用于基因组测试测定的高性能荧光成像模块的制作方法

用于基因组测试测定的高性能荧光成像模块
本技术是申请日为2021年01月15日、申请号为202180003305.6、发明名称为“用于基因组测试测定的高性能荧光成像模块”的中国专利申请(其对应pct申请的申请日为2021年01月15日、申请号为pct/us2021/013696)的分案申请。交叉引用
1.本技术要求2020年9月9日提交的美国临时申请第63/076,361号和2020年1月17日提交的美国临时申请第62/962,723号的权益，通过引用而将它们整体并入本文。


背景技术：

2.在典型的基于荧光的基因组测试测定，例如，基因分型或核酸测序(使用实时、循环或步进反应方案)中，使用激发光源激发与拴系在基质上的核酸分子相连接的染料分子，在基质上一个或多个空间定位的位置产生荧光光子信号，并且随后使荧光通过光学系统成像到图像传感器上。然后使用分析方法来分析图像，找到基质上经标记的分子(或分子的克隆扩增簇)的位置，并根据波长和空间坐标对荧光光子信号进行量化，然后可以将其与在基质上指定位置发生的特定化学反应(例如，杂交事件或碱基添加事件)的程度相关联。基于图像的方法提供了大规模并行和多路复用能力，这有助于降低此类技术的成本和可得性。但是，由于例如基质表面小区域内的经标记的分子(或分子的克隆扩增簇)的过密堆积或由于图像中的低对比度噪声比(cnr)而引起的检测错误可能导致在将荧光信号归因于正确的分子(或分子的克隆扩增簇)时出错。


技术实现要素：

3.本文公开了被配置成对流动池的第一内表面和第二内表面成像的成像系统，所述成像系统包括：a)物镜；b)至少一个图像传感器；和c)在所述物镜和所述至少一个图像传感器之间的光路上布置的至少一个镜筒透镜；其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(na)和大于1.0mm2的视场(fov)；并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正成像性能，使得所述流动池的第一内表面和所述流动池的第二内表面的图像具有基本相同的光学分辨率。
4.在一些实施方案中，流动池的壁厚为至少700μm，并且在第一内表面和第二内表面之间的流体填充间隙为至少50μm。在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取第一内表面和第二内表面的图像。在一些实施方案中，成像系统具有小于0.6的数值孔径(na)。在一些实施方案中，成像系统具有大于0.3的数值孔径(na)。在一些实施方案中，成像系统具有大于1.5mm2的视场(fov)。在一些实施方案中，第一内表面和第二内表面的图像的光学分辨率在整个视场(fov)上受到衍射限制。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜依次包括不对称凸-凸透镜、凸-平透镜、不对称凹-凹透镜和不对称凸-凹透镜。在一些实施方案中，成像系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计为在两个或更多个荧光波长下为第一内表面和第二内表面提供最佳成像性能。在一些实施方案中，成像系统还包括聚焦机构，其被配置为在获取第一内表面和第
二内表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，成像系统被配置为对第一内表面或第二内表面中的至少一个上的两个或更多个视场成像。在一些实施方案中，流动池的第一内表面和第二内表面涂覆有亲水涂层，并且其中所述亲水涂层还包含以》10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，当核酸群落用花青染料3(cy3)标记时，使用成像系统获取的第一内表面或第二内表面的图像显示出至少5的对比度噪声比(cnr)，成像系统包括优化用于cy3发射的二向色镜和带通滤光镜组，并且在将表面浸入25mm aces ph 7.4缓冲液中的同时，在非信号饱和条件下获取图像。在一些实施方案中，所述成像系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在所述两个不同的表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，成像系统用于监测在第一内表面和第二内表面中的至少一个上的通过亲和力测序、通过核苷酸碱基配对测序、通过核苷酸结合测序或通过核苷酸掺入反应测序，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，成像系统用于执行核酸测序。在一些实施方案中，成像系统用于确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备从样品中提取的用于测序的核酸分子，然后对核酸分子进行测序。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得成像系统的空间采样频率是成像系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，物镜和至少一个镜筒透镜的组合被配置为在样品平面中在700个周期/mm至1100个周期/mm的空间频率范围内优化调制传递函数。在一些实施方案中，对于物镜和至少一个镜筒透镜的组合而言，至少一个镜筒透镜被设计为在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(cnr)或其任何组合方面校正调制传递函数(mtf)。
5.本文还公开了核酸分子测序的方法，所述方法包括：a)使用光学系统对第一表面和轴向移位的第二表面进行成像，所述光学系统包括物镜和至少一个图像传感器，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(na)和大于1.0mm2的视场(fov)，并且其中在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取具有基本相同的光学分辨率的所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像；b)检测设置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含核酸分子或其互补序列的经荧光标记的组合物，以确定核酸分子中核苷酸的身份。
6.在一些实施方案中，利用聚焦机构在获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上对两个或更多个视场成像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水涂层。在一些实施方案中，所述亲水涂层还包含以》10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，当核酸群落用花青染料3(cy3)标记时，使用所述光学系统获取的所述两个表面的表面图像显示出至少5的对比度噪声比(cnr)，光学系统包括优化用于cy3发射的二向色镜和带通滤光镜组，并且在将表面浸入25mm aces ph 7.4缓冲液中的同时，在非信号饱和条件下获取图像。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得光学系统的
空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，光学系统包括定位在物镜和至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正用于对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，流动池的壁厚为至少700μm，并且在第一内表面和第二内表面之间的间隙为至少50μm。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜依次包括不对称凸-凸透镜、凸-平透镜、不对称凹-凹透镜和不对称凸-凹透镜。在一些实施方案中，光学系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计为在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，物镜和镜筒透镜的组合被配置为在中等空间频率至高空间频率范围内优化调制传递函数。在一些实施方案中，成像性能指标包括在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(cnr)或其任何组合方面的调制传递函数(mtf)的测量。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面的图像的光学分辨率在整个视场(fov)上受到衍射限制。在一些实施方案中，核酸分子的测序还包括在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上进行通过亲和力测序、通过核苷酸碱基配对测序、通过核苷酸结合测序或通过核苷酸掺入反应测序，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备用于测序的所述核酸分子，然后对所述核酸分子进行测序。
