
实施例1.76hkfy-76的制备
[0606]
以相同的方式制备his(三苯甲基)-lys(辛酸)-d-phe(4-cf3)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-2-氨基-3-(1-三苯甲基-1h-咪唑-4-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用fmoc-d-phe(4-cf3)代替在实施例1.73的组成氨基酸中fmoc-d-3pal。
[0607]
hkfy-76的纯度和分子量分别如图174和图175所示。
[0608]
实施例1.77hkfy-77的制备
[0609]
以相同的方式制备his(tbm)-lys(辛酸)-d-phe(4-cf3)-tyr((r)-2-((s)-2-((s)-3-(1-((2
’‑
(1h-四唑-5-基)-[1，1
’‑
联苯基]-4-基)甲基)-1h-咪唑-4-基)-2-氨基丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-his(tbm)-oh代替在实施例1.34组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0610]
hkfy-77的纯度和分子量分别如图176和图177所示。
[0611]
实施例1.78hkfy-78的制备
[0612]
以相同的方式制备boc-trp-lys(辛酸)-d-phe(4-甲基)-tyr(((r)-2-((s)-2-((s)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-(1h-吲哚-3-基)丙酰胺基)-6-辛酰胺基己酰胺基)-3-(对甲苯基)丙酰基)-l-酪氨酸)，除了使用boc-trp-oh代替在实施例1.34组成氨基酸中boc-his(二苯甲基)-oh。
[0613]
hkfy-78的纯度和分子量分别如图178和图179所示。
[0614]
实施例1.79hkfy-79的制备
[0615]
将fmoc-lys(dde)和dmf(二甲基甲酰胺)负载到三苯甲基树脂上以制备fmoc-lys(dde)-三苯甲基树脂。以与实施例1.1的合成方法相同的方式制备fmoc-lys(辛酸)-三苯甲基树脂。此后，boc-his(二苯甲基)-oh用于制备his(二苯甲基)-lys(辛酸)(n2-(nt-二苯甲基-l-组氨酰)-n6-辛酰基-l-赖氨酸)。
[0616]
通过上述制备方法制备的hkfy肽衍生物如下表1所示。
[0617]
[表1]
[0618]
[0619]
[0620]
[0621]
[0622]
[0623]
[0624][0625]
实施例1.hkfy衍生物分析
[0626]
使用hplc和离子质量分析实施例1.1至1.79中制备的hkfy衍生物的纯度和分子量。结果显示在下表2中，hkfy衍生物的hplc分析结果显示在图1至36、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178和180，以及hkfy的离子质量分析结果衍生物示于图37至72、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179和181。
[0627]
[表2]
[0628]
[0629]
[0630][0631]
实施例2.hkfy衍生物与gpr39受体结合能力的验证
[0632]
使用荧光素酶检测系统研究实施例1.1到1.79中制备的hkfy衍生物与gpr39的结
合能力。荧光素酶检测系统是一种通过细胞中配体与受体的结合来确定细胞中受体活性程度的方法。
[0633]
