一株具有润肠通便功效的发酵乳杆菌TY-G04及其应用的制作方法

一株具有润肠通便功效的发酵乳杆菌ty-g04及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一株具有润肠通便功效的发酵乳杆菌ty-g04及其应用。


背景技术：

2.肠道是保护人体健康的第一道防线，也是人体的清道夫。人体99％的营养物质被肠道吸收，80％以上的毒素通过肠道排出体外，若肠道出现疾病，则会对人体健康造成一定的影响。
3.便秘是最常见的肠道疾病之一，其主要表现为排便次数减少，排便困难，粪质硬结，量少，排便时肛门不适、坠胀和便血等。如果人体长期处于便秘状态，则体内毒素就不能及时清除，这会造成体内毒素被肠道重复吸收利用并进入血液循环，导致对体内器官造成危害、病变，甚至癌变。临床上通常使用药物或手术进来治疗便秘，药物治疗虽然有一定的作用，但是长期用药身体可能会产生抗药性、依赖性和其他并发症，例如药物依赖、恶心和严重腹泻；手术治疗立竿见影，但治标不治本，平时不注意很容易复发。可见，目前针对便秘症状，临床治疗仍然存在治疗难度大、易反复等特点。
4.引起便秘的常见原因是肠道菌群失调，补充乳酸菌来调节肠道微生态是治疗便秘的有效措施之一，乳酸菌进入人体后能够改变肠道环境并影响肠道的运动和肠道激素的分泌，从而为便秘患者带来益处；而乳酸菌发挥有益功效的前提是能活着到达肠道并能成功定植在肠道。因此，本领域亟需寻找一种能活着到达肠道并能成功定植在肠道的乳酸菌新菌种，以解决因肠道菌群失调引起的便秘问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株具有润肠通便功效的发酵乳杆菌ty-g04。根据序列比对和同源性分析结果显示ty-g04为发酵乳杆菌。通过验证实验确定ty-g04具有良好的消化道抗性和肠道定植能力，并且能通过促进5-ht和胃肠调节肽的分泌为大脑神经元传递信号，从而触发肠道蠕动反射，改善盐酸洛哌丁胺诱导的便秘。
6.发酵乳杆菌的分离纯化：收集四川省阿坝藏族羌族自治州红原县牧民家自然发酵牦牛酸乳，经过无菌生理盐水稀释，再涂布于mrs平板上进行培养；培养结束后挑选菌落，采用平板划线法得到纯化的菌株。
7.分离菌株的菌落形态和细胞形态：菌株纯化后在固体培养基中形成单菌落，表面湿润，中等大小，凸起，边缘整齐，呈圆形，菌落为不透明状，颜色呈乳白色。革兰氏染色后，在显微镜下细胞均呈紫色，为革兰氏阳性菌(g )，形态呈杆状，与乳酸杆菌特征相符，形态结构均一，表明菌株为纯种。
8.pcr扩增16s rdna序列：对纯化的菌株采用25μl反应体系进行pcr扩增，序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的pcr扩增产物进行测序，获得序列后，使用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)在genbank进行搜索和相似性比对。
9.菌株16s rdna序列分析：16s rdna基因序列测定后，将序列输入ncbi中的blast程序进行序列比对和同源性分析，结果显示ty-g04为发酵乳杆菌。发酵乳杆菌ty-g04的16s rdna基因扩增产物的序列如seq id no.1所示。
10.ty-g04的人工胃液耐受能力：制备菌悬液，将其与人工胃液混合，并置于恒温振荡器中培养，采用倾注平板法分别测定0h、3h的活菌数，计算菌株耐受ph3.0人工胃液的存活率。实验结果显示，ty-g04在ph＝3.0的人工胃液中培养3h的存活率为128.74％，具有极强的胃液耐受性。
11.ty-g04的胆盐耐受能力：将培养后的ty-g04分别接种于含0.0％、0.3％猪胆盐的mrs-thio培养基中，并混匀后置于恒温振荡器中培养，以未接种的mrs-thio培养基为空白对照，测定含0.0％猪胆盐和0.3％猪胆盐培养液的od
600
值，计算菌株在胆盐中的生长效率。实验结果显示，ty-g04在浓度为0.3％的胆盐中的生长效率为12.06％，具备较好的胆盐耐受力。
12.ty-g04的细胞粘附能力：
