一种凝结芽孢杆菌BC07、其用途及其抑菌剂、药物、食品和抑菌方法与流程

一种凝结芽孢杆菌bc07、其用途及其抑菌剂、药物、食品和抑菌方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种凝结芽孢杆菌bc07、其用途及其抑菌剂、药物、食品和抑菌方法。


背景技术：

2.腹泻是一种正常大便习惯改变的症状，主要表现为每天的大便次数增加到3次或3次以上，且稠度降低，呈水样，通常伴随呕吐或发热，人体虚脱。如果不及时干预或治疗，腹泻会严重影响人的身体健康和精神状态，对于儿童还会影响生长发育。有研究表明由于抗生素的长期大量使用，破坏了肠道内菌群的平衡，致使机体失去屏障保护作用，导致内源性或医院获得性病原菌如艰难梭菌的感染，产生外毒素引起艰难梭菌相关性腹泻，严重影响肠道菌群平衡，致使肠道菌群失调，引起各种代谢紊乱，甚至导致慢性疾病的发生，其中就包括炎症性肠病（ibd）。
3.目前，医学上对于缓解腹泻主要采用改善电解质紊乱、补充营养，服用止泻药或者生物疗法。虽然这些疗法取得了一定的效果，但是不能对肠道菌群进行有效的修复。而益生菌具有调节肠道菌群结构，改善肠道代谢紊乱，增强肠道免疫功能，缓解炎症的功效。因此，筛选出具有缓解腹泻作用同时能有效调节肠道菌群平衡，快速修复肠道环境的益生菌成为新的开发思路。
4.本领域现有技术也报道过一些具有抑制病原菌的益生菌，但可同时高效抑制产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌等多种病原菌且理化性能优异的凝结芽孢杆菌尚未见报道。


技术实现要素：

5.针对本领域现有技术存在的上述不足，本发明提供一株缓解腹泻、调节肠道菌群平衡的凝结芽孢杆菌bc07、其用途及其抑菌剂、药物、食品和抑菌方法。
6.本发明的技术方案如下：一种凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07，其特征在于，其保藏编号为cctcc no: m 2022195。
7.保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07在抑制病原菌、和/或，制备缓解腹泻或调节肠道菌群或抑菌的药物、和/或，制备食品方面的用途。
8.所述病原菌选自：产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌；优选地，所述腹泻指肠致病性大肠杆菌（epec）或艰难梭菌引发的腹泻；优选地，所述调节肠道菌群指调节有益菌；优选地，有益菌选自：乳双歧杆菌和/或嗜酸乳杆菌。
9.一种抑菌剂，包括抑菌活性成分，其特征在于，其抑菌活性成分包括：保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
10.所述的一种抑菌剂还包括：菌剂常用的辅料；优选地，所述抑菌指抑制病原菌；优选地，所述病原菌选自：产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌。
11.一种缓解腹泻或调节肠道菌群的药物，包括药效活性成分，其特征在于，其药效活性成分包括：保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
12.所述的一种缓解腹泻或调节肠道菌群的药物还包括：药学上可接受的辅料；优选地，所述腹泻指肠致病性大肠杆菌（epec）或艰难梭菌引发的腹泻；优选地，所述调节肠道菌群指调节有益菌；优选地，有益菌选自：乳双歧杆菌和/或嗜酸乳杆菌。
13.一种食品，其特征在于，包括：保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
14.所述的一种食品还包括：食品添加剂。
15.一种非治疗目的地抑制病原菌的方法，其特征在于，采用保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07抑制病原菌。
16.优选地，所述病原菌选自：产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌。
[0017] 本发明还请求保护保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07在缓解腹泻或调节肠道菌群方面的用途。
