合成三七素的工程菌和应用

1.本发明属于生物医药工程技术领域，更确切的说，本发明涉及一种合成三七素的工程菌和应用。


背景技术：

2.三七，又名田七，是国内医药业界公认的战略资源，具有活血止血，化瘀定痛的功效，是包括云南白药、片仔癀等在内的360多种中成药制剂的关键原料。三七素(β-n-oxalyl-l-α,β-diaminopropionic acid,β-odap)则是三七发挥止血功效的主要成分，其结构式为
3.三七素是一种特殊的氨基酸，为白色固体，直接食用有毒性，外用促使血小板聚集发挥类似凝血酶的作用而缩短出血时间，具有止血功能，是一种重要的医药体。由于三七中成分复杂，且三七素含量很低，所以天然的三七素提取率低，利润空间小，存在资源匮乏、耕地依赖性强、破坏生态和周期长等问题，难以满足人民日益增长的健康需求。所以，三七素的合成成为研究的热点。现阶段三七素的合成依赖于化学合成法，生物合成的方法并没有相关报道。
4.然而，现有的化学方法合成三七素通常存在步骤繁琐、收率低、环境污染问题大等问题。因此，有必要寻找一种新的途径来合成三七素。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明确有必要提供一种合成三七素的工程菌和应用以解决上述问题。
6.本发明的一个主要目的是在三七素天然途径未完全解析的情况下，通过途径设计并从不同生物体中筛选鉴定相关酶，实现其异源合成。为此，本发明主要选择了来源于细菌、霉菌、植物或蛋白质工程改造的2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的相关基因，利用这些相关基因构建重组微生物，获得生物合成三七素的工程菌，利用该生物合成三七素的工程菌合成三七素，克服了现有的植物提取法和化学方法合成三七素的不足。
7.本发明的第二个目的是提供一种利用葡萄糖、甘油等简单碳源来合成三七素的工程菌。
8.本发明的第三个目的在于通过增强上游途径、抑制竞争途径等一系列代谢调控方式来提高三七素的产量，实验结果表明，在正常条件下，代谢工程改造菌利用葡萄糖、甘油等简单碳源来生产三七素，能达到0.29g/l的产量，而在经过优化后，利用简单碳源的代谢工程菌能达到3.87g/l的最终产量。
9.为了实现上述目的，本发明提供一种合成三七素的工程菌，包括宿主菌和转入所述宿主菌的质粒载体，其中，所述质粒载体中同时导入了编码合成草酰辅酶a的酶和2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的基因。
10.其中，所述合成草酰辅酶a的酶可以分为三种方式：
11.第一种方式，合成草酰辅酶a的酶为酰化乙醛酸脱氢酶pane。所述酰化乙醛酸酰化脱氢酶pane可以来源于细菌、霉菌或植物。
12.第二种方式，所述合成草酰辅酶a的酶由乙醛酸脱氢酶gloxdh和草酰辅酶a连接酶aae组成。所述乙醛酸脱氢酶gloxdh可以来源于细菌、霉菌、植物。所述草酰辅酶a连接酶aae可以来源于细菌、霉菌或植物。
13.第三种方式，所述合成草酰辅酶a的酶由草酰乙酸水解酶oah和草酰辅酶a连接酶aae组成。所述草酰乙酸水解酶oah可以来源于细菌、霉菌、植物。
14.其中，所述2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd可以来源于细菌、霉菌或植物。
15.所述宿主菌为细菌或真菌，其中，所述细菌或真菌为原始的或改造过的。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌或酿酒酵母。
16.本发明还提供一种上述合成三七素的工程菌的应用，按照体积分数1％～10％的接种量，将上述工程菌接种到培养基中，向所述培养基中加入浓度1～5g/l的2,3-二氨基丙酸，然后加入诱导剂，在30℃～40℃进行发酵处理，制得三七素；所述培养基包括：1～5g/l mops、5～20g/l葡萄糖、1～5g/l酵母粉、5～8g/l na2hpo4、0.3～2g/l nacl、2.3～4.0g/l kh2po4和1～5g/l nh4cl。
17.本发明还提供一种合成三七素的工程菌，包括宿主菌和转入所述宿主菌的质粒载体，其中，所述质粒载体中同时导入了编码合成草酰辅酶a的酶、2,3-二氨基丙酸生物合成酶和2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的基因。
18.其中，所述合成草酰辅酶a的酶还有第四种方式：由酰化乙醛酸脱氢酶pane、乙醛酸脱氢酶gloxdh、草酰乙酸水解酶oah和草酰辅酶a连接酶aae组成。