13.正常培养人结肠癌细胞(ht-29)并传代，收集培养好的细胞，并用mccoy's 5a培养基(添加青霉素-链霉素、胎牛血清)重悬，采用血球计数板计数法调整细胞数至2
×
105个/ml。6孔培养板放入经酸洗并灭菌的盖玻片并向每孔各加入2ml的细胞悬液，培养条件为37℃，5％co2，待细胞贴壁于盖玻片后，使用无菌pbs洗涤3次。正常培养菌株并连续活化3代，离心收集菌体，用无菌pbs清洗1次，最终以mccoy's 5a培养基(不添加青霉素-链霉素、胎牛血清)重悬至菌液浓度为108cfu/ml。吸取2ml菌悬液到已加入细胞悬液的6孔培养板中，孵育2h，孵育结束后，弃去培养液，无菌pbs洗涤6次，每孔中加入2ml甲醇室温固定1h，弃甲醇加入革兰氏染液，于显微镜下计数，记录100个细胞所粘附的ty-g04总数(随机选取20个视野)，即为粘附值。实验结果显示，100个细胞粘附ty-g04的数量为223，具备很强的细胞粘附能力，表明ty-g04具有较强的肠道定植能力。
14.保藏信息：
15.本发明所述的具有润肠通便功效的发酵乳杆菌ty-g04已经进行保藏，具体保存信息如下：
16.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)
17.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
18.保藏日期：2021年11月8日
19.保藏编号：cgmcc no.23752
20.分类命名：发酵乳杆菌ty-g04(lactobacillus fermentum ty-g04)。
21.本发明的原理在于：
22.便秘的发生与肠道菌群失调有关，补充乳酸菌来调节肠道微生态是治疗便秘的有效措施之一，乳酸菌进入人体后能够改变肠道环境并影响肠道的运动和肠道激素的分泌，从而为便秘患者带来益处；而乳酸菌发挥有益功效的前提是能活着到达肠道并能成功定植在肠道。
[0023]“脑-肠轴”在肠道运动的调节中具有关键的作用，中枢神经系统(cns)和肠神经系统(ens)共同参与正常肠道运动的调控，对ens来说，肠道微生物的定植是其发育和成熟的关键；而cns能够通过控制5-羟色胺(5-ht)的产生和分泌与肠道微生物相互作用。5-ht是
脑-肠轴的关键神经递质，起到连接cns、ens和肠道微生物的重要作用。
[0024]
5-ht主要由位于肠上皮细胞的肠嗜铬细胞分泌，其发挥功效的具体机制是：当肠道受到微生物及其代谢产物(如短链脂肪酸)的刺激时，位于肠黏膜上的肠嗜铬细胞会释放大量的5-ht，通过结合5-ht受体蛋白刺激位于肠黏膜下方的内在感觉神经元，引起p物质(sp)和胃动素(mtl)等兴奋性神经递质的释放，为神经元提供次级信号以产生缓慢的、兴奋的、突触后电位，进而触发肠道蠕动反射，从而达到缓解便秘的效果。因此，认识脑-肠轴间的相互作用可为便秘的诊断和治疗提供更为广阔的思路。
[0025]
本发明的有益效果在于：本发明提出的保藏编号为cgmcc no.23752的发酵乳杆菌ty-g04具有良好的消化道抗性和肠道定植能力，可通过促进5-ht和胃肠调节肽的分泌改善便秘，本发明提供了一种涉及“脑-肠轴”的综合治疗理念，为益生菌辅助治疗便秘提供了重要的理论支撑。
附图说明
[0026]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0027]
图1为分离菌株菌落形态图。
[0028]
图2为革兰氏染结果图。
[0029]
图3为ty-g04对ht-29细胞的粘附情况图。
[0030]
图4为气相色谱法检测小鼠粪便中的scfas含量时的标准色谱图。
[0031]
图5为5-ht标准液在450nm波长处的吸光值标准曲线图。
[0032]
图6为sp标准液在450nm波长处的吸光值标准曲线图。
[0033]
图7为mtl标准液在450nm波长处的吸光值标准曲线图。
[0034]
图8为实验期间各组小鼠体重变化对比图。
[0035]
图9为实验期间各组小鼠摄食量变化对比图。
[0036]
图10为实验期间各组小鼠饮水量变化对比图。
[0037]
图11为各组小鼠首例黑便时间对比图。
