一种禾谷镰刀菌胞外多糖及其制备方法和在制备治疗胃癌药物中的应用与流程

mgso4·
7h2o，cacl
2 0.25g，蒸馏水定容至1l。所制备的液体培养基，用300ml锥形瓶分装，每瓶200ml，灭菌备用。
14.步骤2)中，所述减压浓缩是指40-60℃减压浓缩；
15.步骤2中减压浓缩后加入无水乙醇或体积浓度95％的乙醇溶液，使混合溶液中乙醇体积浓度达到70％-75％；
16.步骤2)中，加入无水乙醇的体积为减压浓缩后发酵液体积的3倍，加入95％乙醇为减压浓缩后发酵液体积的4倍，以此类推，最终混合溶液中乙醇体积浓度为70-75％。
17.步骤2)中，所述静置时间为10-24小时；
18.步骤3)中，所述脱色具体为：采用d101大孔树脂脱色，蒽酮硫酸法检测并收集洗脱液；
19.步骤3)中所述脱蛋白，具体方法为：使用sevage试剂法，对多糖溶液进行脱蛋白；所用试剂为：v
三氯甲烷
：v
正丁醇
＝4:1，v
多糖溶液
：v
sevage试剂
＝4:1；
20.步骤3)中所述过滤除菌为：0.22μm滤膜过滤除菌；
21.步骤3)中使用再生纤维素透析袋，截留分子量3500da，于4℃下透析72h。
22.本发明通过发酵、提取、提纯等方法制备禾谷镰刀菌胞外多糖；真菌在培养液中发酵时，会产生次级代谢产物，其中包括多糖一类物质，胞外多糖就是指发酵液中由真菌产生的多糖。多糖是一种含有大量羟基、极性较大的物质，较易溶解在水中，乙醇是一种极性小的溶剂，因此混合溶液中乙醇浓度含量较高时，混合溶液极性下降到使多糖无法溶解，从而沉淀。多糖溶液中含有较多的色素，大孔树脂可以吸附色素而不会或较少的吸附多糖，是一种绿色高效的分离选择。sevage试剂是由三氯甲烷和正丁醇按比例混合而成，sevage试剂和多糖水溶液按比例混合，通过剧烈搅拌混匀，使水溶液中的蛋白质变性析出，同时有机试剂和溶解多糖的水溶液互不相容，在分液漏斗中静置产生分层，从上往下依次为多糖水溶溶液层、变性蛋白层、sevag有机试剂层，分别收集各层。通过反复重复以上的搅拌和静置，直至没有变性蛋白析出。去除了色素和蛋白质等物质后，多糖水溶液还存在较多的小分子盐、离子以及分子量较小的非活性糖类，选用固定截留分子量的透析袋，可以使小于截留分子量的物质自由穿过透析袋向物质浓度低的溶液扩散，透析袋中装多糖溶液，透析溶液使用超纯水，通过反复更换超纯水，从而去除小分子物质。此外由于透析过程较长，如未除菌则容易导致细菌大量繁殖而污染多糖溶液，因此先采用过滤的方法除菌，然后进行透析。
23.本发明提供的一种禾谷镰刀菌胞外多糖，采用上述方法制备得到。
24.本发明提供的一种禾谷镰刀菌胞外多糖的应用，能够抑制sgc-7901细胞的增殖，且可能通过线粒体途径介导sgc-7901细胞发生凋亡，用于制备治疗胃癌药物。
25.在广泛的抗肿瘤活性多糖筛选中发明人发现，从苹果链格孢菌发酵液中分离出的胞外多糖具有良好的抗肿瘤活性，这提醒发明人植物病原菌可能是抗肿瘤活性多糖的一个重要来源。禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)能够侵染小麦，致使病穗上出现粉红色或橘红色的霉状物，引发植物赤霉病。本发明从禾谷镰刀菌发酵液中分离得到禾谷镰刀菌胞外多糖(extracellular polysaccharides from fusarium graminearum,fgeps)，经过体外活性筛选发现，fgeps能够显著抑制人胃癌细胞sgc-7901的增殖。通过对禾谷镰刀菌胞外多糖体外抗胃癌sgc-7901作用及其机制的探究，为开发抗胃癌活性多糖药物提供实验基础。