[0018] 本发明提供一株凝结芽孢杆菌菌株（bacillus coagulans）菌株bc07，其保藏编号为：cctcc no: m 2022195。
[0019]
保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌bc07在缓解腹泻和/或调节肠道菌群平衡的药品或食品、保健品方面的用途。
[0020]
所述凝结芽孢杆菌bc07具体形态特征如下：菌体特征为：革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，芽孢形态一端膨大成鼓槌状。
[0021]
菌落特征为：在固体葡萄糖胰蛋白胨培养基上菌落呈米白色，微凸起，表面光滑，湿润，边缘整齐。
[0022]
本发明提供的凝结芽孢杆菌bc07具有较强的胃液和肠液耐受能力，在ph2.5时的人工胃液下处理3h，其存活率达到67%，在ph3.5时的人工胃液条件下处理3h，其存活率可达100%，在0.3%胆盐的人工肠液处理3h，其存活率可达99.5%。
[0023]
进一步地，本发明通过抑制圈方法筛选出具有抑制致泻性大肠埃希氏菌的凝结芽孢杆菌bc07，其对致泻性大肠埃希氏菌的抑制圈直径分别达到了20mm、21mm，进一步地其对福氏志贺氏菌的抑菌圈直径达到了19mm，对肠炎沙门氏菌的抑制圈直径达到了23mm，对艰难梭菌的抑制圈直径达到了22mm，是一株具有较强病原菌抑制能力的益生菌，能显著降低病原菌地生长，有效缓解病原菌引起的腹泻。
[0024]
另一方面，凝结芽孢杆菌在与双歧杆菌、嗜酸乳杆菌共培养时，显著提升了有益菌
的含量，对于改善肠道菌群结构，调节肠道菌群平衡起到了有效作用。
[0025]
所述凝结芽孢杆菌bc07在体外细胞黏附实验中，能显著抑制艰难梭菌和大肠杆菌对人肠道上皮细胞ht-29的黏附，降低病原菌的致病性，能有效改善肠道健康，提高肠道屏障功能。
[0026]
所述凝结芽孢杆菌bc07对常见的15种抗生素敏感，表明凝结芽孢杆菌是不耐药的安全益生菌。
[0027]
同时，本发明提供的凝结芽孢杆菌bc07能显著减轻艰难梭菌或致泻性大肠杆菌引起的小鼠腹泻发生，对病原菌有明显地抑制效果，有助于缓解腹泻的症状。
[0028]
所述的产品包含但不限于食品或药品。食品使用形式可包括但不限于糖果，饮料，饼干。药品使用形式可包括但不限于胶囊，片剂，颗粒剂，丸剂等。
[0029]
根据实施例，所述的产品，包括蛋白粉，也包括胶囊。
[0030]
本发明的有益效果：与其他技术相比，本发明提供了一株具有缓解腹泻、调节肠道菌群平衡的凝结芽孢杆菌bc07及其应用。本发明的凝结芽孢杆菌bc07是一种能产乳酸的芽孢杆菌，可以利用氧气，进入肠道后制造厌氧环境，促进有益菌特别是双歧杆菌的增殖，抑制病原菌的生长，形成具有保护作用的生物屏障，恢复正常的肠道蠕动，减轻和修复侵袭性细菌对肠粘膜的损伤，调节肠道菌群平衡，从而减少粪便的次数，缓解腹泻的发生。该bc07菌株具有较强的病原菌抑制能力，尤其是在抑制致泻性大肠杆菌和服用抗生素感染的艰难梭菌生长方面体现出较强的抑制效果，能减轻病原菌导致的腹泻发生；同时该菌株在与双歧杆菌、嗜酸乳杆菌共培养时，显著提升了有益菌的含量，说明有助于促进有益菌的增长，调节肠道菌群平衡。该菌株具有较强的胃液和胆盐耐受能力，说明该菌株能顺利通过机体胃肠道发挥益生功效，改善机体健康，并且该菌株对常见的抗生素敏感，安全性高，有应用于缓解腹泻产品的巨大前景。
[0031]
本发明凝结芽孢杆菌bc07（bacillus coagulans）的保藏信息如下：保藏编号：cctcc no：m 2022195；分类命名：bacillus coagulans；保藏日期：2022年03月04日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
[0032]
图1为本发明实验例1的凝结芽孢杆菌bc07菌落形态及个体形态。
[0033]
图2为本发明实验例2的凝结芽孢杆菌bc07胃液耐受能力测试。
[0034]
图3为本发明实验例2的凝结芽孢杆菌bc07胆盐耐受能力测试。
[0035]
图4为本发明实验例4的凝结芽孢杆菌bc07与有益菌共培养时促增长实验。
[0036]
图5为本发明实验例5的凝结芽孢杆菌bc07抑制病原菌黏附实验。
具体实施方式
[0037]
下面结合实施例和实验例对本发明做进一步详细阐述，但本发明的实施方式不限于此，也不以此限制本发明的保护范围。
[0038]