[0038]
图12为各组小鼠粪便含水量对比图。
[0039]
图13为各组小鼠小肠推进率对比图。
[0040]
图14为各组小鼠小肠推进距离对比图。
[0041]
图15为各组小鼠小肠组织的病理学形态图。
[0042]
图16为各组小鼠粪便中乙酸含量对比图。
[0043]
图17为各组小鼠粪便中丁酸含量对比图。
[0044]
图18为各组小鼠血清中5-ht浓度的变化对比图。
[0045]
图19为各组小鼠血清中mtl水平对比图。
[0046]
图20为各组小鼠血清中sp水平对比图。
具体实施方式
[0047]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0048]
实施例1
[0049]
ty-g04的分离纯化及鉴定
[0050]
1.实验材料
[0051]
采集四川省阿坝藏族羌族自治州红原县牧民家自然发酵牦牛酸乳：用无菌小勺取牧民家中自制的牦牛酸乳，将其装入含有适量无菌碳酸钙和可溶性淀粉的15ml无菌旋盖离心管中(碳酸钙∶可溶性淀粉比例为1∶1)，搅拌均匀后旋紧旋盖，然后放入冷藏箱，运回实验室立即进行乳酸菌的纯化分离。
[0052]
2.ty-g04的分离纯化
[0053]
在无菌条件下，吸取1ml样品于9ml无菌生理盐水中，涡旋使其混匀，即为10-1
的样品稀释液，再依次进行10倍梯度稀释至10-7
，选取10-5
、10-6
、10-7
稀释度下的稀释液100μl，均匀涂布于mrs平板上，37℃倒置培养48h。培养结束后，观察mrs平板上菌落形态，挑取中等大小，凸起，微白色或微黄色，湿润，边缘整齐，呈圆形的菌落进行平板划线法纯化菌株，重复此划线操作，直至得到纯化的菌株。
[0054]
3.形态结构观察
[0055]
将已经纯化的菌株接种于5ml无菌mrs肉汤中，37℃培养18h。取1ml菌液以转速为12000r/min离心1min，再用无菌生理盐水洗涤两次后，然后加入等体积无菌生理盐水重悬菌体，最后用接种环取少量均匀涂布于载玻片上，固定后，进行革兰氏染色，镜检，拍照。革兰氏阳性菌(g )染色后细胞呈蓝紫色，革兰氏阴性菌(g-)细胞呈红色。观察并记录细胞形态和革兰氏染色结果。
[0056]
4.pcr扩增16s rdna序列
[0057]
采用25μl反应体系进行pcr扩增：模板1μl、上游引物(10μm)1μl、下游引物(10μm)1μl、2
×
taq pcr master mix 12.5μl，用无菌超纯水补足至25μl。pcr扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃末端延伸10min。序列扩增后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司对检测合格的pcr扩增产物进行测序，获得序列后，使用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)在genbank中进行搜索和相似性比对。
[0058]
5.实验结果与分析
[0059]
5.1.分离菌株的菌落形态和细胞形态
[0060]
菌株纯化后在固体培养基中形成单菌落，表面湿润，中等大小，凸起，边缘整齐，呈圆形，菌落为不透明状，颜色呈乳白色。革兰氏染色后，在显微镜下细胞均呈紫色，为革兰氏阳性菌(g )，形态呈杆状，与乳酸杆菌特征相符，形态结构均一，表明菌株为纯种。分离菌株的菌落形态如图1所示，革兰氏染色结果如图2所示。
[0061]
5.2.菌株16s rdna序列分析
[0062]
16s rdna基因序列测定后，将序列输入ncbi中的blast程序进行序列比对和同源
性分析，结果显示ty-g04为发酵乳杆菌。发酵乳杆菌ty-g04的16s rdna基因扩增产物的序列如seq id no.1所示。
[0063]
实施例2
[0064]
ty-g04胃肠液耐受能力和细胞粘附能力测定
[0065]
1.实验材料
[0066]
具有润肠通便功效的发酵乳杆菌ty-g04：分离自四川红原牧民家自然发酵牦牛酸乳，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为cgmcc no.23752。