26.本发明采用液体培养基对禾谷镰刀菌进行发酵培养，通过醇沉、脱色、脱蛋白和透析分离得到胞外多糖，并利用高效尺寸排阻色谱、红外光谱、紫外光谱进行分析。通过体外培养人胃腺癌细胞sgc-7901，采用cck-8法、annexinv-fitc/pi染色、jc-1染色和hoechst 33258染色分析fgeps对sgc-7901细胞的影响，进一步通过western blot法检测促凋亡蛋白bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和抑凋亡蛋白bcl-2的表达水平，探究禾谷镰刀菌胞外多糖fgeps抗人胃腺癌细胞sgc-7901作用及其可能的机制。采用本发明的方法从禾谷镰刀菌发酵液中首次分离出胞外多糖，该多糖具有多糖特征吸收，紫外光谱扫描提示不含有多肽核酸类物质，色谱显示含有4个多糖组分。且本发明制备的禾谷镰刀菌胞外多糖fgeps能够显著抑制人胃癌sgc-7901细胞的增殖，并具有浓度依赖性；给药浓度在1.0mg/ml和1.5mg/ml时细胞线粒体膜电位显著降低，细胞核染色质浓缩，产生凋亡小体，诱导细胞发生凋亡(p《0.05或p《0.01)。fgeps能够上调sgc-7901细胞中促凋亡蛋白bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达(p《0.01或p《0.001)，下调抑凋亡蛋白bcl-2表达(p《0.001)。本发明从禾谷镰刀菌发酵液中分离出胞外多糖fgeps，该胞外多糖能够抑制sgc-7901细胞的增殖，且可能通过线粒体途径诱导sgc-7901细胞发生凋亡。
附图说明
27.图1为本发明禾谷镰刀菌胞外多糖的制备过程；
28.图2为本发明制备的禾谷镰刀菌胞外多糖fgeps的红外(a)和紫外光谱(b)；
29.图3为本发明制备的fgeps的高效尺寸排阻色谱图；
30.图4为本发明fgeps对sgc-7901细胞增殖的影响；
31.图5为本发明fgeps对sgc-7901细胞形态的影响(
×
200)；
32.图6为本发明fgeps对sgc-7901细胞细胞核及染色质变化的影响(
×
400)；
33.图7为本发明不同浓度fgeps对sgc-7901细胞凋亡的影响；
34.图8为本发明不同浓度fgeps对sgc-7901细胞线粒体膜电位的影响；
35.图9为本发明fgeps对sgc-7901细胞bax、bcl-2、cleaved caspase-3及cleaved caspase-9蛋白表达的影响。
具体实施方式
36.本发明所用主要仪器如下：
37.lc-20ap半制备高效液相色谱仪(日本shimadzu)；epoch全波长酶标仪(美国biotek)；g3000pwxl型色谱柱(日本tosoh bioscience)；co2培养箱(美国sim international group)；facsverse流式细胞仪(美国becton,dickinson and company)；ix53荧光正置显微镜，ix51荧光倒置显微镜(日本olympus corporation)；wix-minipr02迷你垂直电泳槽，wix-miniblot迷你转印槽，wix-ep600通用电泳仪电源(伟克斯科技有限公司)；amersham lmager 600全自动化学发光凝胶成像分析系统(美国general electric company)。
38.本发明所用主要试剂如下：
39.rpmi 1640基础培养基(cat.no.:8121075)(gibco公司)；胎牛血清(cat.no.:s711-001s)(lonsa science srl公司)；cck-8试剂盒(cat.no.:c0037)、annexin v-fitc细
胞凋亡检测试剂盒(cat.no.:c1062m)、hoechst 33258染色试剂盒(cat.no.:c0003)、sds-page配胶试剂盒(cat.no.:p0012a)、sds-page蛋白上样缓冲液5
×