7.本文公开了被配置成对两个不同的轴向移位的表面成像的成像系统，所述成像系统包括物镜和至少一个图像传感器，其中所述成像系统具有小于0.6的数值孔径(na)和大于1.0mm2的视场(fov)，并且其中在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下，所述成像系统能够获取具有基本相同的光学分辨率的两个不同的轴向移位表面的图像。
8.在一些实施方案中，成像系统具有大于0.3的数值孔径。在一些实施方案中，成像系统还包括聚焦机构，其用于在获取两个不同的轴向移位的表面的图像之间重新聚焦光学系统。在一些实施方案中，成像系统被配置为对所述两个不同的轴向移位的表面中的至少一个上的两个或更多个视场成像。在一些实施方案中，所述两个不同的轴向移位的表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个不同的表面涂覆有亲水涂层，并且其中所述亲水涂层还包含以》10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，所述成像系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在所述两个不同的表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得成像系统的空间采样频率是成像系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，成像系统包括定位在物镜和至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正用于对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，流动池的壁厚为至少700μm，并且在第一内表面和第二内表面之间的间隙为至少50μm。在一些实施方案中，成像系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计为在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，两个不同的轴向移位的表面的图像的光学分辨率在整个视场(fov)上受到衍射限制。
9.本文公开了核酸分子测序的方法，所述方法包括：a)使用无补偿光学系统对第一表面和轴向移位的第二表面进行成像，所述无补偿光学系统包括物镜和至少一个图像传感
器，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(na)和大于1.0mm2的视场(fov)；b)处理所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像以校正光学像差，以使所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像具有基本相同的光学分辨率；以及c)检测布置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含核酸分子或其互补序列的经荧光标记的组合物，以确定核酸分子中核苷酸的身份。
10.在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像。在一些实施方案中，通过仅重新聚焦光学系统来获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像。在一些实施方案中，所述方法还包括在第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上对两个或更多个视场成像。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水涂层。在一些实施方案中，所述亲水涂层还包含以》10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，当核酸群落用花青染料3(cy3)标记时，使用所述光学系统获取的所述两个表面的表面图像显示出至少5的对比度噪声比(cnr)，所述光学系统包括优化用于cy3发射的二向色镜和带通滤光镜组，并且在将表面浸入25mm aces ph 7.4缓冲液中的同时，在非信号饱和条件下获取图像。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得光学系统的空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，光学系统包括定位在物镜和至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正用于对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，流动池的壁厚为至少700μm，并且在第一内表面和第二内表面之间的间隙为至少50μm。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜依次包括不对称凸-凸透镜、凸-平透镜、不对称凹-凹透镜和不对称凸-凹透镜。在一些实施方案中，光学系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计为在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，物镜和镜筒透镜的组合被配置为在中等空间频率至高空间频率范围内优化调制传递函数。在一些实施方案中，成像性能指标包括在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、图像对比度噪声比(cnr)或其任何组合方面的调制传递函数(mtf)的测量。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面的图像的光学分辨率在整个视场(fov)上受到衍射限制。在一些实施方案中，核酸分子的测序还包括在第一表面和轴向移位的第二表面中的至少一个上进行通过亲和力测序、通过核苷酸结合测序或通过核苷酸掺入反应测序，并检测结合或掺入的核苷酸碱基。在一些实施方案中，所述方法还包括确定样品的基因型，其中确定样品的基因型包括制备用于测序的所述核酸分子，然后对所述核酸分子进行测序。
11.本文公开了用于核酸分子测序的系统，所述系统包括：a)光学系统，其包括物镜和至少一个图像传感器，其中所述光学系统具有小于0.6的数值孔径(na)和大于1.0mm2的视场(fov)，并被配置为获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像；b)处理器，其被编程为：i)处理所述第一表面和所述轴向移位的第二表面的图像以校正光学像差，以使所述第一表
面和所述轴向移位的第二表面的图像具有基本相同的光学分辨率；并且ii)检测布置在所述第一表面或所述轴向移位的第二表面上的包含核酸分子或其互补序列的经荧光标记的组合物，以确定核酸分子中核苷酸的身份。
12.在一些实施方案中，在不将光学补偿器移动到所述物镜与所述至少一个图像传感器之间的光路中的情况下获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像。在一些实施方案中，通过仅重新聚焦光学系统来获取第一表面和轴向移位的第二表面的图像。在一些实施方案中，成像系统具有大于0.3的数值孔径。在一些实施方案中，第一表面和轴向移位的第二表面包括流动池的两个表面。在一些实施方案中，流动池的所述两个表面涂覆有亲水涂层，并且其中所述亲水涂层还包含以》10,000个核酸群落/mm2的表面密度布置在其上的经标记的核酸群落。在一些实施方案中，所述光学系统包括1、2、3或4个成像通道，其被配置为检测布置在第一表面或轴向移位的第二表面中的至少一个上的已经用1、2、3或4种不同的可检测标记物标记的核酸群落。在一些实施方案中，至少一个图像传感器包括像素，所述像素的像素尺寸被选择为使得光学系统的空间采样频率是光学系统的光学分辨率的至少两倍。在一些实施方案中，系统包括定位在物镜和至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，并且其中所述至少一个镜筒透镜被配置为校正用于对流动池的第一内表面和流动池的第二内表面进行成像的成像性能指标。在一些实施方案中，流动池的壁厚为至少700μm，并且在第一内表面和第二内表面之间的间隙为至少50μm。在一些实施方案中，光学系统包括两个或更多个镜筒透镜，其被设计为在两个或更多个荧光波长下提供最佳成像性能。
13.本文公开的荧光成像系统包括：a)至少一个光源，其被配置为提供一个或多个指定波长范围内的激发光；b)物镜，其被配置为在样品平面暴露于激发光后收集从所述样品平面的指定视场内产生的荧光，其中所述物镜的数值孔径为至少0.3，其中所述物镜的工作距离是至少700μm，并且其中所述视场的面积是至少2mm2；以及c)至少一个图像传感器，其中由所述物镜收集的荧光被成像到所述图像传感器上，并且其中所述图像传感器的像素尺寸被选择为使得荧光成像系统的空间采样频率是荧光成像系统的光学分辨率的至少两倍。