19.所述2,3-二氨基丙酸生物合成酶为源自金黄葡萄球菌的基因簇sbna和sbnb。
20.所述质粒载体中还导入了过表达编码3-磷酸甘油酸脱氢酶sera和磷酸丝氨酸转氨酶serc的基因；如此提高了2,3-二氨基丙酸的前体l-o-磷酸丝氨酸的供应量，从而提高2,3-二氨基丙酸的合成产量，进而实现通过增强上游途径的方式提高三七素的合成产量。
21.所述宿主菌还敲除了编码苹果酸合成酶aceb、苹果酸合成酶glcb、乙醛酸还原酶ycdw、乙醛酸还原酶ghrb、乙醛酸羧化酶gcl、2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶eda和草酰辅酶a脱羧酶yfdu的基因。所述宿主菌通过采用crispr或red重组方法敲除了其中消耗乙醛酸和草酰辅酶a的基因，以减少因宿主菌造成的乙醛酸和草酰辅酶a的消耗，实现通过抑制竞争途径的方式提高上述合成三七素的工程菌生产三七素的产量。
22.本发明还提供一种上述合成三七素的工程菌的应用，按照体积分数1％～10％的接种量，将上述工程菌接种到培养基中，然后加入诱导剂，在30℃～40℃进行发酵处理，制得三七素；所述培养基包括：1～5g/l mops、5～20g/l葡萄糖、1～5g/l酵母粉、5～8g/l na2hpo4、0.3～2g/l nacl、2.3～4.0g/l kh2po4和1～5g/l nh4cl。
23.请参阅图1，利用本发明提供的上述合成三七素的工程菌主要在含有葡萄糖、甘油等简单碳源的培养基中发酵培养，以合成三七素的主要原因是：所述简单碳源在工程菌的新陈代谢作用下可以生成草酰辅酶a和2,3-二氨基丙酸，草酰辅酶a和2,3-二氨基丙酸共同在2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下合成三七素。
24.具体地，从图1中可以看出：上述简单碳源可以经过糖酵解途径然后进入三羧酸循
环，在三羧酸循环中可以分别产生异柠檬酸和草酰乙酸；异柠檬酸可以转化为乙醛酸，乙醛酸可以在酰化乙醛酸脱氢酶pane的作用下生成草酸辅酶a，还可以在乙醛酸脱氢酶gloxdh的作用下生成草酸；草酰乙酸可以在草酰乙酸水解酶oah的作用下产生草酸；草酸在草酰辅酶a连接酶aae的作用下生成草酸辅酶a。
25.上述简单碳源通过工程菌的新陈代谢可以形成l-o-磷酸丝氨酸，l-o-磷酸丝氨酸可以在2,3-二氨基丙酸生物合成酶sbna和sbnb的作用下合成2,3-二氨基丙酸。草酰辅酶a和2,3-二氨基丙酸共同在2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下合成三七素。
26.由此可见，本发明提供的合成三七素的工程菌在发酵培养的过程中，可以联合草酰辅酶a和2,3-二氨基丙酸在2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下实现生物合成三七素。
27.本发明提供的合成三七素的工程菌在发酵培养的过程中，也可以联合2,3-二氨基丙酸，在酰化乙醛酸脱氢酶pane和2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下，或在乙醛酸脱氢酶gloxdh、草酰辅酶a连接酶aae和2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下，或在草酰乙酸水解酶oah、草酰辅酶a连接酶aae和2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下，实现生物合成三七素。
28.本发明提供的合成三七素的工程菌在含有简单碳源的培养基中进行发酵培养时，可以分别生物合成草酰辅酶a和2,3-二氨基丙酸，进而在2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd的作用下合成三七素，所以，本发明提供的合成三七素的工程菌可以实现以简单碳源为源头从头生物合成三七素。
29.本发明提供的合成三七素的工程菌通过增强上游途径，敲除或抑制竞争途径，解除乙醛酸循环的抑制等方法对所述工程菌进行优化，以提高利用合成三七素的工程菌合成三七素的能力。
30.因此，本发明通过筛选出在体外具有活性的酶，获得本发明提供的上述合成三七素的工程菌；以该合成三七素的工程菌为基础，设计出如图1所示的三七素的生物合成途径，并且利用分子生物学以及代谢调控来优化合成路径，从而实现采用生物方法高效合成三七素。利用本发明提供的合成三七素的工程菌生产三七素具有方法简单、成本低廉、转化率高等优点，有利于工业化放大生产，降低生产成本，为三七素工业化生产提供了重要的依据。
附图说明