生物材料来源本发明实施例使用的凝结芽孢杆菌bc07（bacillus coagulans）保藏编号为cctcc no: m 2022195。
[0039]
产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、肠炎沙门氏菌、福氏志贺氏菌和艰难梭菌购自广东省微生物菌种保藏中心。
[0040]
人结肠腺癌上皮细胞ht-29细胞购自中国典型培养物保藏中心。
[0041]
第1组实施例、本发明的bc07菌株本组实施例提供一种凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07，其保藏编号为cctcc no: m 2022195。
[0042]
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、发酵保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07的行为均落入本发明的保护范围。
[0043]
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂；还可制成食品，例如，发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品、发酵肉制品、发酵饮料、益生菌发酵剂、益生菌固体饮料等。所述发酵乳制品包括常温酸奶、低温酸奶、搅拌型酸奶、凝固型酸奶、饮用性酸奶、乳酪、乳酸菌饮料等。
[0044]
本文中，发明内容、具体实施方式部分记载的凝结芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌菌株、bc07、菌株bc07、bacillus coagulans、凝结芽孢杆菌bc07、凝结芽孢杆菌bc07菌株均指代：本发明的保藏编号为cctcc no: m 2022193的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
[0045]
在一些实施例中，所述的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07为活菌或灭活菌或该菌株的衍生物。
[0046]
第2组实施例、本发明的bc07菌株的用途本组实施例提供保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07在抑制病原菌、和/或，制备缓解腹泻或调节肠道菌群或抑菌的药物、和/或，制备食品方面的用途。
[0047]
在一些实施例中，所述病原菌选自：产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌；优选地，所述腹泻指肠致病性大肠杆菌（epec）或艰难梭菌引发的腹泻；优选地，所述调节肠道菌群指调节有益菌；优选地，有益菌选自：乳双歧杆菌和/或嗜酸乳杆菌。
[0048]
本领域技术人员可根据实际生产需要，结合食品/药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《药用辅料手册》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），对食用辅料或药用辅料进行常规选择或调整，进而制成不同的剂型、不同存储条件、不同保质期的药物或食品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
[0049]
第3组实施例、本发明的抑菌剂
本组实施例提供一种抑菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抑菌剂包括抑菌活性成分；所述抑菌活性成分包括：保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
[0050]
在进一步的实施例中，所述的一种抑菌剂还包括：菌剂常用的辅料。
[0051]
在具体的实施例中，所述抑菌指抑制病原菌。
[0052]
更具体地，所述病原菌选自：产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌。
[0053]
在更具体的实施例中，所述菌剂常用的辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