14.在一些实施方案中，数值孔径是至少0.75。在一些实施方案中，数值孔径是至少1.0。在一些实施方案中，工作距离是至少850μm。在一些实施方案中，工作距离是至少1,000μm。在一些实施方案中，视场的面积是至少2.5mm2。在一些实施方案中，视场的面积是至少3mm2。在一些实施方案中，空间采样频率是荧光成像系统的光学分辨率的至少2.5倍。在一些实施方案中，空间采样频率是荧光成像系统的光学分辨率的至少3倍。在一些实施方案中，系统还包括x-y-z位移平台，使得系统被配置为以自动化方式获取一系列的两个或更多个荧光图像，其中针对不同的视场获取所述系列的每个图像。在一些实施方案中，在x方向、y方向和z方向上同时调整样品平面的位置，以匹配在针对不同视场的获取图像之间的物镜焦平面的位置。在一些实施方案中，在x方向、y方向和z方向上同时调整所需的时间小于0.4秒。在一些实施方案中，系统还包括自动聚焦机构，其被配置为如果错误信号指示焦平面和样品平面在z方向上的位置之差大于指定的误差阈值，则在获取不同视场的图像之前调整焦平面位置。在一些实施方案中，指定的误差阈值是100nm。在一些实施方案中，指定的误差阈值是50nm。在一些实施方案中，系统包括三个或更多个图像传感器，并且其中系统被配置为将三个或更多个波长范围中的每一个的荧光成像到不同的图像传感器上。在一些实施方案中，三个或更多个图像传感器中的每一个的焦平面与样品平面的位置之差小于100nm。在
一些实施方案中，三个或更多个图像传感器中的每一个的焦平面与样品平面的位置之差小于50nm。在一些实施方案中，重新定位样品平面，必要时调整焦点以及获取图像所需的总时间少于0.4秒/视场。在一些实施方案中，重新定位样品平面，必要时调整焦点以及获取图像所需的总时间少于0.3秒/视场。
15.本文还公开了用于流动池的双面成像的荧光成像系统，包括：a)物镜，其被配置为收集在流动池内的样品平面的指定视场内产生的荧光；b)定位在所述物镜和至少一个图像传感器之间的至少一个镜筒透镜，其中所述至少一个镜筒透镜被配置为当对所述流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。并且其中所述流动池的壁厚是至少700μm，并且上内表面和下内表面之间的间隙是至少50μm；其中在不使光学补偿器移入或移出所述流动池和所述至少一个图像传感器之间的光路情况下，在不使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿光路移动情况下并且在不使镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路的情况下，所述成像性能指标对于对所述流动池的所述上内表面或所述下内表面成像基本相同。
16.在一些实施方案中，物镜是可商购的显微镜物镜。在一些实施方案中，可商购的显微镜物镜的数值孔径是至少0.3。在一些实施方案中，物镜的工作距离是至少700μm。在一些实施方案中，对物镜进行校正以补偿0.17mm的盖玻片厚度(或流动池壁厚)。在一些实施方案中，荧光成像系统还包括位于物镜附近并且位于物镜和镜筒透镜之间的电光相位板，其中所述电光相位板提供对由于流体填充流动池的上内表面和下内表面之间的间隙而引起的光学像差的校正。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜是包括三个或更多个光学组件的复合透镜。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜是包括四个光学组件的复合透镜。在一些实施方案中，四个光学组件依次包括第一不对称凸-凸透镜、第二凸-平透镜、第三不对称凹-凹透镜和第四不对称凸-凹透镜。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜被配置为当对具有至少1mm壁厚的流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜被配置为当对具有至少100μm间隙的流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。在一些实施方案中，至少一个镜筒透镜被配置为当对具有至少200μm间隙的流动池的内表面进行成像时校正所述物镜、所述至少一个镜筒透镜和所述至少一个图像传感器的组合的成像性能指标。在一些实施方案中，该系统包括单个物镜、两个镜筒透镜和两个图像传感器，并且所述两个镜筒透镜中的每一个被设计为在不同的荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，该系统包括单个物镜、三个镜筒透镜和三个图像传感器，并且所述三个镜筒透镜中的每一个被设计为在不同的荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，该系统包括单个物镜、四个镜筒透镜和四个图像传感器，并且所述四个镜筒透镜中的每一个被设计为在不同的荧光波长下提供最佳成像性能。在一些实施方案中，物镜或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在中等空间频率至高空间频率范围内优化调制传递函数。在一些实施方案中，成像性能指标包括在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、对比度噪声比(cnr)或其任何组合方面的调制传递函数(mtf)的测量。在一些实施方案中，用于对流动池的上内表面和下内表面成像的成像性能指标之差小于10％。在一些实施方案中，用于对流动池的上内表面和下内表面成像的成像性能指标之差小于5％。在一些实
施方案中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，至少一个镜筒透镜的使用为双面成像提供了成像性能指标的至少等同或更好的改善。在一些实施方案中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，至少一个镜筒透镜的使用为双面成像提供了成像性能指标的至少10％的改善。
17.本文公开了用于基于成像的固相基因分型和测序应用的照明系统，所述照明系统包括：a)光源；b)液体光导，其被配置为收集由光源发出的光并将所述光传递到包含拴系的生物大分子的载体表面上的指定照明场。
18.在一些实施方案中，照明系统还包括聚光透镜。在一些实施方案中，指定的照明区域具有至少2mm2的面积。在一些实施方案中，对于用于获取载体表面的图像的成像系统，传递到指定照明场的光在整个指定视场上具有均匀的强度。在一些实施方案中，指定的视场具有至少2mm2的面积。在一些实施方案中，当光强度的变化系数(cv)小于10％时，传递到指定照明场的光在整个指定视场上具有均匀的强度。在一些实施方案中，当光强度的变化系数(cv)小于5％时，传递到指定照明场的光在整个指定视场上具有均匀的强度。在一些实施方案中，传递到指定照明场的光具有小于0.1的散斑对比度值。在一些实施方案中，传递到指定照明场的光具有小于0.05的散斑对比度值。通过引用并入
19.本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文，其程度如同具体地和单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文的术语为准。
附图说明
20.在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考下面的利用了本发明原理的说明性实施方式的详细描述并结合附图可以更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：
21.图1a-图1b示意性地示出了成像双表面载体结构的非限制性示例，其用于呈现样品位点以通过本文公开的成像系统进行成像。图1a：对流动池前和后内表面成像的图示。图1b：对基质的前和后外表面成像的图示。
22.图2a-图2b示出了包括二向色分束镜的多通道荧光成像模块的非限制性示例，所述二向色分束镜用于将激发光束传输至样品，并且接收并通过反射重定向所产生的荧光发射至四个检测通道，所述四个检测通道被配置为检测四个不同对应波长或波段的荧光发射。图2a：顶等距视图。图2b：底等距视图。
23.图3a-图3b示出了图2a和图2b的多通道荧光成像模块内的光路，该多通道荧光成像模块包括二向色分束镜，所述二向色分束镜用于将激发光束传输至样品，并且接收并通过反射重定向所产生的荧光发射至四个检测通道，所述四个检测通道用于检测四个不同对应波长或波段的荧光发射。图3a：顶视图。图3b：侧视图。
24.图4是示出二向色滤光镜性能和入射光束角之间的关系的图。
25.图5是示出在二向色滤光镜上光束足迹大小和入射光束角之间的关系的图。
26.图6a-图6b示意性地示出了多通道荧光成像模块的二向色滤光镜和检测通道的示例配置，其中二向色滤光镜具有倾斜的反射表面，使得入射光束(例如中心角)和二向色滤
光镜的反射表面之间的角度小于45。图6a：包括四个检测通道的多通道荧光成像模块的示意图。图6b：示出光束在二向色反射镜上的入射角(aoi)的详细视图。
27.图7提供了图，其示出了对应于图6a和6b中示出的成像模块配置的改善的二向色滤光镜性能。
28.图8提供了图，其示出了对应于图6a和6b中示出的成像模块配置的改善的二向色滤光镜性能。
29.图9a-图9b提供了图，其示出了由图6a和6b的成像模块配置导致的减小的表面变形。图9a示出了折叠角对由于向最后一个反射镜增加1波pv球面光焦度而引起的图像质量下降的影响。图9b示出了折叠角对由于向最后一个反射镜增加0.1波pv球面光焦度而引起的图像质量下降的影响。