(cat.no.:p0015)、bca试剂盒(cat.no.:p0009)、ripa裂解液(cat.no.:p0013b)(碧云天生物科技公司)；彩色预染蛋白标准品(cat.no.:26616)(thermo science公司)，bcl-2(cat.no.:a0208)、bax(cat.no.:a7626)、cleaved caspase-3(cat.no.:a0214)、cleaved caspase-9(cat.no.:a2636)、actb(cat.no.:ac026)抗体(abclone technology公司)，山羊抗兔igg hrp(cat.no.:bl103a)(麦克生物)。
40.本发明所用实验细胞与菌种如下：
41.人胃癌细胞sgc-7901(cat.no.:c6795)购自碧云天生物技术有限公司，已在原公司完成细胞str鉴定，禾谷镰刀菌菌种属于市售产品。
42.实施例1
43.一种禾谷镰刀菌胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
44.1)禾谷镰刀菌的培养和发酵：
45.pda培养基配制：200g马铃薯切碎并加水煮沸30min，纱布过滤后加入17g琼脂并加热溶解，继续加入15g葡萄糖后蒸馏水定容至1l，分装后高压蒸汽灭菌。液体培养基配制：葡萄糖10g，酵母膏2g，0.5g kh2po4，0.5g mgso4·
7h2o，cacl
2 0.25g，蒸馏水定容至1l。300ml锥形瓶分装，每瓶200ml，灭菌备用。禾谷镰刀菌使用pda培养基在28℃平板培养，并活化3-5天，在菌丝长势良好但未产生孢子前，挑取边缘菌丝接入上述分装的液体培养基中，共使用8l体液培养基，在28℃、150rpm/min下恒温发酵培养7天。
46.2)fgeps的制备：发酵液过滤去除菌丝体，60℃减压浓缩，加入发酵液四倍体积的体积浓度为95％的乙醇溶液混匀，使混合溶液中乙醇终浓度达到70％-75％；4℃下静置12小时。离心保留沉淀并使用500ml超纯水加热至50℃溶解，再次离心并保留上清。
47.3)利用d101大孔树脂脱色，蒽酮硫酸法检测并收集洗脱液，进一步使用sevage试剂法脱蛋白：sevage试剂是由三氯甲烷和正丁醇按比例混合而成，sevage试剂和多糖水溶液按比例混合，通过剧烈搅拌混匀，使水溶液中的蛋白质变性析出，同时有机试剂和溶解多糖的水溶液互不相容，在分液漏斗中静置产生分层，从上往下依次为多糖水溶溶液层、变性蛋白层、sevag有机试剂层，分别收集各层。通过反复重复以上的搅拌和静置，直至没有变性蛋白析出。使用的试剂为：v
三氯甲烷
：v
正丁醇
＝4:1，v
多糖溶液
：v
sevage试剂
＝4:1，对多糖溶液进行脱蛋白。再经过0.22μm滤膜过滤除菌(细菌无法通过0.22微米孔径的滤膜，因此使用该滤膜过滤可以除去溶液中的细菌)后，使用再生纤维素透析袋(截留分子量3500da)于4℃下透析72小时，收集截留液冷冻干燥：-80℃冷冻温度下抽真空，多糖溶液中的水分直接由冰升华成为气态被抽走，最终仅剩余多糖固体，得到fgeps。
48.如图1所示，禾谷镰刀菌菌种活化后长势良好，挑取边缘菌丝接种到共8l液体培养基中，发酵7天后收集发酵液，经过醇沉、脱色、脱蛋白、透析和冻干后，得到禾谷镰刀菌胞外多糖670mg，多糖得率为83.75mg/l。
49.上述所得产品fgeps的红外和紫外光谱扫描：
50.fgeps使用kbr压片，并于傅里叶红外光谱仪在4000-400cm-1
范围进行扫描。精密称取5.0mg fgeps，超纯水溶解，配制成5mg/ml溶液，使用紫外可见分光光度计在190-400nm波长范围进行扫描。
51.fgeps红外结果如图2中a所示,3600-3200cm-1
处吸收带是-oh的伸缩振动吸收峰，此区域的吸收峰为糖类的特征吸收峰。如3377cm-1
为o-h的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰；在2929cm-1