[0054]
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合菌剂制备领域的常规技术手段（例如，《药用辅料手册》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述菌剂常用的辅料进行选择和调配，并将cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
[0055]
第4组实施例、本发明的药物本组实施例提供一种缓解腹泻或调节肠道菌群的药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述药物包括药效活性成分；所述药效活性成分包括：保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
[0056]
在进一步的实施例中，所述的一种缓解腹泻或调节肠道菌群的药物还包括：药学上可接受的辅料；优选地，所述腹泻指肠致病性大肠杆菌（epec）或艰难梭菌引发的腹泻；优选地，所述调节肠道菌群指调节有益菌；优选地，有益菌选自：乳双歧杆菌和/或嗜酸乳杆菌。
[0057]
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
[0058]
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《药用辅料手册》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述药用辅料进行选择和调配，并将cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
[0059]
第5组实施例、本发明的食品本组实施例提供一种食品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述食品包括：保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07。
[0060]
在进一步的实施例中，所述的一种食品还包括：食品添加剂。
[0061]
在另一些实施例中，所述食品添加剂选自：漂白剂、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜
味剂、酸味剂、增味剂、护色剂等。
[0062]
在具体的实施例中，所述食品包括一般食品、保健食品；在更具体的实施例中，所述食品选自：益生菌固体饮料、冲泡饮料、压片糖果、休闲零食、软糖、调制乳粉、发酵制品、发酵饮料、发酵乳、豆制品、果蔬制品。
[0063]
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合食品生产加工工艺领域的常规技术手段（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》等），本领域技术人员可对上述食品添加剂进行选择和调配，并将cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液等。
[0064]
第6组实施例、本发明的抑菌方法本组实施例提供一种非治疗目的地抑制病原菌的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用保藏编号为cctcc no: m 2022195的凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans）菌株bc07抑制病原菌。
[0065]
优选地，所述病原菌选自：产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌。
[0066]
下面通过实验例进一步阐述和验证本发明bc07菌株的有益效果。下述实验例所使用的凝结芽孢杆菌培养基的配比为：葡萄糖0.1g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加水定容至1000ml，ph调节至7.0，500ml三角瓶分装，每瓶300ml，按每瓶装量称琼脂粉18g/l于三角瓶中，塞好棉塞，牛皮纸外包扎，121℃灭菌20min。灭菌好的培养基冷却至45~50℃时，倒制平板培养基。
[0067]