31.图1是生物合成三七素的3种不同合成途径。
32.图2是本发明实施例采用的pane的sds-page电泳图。
33.图3是本发明实施例采用的bahd sds-page电泳图。
34.图4是本发明实施例采用的fpgloxdh和sagloxdh sds-page电泳图。
35.图5是本发明实施例采用的saaae和ataae sds-page电泳图。
36.图6是本发明实施例采用的bfoah和anoah sds-page电泳图。
37.图7是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw1、bw2和bw3联合2,3-二氨基丙酸生产三七素的发酵结果图。
38.图8是三七素标品的hplc检测图。
39.图9是本发明实施例利用工程菌bw1联合2,3-二氨基丙酸生产三七素的发酵产物的hplc检测图。
40.图10是本发明实施例利用工程菌bw2联合2,3-二氨基丙酸生产三七素的发酵产物的hplc检测图。
41.图11是本发明实施例利用工程菌bw3联合2,3-二氨基丙酸生产三七素的发酵产物的hplc检测图。
42.图12是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw4、bw5和bw6从头合成三七素的发酵结果图。
43.图13是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw4从头合成三七素的发酵产物的hplc检测图。
44.图14是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw5从头合成三七素的发酵产物的hplc检测图。
45.图15是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw6从头合成三七素的发酵产物的hplc检测图。
46.图16是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw7、bw9和bw10从头合成三七素的发酵结果图。
47.图17是本发明实施例利用合成三七素的工程菌株bw11从头合成三七素的发酵结果图。
48.序列表中：
49.seq id no.1为bahd的氨基酸序列。
具体实施方式
50.下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
51.本发明中，对表达质粒的种类没有特殊要求，可认为在大肠杆菌中表达目的基因的构建方法可以采用本领域常用的各种方法，如将目的基因经过酶切处理后连接至在载体中，替换启动子，敲除基因的方法、基因突变方法等，之后不再赘述。本发明中涉及的各种酶均来源于常用的物质，而且酶的来源也不限于本发明列举的，只要与本发明列举的酶的相似度在80％以内都在本发明的保护范围内。
52.以下各实施例中，大肠杆菌菌株bw25113，trans5α和bl21(de3)均为常用大肠杆菌菌株，均可市售获得，其中trans5α用于载体构建，bl21(de3)用于蛋白表达，bw25113则作为发酵用菌株。其中，本发明各实施例中使用的质粒和菌株见后续表1所示。
53.实施例1pane的表达、纯化及酶活测定
54.根据ncbi序列id：wp_015822665.1公布的酰化乙醛酸脱氢酶基因，通过化学合成得到基因片段，用bamhⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-pane；挑选阳性转化子化转入bl21(de3)感受态细胞，将转化混合物涂布于固体lb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种至lb氨苄抗性培养基试管中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养8h，按体积分数1％～10％接种量转接至含100ml lb氨苄抗性培养基的三角瓶中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养2h，加入诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.5mm，于200rpm恒温摇床25℃恒温培养12h，将菌体离心、用裂解缓冲液(lysis buffer)重悬后超声破碎、镍柱纯化、十
二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析，结果如图2所示。其中lb培养基成分为nacl 10g/l、蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l；固体lb需另加2％的琼脂；lb氨苄抗性培养基在lb培养基的基础上另加氨苄抗性。