30.图10a-图10b提供了图，其示出了由于使用激发光束的s偏振而导致的改善的激发滤光镜性能(例如通带和周围阻带之间的更陡峭的过渡)。图10a：示例性带通二向色滤光镜在入射角为40度和45度时的透射光谱，其中入射光束是线性偏振的，并且相对于二向色滤光镜的平面是p偏振的。图10b：改变光源相对于二向色滤光镜的取向，从而使入射光束相对于二向色滤光镜的平面呈s偏振，导致通带和阻带之间实质上更陡峭的边缘。
31.图11a-图11b示出了本文公开的具有0.3的数值孔径(na)的示例性双表面成像系统的调制传递函数(mtf)。图11a：第一表面。图11b：第二表面。
32.图12a-图12b示出了本文公开的具有0.4的na的示例性双表面成像系统的mtf。图12a：第一表面。图12b：第二表面。
33.图13a-图13b示出了本文公开的具有0.5的na的示例性双表面成像系统的mtf。图13a：第一表面。图13b：第二表面。
34.图14a-图14b示出了本文公开的具有0.6的na的示例性双表面成像系统的mtf。图14a：第一表面。图14b：第二表面。
35.图15a-图15b示出了本文公开的具有0.7的na的示例性双表面成像系统的mtf。图15a：第一表面。图15b：第二表面。
36.图16a-图16b示出了本文公开的具有0.8的na的示例性双表面成像系统的mtf。图16a：第一表面。图16b：第二表面。
37.图17a-图17b提供了用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的所计算的斯特列尔比(strehl ratio)的图。图17a：对于不同物镜和/或光学系统数值孔径，作为中间流体层厚度(流体通道高度)的函数的用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的斯特列尔比的图。图17b：针对通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像和厚度为0.1mm的中间水层，作为数值孔径的函数的斯特列尔比的图。
38.图18提供了本公开的双波长激发/四通道发射荧光成像系统的示意图。
39.图19提供了用于物镜设计的光射线追迹图，所述物镜设计被设计为用于对0.17mm厚的盖玻片相对侧的表面成像。
40.图20提供了当用于对0.17mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
41.图21提供了当用于对0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
42.图22提供了当用于对与0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
43.图23提供了当用于对1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
44.图24提供了当用于对与1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图19中示出的物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。
45.图25提供了用于镜筒透镜设计的射线追迹图，如果与图19中示出的物镜结合使用，则所述镜筒透镜提供通过1mm厚的盖玻片的改善的双面成像。
46.图26提供了当用于对1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图25中示出的物镜和镜筒透镜的组合的随空间频率变化的调制传递函数的图。
47.图27提供了当用于对与1.0mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚水性流体层的表面成像时，图25中示出的物镜和镜筒透镜的组合的随空间频率变化的调制传递函数的图。
48.图28提供了用于本公开的镜筒透镜设计(左)的射线追迹图，所述镜筒透镜设计已被优化以提供高质量的双面成像性能。由于镜筒透镜不再经无限校正，因此可以将适当设计的零透镜(右)与镜筒透镜组合使用，以补偿出于制造和检测目的而非无限校正的镜筒透镜。
49.图29图示了具有2个流体适配器的单个毛细管流动池的一个非限制性示例。
50.图30图示了流动池盒的一个非限制性示例，该流动池盒包括底座、流体适配器和任选的其他组件，并且被设计成容纳两个毛细管。
51.图31图示了系统的一个非限制性示例，该系统包括连接到各种流体流量控制组件的单个毛细管流动池，其中该单个毛细管与在显微镜载物台上或在定制成像仪器中的安装兼容，以用于各种成像应用。
52.图32图示了系统的一个非限制性示例，该系统包括具有集成的隔膜阀的毛细管流动池盒，以减少或最小化死体积并节省某些关键试剂。
53.图33图示了系统的一个非限制性示例，该系统包括毛细管流动池，显微镜装置和温度控制机构。
54.图34图示了通过使用与流动池盒接触放置的金属板来控制毛细管流动池的温度的一个非限制性示例。
55.图35图示了用于包括非接触式热控制机构的毛细管流动池的温度控制的一种非限制性方法。
56.图36a-图36c图示了流动池装置制造的非限制性示例。图36a显示了一件式玻璃流动池的制备。图36b显示了两件式玻璃流动池的制备。图36c显示了三件式玻璃流动池的制备。
57.图37a-图37c图示了玻璃流动池设计的非限制性示例。图37a显示了一件式玻璃流动池设计。图37b显示了两件式玻璃流动池设计。图37c显示了三件式玻璃流动池设计。
58.图38图示了在毛细管腔中簇扩增的可视化。
59.图39提供了本文公开的测序系统的框图的非限制性示例。
60.图40提供了本文公开的测序方法的流程图的非限制性示例。
61.图41提供了本文公开的结构化照明系统的示意图的非限制性示例。
62.图42提供了用于获取和处理如本文公开的流动池表面的结构化照明图像的流程图的非限制性示例。
63.图43a-图43b提供了如本文公开的多路复用读取头的非限制性示意图。图43a：多路复用读取头的侧视图，其中各个测微荧光计被配置为对共同表面(例如，流动池的内表面)成像。图43b：多路复用读取头的顶视图，其示出了由多路复用读取头的各个测微荧光计获取的成像路径。
64.图44a-图44b提供了如本文公开的多路复用读取头的非限制性示意图。图44a：多路复用读取头的侧视图，其中多个单独的测微荧光计的第一子集被配置为对流动池的第一表面(例如第一内表面)成像，并且多个单独的测微荧光计的第二子集被配置为对流动池的第二表面(例如第二内表面)成像。图44b：图44a的多路复用读取头的顶视图，其示出了由多路复用读取头的各个测微荧光计获取的成像路径。
具体实施方式
65.需要荧光成像方法和系统，其为基因组学应用提供增加的光学分辨率和改善的图像质量，从而导致基因组测试准确性的相应改善。本文公开了用于高性能荧光成像方法和系统的光学系统设计，其可以为基于荧光成像的基因组学应用提供改善的光学分辨率(包括高性能光学分辨率)、改善的图像质量和更高的通量中的任何一种或多种。所公开的光学照明和成像系统设计可以提供以下优点中的任何一个或多个：改善的二向色滤光镜性能，增加的二向色滤光镜频率响应均匀性，改善的激发光束滤波，更大的视场，增加的空间分辨率，改善的调制传递、对比度噪声比和图像质量，更高的空间采样频率，重新定位样品平面以捕获一系列图像(例如不同视场的图像)时图像捕获之间的过渡更快，改善的成像系统占空比，以及更高的通量图像获取和分析。
66.在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用(包括使用厚流动池壁(例如壁(或盖玻片)厚度》700μm和流体通道(例如，流体通道的高度或厚度是50-200μm))，成像性能的改善可以使用新颖的物镜设计来实现，所述物镜设计校正光学像差，所述光学像差是通过对厚盖玻片和/或流体通道与物镜相对侧上的表面成像而引入的。
67.在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用(包括使用厚流动池壁(例如壁(或盖玻片)厚度》700μm和流体通道(例如，流体通道的高度或厚度是50-200μm))，成像性能的改善可以甚至在使用商业上可用的现成物镜时通过以下实现：使用新颖的镜筒透镜设计(不同于只是在中间像平面上形成图像的传统显微镜中的镜筒透镜)，所述新颖的镜筒透镜设计与物镜组合地校正由厚流动池壁和/或中间流体层引起的光学像差。
68.在一些情况下，例如对于多通道(例如，两色或四色)成像应用，成像性能的改善可以通过以下来实现：使用多个镜筒透镜，一个镜筒透镜用于一个成像通道，其中每个镜筒透镜设计已经针对在该成像通道中使用的指定波长范围进行了优化。
69.在一些情况下，例如对于双面(流动池)成像应用，成像性能的改善可以通过以下来实现：使用电光相位板与物镜组合以补偿由分隔流动池的上(近)内和下(远)内表面的流体层引起的光学像差。在一些情况下，该设计方法还可以补偿由例如运动致动的补偿器引入的振动，所述运动致动的补偿器根据对流动池的哪个表面进行成像而移入或移出光路。