具体地，成纤维细胞系cv-1(1x105细胞/ml，韩国细胞系库)在96孔细胞培养板中培养24小时，然后用插入腺病毒的gpr39和sre(血清反应元件)荧光素酶分别以50moi(感染复数)和25moi病毒处理3小时，然后培养24小时。为了给出禁食过程，24小时后，用无血清培养基替换培养基并培养16小时，然后用每种hkfy和hkfy衍生物处理6小时并培养，然后使用光度计定量活化gpr39的荧光素酶(报告基因)的表达水平(表3)。
[0634]
[表3]
[0635]
[0636]
[0637][0638]
结果参考表3，证实所有hkfy衍生物在nm至μm水平对gpr39具有高活性。此外，在各种脂肪酸与赖氨酸偶联的类似物中，与辛酸偶联的类似物显示出最优异的活性。表现出nm活性水平的衍生物被认为对gpr39具有高度选择性和特异性活性。
[0639]
另一方面，hkfy-30、hkfy-34、hkfy-63、hkfy-64和hkfy-65衍生物表现出比其他hkfy衍生物更高的活性水平。特别是，由d-phe(甲基)组成的hkfy-30和hkfy-34表现出最优异的活性和较高的ecmax值。
[0640]
实施例3.hkfy衍生物对gpr39的选择性和特异性的确认
[0641]
为了确认hkfy衍生物对gpr39的选择性和特异性，通过荧光素酶检测系统和钙内流检测系统确认活性程度(图73和表4)。
[0642]
具体地，荧光素酶检测系统使用上述实验例2中的hkfy衍生物中的hkfy-34分析了活性程度(图73顶部)。在钙内流检测系统中，用人gpr39(pcdna3.1_hgpr39，美国典型培养物保藏中心)、gαq(pcdna3.1_gαq，美国典型培养物保藏中心)、水母光蛋白(pcdna3.1_aequrin，美国典型培养物保藏中心)和脂质体胺(美国典型培养物保藏中心)的混合物转染成纤维细胞系cv-1(1x105细胞/ml)，然后用无血清培养基替换培养基，禁食16小时后，用hkfy-34处理6小时并培养，然后使用光度计定量被活化的gpr39活化的钙与水母光蛋白的结合程度(图73中的底部)。
[0643]
[表4]
[0644][0645]
结果参考图73和表4，证实了当用hkfy-34处理时，对gpr39受体的结合能力和活性优异。
[0646]
此外，通过hkfy衍生物对与gpr39、生长素释放肽受体家族(生长素释放肽受体(ghsr)、胃动素受体(mtlr)、神经降压素受体(ntsr1&ntsr2)、神经介素u受体(nmu1&nmu2)、trh(促甲状腺素释放激素)受体(trhr))相似的受体的活性测试，证实了对gpr39受体的选择性和特异性。
[0647]
具体地，使用荧光素酶检测系统分析每种受体的内在配体和hkfy-34之间的活性程度(图74)。
[0648]
结果参照图74可以确定hkfy-34对ghsr、mtlr、ntsr1&ntsr2、nmu1&nmu2和trhr的活性非常低。
[0649]
这些结果表明，hkfy衍生物可用作选择性和特异性结合gpr39受体的激动剂。
[0650]
实施例4.根据hkfy衍生物治疗确认胰岛素分泌能力
[0651]
gpr39受体广泛分布在胰腺中，并且已知在gpr39 ko小鼠中葡萄糖依赖性胰岛素分泌能力受损(endocrinology 2009，150:2577-2585)。
[0652]
在这方面，为了证实候选hkfy衍生物，即gpr39激动剂对胰岛素分泌能力的作用，在大鼠胰岛素瘤细胞ins-1(韩国细胞系库)中进行了葡萄糖依赖性胰岛素分泌能力试验(图75)。
[0653]
具体地，当ins-1细胞用1或10μm的hkfy-34在类似于生理血糖水平的2.8mm葡萄糖或高血糖水平的11.1mm葡萄糖中处理时，使用大鼠胰岛素elisa证实了胰岛素分泌能力。
[0654]
结果如图75所示，在血糖水平较低的情况下，hkfy-34处理的胰岛素分泌水平变化不明显，但在血糖水平较高的情况下，所有浓度的hkfy-34处理的胰岛素分泌都有所增加。
[0655]