处的吸收峰是多糖的c-h伸缩振动；1649cm-1
是结晶水引起的吸收峰；1539cm-1
处吸收峰为c＝o的伸缩振动；1415cm-1
处是c-o的伸缩振动引起的吸收峰；1030cm-1
为o-h的变角振动引起的吸收峰。红外光谱表明通过方法3.1制备最终得到的成分是多糖。fgeps紫外光谱图2中b所示，fgeps在280-320nm波长下没有紫外吸收，表明该多糖中不含有多肽及核酸类物质。
52.对制备的fgeps进行高效凝胶渗透色谱(hpsec)分析，具体方法为：
53.采用高效尺寸排阻色谱法测定分析fgeps，色谱条件：rid-10a示差折光检测器，g3000pwxl型色谱柱(内径
×
长度：7.8mmid
×
30cm，东曹株式会社)，柱温40℃，流速0.7ml/min，流动相为超纯水，定量环20μl，样品浓度5mg/ml。经hpsec分析显示共有四个组分，结合红外光谱表明该物质是多糖成分，紫外扫描显示不含有多肽核酸类物质，经透析去除3500da分子量以下的物质，因此该色谱图出峰均为多糖物质引起。如图3所示，经hpsec分析显示共有四个组分。1号峰占比75.99％，其余分别为17.86％、3.45％、2.70％。从保留时间来看，1号峰保留时间最短，组分相对分子量最大，其结构和组成相对其他三个峰的组分可能更复杂。结合其含量占比，fgeps发挥生物学活性的成分可能主要是1号峰所在的组分。
54.实施例2
55.实施例1制备的一种禾谷镰刀菌胞外多糖的应用，用于制备治疗胃癌药物。
56.具体实验过程如下：
57.1)细胞培养：人胃癌细胞系sgc-7901细胞株培养于1640完全培养基中，为含10％胎牛血清和1％双抗的rami 1640基础培养基，在5％co2、37℃条件下恒温培养，胰酶消化后重悬细胞得细胞悬液；细胞处于对数生长期时可用于实验。
58.2)细胞增殖抑制实验：取对数期sgc-7901细胞，培养于96孔细胞培养板内。每孔加入100μl细胞悬液(5
×
104个/ml)，培养箱中孵育12h待细胞贴壁后，每孔分别含不同浓度的fgeps培养基(0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/ml)，每组设5个复孔，继续培养24小时。去除培养基，加入含10％cck-8培养基继续孵育2h，测定各孔在450nm处吸光度值。
[0059][0060]a对照组
：药物以等体积培养基替代组的吸光度，a
给药组
：加入各浓度fgeps处理的吸光度。
[0061]
对照组为的不含谷镰刀菌胞外多糖的培养基，即谷镰刀菌胞外多糖的终浓度为0mg/ml。
[0062]
结果如图4所示，使用不同浓度的fgeps处理sgc-7901细胞24小时后，与对照组相比，fgeps在浓度为1.2mg/ml之后，能够显著抑制sgc-7901细胞的增殖。表明fgeps能够有效抑制人胃癌sgc-7901细胞的体外增殖，并具有浓度依赖性。
[0063]
3)细胞形态分析：取对数期sgc-7901细胞，六孔板每孔加入1ml细胞悬液(3
×
105个/ml)，吹打分散均匀。贴壁后弃去培养基并以pbs缓冲溶液润洗后，加入1ml含不同浓度的fgeps完全培养基(0、0.5、1.0、1.5mg/ml)，处理24小时后，使用倒置显微镜观察并拍照。
[0064]
结果如图5，正常组细胞形态清晰，数量较多。给予fgeps处理后，细胞均呈现皱缩、变形，细胞膜出现发泡现象，甚至出现死细胞。1.5mg/ml的fgeps处理组，细胞由于凋亡使得活细胞数量明显减少，细胞严重收缩变形。结果表明，fgeps能够造成sgc-7901细胞收缩变形，细胞膜发泡等，直至死亡。
[0065]
4)hoechst 33258染色：取对数生长期sgc-7901细胞，调整细胞密度至1.5
×