70.公开了各种多通道荧光成像模块设计，其可以包括照明和成像光路，所述照明和成像光路包括折叠光路(例如，包括一个或多个分束镜或合束镜，例如二向色分束镜或合束镜)，所述折叠光路将激发光束引导至物镜，并将透射通过物镜的发射光引导至多个检测通道。本文所述的荧光成像模块的一些特别有利的特征包括指定二向色滤光镜入射角，其导致在二向色滤光镜的通带和阻带波长区域之间更陡峭和/或更均匀的过渡。这样的滤光镜可以被包括在折叠式光学器件内并且可以包括二向色分束镜或合束镜。所公开的成像光学器件设计的另外有利特征可以包括一个或多个激发光源以及一个或多个检测光路相对于物镜和接收激发光束的二向色滤光镜的位置和取向。激发光束也可以是线性偏振的，并且线性偏振的取向可以使得s偏振光入射在二向色滤光镜的二向色反射表面上。这样的特征可以潜在地改善激发光束滤波和/或减少由于二向色滤光镜的表面变形而引入到发射光束中的波前误差。本文所述的荧光成像模块可以包括或不包括这些特征中的任何一个，并且可以包括或不包括这些优点中的任何一个。
71.本文还描述了被配置为通过对例如形成于流动池表面上的固定的核酸分子的阵列或扩增的核酸簇进行成像，来分析大量不同的核酸序列的装置和系统。本文所述的装置和系统还可用于例如对比较的基因组执行测序、追踪基因表达、执行微rna序列分析、表观基因组学、适体和噬菌体展示文库表征以及执行其他测序应用。本文公开的装置和系统包括光学、机械、流体、热、电和计算装置/方面的各种组合。所公开的流动池装置、盒和系统所赋予的优点包括但不限于：(i)降低了装置和系统的制造复杂性和成本，(ii)显著降低了可消耗成本(例如，与现有的核酸测序系统相比)，(iii)与典型的流动池表面功能化方法的兼容性，(iv)与微流体组件(例如注射泵和隔膜阀等)组合时的灵活流量控制，以及(v)灵活的系统通量。
72.本文中公开的是由现成的、一次性的单腔(例如，单个流体流动通道)或多腔毛细管构造的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒，其还可包括流体适配器、盒底座，一个或多个集成的流体流量控制组件，或其任何组合。本文还公开了基于毛细管流动池的系统，其可包括一个或多个毛细管流动池装置(或微流体芯片)、一个或多个毛细管流动池盒(或微流体盒)、流体流动控制器模块、温度控制模块、成像模块或其任何组合。
73.一些公开的毛细管流动池装置、盒和系统的设计特征包括但不限于(i)一体式的流动通道构造，(ii)试剂流之间的密封、可靠和重复的切换，这些可通过以下方式实现：简单的加载/卸载机制，从而可靠地密封了系统和毛细管之间的流体界面，由此有利于毛细管更换和系统重复使用，并能够精确控制反应条件，例如试剂浓度、ph和温度；(iii)可更换的单个流体流动通道装置或毛细管流动池盒包括多个可互换使用的流动通道，以提供灵活的系统通量，以及(iv)与多种检测方法(例如荧光成像)的兼容性。
74.尽管公开的毛细管流动池装置和系统、毛细管流动池盒、基于毛细管流动池的系统、微流体装置和盒以及基于微流体芯片的系统主要在其用于核酸测序应用的背景下进行了描述，但是所公开的装置和系统的各个方面不仅可以应用于核酸测序，也可以应用于任何其他类型的化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用。应当理解，可以单独地、共同地或彼此结合地理解所公开的方法、装置和系统的不同方面。尽管本文主要在荧光成像(包括例如荧光显微镜成像、荧光共聚焦成像、双光子荧光等)的背景下讨论，但本领域技术人员将理解，许多公开的光学设计方法和特征可应用于其他成像模式，例如，明场成
像、暗场成像、相衬成像等。
75.定义：除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本公开所属领域的本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。
76.如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“所述”包括重复数个指称物，除非上下文另外明确指出。除非另有说明，否则这里中任何引用的“或”旨在覆盖“和/或”。
77.如本文所用，术语“约”是指该数字加上或指向该数字的10％。在范围背景下使用术语“约”是指该范围减去其最小值的10％和加上其最大值的10％。
78.如本文中所使用的，短语“成像模块”、“成像单元”、“成像系统”、“光学成像模块”、“光学成像单元”和“光学成像系统”可以互换使用，并且可以包括较大系统的组件或子系统，所述较大系统包括例如，流体模块、温度控制模块、位移平台、自动流体分配和/或微孔板处理、处理器或计算机、仪器控制软件、数据分析和显示软件等。
79.如本文中所使用的，术语“检测通道”是指光学系统内的光路(和/或其中的光学组件)，其被配置为将从样品产生的光信号传递至检测器。在一些情况下，检测通道可以被配置为用于执行光谱学测量，例如使用检测器(例如光电倍增管)来监测荧光信号或其他光信号。在一些情况下，“检测通道”可以是“成像通道”，即光学系统内的光路(和/或其中的光学组件)，其被配置为捕获图像并将图像传递至图像传感器。
80.如本文所用，“可检测标记”可以指本领域技术人员已知的多种可检测标记或标签中的任何一种。示例包括但不限于发色团、荧光团、量子点、上转换磷光体、发光或化学发光分子、放射性同位素、磁性纳米颗粒、质量标签等。在一些情况下，优选的标记可以包括荧光团。
81.如本文所用，术语“激发波长”是指用于激发荧光指示剂(例如，荧光团或染料分子)并产生荧光的光的波长。尽管典型地将激发波长指定为单个波长，例如620nm，但是本领域技术人员将理解，该说明书是指以指定波长为中心的波长范围或激发滤光镜带通。例如，在一些情况下，指定激发波长的光包括指定波长
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大的光。在一些情况下，所使用的激发波长可以与或可以不与荧光指示剂的最大吸收峰一致。
82.如本文所用，术语“发射波长”是指由荧光指示剂(例如，荧光团或染料分子)在适当波长的光激发后发射的光的波长。尽管典型地将发射波长指定为单个波长，例如670nm，但是本领域技术人员将理解，该说明书是指以指定波长为中心的波长范围或发射滤光镜带通。在一些情况下，指定发射波长的光包括指定波长
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大的光。在一些情况下，所使用的发射波长可以与或可以不与荧光指示剂的最大发射峰一致。
83.如本文所用，如果荧光源自退火或以其他方式束缚于表面的荧光团，例如具有与表面上的寡核苷酸衔接子的相应区段反向互补的区域并退火至所述相应区段的荧光标记的核酸序列，那么它是“特异性的”。这种荧光与源自没有通过这样的退火过程束缚在表面上，或者在一些情况下是表面的背景荧光的荧光团的荧光形成对比。
84.如本文所用，“核酸”(也称为“核酸分子”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、核糖核酸(rna)或脱氧核糖核酸(dna))是由两个或更多个通过共价核苷间键连接的核苷酸的线性聚
合物，或其变体或功能片段。在核酸的天然示例中，核苷间键通常是磷酸二酯键。然而，其他示例任选地包含其他核苷间键，例如硫代磷酸酯键，并且可以包含或可以不包含磷酸基团。核酸包括双链和单链dna，以及双链和单链rna、dna/rna杂合体、肽核酸(pna)、pna与dna或rna之间的杂合体，还可以包括其他类型的核酸修饰。
85.如本文所用，“核苷酸”是指核苷酸、核苷或其类似物。在一些情况下，核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基的n-或c-糖苷(例如，含有2-脱氧-d-核糖的脱氧核糖核苷或含有d-核糖的核糖核苷)。其他核苷酸类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸等。
86.被视为信息管道的荧光成像：荧光成像系统在典型的基因组测定技术(包括核酸测序应用)中起到的作用的有用概括是作为信息管道，其中光子信号进入管道的一端，例如用于成像的物镜，并且关于荧光信号的定位特定信息出现在管道的另一端，例如在图像传感器的位置。当更多信息通过此管道传送时，不可避免地一些内容将在此传输过程中丢失并且永远不会恢复。这种情况的一个示例是，在基质表面的小区域内存在太多经标记的分子(或分子的克隆扩增簇)而无法在图像中清晰分辨的情况；在图像传感器的位置，很难区分由相邻分子簇产生的光子信号，从而增加了将信号归于错误簇并导致检测错误的概率。
87.光学成像模块设计：因此，设计光学成像模块的目的是使通过该检测管道的信息内容流最大化，并使检测错误最小化。在设计过程中需要解决多个关键设计要素，包括：
88.1)将有待成像的基质表面上的物理特征密度与光学成像系统的整体图像质量和所用图像传感器的像素采样频率相匹配。这些参数的不匹配可能会导致信息丢失，或者有时甚至会产生错误的信息，例如，当像素采样频率低于光学分辨率极限两倍时，可能会出现空间混叠。
89.2)将有待成像的区域的大小与光学成像系统的整体图像质量和整个视场上的聚焦质量相匹配。
90.3)将光学系统设计的光学收集效率、调制传递函数和图像传感器性能特征与输入激发光子通量预期的荧光光子通量、染料效率(与染料消光系数和荧光量子产率有关)匹配，同时考虑到背景信号和系统噪声特性。
91.4)最大程度地分离光谱内容，以减少荧光成像通道之间的串扰。
92.5)在不同视场的图像捕获之间通过重新定位样品或光学器件，使图像获取步骤有效同步，以最小化成像系统的停机时间(或最大化占空比)，并且从而最大化图像捕获过程的整体通量。
93.本公开描述了解决上述概述的每个设计要素并创建成像系统的组件级说明的系统方式。