55.pane酶活测定体系包含：50mm tris-hcl缓冲液(ph＝7.5)、2mm dtt、3mm辅酶a(coa)、0.5mm nadp

和2mm乙醛酸。通过加入0.15μm的纯化酶pane起始反应，在340nm(ε
nadph
＝6.22*103m-1
cm-1
)记录nadph的生成速率。每生成1mol的nadph即有1mol的草酰辅酶a生成。pane酶活测定结果如表1所示。
56.实施例2bahd的表达、纯化及酶活测定
57.从选取的细菌、霉菌或植物中提取基因组及转录组，通过与已知的n-酰化酶序列进行分析比对，初步确定可以催化2,3-二氨基丙酸和草酰辅酶a生成三七素的酶，命名为2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd，序列见seq id no.1。通过化学合成得到密码子优化后的基因片段，用bamhⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-bahd；挑选阳性转化子化转入bl21(de3)感受态细胞，将转化混合物涂布于固体lb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种至lb氨苄抗性培养基试管中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养8h，按体积分数1％～10％接种量转接至含100ml lb氨苄抗性培养基的三角瓶中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养2h，加入诱导剂iptg至终浓度为0.5mm，于200rpm恒温摇床种25℃恒温培养12h，将菌体离心、用裂解缓冲液重悬后超声破碎、镍柱纯化、sds-page分析，结果如图3所示。
58.由于没有商业化的2,3-二氨基丙酸n-草酰基转移酶bahd底物草酰辅酶a，本发明采用pane与bahd双酶偶联的方法测bahd的酶活。bahd酶活测定体系包含：50mm tris-hcl缓冲液(ph＝7.5)、2mm dtt、3mm coa、0.5mm nadp

、1mm乙醛酸和0.30μm的纯化酶pane，通过乙醛酸和纯化酶pane于30℃反应5min制备草酰辅酶a，随后加入1mm 2,3-二氨基丙酸以及0.15μm的纯化酶bahd，在340nm记录nadph的生成速率。每新生成1mol的nadph即有1mol的三七素生成。bahd酶活测定结果如表1所示。
59.实施例3gloxdh的表达、纯化及酶活测定
60.根据ncbi序列id：bah29964.1公布的乙醛酸脱氢酶基因，通过化学合成得到基因片段，用bamhⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-fpgloxdh；根据ncbi序列id：bah29964.1公布的乙醛酸脱氢酶基因序列比对其它来源，比对结果显示酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)来源的cyb2p基因，ncbi序列id：ajs66626.1与fpgloxdh有50.30％的同源性，命名为sagloxdh。以酿酒酵母基因组为模板pcr，用ecorⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-sagloxdh。分别挑选阳性转化子化转入bl21(de3)感受态细胞，将转化混合物涂布于固体lb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种至lb氨苄抗性培养基试管中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养8h，按体积分数1％～10％接种量转接至含100ml lb氨苄抗性培养基的三角瓶中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养2h，加入诱导剂iptg至终浓度为0.5mm，于200rpm恒温摇床种25℃恒温培养12h，将菌体离心、用裂解缓冲液重悬后超声破碎、镍柱纯化、sds-page分析，结果如图4所示。
61.gloxdh酶活测定体系包含100mm na2hpo
4-nah2po4缓冲液(ph＝7.5)、0.1mm细胞色素c和20mm乙醛酸。通过加入0.15μm的纯化酶fpgloxdh或sagloxdh起始反应，在550nm(ε