此外，通过使用gpr39 sirna的gpr39敲除实验，证实了hkfy-34通过gpr39受体增强胰岛素分泌。特别是，在11.1mm葡萄糖中，用gpr39 sirna处理的细胞中的胰岛素分泌能力与干扰sirna相比没有增加，这一事实表明，hkfy-34通过gpr39受体增强了葡萄糖依赖性胰岛素分泌能力。
[0656]
此外，证实了hkfy衍生物对大鼠胰岛的葡萄糖依赖性胰岛素分泌能力(图76)。
[0657]
具体地，从8周龄的sd大鼠(damul science)中提取胰腺，并分离胰岛。分离的胰岛在2.8mm或28mm葡萄糖中用不同浓度(1nm、10nm、100nm、1μm、10μm和100μm)的hkfy-34处理，然后使用大鼠胰岛素elisa测量分泌的胰岛素的量。
[0658]
结果参照图76，证实hkfy-34具有浓度依赖性(剂量依赖性)的胰岛素分泌能力。
[0659]
通过rt-pcr分析作为胰腺β细胞增殖和分化的重要因子的irs2和ins2的mrna表达水平(图77)。
[0660]
结果参考图77，irs2和ins2的mrna表达水平由于hkfy-34而增加。另一方面，在gpr39sirna处理组中几乎没有irs2和ins2的mrna表达，这表明irs2和ins2的mrna表达都受gpr39调节。
[0661]
实施例5.hkfy衍生物的脂肪分解能力的确认
[0662]
脂肪分解受肾上腺素能受体调节，β肾上腺素能受体主要分布在脂肪细胞中，由于脂肪细胞过度增殖引起的肥胖可以通过正常的脂肪分解进行调节。
[0663]
在一项通过控制gpr39 ko小鼠的高脂肪或低脂肪饮食的研究中，证实了gpr39 ko小鼠的体重增加和体脂积累增加(gastroenterology 2006,131:1131-1141)。
[0664]
因此，使用蛋白质印迹分析脂肪细胞和脂肪组织中gpr39受体的表达水平(图78)。
结果如图78所示，gpr39受体在小鼠(c57bl6/j,中央实验室动物公司)的脂肪细胞3t3-l1细胞(韩国细胞系库)和脂肪组织(白色脂肪组织，wat)中表达。此外，与对照组(con)相比，使用gpr39 sirna敲除的3t3-l1中gpr39的表达水平降低。上述结果表明，在gpr39 ko小鼠的脂肪组织中缺乏gpr39。
[0665]
此外，通过rt-pcr分析了，经hkfy-34处理的hsl(激素敏感脂肪酶)、atgl(脂肪甘油三酯脂肪酶)和perilipin a的mrna表达水平，它们是脂肪分解信号传导的重要因素(图79)。因此，如图79所示，hkfy-34处理3t3-l1细胞和wat细胞时，这些因子的表达均增加到与阳性对照组异丙肾上腺素相似的程度(图79和80)。此外，通过gpr39 sirna证实了gpr39增强了所有因子的mrna表达(图81至83)。
[0666]
此外，证实了在3t3-l1细胞和wat细胞依据hkfy-34处理的浓度(100nm、500nm、1μm、10μm、50μm和100μm)的脂肪分解能力(图84)。当脂肪分解的信号传递后，脂肪细胞中的脂滴甘油和游离脂肪酸作为最终产物被分泌出来并流出细胞。此时，脂解的程度可以通过定量分泌的甘油来确定。阳性对照组异丙肾上腺素是β-肾上腺素能受体的激动剂，主要促进脂肪细胞的脂肪分解能力。
[0667]
结果如图84所示，3t3-l1细胞和脂肪组织的脂质分解能力与hkfy-34呈浓度依赖性增加。特别是当hkfy-34浓度为10μm或更高时，脂肪分解能力显着增加。
[0668]
实施例6.由hkfy衍生物处理分析脂肪分解能力作用机理
[0669]
为了分析hkfy衍生物对3t3-l1细胞和wat细胞的脂肪分解能力的影响机制，分析了perk和ppka的表达水平(图85和86)。
[0670]
具体地，从经hkfy衍生物处理的3t3l-1细胞(韩国细胞系库)和wat(使用的小鼠的组织培养物购自中央实验室动物公司)中纯化蛋白质，然后使用小鼠中表达的perk、erk、ppka和pka的每种抗体，并通过蛋白质印迹法测量由衍生物引起的每种蛋白质的表达水平。