94.改善的光学分辨率和图像质量，以改善或最大化信息传输和通量：一种非限制性的设计实践可以是从光学分辨率开始，所述光学分辨率被要求用于：区分关于线对的数量x/mm(lp/mm)而指定的两个相邻特征并将其转换为相应的数值孔径(na)。然后可以使用数值孔径要求来评估对调制传递函数和图像对比度的所产生的影响。
95.标准调制传递函数(mtf)描述了通过光学系统传递的图像对比度(调制)的空间频率应答；图像对比度作为空间频率的函数而降低，并随na的增加而增加。此功能限制了给定na可以实现的对比度/调制。此外，波前误差可能会对mtf产生负面影响，因此需要使用真正
的系统mtf而不是衍射极限光学器件预测来改善或优化光学系统设计。注意，尽管设计实践可能主要考虑物镜的mtf，但如本文所用，mtf指的是整个系统mtf(包括从盖玻片到图像传感器的完整光路)。
96.在基因组测试应用中，要成像的目标是表面上的高密度“点”阵列(随机分布或图案化)，可以确定下游分析所需的最小调制传递值，以分辨两个相邻点并区分四个可能的状态(例如on-off、on-on、off-on和off-off)。例如，假设点足够小，从而可以近似为点光源。假设检测任务是确定相隔距离d的两个相邻点是on还是off(换句话说，是亮还是暗)，并且确定由样品平面(或物平面)处的点产生的荧光信号的对比度噪声比(cnr)为c
样品
，那么在理想条件下图像传感器平面处的两个相邻点的读出信号的cnr c
图像
可以近似地约是c
图像
＝c
样品
*mtf(1/d)，其中mtf(1/d)是空间频率＝(1/d)时的mtf值。
97.在典型的设计中，c的值可能需要是至少4，以便可以使用简单的阈值方法来避免荧光信号的错误分类。假设荧光信号强度的高斯分布在平均值附近，在c
图像
》4时，正确分类荧光信号(例如为on或off)的预期误差是《0.035％。使用专有的高cnr测序和表面化学方法(例如美国专利申请号16/363,842中所述)，可以当针对稀疏场测量时(即在簇或点的表面密度较低时)(其中mtf的值接近100％)实现针对栓系到基质表面的经克隆扩增的、经标记的寡核苷酸分子的簇的大于12(或甚至更高)的样品平面cnr(c
样品
)值。假设样品平面cnr值c
样品
》12，并且目标分类错误率《0.1％(因此，c
图像
》4)，则在某些实施方式中，可以确定m(1/d)的最小值为m(1/d)＝4/12～33％。因此，至少33％的调制传递函数阈值可用于保留所传递图像的信息内容。
98.设计实践可以将两个特征或点的最小分隔距离d与光学分辨率要求(如上所述以x(lp/mm)表示)相关，d＝(1mm)/x，即，d是两个特征或点之间的可以由光学系统完全分辨的最小分隔距离。在本文公开的一些设计中，在设计分析的目的是增加或最大化相关信息传递的情况下，则可以将该设计标准放宽为d＝(1mm)/x/a，其中2》a》1。对于相同的光学分辨率x lp/mm，减小了d(样品平面处的最小可分辨点分离距离)的值，从而使得能够使用更高的特征密度。
99.设计实践使用奈奎斯特标准确定样品平面处的最小空间采样频率，其中空间采样频率s≥2*x(并且其中x是如上所述以xlp/mm表示的成像系统的光学分辨率)。当系统空间采样频率接近奈奎斯特标准时(通常是这种情况)，大于s的成像系统分辨率会导致混叠，因为光学传感器无法充分采样光学系统分辨出的更高频率信息。
100.在本文公开的一些设计中，可以使用基于关系s＝b*y(其中b≥2且y是真实的光学系统mtf极限)的过采样方案来进一步改善成像系统的信息传递能力。如上所述，x(lp/mm)对应于实际的非零(》33％)最小调制传递值，而y(lp/mm)是光学分辨率的极限，因此在y(lp/mm)时调制是0。因此，在所公开的设计中，y(lp/mm)可以有利地明显大于x。对于b≥2的值，所公开的设计是针对样品对象频率x进行过采样，即，s≥b*y》2*x。
101.以上关系可用于确定系统放大率，并可为图像传感器像素大小提供上限。图像传感器像素大小的选择与系统的光学质量以及减少混叠所需的空间采样频率相匹配。图像传感器像素大小的下限可以基于光子通量来确定，因为相对噪声贡献随像素变小而增加。
102.但是，其他设计方法也是可能的。例如，将na减小到小于0.6(例如，0.5或更小)可以提供增加的景深。这种增加的景深可以实现双表面成像，其中可以在有或没有重新聚焦
的情况下同时成像不同深度的两个表面。如上所述，减小na可以减小光学分辨率。在一些实施方式中，可以采用使用更高的激发束功率，例如1w或更高，以产生强信号。固有的高对比度样品(即，包括表现出强大的前景信号和显著降低的背景信号的样品表面)也可以用于促进获取高对比度噪声比(cnr)图像，例如具有cnr值》20，其为核酸测序应用等中的碱基检出提供改善的信号辨别力。在本文公开的一些光学系统设计中，样品载体结构(例如具有亲水性表面的流动池)用于降低背景噪声。
103.在各种实施方式中，所公开的光学系统提供了大视场(fov)。例如，可以为包括例如物镜和镜筒透镜的一些光学成像系统提供大于2mm或3mm的fov。在一些情况下，光学成像系统提供减小的放大率，例如小于10x的放大率。在一些实施方式中，这种减小的放大率可以促进大fov设计。尽管放大率降低，但是由于可以使用具有小像素尺寸或间距的检测器阵列，因此这种系统的光学分辨率仍然足够。在一些实施方案中，可使用包含比光学成像系统(例如，物镜和镜筒透镜)提供的光学分辨率的两倍更小的像素大小的图像传感器来满足奈奎斯特定理。
104.其他设计也是可能的。在一些光学设计中，配置为提供双表面成像，其中可以同时对不同深度的两个表面进行成像，光学成像系统(例如，物镜和/或镜筒透镜)被配置为降低光学像差，以与在其他深度的其他位置(例如，其他平面)相比，对这两个相应深度处的所述两个表面(例如，两个平面)的成像更多。另外，光学成像系统可以被配置为降低像差，以通过所述样品载体结构上的透射层(例如玻璃层(例如盖玻片))并且通过包含样品或在所述两个表面中的至少一个上与样品接触的溶液(例如水溶液)对这两个相应深度处的所述两个表面(例如，两个平面)成像。
105.多通道荧光成像模块和系统：在一些情况下，本文公开的成像模块或系统可以包括荧光成像模块或系统。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可包括单个荧光激发光源(用于提供单个波长或单个激发波长范围内的激发光)和配置为将激发光递送到样品(例如，布置在基质表面上的经荧光标记的核酸分子或其簇)的光路。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可以包括单个荧光发射成像和检测通道，例如光路，所述光路被配置为收集由样品发射的荧光并递送样品的图像(例如，其上面布置有经荧光标记的核酸分子或其簇的基质表面的图像)至图像传感器或其他光检测装置。在一些情况下，荧光成像系统可包括两个、三个、四个或多于四个的荧光激发光源和/或光路，其被配置为以两个、三个、四个或多于四个的激发波长(或在两个、三个、四个或多于四个的激发波长范围内)递送激发光。在一些情况下，本文公开的荧光成像系统可包括两个、三个、四个或多于四个的荧光发射成像和检测通道，其被配置为收集样品在两个、三个、四个或多于四个发射波长(或在两个、三个、四个或多于四个的发射波长范围内)发射的荧光，并将样品的图像(例如，其上面布置有经荧光标记的核酸分子或其簇的基质表面的图像)递送至两个、三个、四个或多于四个的图像传感器或其他光电检测设备。
106.双表面成像：在一些情况下，本文公开的成像系统，包括荧光成像系统，可以被配置为获取单个样品载体结构或基质表面的高分辨率图像。在一些情况下，本文公开的成像系统，包括荧光成像系统，可以被配置为获取两个或更多个样品载体结构或基质表面(例如，流动池的两个或更多个表面)的高分辨率图像。在一些情况下，由所公开的成像系统提供的高分辨率图像可以用于随着各种试剂流过流动池或在流动池基质周围流动而监测在
流动池的两个或更多个表面上发生的反应(例如，核酸杂交、扩增和/或测序反应)。图1a和图1b提供了这种双表面载体结构的示意图。图1a示出了双表面载体结构，例如流动池，其包括内部流动通道，分析物或试剂可通过所述内部流动通道流动。流动通道可以在第一层和第二层、顶层和底层和/或前层和后层之间形成，例如在所示的第一板和第二板、顶板和底板和/或前板和后板之间形成。一个或多个板可包括玻璃板，例如盖玻片等。在一些实施方式中，所述层包括硼硅酸盐玻璃、石英或塑料。这些顶层和底层的内表面提供了流动通道的壁，这些壁有助于限制分析物或试剂通过流动池的流动通道的流动。在一些设计中，这些内表面是平的。类似地，顶层和底层可以是平的。在一些设计中，在顶层和底层之间布置至少一个另外的层(未示出)。该另外的层可在其中切出一个或多个通道，这些通道有助于限定一个或多个流动通道并控制分析物或试剂在流动通道内的流动。样品载体结构(例如流动池)的另外讨论可在下面找到。
107.图1a示意性地示出了流动池的第一内表面和第二内表面、顶内表面和底内表面，和/或前内表面和后内表面上的多个发荧光的样品位点。在一些实施方式中，可在这些位点处发生反应以结合样品，使得荧光从这些位点发射(注意，图1a是示意性的且未按比例绘制；例如，发荧光的样品位点的尺寸和间距可能小于所示)。