还原态细胞色素c
＝27.7*103m-1
cm-1
)记录还原态细胞色素c的生成速率。每生成1mol的还原态细胞色素c即有1mol的草酸生成。gloxdh酶活结果如表1所示。
62.实施例4aae的表达、纯化及酶活测定
63.根据ncbi序列id：aam65672.1公布的草酰辅酶a连接酶基因，通过化学合成得到基因片段，用bamhⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-ataae；根据ncbi序列id：aam65672.1公布的草酰辅酶a连接酶基因序列比对其它来源，比对结果显示酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)来源的aae基因，ncbi序列id：np_009781.3(序列表seq id no.6)与ataae有52.14％的同源性，命名为saaae。以酿酒酵母基因组为模板pcr，用bamhⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-saaae。分别挑选阳性转化子化转入bl21(de3)感受态细胞，将转化混合物涂布于固体lb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种至lb氨苄抗性培养基试管中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养8h，按体积分数1％～10％接种量转接至含100ml lb氨苄抗性培养基的三角瓶中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养2h，加入诱导剂iptg至终浓度为0.5mm，于200rpm恒温摇床种25℃恒温培养12h，将菌体离心、用lysis buffer重悬后超声破碎、镍柱纯化、sds-page分析，结果如图5所示。
64.aae酶活测定体系包含100mm na2hpo
4-nah2po4缓冲液(ph＝7.5)、1mm草酸钠、2mm atp、2mm mgcl2、0.5mm coa、2mm dtt和0.16mm nadph，通过加入0.15μm的纯化酶ataae或saaae起始反应，在340nm(ε
nadph
＝6.22*103m-1
cm-1
)记录nadph的消耗速率。每消耗1mol的nadph即有1mol的草酸被转化成1mol的草酰辅酶a。aae酶活测定结果如表1所示。
65.实施例5oah的表达、纯化及酶活测定
66.根据ncbi序列id：bam16481.1(序列表seq id no.7)和aas99938.1(序列表seq id no.8)公布的草酰乙酸水解酶基因，通过化学合成得到基因片段，用bamhⅰ，xhoⅰ酶切位点构建重组质粒pet-anoah和pet-bfoah。分别挑选阳性转化子化转入bl21(de3)感受态细胞，将转化混合物涂布于固体lb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种至lb氨苄抗性培养基试管中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养8h，按体积分数1％～10％接种量转接至含100ml lb氨苄抗性培养基的三角瓶中，于200rpm恒温摇床中37℃恒温培养2h，加入诱导剂iptg至终浓度为0.5mm，于200rpm恒温摇床种25℃恒温培养12h，将菌体离心、用lysis buffer重悬后超声破碎、镍柱纯化、sds-page分析，结果如图6所示。
67.oah酶活测定体系包含100mm na2hpo
4-nah2po4缓冲液(ph＝7.5)、2mm草酰乙酸和5mm mncl2，通过加入0.05μm的纯化酶起始反应，在255nm(ε
oaa
＝1.1*103m-1
cm-1
)记录酮式草酰乙酸的消耗速率。每消耗1mol的酮式草酰乙酸即有1mol的草酸生成。oah酶活测定结果如表1所示。
68.实施例6联合2,3-二氨基丙酸合成三七素
69.本实施例主要是通过三条合成草酸辅酶a的途径分别联合2,3-二氨基丙酸合成三七素。
70.(1)重组质粒：pcs-pane-bahd、pcs-bfoah-saaae-bahd、pcs-fpgloxdh-saaae-bahd