[0067]
2.ty-g04耐受ph3.0人工胃液测定
[0068]
ty-g04按2％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h后，取10ml以4000r/min的转速离心10min，收集菌体沉淀，用无菌生理盐水洗涤2次，并重悬于等体积无菌生理盐水中，即为菌悬液。将制备好的菌悬液与人工胃液(0.2％nacl、0.35％胃蛋白酶1∶10000，用1mol/l的hcl调节ph＝3.0，过滤除菌备用)按1∶9的比例混合，混匀后置于恒温振荡器中，并在37℃下以100r/min的转速培养3h，采用倾注平板法分别测定0h、3h的活菌数。按公式(1)计算菌株耐受ph3.0人工胃液的存活率。
[0069][0070]
3.ty-g04在0.3％胆盐中生长效率的测定
[0071]
ty-g04按2％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养18h后，取培养液按2％的接种量分别接种于含0.0％猪胆盐和0.3％猪胆盐的mrs-thio培养基(mrs培养基中加0.2％的巯基乙酸钠)中，混匀后置于恒温振荡器中，并在37℃下以100r/min的转速培养24h。以未接种的mrs-thio培养基为空白对照，测定含0.0％猪胆盐和0.3％猪胆盐培养液的od
600
值。按照公式(2)计算菌株在胆盐中的生长效率。
[0072][0073]
4.ty-g04细胞粘附能力测定
[0074]
正常培养人结肠癌细胞(ht-29)并传代，收集培养好的细胞，并用mccoy's 5a培养基(添加青霉素-链霉素、胎牛血清)重悬，采用血球计数板计数法调整细胞数至2
×
105个/ml。6孔培养板放入经酸洗并灭菌的盖玻片并向每孔各加入2ml的细胞悬液，培养条件为37℃，5％co2，待细胞贴壁于盖玻片后，使用无菌pbs洗涤3次。正常培养菌株并连续活化3代，离心收集菌体，用无菌pbs清洗1次，最终以mccoy's 5a培养基(不添加青霉素-链霉素、胎牛血清)重悬至菌液浓度为108cfu/ml。吸取2ml菌悬液到已加入细胞悬液的6孔培养板中，孵育2h，孵育结束后，弃去培养液，无菌pbs洗涤6次，每孔中加入2ml甲醇室温固定1h，弃甲醇加入革兰氏染液，于显微镜下计数，记录100个细胞所粘附的ty-g04总数(随机选取20个视野)，即为粘附值。
[0075]
5.实验结果与分析
[0076]
5.1.ty-g04的人工胃液耐受能力
[0077]
进入人体的益生菌要发挥相应功能活性，应具有良好的消化道耐受性。益生菌进入人体肠道发挥其功能之前要先经过胃部(胃液ph在3.0左右，存留时间为1-3h)，强酸性的
胃部环境不利于益生菌的生存，因此，作为益生菌应具备的首要条件是能耐受人体中胃液的作用。实验结果显示，ty-g04在ph＝3.0的人工胃液中培养3h的存活率为128.74％，具有极强的胃液耐受性。
[0078]
5.2.ty-g04的胆盐耐受能力
[0079]
经胃液处理存活下来的益生菌进入肠道后，会受到小肠中胆盐的抑制和毒害，因此，菌株对胆盐的耐受力也是作为益生菌筛选的重要指标之一，人体胆盐的质量浓度在0.03％-0.3％的范围内波动。实验结果显示，ty-g04在浓度为0.3％的胆盐中的生长效率为12.06％，具备较好的胆盐耐受力。
[0080]
5.3.ty-g04的细胞粘附能力
[0081]
益生菌的粘附能力对于其在胃肠道转运的驻留时间十分重要，益生菌成功定植在肠道是发挥益生功效的关键。益生菌粘附于肠粘膜的能力有益于调节肠道菌群的正常结构、增强自身的定植能力、抑制病原体对肠道的侵袭和提高肠道免疫力等。一般来说，100个细胞所黏附菌株数量少于40个，说明该菌株无粘附能力；100个细胞粘附菌株数量在41-100个之间，说明该菌株粘附能力一般；100个细胞粘附菌株数量超过100个，说明该菌株粘附能力很强。采用ht-29细胞来模拟人的小肠上皮细胞来评估ty-g04的粘附能力，实验结果显示，100个细胞粘附ty-g04的数量为223，具备很强的细胞粘附能力，表明ty-g04具有较强的肠道定植能力。ty-g04对ht-29细胞的粘附情况如图3所示。