108.图1b示出了具有两个表面的另一个双表面载体结构，所述两个表面包含要成像的发荧光的样品位点。样品载体结构包括具有第一外表面和第二外表面、顶外表面和底外表面和/或前外表面和后外表面的基质。在一些设计中，这些外表面是平的。在各种实施方式中，分析物或试剂流过这些第一外表面和第二外表面。图1b示意性地示出了在样品载体结构的第一外表面和第二外表面、顶外表面和底外表面和/或前外表面和后外表面上的多个发荧光的样品位点。在一些实施方式中，可在这些位点处发生反应以结合样品，使得荧光从这些位点发射(注意，图1b是示意性的且未按比例绘制；例如，发荧光的样品位点的尺寸和间距可能小于所示)。
109.在一些情况下，本文描述的荧光成像模块和系统可以被配置为对距物镜不同距离的第一表面和第二表面上的这种发荧光的样品位点成像。在一些设计中，一次仅对第一表面或第二表面中的一个聚焦。因此，在这样的设计中，这些表面之一在第一时间成像，并且另一个表面在第二时间成像。可以在对这些表面之一进行成像之后改变荧光成像模块的焦点，以便以可比较的光学分辨率对另一个表面成像，因为两个表面的图像不同时对焦。在一些设计中，可以将光学补偿元件引入到样品载体结构与图像传感器之间的光路中，以对两个表面之一成像。在这种荧光成像配置中，景深可能不够大，不能包括第一表面和第二表面两者。在本文所述的荧光成像模块的一些实施方式中，第一表面和第二表面两者可以在同一时间，即同时成像。例如，荧光成像模块可以具有足够大的景深以包括两个表面。在一些情况下，可以通过例如减小物镜(或显微镜物镜)的数值孔径来提供这种增加的景深，这将在下面更详细地讨论。
110.如图1a和图1b所示，成像光学器件(例如，物镜)可以与第一表面和第二表面相距合适的距离(例如，与工作距离相对应的距离)定位，以在检测通道的图像传感器上形成第一表面和第二表面的对焦图像。如图1a和图1b的示例所示，第一表面可以在所述物镜和第二表面之间。例如，如所示，物镜布置在第一表面和第二表面两者之上，并且第一表面布置在第二表面之上。第一表面和第二表面例如处于不同的深度。第一表面和第二表面与荧光
成像模块、照明和成像模块、成像光学器件或物镜中的任何一个或多个相距不同的距离。第一表面和第二表面彼此分开，第一表面在第二表面上方间隔开。在所示的示例中，第一表面和第二表面是平面，并且沿着垂直于所述第一平面和第二平面的方向彼此分开。同样，在所示的示例中，所述物镜具有光轴，并且所述第一表面和第二表面沿所述光轴的方向彼此分开。类似地，第一表面和第二表面之间的间隔可以对应于纵向距离，诸如沿着激发光束的光路和/或沿着穿过荧光成像模块和/或物镜的光轴。因此，这两个表面可以在纵向(z)方向上彼此分开一定距离，所述纵向方向可以沿着激发光束的中心轴和/或物镜和/或荧光成像模块的光轴的方向。在一些实施方式中，该间隔可以例如对应于流动池内的流动通道。
111.在各种设计中，物镜(可能与另一个光学组件，例如镜筒透镜组合)具有至少与第一表面和第二表面之间的纵向间隔(沿z方向)一样大的景深和/或聚焦深度。因此，物镜可以单独地或与另外的光学组件组合地在一个或多个检测通道的图像传感器上同时形成第一表面和第二表面两者的对焦图像，其中这些图像具有可比较的光学分辨率。在一些实施方式中，成像模块可以或可以不需要重新聚焦以捕获具有可比较的光学分辨率的第一表面和第二表面两者的图像。在一些实施方式中，补偿光学器件不需要移入或移出成像模块的光路以形成第一表面和第二表面的对焦图像。类似地，在一些实施方式中，成像模块(例如，物镜和/或镜筒透镜)中的一个或多个光学元件(例如透镜元件)不需要例如沿着第一光路和/或第二光路(例如，沿着成像光学器件的光轴)在纵向上移动以与用于形成第二表面的对焦图像时所述一个或多个光学元件的位置相比，形成第一表面的对焦图像。然而，在一些实施方式中，成像模块包括自动聚焦系统，所述自动聚焦系统被配置为同时使第一表面和第二表面对焦。在各种实施方式中，将样品对焦以充分分辨样品位点，所述样品位点在横向方向(例如，x和y方向)上紧密地间隔在一起。因此，在各种实施方式中，在至少一个检测通道中，没有光学元件进入样品载体结构(例如，支持样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器(或光电检测器阵列)之间的光路，以形成样品载体结构的第一表面和所述样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。类似地，在各种实施方式中，没有光学补偿用于在图像传感器或光电检测器阵列上形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像，这与用于在图像传感器或光电检测器阵列上形成样品载体结构第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像的光学补偿不相同。另外，在某些实施方式中，与形成样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像相比，在样品载体结构(例如在支持样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器之间的光路中没有光学元件被不同地调节以形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。类似地，在一些各种实施方式中，与在图像传感器上形成所述样品载体结构的第二表面上的发荧光的样品位点的对焦图像相比，在样品载体结构(例如在支持样品载体结构的平移台之间)和至少一个检测通道中的图像传感器之间的光路中没有光学元件移动不同的量或不同的方向以在图像传感器上形成样品载体结构的第一表面上的发荧光的样品位点的对焦图像。特征的任何组合都是可能的。例如，在一些实施方式中，无需将光学补偿器移入或移出流动池和至少一个图像传感器之间的光路并且无需使成像系统的一个或多个光学元件(例如，物镜和/或镜筒透镜)沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，可以获得流动池的上内表面和下内表面的对焦图像。例如，无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路或者无需使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿其间的
光路(例如，光轴)移动的情况下，可以获得流动池的上内表面和下内表面的对焦图像。
112.可以将荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为减少或最小化在两个位置(例如，与流动池或其他样品载体结构上的两个表面相对应的两个平面，例如发荧光的样品位点所在之处)处的光学像差。可以将荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为相对于其他位置或平面减小或最小化所选位置或平面，例如在双表面流动池上包含发荧光的样品位点的第一表面和第二表面处的光学像差。例如，可以将荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个设计为与位于距物镜其他距离的其他深度或平面相关的像差相比，减小或最小化位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的光学像差。例如，用于成像第一表面和第二表面的光学像差可以比距物镜约1mm至约10mm范围的区域中的其他地方更小。另外，在一些情况下，荧光成像模块、照明光路、成像光路、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个可被配置为补偿由发射光穿过样品载体结构的一个或多个部分(例如包括样品附着在其上的表面之一的层以及可能与样品接触的溶液)的透射引起的光学像差。该层(例如，盖玻片或流动池的壁)可包括例如具有折射率并引入光学像差的玻璃、石英、塑料或其他透明材料。
113.因此，当成像第一表面和第二表面时，成像性能可以基本相同。例如，对于第一表面和第二表面的成像，光学传递函数(otf)和/或调制传递函数(mtf)可以基本相同。这些传递函数中的一个或两个在一个或多个指定的空间频率处或在一系列空间频率上取平均值时可以例如在彼此的20％之内、15％之内、10％之内、5％之内、2.5％之内或1％之内，或由这些值中的任何形成的任何范围内。因此，无需将光学补偿器移入或移出流动池和至少一个图像传感器之间的光路并且无需使成像系统的一个或多个光学元件(例如，物镜和/或镜筒透镜)沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，成像性能指标对于流动池的上内表面或下内表面成像可以是基本相同的。例如，无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件移入或移出光路或者无需使镜筒透镜的一个或多个光学元件沿其间的光路(例如，光轴)移动的情况下，成像性能指标对于流动池的上内表面或下内表面成像可以是基本相同的。下文和于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723中包含了mtf的其他讨论，该申请的全部内容通过引用合并于本文。