71.本实施例采用实施例1～5提供的酶，通过设计引物进行pcr，接着用合适的酶对目的片段和载体进行酶切，将酶切后的片段进行回收，之后插入到载体质粒pcs27，分别获得重组质粒pcs-pane-bahd、pcs-bfoah-saaae-bahd、pcs-fpgloxdh-saaae-bahd。其中，重组质粒pcs-pane-bahd主要是将编码pane和bahd的基因连接至同一载体质粒pcs27获得；重组质粒pcs-bfoah-saaae-bahd主要是将编码bfoah、saaae和bahd的基因连接至同一载体质粒
pcs27获得；重组质粒pcs-fpgloxdh-saaae-bahd主要是将编码fpgloxdh、saaae和bahd的基因连接至同一载体质粒pcs27获得。
72.(2)合成三七素的工程菌：重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3(见表2)
73.本发明实施例提供的合成三七素的工程菌对用于构建表达质粒的宿主菌菌株种类没有特殊要求，本发明实施例采用了bw25113菌株作为构建表达质粒的初始宿主菌。
74.首先挑取新鲜的bw25113菌落接种到4ml lb培养基中，37℃培养8～12h后，取1ml接种到100ml lb培养基中，37℃培养至od
600
长到0.6时，在4℃的温度下6000rpm离心10min收集菌体，用10ml 10％预冷的甘油洗涤，6000rpm离心10min，再次重复甘油洗涤步骤，离心后尽量倒干剩余甘油，最后加入适量10％甘油重悬细胞，制得感受态细胞。取90μl感受态加入2μl重组质粒pcs-pane-bahd，冰上放置两分钟，电转后加入600μl lb培养基，洗出电转后细胞，37℃复苏1h，涂布到卡那抗性平板，于37℃恒温培养箱中过夜培养，待平板上长出菌落后，挑菌于含有卡那抗性的4ml lb培养基中37℃培养8～10h，即可获得合成三七素的工程菌：含有重组质粒pcs-pane-bahd的大肠杆菌菌株，用重组大肠杆菌bw1表示。
75.利用上述相同方法构建：含有重组质粒pcs-bfoah-saaae-bahd的大肠杆菌菌株用bw2表示，含有重组质粒pcs-fpgloxdh-saaae-bahd的大肠杆菌菌株用bw3表示。
76.(3)合成三七素的工程菌的应用：重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3分别联合2,3-二氨基丙酸通过发酵培养生产三七素
77.分别在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌bw1、bw2和bw3的工程单菌落并接种到对应的4ml含有相应抗生素的lb试管中，37℃培养8h后，转入含有相应抗生素的50ml m9培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为1％～10％，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm；其中，m9培养基包括：2g/l mops、10g/l葡萄糖、2g/l酵母粉、6.78g/l na2hpo4、0.5g/l nacl、3.0g/l/kh2po4和1.0g/l nh4cl，并根据实际情况加入相应抗生素。发酵初始加入终浓度为0.5mm的诱导剂iptg及终浓度1g/l的2,3-二氨基丙酸，发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液用以测定对应的重组大肠杆菌生长状况及目标产物产量，结果如图7所示。
78.从图7中可以看出利用重组大肠杆菌bw1生产三七素的产量最好，所以，相对其它两种菌株，使用编码pane和bahd的基因的重组大肠杆菌bw1通过联合2,3-二氨基丙酸进行发酵培养生产三七素的能力最好。
79.(4)分别鉴定重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3联合2,3-二氨基丙酸发酵培养的产物
80.待测样品需进行柱前衍生化，其中，待测样品分别为三七素标品、重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3分别联合2,3-二氨基丙酸发酵培养的发酵液，具体衍生化方法如下：
81.衍生化试剂：第一种试剂为三乙胺-乙腈溶液，使用移液枪吸取三乙胺溶液1.4ml于15ml离心管中(通风橱中操作)，再吸取乙腈8.6ml并加入其中，将混合液涡旋均匀并存放于4℃冰箱中。第二种试剂为异硫氰酸苯酯溶液，使用精细天平称取异硫氰酸苯酯-乙腈溶液135.18mg于15ml离心管中(通风橱中操作)，再用移液枪吸取乙腈10ml并加入其中，将混合液涡旋均匀并存放于4℃冰箱中。