[0671]
结果参考图85和86，当用hkfy-34处理3t3-l1细胞(图85)和wat细胞(图86)时，与erk和pka相比，perk和ppka的表达增加。这些结果表明，hkfy-34与调节脂肪细胞主要脂解作用的β-肾上腺素能受体具有相同的信号传导和脂解调节机制。
[0672]
实施例7经hkfy衍生物治疗的小鼠的葡萄糖耐量试验
[0673]
分析了经hkfy衍生物治疗的糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐量水平(图87)。
[0674]
具体地，雄性db/db小鼠(5至7周大，中央实验室动物公司)，为糖尿病小鼠模型，禁食16小时，然后分别皮下注射浓度为0.5、1、5和10mg/kg的hkfy-34。30分钟后，腹膜内注射葡萄糖(1.5g/kg)。在0、15、30、45、60、90、120和180分钟后，从小鼠的尾部采集血液，用血糖仪(acc-check，罗氏，德国)测量血糖以分析葡萄糖耐量。
[0675]
结果参照图87，糖尿病模型小鼠对治疗的hkfy-34具有浓度依赖性的显著的葡萄糖耐量。
[0676]
此外，对糖尿病模型小鼠进行糖耐量试验的同时，分析血液胰岛素水平(图88)。
[0677]
具体地，在0、15、30、60、90、120和180分钟后，从小鼠的眼眶静脉采集血液，并使用小鼠elisa分析血浆中的胰岛素水平。
[0678]
结果参照图88，在糖尿病模型小鼠中，经hkfy-34处理后的胰岛素分泌呈浓度依赖性增加。特别是，当用浓度为5和10mg/kg的hkfy-34治疗时，胰岛素分泌水平显著增加。
[0679]
此外，分析了肥胖模型小鼠经hkfy-34治疗后的葡萄糖耐量水平和胰岛素水平(图
89和90)。
[0680]
具体地，在葡萄糖耐量水平和胰岛素水平分析实验中，将糖尿病模型小鼠改为肥胖症模型小鼠(dio)进行实验，其中通过向雄性c57bl6/j小鼠(6至7周龄，中央实验室动物公司)提供高脂肪饲料(60％脂肪食物)持续5-6周来诱导肥胖。
[0681]
结果参考图89和90，hkfy-34治疗的肥胖模型小鼠有浓度依赖性的糖耐量(图89)，并且胰岛素分泌水平增加(图90)。
[0682]
此外，分析了经hkfy衍生物处理的高脂肪饮食诱导的gpr39 ko模型小鼠中的葡萄糖耐量水平(图91)。
[0683]
具体地，通过向雄性gpr39 ko小鼠(6至7周大，中央实验室动物公司)提供高脂肪饲料(60％脂肪食物)持续5-6周来诱导肥胖。将hkfy-34以0.5、1、5和10mg/kg的浓度分别给于16、17和18周龄的已被诱导肥胖的gpr39 ko小鼠，。30分钟后，腹膜内注射葡萄糖(1.5g/kg)。在0、15、30、45、60、90、120和180分钟后，从小鼠的尾部采集血液，用血糖仪(acc-check，罗氏，德国)测量血糖以分析葡萄糖耐量。
[0684]
结果参照图91，对于16、17、18周龄的gpr39 ko小鼠，即使给予hkfy-34处理，也未观察到显著的糖耐量。这些结果表明hkfy-34特异地作用于gpr39。
[0685]
实施例8通过hkfy衍生物治疗确认抗糖尿病效果
[0686]
经hkfy衍生物治疗的糖尿病模型小鼠的血糖水平下降进行了分析(图92)。
[0687]
具体地，将hkfy-34分别以0.5、1、5和10mg/kg的浓度皮下注射给雄性db/db小鼠(5至7周龄)，一种糖尿病模型小鼠。在0、1、2、4、6、8、12、18和24小时后，从小鼠的尾部采集血液，用血糖仪((acc-check，罗氏，德国))测量血糖以确认抗糖尿病效果。
[0688]
结果参照图92，证实在糖尿病模型小鼠中，以浓度依赖的方式显示了血糖水平下降对hkfy-34治疗的影响。特别是，当用浓度为5和10mg/kg的hkfy-34治疗时，降低血糖的效果显著增加。