[0082]
实施例3
[0083]
ty-g04对便秘的改善作用
[0084]
1.实验材料
[0085]
具有润肠通便功效的发酵乳杆菌ty-g04：分离自四川红原牧民家自然发酵牦牛酸乳，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为cgmcc no.23752。
[0086]
2.动物验证实验
[0087]
2.1.实验动物分组及处理
[0088]
选取7周龄的balb/c雄性小鼠(20g-25g)，饲养于室温25
±
2℃、相对湿度50
±
5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中，适应性喂养一周后开始实验。适应期结束后，小鼠随机分为正常组、便秘组、ty-g04组，每组10只。
[0089]
实验周期为18d，1-14d为ty-g04干预期，正常组和便秘组灌胃10ml/kg.bw的生理盐水，ty-g04组灌胃109cfu/kg.bw的ty-g04菌液，灌胃容积同正常组和模型组。第15d开始进行便秘小鼠造模实验，除正常组外的各组均灌胃10mg/kg
·
bw盐酸洛哌丁胺溶液，正常组小鼠灌胃10ml/kg.bw的生理盐水；间隔1h后，正常组和模型组灌胃10ml/kg.bw的生理盐水，ty-g04组灌胃109cfu/kg.bw的ty-g04菌液，持续3d，直到实验的第17d天，灌胃结束后，所有小鼠开始禁食。禁食16h后(第18d)，所有小鼠灌胃10ml/kg.bw的活性炭溶液，每组小鼠取5只用于测定初次排出黑便所需时间(首粒黑便排出后立即解剖、取血和组织)，其余5只小鼠灌胃活性炭溶液30min后处死解剖，用于小鼠小肠推进率的测定。
[0090]
2.2.实验期间小鼠生长性能监测
[0091]
记录小鼠实验期17d内每天小鼠的体重、摄食量及饮水量。
[0092]
2.3.小鼠粪便收集及粪便含水量测定
[0093]
收集各组小鼠在实验第17d的粪便，用于粪便中scfas的测定，同时按照公式(3)测
定第17天的粪便含水量。
[0094][0095]
2.4.小鼠小肠推进率的测定
[0096]
将小鼠处死后，打开小鼠腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，平铺在刻度尺上，计算墨汁推进距离占小肠总长的百分比。
[0097]
2.5.小肠组织病理切片观察
[0098]
固定好的小肠组织经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行he染色，最后在显微镜(50
×
)下观察组织病理形态变化。
[0099]
2.6.气相色谱法检测小鼠粪便中的scfas含量
[0100]
在50mg小鼠粪便样品加入500μl饱和nacl溶液，振荡至无明显块状物(组织破碎仪，60hz，30s，反复5次)，加入40μl10％硫酸酸化，振荡混匀，随后加入1000μl的乙醚萃取，振荡混匀，12000rpm、15min、4℃条件下离心，取上清加入到装有0.25g的无水硫酸钠的ep管中，静置15min，同样条件离心，取上清加入气相小瓶，上机分析，气相色谱检测条件如下表1所示：
[0101]
表1.气相色谱检测条件表
[0102][0103]
利用气相色谱法检测小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸的含量，scfas浓度通过外标法计算，气相色谱法检测小鼠粪便中的scfas含量时的标准色谱如图4所示。
[0104]
2.7.酶联免疫法测定小鼠血清5-ht及胃肠激素肽水平
[0105]
小鼠血液静置2h，3000r/min离心15min后获得血清，测定小鼠血清中5-ht、sp、mtl的浓度。使用上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒并参照相应试剂盒的说明书进行实验。测定标准液在450nm处的od值，根据标准曲线计算血清中5-ht、sp、mtl水平，od值的标准曲线如图5-图7所示，其中，图5为5-ht标准液在450nm波长处的吸光值标准曲线图；图6为sp标准液在450nm波长处的吸光值标准曲线图；图7为mtl标准液在450nm波长处的吸光值标准曲线图。