105个/ml。在6孔板中放置细胞爬片盖玻片，每片上加入细胞悬液200μl继续培养。细胞贴壁后在细胞密度为50～80％时，弃去培养基并加入含不同浓度的fgeps完全培养基(0、0.5、1.0、1.5mg/ml)。处理24小时后，弃去培养液，加入0.5ml固定液在4℃下固定12小时。弃去固定液后，pbs清洗两遍。加入0.5ml的hoechst 33258染色液，染色5分钟。pbs清洗两遍。抗荧光淬灭封片液封片，使用正置荧光显微镜观察并拍照。
[0066]
细胞染色质经过hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下正常细胞的细胞核为蓝色，而凋亡细胞由于染色质固缩呈现致密浓染，颜色发白并较为明亮。如图6所示，随着给药剂量的增加，细胞凋亡现象加重，出现较多的凋亡小体。此外在1.5mg/ml时，细胞数量减少，细胞核明显缩小。
[0067]
5)annexinv-fitc/pi染色：取对数期sgc-7901细胞，六孔板每孔加入1ml细胞悬液(3
×
105个/ml)。贴壁后弃去培养基并以pbs缓冲溶液润洗，分别加入1ml含fgeps的完全培养基(fgeps的终浓度为0、0.5、1.0、1.5mg/ml)。处理24小时后消化、离心收集细胞。结合液重悬分散细胞后，各组依次加入5μl的annexinv-fitc荧光探针和10μl的pi染液，混匀后在20～25℃下避光孵育20min。流式细胞仪检测，flowjo软件分析。
[0068]
细胞凋亡早期时磷脂酰丝氨酸外翻，能够被annexin v-fitc结合。而坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性后的细胞核能够被碘化丙啶(propidium iodide,pi)结合。如图7所示，随着fgeps剂量的增大，sgc-7901细胞凋亡率显著增加，与对照组相比，1.0mg/ml时凋亡率为12.18
±
2.16％(p《0.01)，1.5mg/ml时，凋亡率为15.69
±
0.51％(p《0.001)。结果表明，fgeps能够诱导sgc-7901细胞发生凋亡，并伴有浓度依赖性。
[0069]
6)jc-1染色：取对数生长期sgc-7901细胞，调整细胞密度至3
×
105个/ml。在6孔板中放置盖玻片，每孔加入细胞悬液1ml继续培养。细胞贴壁后在细胞密度为50～80％时，弃去培养基并加入含fgeps完全培养基(使fgeps的终浓度为0、0.5、1.0、1.5mg/ml)。处理24小时后，弃去培养液，pbs洗涤后加入1ml胰酶消化液(不含edta)消化细胞，待消化结束后移除胰酶消化液，加入新的培养液，吹打后慢速离心收集细胞，0.5ml培养液重悬后加入0.5ml jc-1染色工作液，轻弹混匀，37℃孵育20min。孵育结束后用预冷的jc-1染色缓冲液(1
×
)洗涤2次并重悬后，使用流式细胞仪分析。
[0070]
线粒体膜电位(δψm)的下降是细胞凋亡的标志之一，jc-1是一种良好的荧光探针，当膜电位较高时，jc-1聚合于基质中产生红色荧光；而当膜电位较低时，jc-1以单体形式存在，发出绿色荧光。如图8所示，随着fgeps剂量的增大，sgc-7901细胞线粒体膜电位水平显著降低，与对照组相比，1.0mg/ml时的线粒体膜电位水平为10.73
±
1.16％(p《0.05)，1.5mg/ml时，膜电位水平为12.1
±
1.83％(p《0.01)。结果表明，fgeps能够显著降低sgc-7901细胞线粒体膜电位水平，并伴有浓度依赖性。
[0071]
7)western blot实验：取对数期sgc-7901细胞，培养于6孔板中。每孔加入1ml细胞悬液(4
×
105个/ml)。贴壁后，弃去培养基并以pbs润洗后，分别加入1ml含fgeps的完全培养
基(每孔fgeps终浓度0、0.5、1.0、1.5mg/ml)继续培养24小时。弃去培养基冰上裂解后，4℃下以12000g离心10min，提取细胞总蛋白。bca法调整各组样品蛋白浓度后，按体积比4：1将样品蛋白与上样缓冲液5