82.衍生化方法：分别取待测样品上清液200μl(如果目标产物浓度较大，则需要先对样品进行稀释)。加入100μl试剂1三乙胺-乙腈溶液进行衍生化催化，再加入100μl试剂2异硫氰酸苯酯-乙腈溶液进行反应，加入后进行震荡混匀，然后静置反应1h使衍生化反应充分进行。待上述反应结束后加入200μl正己烷终止反应进行萃取分离，充分震荡混匀，然后离
心。待测样品在上述分层液体中下层，用一次性注射器吸取上述下层液，并将液体过膜后注入液相小导管中，再放置于液相小瓶中，盖上液相小瓶盖，做好标记，备用hplc分析。
83.采用hplc分析方法对待测样品进行检测，检测条件如下：
84.色谱柱：分离柱：diamonsil c18，id 5μm，250
×
4.6mm；
85.流动相：a为甲醇，b为1
‰
甲酸水溶液，柱温40℃，流速1ml/min检测波长为254nm。梯度洗脱程序如下表1所示：
86.表1梯度洗脱程序
87.时间(min)流动相a％流动相b％03268208020223268273268
88.配制三七素标准溶液，浓度分别为0mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、500mg/l，经上述衍生化处理和hplc检测，图8为50mg/l三七素标品的hplc图，出峰时间为4.531min。图9、图10和图11分别为重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3联合2,3-二氨基丙酸分别发酵培养的发酵产物的hplc图，分别在4.527min左右出峰，与标品峰出峰时间基本一致，可以证明：本实施例提供的重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3分别联合2,3-二氨基丙酸通过发酵培养可以生产三七素。
89.实施例7以简单碳源为源头从头合成三七素
90.本实施例主要是提供三条途径实现以简单碳源为源头从头合成三七素，主要是通过三条合成草酸辅酶a的途径联合一条合成2,3-二氨基丙酸的途径合成三七素。
91.(1)构建重组质粒pze-sbnab
92.该重组质粒主要是将编码2,3-二氨基丙酸生物合成酶sbna和sbnb的基因连接至同一表达载体pze获得，该重组质粒的构建方法与实施例6提供的重组质粒的构建方法基本相同。
93.(2)合成三七素的工程菌bw4、bw5、bw6(见表2)
94.将实施例6提供的重组大肠杆菌菌株bw1、bw2和bw3分别电转入重组质粒pze-sbnab，得到合成三七素的工程菌菌株bw4、bw5和bw6。
95.(3)合成三七素的工程菌的应用：重组大肠杆菌bw4、bw5、bw6分别通过简单碳源发酵培养生产三七素
96.分别在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌bw4、bw5、bw6的工程单菌落并接种到对应的4ml含有相应抗生素的lb试管中，37℃培养8h后，转入含有相应抗生素的50ml m9培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为1％～10％，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm。发酵初始加入终浓度为0.5mm的诱导剂iptg，发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液，用以测定对应的重组大肠杆菌菌体生长状况及目标产物产量，测量结果如图12所示。
97.从图12中可以看出：初期重组大肠杆菌bw4合成三七素的速度最快，随着时间的增加直至48h，重组大肠杆菌bw6合成三七素的产量基本接近重组大肠杆菌bw4合成三七素的产量，所以，使用编码pane、bahd、sbna和sbnb的基因的重组大肠杆菌bw4和使用编码fpgloxdh、saaae、bahd、sbna和sbnb的基因的重组大肠杆菌bw6通过简单碳源从头生物合成
三七素的能力较好。
98.(4)分别鉴定重组大肠杆菌bw4、bw5、bw6从头发酵培养的产物
99.以重组大肠杆菌bw4、bw5、bw6分别从头发酵培养的发酵液为待测样品，参照实施例6中“(4)分别鉴定重组大肠杆菌bw1、bw2、bw3联合2,3-二氨基丙酸发酵培养的产物”的鉴定方法分别对待测样品的hplc检测，鉴定结果分别参照图13、图14和图15。
100.从图8、图13、图14和图15中可以看出：分别由重组大肠杆菌bw4、bw5、bw6从头发酵培养获得的发酵液分别在4.530min左右出峰，与标品峰出峰时间基本一致，可以证明：本实施例提供的重组大肠杆菌bw4、bw5、bw6以简单碳源为源头通过发酵培养可以实现从头生产三七素。