[0106]
3.实验结果与分析
[0107]
3.1.实验期间小鼠体重、摄食量及饮水量变化
[0108]
小鼠的体重、摄食量及饮水量能在一定程度上反映其健康状况，实验期间，小鼠的体重、摄食量及饮水量变化图如图8-图10所示，其中，图8为实验期间各组小鼠体重变化对
比图；
[0109]
图9为实验期间各组小鼠摄食量变化对比；图10为实验期间各组小鼠饮水量变化对比图。
[0110]
由图8-图10可知，在整个实验期间，各组小鼠的体重、摄食量及饮水量虽在一定的范围内波动，但均无统计学差异(p《0.05)，表明在实验过程中小鼠生长性能良好，本次实验未影响小鼠的正常生活及生长。
[0111]
3.2.ty-g04对盐酸洛哌丁胺诱导小鼠便秘的预防及改善作用
[0112]
当出现便秘时，肠道的蠕动会减缓，粪便会长时间滞留在肠道内，造成水分的过度吸收，使粪便变干变少，排便时间延长。另外，食物通过肠道的时间也是评价便秘症状的重要指标之一，这个过程可以分为小肠和大肠两个部分，其中食物通过小肠的时间可以使用小肠推进率来表示，而通过整个肠道的时间可通过测定小鼠的首粒黑便时间来进行评价。盐酸洛哌丁胺诱导的便秘小鼠模型中，小鼠的排便状态发生了显著变化，具体如图11-图14所示，其中，图11为各组小鼠首例黑便时间对比图；图12为各组小鼠粪便含水量对比图；图13为各组小鼠小肠推进率对比图；图14为各组小鼠小肠推进距离对比图。在图11-图13中，标有“*”代表两组之间存在统计学差异(p《0.05)。
[0113]
由图11可知，便秘组的首粒黑便排出时间显著多于正常组，表明盐酸洛哌丁胺诱导小鼠便秘模型成功，ty-g04能显著改善小鼠便秘，缩短首粒黑便排出时间(p《0.05)。
[0114]
由图12可知，便秘组小鼠的粪便含水量相比于正常组有下降的趋势，ty-g04组相比于便秘组却有上升的趋势，但各组小鼠的粪便含水量并无统计学差异(p《0.05)，可能的原因是样本量太少，未完整的反映真实状态。
[0115]
由图13-图14可知，本次实验中，ty-g04能使小鼠小肠的推进距离变长，小肠推进率显著增加(p《0.05)，说明小鼠的小肠蠕动明显得到了改善。
[0116]
以上结果表明，盐酸洛哌丁胺能造成小鼠便秘，ty-g04则能促进肠道的蠕动，缩短排便时间，从而改善小鼠的便秘症状。
[0117]
3.3.ty-g04对便秘小鼠小肠绒毛的影响
[0118]
肠道蠕动功能的好坏与小肠绒毛的完整性密切相关，便秘患者常伴有不同程度的小肠绒毛损伤。各组小鼠小肠组织的病理学形态如图15所示。
[0119]
由图15可知，正常组小鼠的小肠绒毛均匀整齐、无损伤，而模型组小肠绒毛断裂、萎缩等损伤严重，而且肠腔内出现了炎性浸润现象；ty-g04干预后的小鼠，其小肠绒毛损伤均匀、整齐、完整，说明ty-g04干预可以有效抑制小肠绒毛的损伤，具有保护小肠绒毛的作用。
[0120]
3.4.ty-g04对便秘小鼠肠道scfas水平的影响
[0121]
乳酸菌自身代谢生成的scfas，一方面可通过刺激肠道蠕动并提升粪便的湿度缓解便秘，另一方面则通过刺激肠黏膜细胞分泌5-ht及胃肠调节肽，加速胃肠运动，改善便秘。本发明采用气相色谱法检测了造模第17d各组小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸水平。本发明近对各组小鼠粪便中乙酸、丁酸含量做了展示，具体如图16-图17所示，其中，图16为各组小鼠粪便中乙酸含量对比图；图17为各组小鼠粪便中丁酸含量对比图。在图16-图17中，标有“*”代表两组之间存在统计学差异(p《0.05)。
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由图16-图17可知，便秘组的乙酸、丁酸水平显著低于正常组，ty-g04干预后，乙