mrs培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸膏5 g、葡萄糖20 g、k2hpo
4 2 g、柠檬酸钠2 g、mg so4·
7h2o 0.2 g、乙酸钠5.0 g、mnso4·
4h2o 0.2 g，吐温80 1ml，1000 ml蒸馏水。121 ℃灭菌20 min。
[0068]
艰难梭菌培养基：液体培养基使用bhi培养基，购至青岛海博;固体培养基使用tsa 5%脱纤维蛋白羊血。
[0069]
大肠杆菌培养基：lb培养基如无特殊说明，本发明实施例和实验例中使用的各类试剂耗材均可商购获得，相关实验步骤均为本领域常见操作，具有本领域技术人员可常规理解的技术含义。
[0070]
实验例1、凝结芽孢杆菌bc07的分离鉴定1）菌株分离取泡菜样品放入装有无菌生理盐水离心管中，振荡使之充分混匀，静置后取样品悬液2ml置于 80
ꢀ°
c 水浴处理 10 min， 进行10 倍梯度稀释，再选择适宜稀释梯度涂布于含1.5% 碳酸钙的 mrs琼脂培养基，置于42℃ 培养箱恒温培养 72 h，待菌落长出后，挑选白色有光泽，圆形、边缘整齐，微凸起，透明圈较大的单菌落，进行革兰氏染色、细胞形态观察后挑单菌落在凝结芽孢杆菌固体平板上反复划线纯化，得到纯培养菌株。
[0071]
2）菌株鉴定形态学特征：纯化后的凝结芽孢杆菌在所述固体平板培养基上呈圆形，菌落直径在2~5mm，米白色，边缘整齐，表面湿润；革兰氏染色镜检菌体呈紫色，单杆或对杆，形成芽孢时一端膨大，呈鼓槌状，此特征为凝结芽孢杆菌特有特征，如图1所示。
[0072]
生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行，如表1所示。
[0073]
注：“ ”：表示阳性；
“‑”
：表示阴性。
[0074]
16s rdna鉴定：使用cn 114574405 a一文记载的通用引物对菌株进行 pcr 扩增，pcr 产物通过凝胶电泳检测后，产物送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将测得基因序列提交至ncbi数据库中进行blast 分析比对，以 16s rrna 基因序列同源性≥99%为鉴定标准。鉴定结果显示该菌株属于凝结芽孢杆菌，将该菌株命名为bc07，并送保藏，其保藏信息如下：保藏编号：cctcc no：m 2022195；分类命名：bacillus coagulans；保藏日期：2022年03月04日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
[0075]
实验例2、凝结芽孢杆菌bc07对人工胃液和人工肠液的耐受性测试模拟人工胃液：配制pbs溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/l hcl调节ph值至2.5、3.5、4.5，充分溶解后分别用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
[0076]
模拟人工肠液：配制pbs溶液，加入0.1%胰蛋白酶后再分别加入0.1%、0.3%、0.5%的牛胆盐，用0.1mol/l naoh调节ph值至8.0，充分溶解分别后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
[0077]
分别取凝结芽孢杆菌bc07的芽孢菌悬液1ml，离心6000rpm 6min，弃上清，加入pbs 充分震荡均匀，离心10000rpm，2min小心弃去上清收集菌体。然后分别加入1ml的模拟胃液和人工肠液中，于37℃孵育3h，孵育结束后将处理液离心，并稀释平板法测定活菌总数（cfu/ml）。存活率%=（3h活菌数/0h活菌数）
×
100%实验结果如图2和图3所示，在胃液ph2.5、3.5、4.5条件下37℃孵育3h后，凝结芽孢杆菌bc07活菌数存活率高达67%、100%、122%，在胆盐溶液中37℃孵育3h后，bc07在0.3%胆盐条件处理3h后活菌数存活率高达99%，在0.5%的胆盐处理后存活率达到了90%，表明凝结芽孢杆菌bc07的芽孢悬液在0.5%胆盐浓度下存活率较高，具有较强的耐受胃液和胆盐的能力，能顺利通过机体胃肠道从而发挥益生功效，调节肠道菌群平衡和改善机体健康功能。
[0078]