101.实施例8通过调控策略提高从头合成三七素的产量
102.通过增强上游途径、抑制竞争等方式对合成三七素的工程菌进行优化可以提高三七素的产量。
103.(1)合成三七素的工程菌：重组大肠杆菌bw7、bw9、bw10(见表2)
104.重组大肠杆菌bw7主要是进一步通过过表达上游途径中的3-磷酸甘油酸脱氢酶sera和磷酸丝氨酸转氨酶serc的基因方式获得。具体地，重组大肠杆菌菌株bw7相当于在野生型大肠杆菌菌株bw25113的基础上同时电转入重组质粒pze-sbnab-serac和pcs-pane-bahd。其中，该重组质粒pze-sbnab-serac主要是将编码2,3-二氨基丙酸生物合成酶sbna和sbnb的基因以及过表达上游编码3-磷酸甘油酸脱氢酶sera和磷酸丝氨酸转氨酶serc的基因连接至大肠杆菌表达载体pze获得。
105.重组大肠杆菌bw9和bw10主要是通过抑制竞争的方式获得，即敲除消耗乙醛酸和草酸辅酶a的基因。具体地，采用crispr或red重组方法删除野生型大肠杆菌bw25113菌株中编码苹果酸合成酶aceb、苹果酸合成酶glcb、乙醛酸还原酶ycdw、乙醛酸还原酶ghrb、乙醛酸羧化酶gcl、2-酮-4-羟基戊二酸醛缩酶eda和草酰辅酶a脱羧酶yfdu的基因，得到大肠杆菌菌株bw8。将实施例6提供的重组质粒pcs-pane-bahd和pze-sbnab一起电转入大肠杆菌菌株bw8：bw25113δacebδglcbδycdwδghrbδgclδedaδyfdu，得到重组大肠杆菌bw9。将实施例6提供的重组质粒pcs-pane-bahd和本实施例提供的重组质粒pze-sbnab-serac一起电转入菌株大肠杆菌bw8，得到重组大肠杆菌bw10。
106.(2)合成三七素的工程菌的应用：重组大肠杆菌bw7、bw9、bw10分别通过简单碳源发酵培养生产三七素
107.分别在平板上挑取新鲜的重组大肠杆菌bw7、bw9和bw10的工程单菌落并接种到对应的4ml含有相应抗生素的lb试管中，37℃培养8h后，转入含有相应抗生素的50ml m9培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为1％～10％，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm。发酵初始加入终浓度为0.5mm的诱导剂iptg，发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液用以测定对应的重组大肠杆菌菌体生长状况及目标产物产量，测量结果如图16所示。
108.从图16可以看出：利用重组大肠杆菌bw10生产三七素的产量最好，所以，通过增强上游途径和抑制竞争等方式能够高效提高合成三七素的工程菌以碳源为源头，从头合成三七素的产量。
109.实施例9通过协同效应从头合成三七素
110.(1)合成三七素的工程菌重组大肠杆菌bw11(见表2)
111.将本发明实施例7提供的三条不同的途径同时在敲除中间产物降解途径的bw8中共表达。即采用实施例6提供的方法构建含有三条途径关键基因的质粒pcs-pane-bfoah-fpgloxdh-saaae-bahd与实施例8提供的pze-sbnab-serac一起电转入大肠杆菌菌株bw8，得到重组大肠杆菌bw11。
112.(2)合成三七素的工程菌的应用：利用重组大肠杆菌bw11从头合成三七素
113.在平板上挑取新鲜重组大肠杆菌bw11的单菌落接种到4ml含有相应抗生素的lb试管中，37℃培养8h后，转入含有相应抗生素的50ml m9培养基的摇瓶中进行发酵培养，接种量为1％～10％，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm。发酵初始加入终浓度为0.5mm的诱导剂iptg，发酵12h、24h、36h、48h取出部分发酵液用以测定重组大肠杆菌菌体生长状况及目标产物产量，测定结果如图17所示。
114.表1本发明实施例1～5提供的各种酶的酶活
115.酶比活力(mm/s/mg蛋白)pane1.50
×
10-3
bahd4.83
×
10-5
fpgloxdh3.84
×
10-5
sagloxdh1.07
×
10-5
saaae3.89
×
10-7
ataae7.22
×
10-7
anoah7.06
×
10-5
bfoah3.80
×
10-4
116.表2本发明实施例中涉及的质粒和菌株列表
[0117][0118]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。