酸、丁酸水平均显著增加(p《0.05)，然而ty-g04并未显著增加肠道中丙酸、异丁酸、戊酸水平(p《0.05)，本发明未展示相关图表。
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以上结果表明ty-g04通过增加肠道中乙酸、丁酸水平刺激5-ht及胃肠调节肽的分泌，从而达到改善便秘、维持肠道健康的功效。
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3.5.ty-g04对便秘小鼠血清5-ht水平的影响
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5-ht在胃肠道运动中具有重要作用，对胃肠动力、平滑肌收缩、黏膜分泌和神经信号传导的调节意义重大，5-ht从肠嗜铬细胞的释放是肠道中运动和感觉反射活动的主要触发因素之一，并与从肠道到中枢神经系统的神经调节相关，因此血清中5-ht的浓度可用于确定肠道功能的变化，5-ht在便秘症状中减少。在本发明的实验中，各组小鼠血清中5-ht浓度的变化具体如图18所示。在图18中，标有“*”代表两组之间存在统计学差异(p《0.05)。
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由图18可知，便秘组小鼠血清中5-ht的浓度相比于正常组显著下降，ty-g04干预后，血清5-ht水平显著增加(p《0.05)。表明ty-g04对便秘症状的影响是通过5-ht这一信号通路完成的。
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3.6.ty-g04对便秘小鼠血清胃肠调节肽水平的影响
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5-ht浓度的提高可促进胃肠调节肽的释放，sp是一种与肠道蠕动增加有关的兴奋性神经肽，低水平的sp与便秘的发生相关，mtl能够促进胃的收缩和小肠的分节运动，小肠分节运动的周期性产生会加速小肠的传输时间。各组小鼠血清中胃肠调节肽的变化具体如图19-图20所示，其中，图19为各组小鼠血清中mtl水平对比图；图20为各组小鼠血清中sp水平对比图。在图19-图20中，标有“*”代表两组之间存在统计学差异(p《0.05)。
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由图19-图20可知，在便秘组小鼠中，mtl、sp的浓度的显著降低(p《0.05)，而便秘小鼠在接受ty-g04干预后，血清mtl、sp显著增加(p《0.05)。以上结果表明5-ht通过刺激sp和mtl等兴奋性神经递质的释放，为神经元提供次级信号，触发肠道蠕动反射，从而达到缓解便秘的效果。
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由本发明的动物实验结果可见，本发明公布的发酵乳杆菌ty-g04能够改善盐酸洛哌丁胺诱导的小鼠便秘，且改善的方式是通过产生代谢产物乙酸、丁酸促进5-ht的释放，5-ht则通过刺激胃肠调节肽的分泌为大脑神经元传递信号，从而触发肠道蠕动反射，产生便意并加速肠道蠕动，最终达到改善便秘的功效。本发明初步探索了便秘患者“脑-肠轴”间的相互作用，为当下便秘的诊断和治疗提供更为广阔的思路。
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最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
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序列表：
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seq id no.1发酵乳杆菌ty-g04的16s rdna基因扩增产物的序列
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