实验例3、凝结芽孢杆菌bc07抑制病原菌实验凝结芽孢杆菌bc07菌液制备：将凝结芽孢杆菌bc07按一定比例接种至液体mrs培养基中，42℃培养24h，得到bc07菌液。
[0079]
指标菌菌液制备：将指示菌株分别在lb固体平板培养基上活化，37℃培养24h，挑取菌苔至生理盐水制备菌悬液108cfu/ml；艰难梭菌在bhi液体培养基中活化，37℃培养24h调整菌悬液浓度至108cfu/ml。
[0080]
抑菌实验：将含有1.5%琼脂的lb液体培养基冷却至55℃左右，与指示菌株菌悬液按一定比例混匀，调节指示菌浓度（106cfu/ml），然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，在每孔中加入200μl拮抗菌液（108cfu/ml），以200μl无菌mrs液体培养基作为空白对照，静置数分钟后，放入37℃恒温培养箱中，培养24h后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌三个重复，结果见表2。
[0081]
结果由表2所示，凝结芽孢杆菌bc07对致泻性病原菌具有较强的抑制能力，进一步说明该菌株在缓解腹泻方面具有积极功效。
[0082]
实验例4、凝结芽孢杆菌bc07与有益菌共培养实验分别将活化好的乳双歧杆菌（1
×
108cfu/ml）、嗜酸乳杆菌（1
×
108cfu/ml）、凝结芽孢杆菌(1
×
108cfu/ml)分别按2%接种量接种培养板，再将凝结芽孢杆菌分别与乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌按1:1混合均匀后，按2%接种量接种至培养板，在高通量筛选仪上培养，观察
单菌株和混合培养菌株的生长趋势。
[0083]
结果如图4所示，其中c9、d9为乳双歧杆菌纯培养，e9、f9为嗜酸乳杆菌纯培养，d10为凝结芽孢杆菌纯培养，c11、d11为凝结芽孢杆菌与乳双歧杆菌共培养，e11与f11为凝结芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌共培养，可以看出与有益菌的纯培养相比，凝结芽孢杆菌bc07在与有益菌共培养时，乳双歧和嗜酸乳杆菌的od增长量显著增加，表明凝结芽孢杆菌bc07在与有益菌共培养时能促进彼此生长，具有调节有益菌群的生长能力，有效改善肠道菌群平衡。
[0084] 实验例5、凝结芽孢杆菌bc07抑制病原菌黏附人结直肠癌细胞ht-29实验（1）凝结芽孢杆菌bc07对艰难梭菌在细胞黏附的抑制能力细胞复苏：将复苏后的ht-29细胞接种至添加了 10%（v/v）胎牛血清的 dmem 培养基的12 孔细胞培养板中，细胞添加量为每孔2.4
×
105cell/ml的细胞， 5% co2、37℃恒温培养至80%细胞贴壁，用pbs洗涤3次后备用。
[0085]
益生菌和病原菌在细胞中的添加方式：竞争方式：向ht-29细胞中添加bc07（1
×
108cfu/ml）和艰难梭菌（1
×
108cell/ml）各200μl菌液，于5% co2、37℃恒温培养箱孵育2h。
[0086]
排斥方式：向ht-29细胞中先添加200μlbc07（1
×
108cfu/ml）于5% co2、37℃恒温培养箱孵育1h后用pbs洗涤3次，再向其中添加200μl艰难梭菌悬液（1
×
108cell/ml）同样条件下再培养1h。
[0087]
置换方式：向ht-29细胞中先添加200μl 艰难梭菌悬液（1
×
108cfu/ml）于5% co2、37℃恒温培养箱孵育1h后用pbs洗涤3次，再向其中添加bc07 200μl（1
×
108cell/ml）同样条件下再培养1h。
[0088]
对照组：向ht-29细胞中添加200μl艰难梭菌（1
×
108cell/ml）悬液，于5% co2、37℃恒温培养箱孵育2h。
[0089]
培养结束后将4组分别用pbs漂洗3次制成细胞悬液，分别从中吸取100ul涂布于ccfa平板上，厌氧条件37℃培养72h。计算凝结芽孢杆菌bc07对病原菌在细胞黏附的抑制率。抑制率公式如下：抑制率=（1-n1/n2）
×
100%n1:实验组平板上的病原菌计数结果n2:对照组平板上的病原菌计数结果（2）凝结芽孢杆菌bc07对大肠杆菌在细胞黏附的抑制率实验方法同（1），计数平板培养基采用emb培养基。
[0090]