×
混合后，煮沸变性。实验组每孔上样蛋白20μg，体积10μl，进行电泳、转膜、封闭，一抗孵育(1:1000稀释)和二抗(1:10000稀释)孵育，使用化学发光显影曝光，image j软件分析。
[0072]
如图9所示，与对照组相比，fgeps能够显著上调sgc-7901细胞中促凋亡蛋白bax、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9和cleaved caspase-9表达(p《0.01或p《0.001)，并下调抑凋亡蛋白bcl-2表达(p《0.001)，因此线粒体介导的凋亡途径在fgeps诱导胃癌sgc-7901细胞凋亡过程可能发挥重要作用。
[0073]
8)统计学分析：本发明所有数据均采用均数
±
标准差进行统计和描述，使用spss 13.0软件进行分析，多组均数的比较，使用单因素方差分析，两组间差异采用duunett-t检验，p《0.05表示差异具有统计学意义。
[0074]
天然产物是一个巨大的药物开发宝库，在疾病治疗中发挥重要作用。真菌发酵过程中次级代谢产物是活性多糖的重要来源，从黑根霉发酵液中分离得到的胞外多糖eps，通过激活小鼠结肠癌ct26细胞中的amp活化蛋白激酶(ampk)途径，以剂量和时间依赖性的方式抑制细胞生长并促进细胞凋；拟康氏木霉胞外多糖以剂量依赖性方式增加caspase-9和caspase-3的活性，增加bax/bcl-2的比例，促进细胞色素c向细胞质的释放，通过固有的线粒体凋亡途径诱导mcf-7细胞凋亡；苹果链格孢菌胞外多糖能够诱导胃癌bgc-823细胞活性氧升高，线粒体膜电位降低并形成凋亡小体。
[0075]
本发明从禾谷镰刀菌发酵液中分离得到胞外多糖fgeps，fgeps能够有效抑制人胃癌sgc-7901细胞的增殖，细胞形态学结果表明fgeps能够引起sgc-7901细胞收缩变形、胞膜发泡，甚至形成凋亡小体，而这些现象正是细胞凋亡的表现。通过anexinv-fitc/pi染色和hoechst 33258染色，其结果均证实了fgeps诱导sgc-7901细胞发生凋亡。本发明重点研究了线粒体途径与fgeps诱导sgc-7901细胞发生凋亡的关系。
[0076]
通过对引起凋亡作用机制的探讨，本发明发现fgeps能够显著上调促凋亡蛋白bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达，并下调抑凋亡蛋白bcl-2蛋白表达，这显示线粒体途径介导的细胞凋亡与fgeps发挥抗人胃癌sgc-7901作用关系密切。线粒体介导的细胞凋亡主要是指在凋亡信号的刺激下，抑凋亡蛋白bcl-2和凋亡蛋白家族中bax比率失衡，bax的过表达引起线粒体膜通透性增加，释放出细胞色素c(cyt-c)等因子，在与凋亡蛋白酶活化因子结合后，能够激活凋亡蛋白酶caspase-9，促使半胱天冬氨酸与其结合，从而形成凋亡小体。caspase是一组庞大的凋亡蛋白酶家族，能够通过线粒体途径被激活，而活化的caspase还能够引起线粒体释放出更多的cyt-c，该家族“瀑布式”的激活链将最终引起细胞走向凋亡。caspase-9处于“瀑布式”激活连的顶端，被激活后的caspase-9将引起下游caspase-3等效应分子的活化，引发caspase级联反应，导致细胞核染色质固缩、裂解以及和胞体分离形成凋亡小体等。目前本发明发现fgeps通过线粒体途径诱导sgc-7901细胞凋亡。
[0077]
本发明首次从禾谷镰刀菌中分离出胞外多糖fgeps，发现fgeps其能够抑制人胃癌sgc-7901细胞的增殖，并可能通过线粒体通路诱导sgc-7901细胞发生凋亡。实验为进一步探讨fgeps抗胃癌作用的研究提供依据，为开发多糖类胃癌辅助治疗药物提供实验基础。