一种基于诱导多能干细胞构建的全主动脉类器官芯片模型及其应用

技术特征：
1.一种基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，包括主动脉类器官芯片以及电磁阀控制器、真空气体泵、气体电磁阀、真空过滤器和蠕动泵，所述主动脉类器官芯片包括模拟不同解剖主动脉节段的第一芯片、第二芯片和第三芯片，所述第一芯片、第二芯片和第三芯片均包括由上至下依次设置的三层芯片骨架，其中，所述芯片骨架的上、下两层分别开设有气体通道、中间层开设有液体通道，相邻芯片骨架间设置有弹性膜，所述弹性膜与各层通道形成位于中间的细胞培养腔和位于所述细胞培养腔两侧的真空腔，所述各芯片的液体通道的两端端部设置有用于与外部连接的管道接口，所述各芯片的上、下层气体通道相错开的端部设置有用于与外部连接的管道接口；所述第一芯片、第二芯片和第三芯片的液体通道依次串联后与蠕动泵连接；所述第一芯片、第二芯片和第三芯片的各真空腔依次连接真空过滤器、气体电磁阀和真空气体泵，所述气体电磁阀与电磁阀控制器连接，所述第一芯片、第二芯片和第三芯片的气体通道形成并联结构；人源诱导多能干细胞定向分化的三胚层血管平滑肌细胞lm-smc、nc-smc、pm-smc分别种植于第一芯片、第二芯片和第三芯片的细胞培养腔的弹性膜上，用蠕动泵进行培养液的更换，模拟血液流动，电磁阀控制器控制气体电磁阀的开闭，模拟细胞受到的生理性周期性张力和节律。2.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，所述三胚层血管平滑肌细胞是由外周血细胞(peripheral blood mononuclear cell,pbmc)重编程为人源诱导多能干细胞后，再经过定向分化培养得到。3.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，所述芯片骨架由pdms材料制成，所述弹性膜为pdms膜。4.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，所述管道接口包括软管和套设于所述软管内的不锈钢针管。5.如权利要求1所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，所述真空气体泵包括依次连接的泵体、水油分离器和真空调压阀，所述真空调压阀与气体电磁阀连接。6.如权利要求2所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，所述人源诱导多能干细胞定向分化的三胚层血管平滑肌细胞的方法包括如下步骤：步骤1：用重编程试剂盒将收集的外周血细胞重新编程；步骤2：之后将转染的细胞重新铺板在涂有玻连蛋白的培养皿上，并在e8培养基中培养，每隔一天更换一次培养基；步骤3：当克隆株细胞形态变大且没有克隆融合的情况下，挑选并收集单克隆干细胞，铺在涂有matrigel的多孔板上，并在mtesr1培养基中扩增培养，每天更换培养基；然后用accutase细胞消化液消化细胞，并使用rocki培养液以1：5至1：7的比例每5-7天传代一次，获得人源诱导多能干细胞；步骤4：步骤3重编程培养得到的人源诱导多能干细胞定向分化为三胚层血管平滑肌细胞lm-smc、nc-smc、pm-smc；其中，对于lm-smc的分化采用的是cdm2培养基诱导分化，所述cdm2培养基是由imdm和f12培养基按照质量比1：1的比例混合后与2mm glutamax、1％v/v化学定义脂质浓缩物、聚
乙烯醇1mg/ml、胰岛素7μg/ml、转铁蛋白15μg/ml和单硫代甘油450μm混合制成；对于nc-smc的分化采用的是含有y27632的培养基中诱导分化；对于pm-smc的分化采用的是含有dmem/f12、1xb27补充剂、1％pen/strep、1-thioglycerol 400μm、pdgf-bb 10ng/ml和tgf-β2ng/mlhipscs的混合培养基诱导分化。7.如权利要求6所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型，其特征在于，所述人源诱导多能干细胞定向分化为lm-smc的过程包括：人源诱导多能干细胞铺板过夜后，用dulbecco改良的eagle培养基dmem/f12清洗hipsc，并在补充有激活素a 30ng/ml、bmp4 40ng/ml、chir99021 6μm、fgf2 20ng/ml和pik90 100nm的培养基中培养24小时，随后，获得的中间原始细胞用dmem/f12 gibco洗涤，并在补充有a83-01 1μm、bmp4 30ng/ml的cdm2培养基中向侧中胚层分化和c59 1μm中培养24小时或48小时，最后，将lm细胞解离或直接在含有pdgf-bb 10ng/ml和tgf-β2ng/ml的cdm2培养基中培养7天；所述人源诱导多能干细胞定向分化为nc-smc的过程包括：将hipscs接种在含有y27632 10μm的tesre8培养基中，两天后，在含有y27632的培养基中诱导细胞分化成神经嵴，然后在含有dmem/f12、1xn2补充剂、0.1％牛血清白蛋白、1％青霉素/链霉素、sb431542 10μm和ldn193189 1μm的培养基中培养6天，其中，在第2-6天将chir99021添加到分化培养基中，最后，在含有dmem/f12、20％敲除血清替代物、pdgf-bb10 ng/ml和tgf-β2ng/ml的培养基中持续培养6至8天；所述人源诱导多能干细胞定向分化为pm-smc的过程包括：将hipsc接种在含有y27632 10μm的tesre8培养基中，第二天，在含有dmem/f12、1xb27补充剂、1％pen/strep、bmp4 25ng/ml、chir99021 8μm、抗坏血酸50μg/ml和1-硫代甘油400μm的培养基中持续培养3天，然后，将pm细胞解离并接种到含有dmem/f12(gibco)、1xb27补充剂、1％pen/strep、1-thioglycerol 400μm、pdgf-bb 10ng/ml和tgf-β2ng/ml的pm-smc诱导培养基中培养7天。8.权利要求1～5中任意一项所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型在研究不同拉伸张力和节律对胚胎起源特异性smc形态、排列及细胞表型的影响中的应用。9.权利要求1～5中任意一项所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型在主动脉疾病节段异质性发病机制的研究中的应用。10.权利要求1～5中任意一项所述的基于诱导多能干细胞构建的主动脉类器官芯片模型在主动脉疾病的分子机制研究及药物筛选中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于诱导多能干细胞构建的全主动脉类器官芯片模型及其应用。本发明结合多能诱导干细胞技术，诱导分化出三种胚胎起源特异性血管SMC(NC-SMCs、LM-SMCs和PM-SMCs)，分化的三胚层SMC分别培养在具有三层结构的芯片的细胞培养腔中，可以模拟不同解剖主动脉节段，应用微流控技术及可控制的真空/气压提供系统，构建出了可以控制平滑肌细胞的机械张力、节律和频率的芯片系统，成功构建了全主动脉类器官芯片模型，并用于主动脉疾病分子机制研究及潜在药物的筛选。该主动脉类器官芯片模型能够完全模拟不同解剖主动脉节段的异质性，可用于研究主动脉疾病节段异质性发病机制和进行有效药物筛选。制和进行有效药物筛选。制和进行有效药物筛选。


技术研发人员：朱铠 刘刚 明杨 李军 冯思思 赖颢 程蕾蕾 王春生
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：2022.09.20
技术公布日：2022/11/18