益生菌能在肠道中发挥作用，首先需要先黏附在肠道黏膜上，占据肠道黏附位点，排除病原菌的侵袭。结果如图5显示，凝结芽孢杆菌对病原菌的抑制率较高，其中在排斥条件下表现最佳，对艰难梭菌在细胞的黏附抑制率达到80%，对大肠杆菌的抑制率达到了84%；竞争方式下对艰难梭菌的抑制率为69%，对大肠杆菌的抑制率达到了65%；置换条件下，对艰难梭菌的抑制率达到了45%，对大肠杆菌的抑制率达到了48%。表明凝结芽孢杆菌能有效抑制艰难梭菌和致泻型大肠杆菌在肠道上皮细胞的黏附，降低病原菌对肠道的破坏作用。
[0091]
实验例6、凝结芽孢杆菌bc07抗生素敏感实验将凝结芽孢杆菌划线接种于琼脂平板上，42℃培养48h后,得到单菌落。挑取单菌落至pbs中制备菌悬液，调整菌悬液浓度为108cfu/ml。取300
µ
l菌悬液，用无菌棉签均匀涂
布于整个mrs固体平板，将抗生素药敏试纸片按照一定间距有序置于平板表面37℃，培养适宜时间后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径，结果见表3。
[0092]
从表3可以看出，凝结芽孢杆菌bc07对15种抗生素都显示敏感，表明bc07是具有益生功能的安全性菌株。
[0093] 实验例7、凝结芽孢杆菌bc07对小鼠感染肠致病性大肠杆菌epec和艰难梭菌腹泻缓解实验（1）菌悬液制备凝结芽孢杆菌bc07菌悬液制备：将活化后的bc07涂布接种于凝结芽孢杆菌固体培养基中，42℃培养72h，收集菌体制成109cuf/ml的菌悬液置于-80℃冰箱保存备用。
[0094]
大肠杆菌悬液制备：将活化后的大肠杆菌涂布接种于lb培养基中，37℃培养48h，收集菌体制成106cuf/ml的菌悬液置于-80℃冰箱保存备用。
[0095]
艰难梭菌悬液制备：取活化后的艰难梭菌涂布接种于含0.1%牛黄胆酸钠的bhi固体培养基中，37℃厌氧培养7天，收集菌苔，洗涤重悬后制成106cuf/ml的菌悬液置于-80℃冰箱保存备用。
[0096]
（2）bc07对小鼠感染后的腹泻干预实验实验取sfp级c57bl/c雄性小鼠30只，体重18-20g。动物饲养室温温度 23
±
2℃，相
对湿度在40%～60%，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养6天后随机分组，每组6只，分为5组，包括对照组、模型ⅰ组（大肠杆菌染致泻组）、模型ⅱ组（艰难梭菌致泻组）、益生菌ⅰ组（bc07 大肠杆菌感染致泻组），益生菌ⅱ组（bc07 艰难梭菌感染致泻组），试验期12天。
[0097]
适应饲养6天，所有小鼠不同组在适应期内均喂养常规饲料和饮水。适应期结束后，对照组试验开始到结束期间每天自由进食和饮水；模型组及益生菌组使用抗生素混合液连续灌胃3天，抗生素混合液组成成分为：卡那霉素（0.4mg/ ml）、庆大霉素（0.035mg/ml）、多粘菌素（850u/ml）、甲硝唑（0.215mg/ml）、万古霉素（0.045mg/ ml），然后再改为纯净水连续灌胃2天。病原菌感染的前1天,给每组小鼠腹腔注射一次克林霉素(10mg/kg)。感染前半小时先给每只小鼠灌胃酸中和液，半小时后再给每只小鼠灌胃菌液，模型ⅰ组以含1.0
×
106cfu/ml的大肠杆菌悬液每天一次灌胃小鼠，模型ⅱ组以含1.0
×
106cfu/ml的艰难梭菌悬液每天一次灌胃小鼠。益生菌ⅰ组以含1.0
×
106cfu/ml的大肠杆菌悬液每天一次灌胃小鼠，当出现腹泻时停止大肠杆菌悬液灌胃，开始每天两次灌胃bc07悬液1.0
×
109cfu/ml连续处理6天；益生菌ⅱ组在罐胃前按以含1.0
×
106cfu/ml的艰难梭菌悬液每天一次灌胃小鼠，当出现腹泻时停止艰难梭菌悬液灌胃，开始每天两次灌胃bc07悬液1.0
×
109cfu/ml连续处理6天；灌胃第2天，发现模型组和益生菌组（此时未进行益生菌干预）小鼠均出现腹泻，模型组继续灌胃病原菌，益生菌组开始灌胃bc07菌悬液进行干预。
[0098]
在试验造模和干预期间每天观察不同组小鼠的腹泻情况，健康状况。对照组整个实验期间未见腹泻，无小鼠死亡现象；模型组小鼠在灌胃的第2天开始出现腹泻症状，第3天，腹泻严重，第4天模型组小鼠出现死亡，小鼠腹泻症状有100%；而益生菌组在整个干预实验过程中，小鼠初期腹泻症状显著改善，后期干预期间未出现腹泻症状，且未见小鼠死亡，结果如表4所示，再次说明凝结芽孢杆菌bc07能有效减缓和预防由病原菌引起的小鼠腹泻发生率。
[0099]
注：
“‑”
表示无腹泻症状；“ ”表示轻微腹泻；“ ”表示中度腹泻；“ ”表示严重腹泻；“o”表示小鼠死亡。