114.本领域技术人员将理解，在一些情况下，所公开的成像模块或系统可以是设计用于对样品或基质表面成像的独立光学系统。在一些情况下，它们可以包括一个或多个处理器或计算机。在一些情况下，它们可以包括一个或多个提供仪器控制功能和/或图像处理功能的软件包。在一些情况下，除了光学组件，例如光源(例如，固态激光器、染料激光器、二极管激光器、弧光灯、卤钨灯等)、透镜、棱镜、反射镜、二向色反射器、分束镜、光学滤波器、带通滤波器、光导、光纤、光圈和图像传感器(例如，互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器和照相机、电荷耦合器件(ccd)图像传感器和相机等)，它们还可以包括机械和/或光机械组件，例如x-y平移台、x-y-z平移台、压电聚焦机构、电光相位板等。在一些情况下，它们可以充当设计用于例如基因组学应用(例如基因测试和/或核酸测序应用)的较大系统的模块、组件、子组件或子系统。例如，在一些情况下，它们可以充当较大系统的模块、组件、子组件或子系统，这些较大系统还包括不透光和/或其他环境控制外壳、温度控制模块、流动池和盒、流体控制模块、流体分配机器人、盒式和/或微孔板处理(拾放)机器人、一个或多个处理
器或计算机、一个或多个基于本地和/或基于云的软件包(例如，仪器/系统控制软件包、图像处理软件包、数据分析软件包)、数据存储模块、数据通信模块(例如，蓝牙、wifi、内联网或因特网通信硬件和相关软件)、显示模块等，或其任何组合。较大系统(例如设计用于基因组学应用的系统)的这些另外组件将在下面更详细讨论。
115.图2a和图2b示出了用于多通道荧光成像的照明和成像模块100的非限制性示例。照明和成像模块100包括物镜110、照明源115、多个检测通道120和第一二向色滤光镜130，其可以包括二向色反射器或分束镜。在一些设计中可以包括自动聚焦系统，所述自动聚焦系统可以包括自动聚焦激光器102，其例如投射光斑，所述光斑的大小被监视以确定成像系统何时对焦。照明和成像模块100的一些或全部组件可以耦合到基板105。
116.照明或光源115可以包括被配置为产生至少期望的激发波长的光的任何合适的光源(在下文中更详细地讨论)。光源可以是发射一个或多个激发波长范围(或频带)内的光的宽带光源。光源可以是窄带光源，其发射一个或多个更窄波长范围内的光。在一些情况下，光源可以产生与期望的激发波长相对应的单个隔离的波长(或线)，或者多个隔离的波长(或线)。在一些情况下，线可以具有一些非常窄的带宽。可以适合用于照明源115的示例光源包括但不限于白炽灯丝、氙弧灯、汞蒸气灯、发光二极管、激光源(例如激光二极管)或固态激光器或其他类型的光源。如下所述，在一些设计中，光源可以包括偏振光源，例如线性偏振光源。在一些实施方式中，光源的取向使得s偏振光入射在一个或多个光学组件的一个或多个表面上，例如一个或多个二向色滤光镜的二向色反射表面上。
117.照明源115还可以包括一个或多个另外的光学组件，例如透镜、滤光器、光纤或任何其他合适的透射或反射光学器件，以向第一二向色滤光镜130输出具有合适特性的激发光束。例如，可以包括光束整形光学器件，以例如接收来自光源中的光发射器的光并产生光束和/或提供期望的光束特性。这样的光学器件可以例如包括准直透镜，所述准直透镜被配置为减小光的发散和/或增加准直和/或使光准直。
118.在一些实施方式中，照明和成像模块100中包括多个光源。在一些这样的实施方式中，不同的光源可以产生具有不同的光谱特性的光，例如，以激发不同的荧光染料。在一些实施方式中，由不同光源产生的光可以被引导以重合并形成聚集的激发光束。该复合激发光束可以由来自每个光源的激发光束构成。与重叠形成复合光束的单个光束相比，复合激发光束将具有更大的光功率。例如，在包括产生两个激发光束的两个光源的一些实施方式中，由两个单独的激发光束形成的复合激发光束可以具有作为单独的光束的光功率之和的光功率。类似地，在一些实施方式中，可以包括三个、四个、五个或更多个光源，并且这些光源可以各自输出激发光束，所述激发光束一起形成具有光功率为各个光束的光功率之和的复合光束。
119.在一些实施方式中，光源115输出足够大量的光以产生足够强的荧光发射。较强的荧光发射可以增加荧光成像模块获取的图像的信噪比(snr)和对比度噪声比(cnr)。在一些实施方式中，光源和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的输出的功率范围可以为约0.5w至约5.0w，或更大(如将在下面更详细地讨论的)。
120.再次参考图2a和图2b，第一二向色滤光镜130相对于光源布置以从其接收光。第一二向色滤光镜可以包括二向色镜、二向色反射器、二向色分束镜或二向色合束镜，其被配置为透射第一光谱区域(或波长范围)中的光并反射具有第二光谱区域(或波长范围)的光。第
一光谱区域可以包括一个或多个光谱带，例如，在紫外和蓝色波长范围内的一个或多个光谱带。类似地，第二光谱区域可以包括一个或多个光谱带，例如，从绿色到红色和红外波长延伸的一个或多个光谱带。其他光谱区域或波长范围也是可能的。
121.在一些实施方式中，第一二向色滤光镜可以被配置为将来自光源的光透射到样品载体结构，例如显微镜载玻片、毛细管、流动池、微流体芯片或其他基质或载体结构。样品载体结构相对于照明和成像模块100支持并定位样品，例如包含经荧光标记的核酸分子或其互补序列的组合物。因此，第一光路经由第一二向色滤光镜从光源延伸至样品。在各种实施方式中，样品载体结构包括至少一个表面，在所述至少一个表面上布置样品或将样品结合到所述至少一个表面上。在一些情况下，样品可以被布置在以下中或结合至以下：样品载体结构的至少一个表面上的不同的局部区域或位点。
122.在一些情况下，载体结构可以包括两个表面，所述两个表面距物镜110的距离不同(即，沿物镜110的光轴位于不同位置或深度)，样品布置在所述两个表面上。如下所述，例如，流动池可以包括至少部分地由第一和第二(例如，上和下)内表面形成的流体通道，并且样品可以布置在第一内表面、第二内表面或两个内表面上的局部位点处。第一表面和第二表面可以由与溶液流过的流体通道相对应的区域分开，并且因此相对于照明和成像模块100的物镜110处于不同的距离或深度。
123.物镜110可以被包括在第一二向色滤光镜和样品之间的第一光路中。该物镜可以被配置为例如具有焦距长度、工作距离、和/或被定位成将来自光源的光聚焦到样品上，例如显微镜载玻片、毛细管、流动池、微流体芯片或其他基质或载体结构的表面上。类似地，物镜110可被配置为具有合适的焦距长度、工作距离、和/或被定位为收集从样品反射、散射或发射的光(例如，荧光发射)，并形成样品的图像。(例如荧光图像)。
124.在一些实施方式中，物镜110可以包括显微镜物镜，例如现成的物镜。在一些实施方式中，物镜110可以包括定制物镜。定制物镜和/或定制物镜-镜筒透镜组合的示例在下文以及于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723(其全部内容通过引用合并于本文)中进行了描述。物镜110可以被设计为减小或最小化在两个位置，例如与流动池或其他样品载体结构的两个表面相对应的两个平面处的光学像差。物镜110可以被设计为相对于光路中的其他位置或平面减小在所选位置或平面(例如，双表面流动池的第一表面和第二表面)处的光学像差。例如，物镜110可以被设计为与位于距物镜其他距离的其他深度或平面相关的光学像差相比，减小位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的光学像差。例如，在一些情况下，用于成像流动池的第一表面和第二表面的光学像差可以比在距物镜前表面1至10mm跨度的区域中的其他地方显示的像差更小。另外，定制物镜110在一些情况下可以被配置为补偿由荧光发射光通过样品载体结构的一个或多个部分(例如包含一个或多个流动池表面(其上布置有样品)的层，或包含填充流动池的流体通道的溶液的层)的透射所引起的光学像差。这些层可以包括例如玻璃、石英、塑料或具有折射率并且可以引入光学像差的其他透明材料。
125.在一些实施方式中，物镜110可具有0.6或更大的数值孔径(na)(如下文更详细地讨论)。这样的数值孔径可以提供减小的聚焦深度和/或景深、改善的背景辨别力以及增加的成像分辨率。
126.在一些实施方式中，物镜110可具有0.6或更小的数值孔径(na)(如下文更详细地讨论)。这样的数值孔径可以提供增加的聚焦深度和/或景深。这种增加的聚焦深度和/或景深可以提高对相隔一定距离的平面进行成像的能力，例如，所述一定距离将双表面流动池的第一表面和第二表面分开。
127.如上所述，流动池可包括例如第一层和第二层，其分别包括第一内表面和第二内表面，所述第一内表面和第二内表面由流体通道隔开，分析物或试剂可流过所述流体通道。在一些实施方式中，物镜110和/或照明和成像模块100可以被配置为提供足够大的景深和/或聚焦深度，从而以相当的光学分辨率顺序地(通过在成像第一表面和第二表面之间重新聚焦成像模块)或同时地(通过确保足够大的景深和/或聚焦深度)对流动池的第一内表面和第二内表面成像。在一些情况下，景深和/或聚焦深度可以至少等于或大于将要成像的流动池的第一表面和第二表面(例如流动池的第一内表面和第二内表面)分开的距离。在一些情况下，第一表面和第二表面，例如双表面流动池或其他样品载体结构的第一内表面和第二内表面，例如可以以约10μm至约700μm的范围或更大的距离分开(如下面将更详细讨论的)。因此，在一些情况下，景深和/或聚焦深度可以在约10μm至约700μm范围内，或者更大(如下面将更详细讨论的)。
128.在一些设计中，补偿光学器件(例如，“光学补偿器”或“补偿器”)可以移入或移出成像模块中的光路，例如，由物镜110收集的光通过该光路传递到图像传感器，以使成像模块能够成像双表面流动池的第一表面和第二表面。成像模块可以被配置为，当补偿光学器件被包括在物镜和被配置为捕获第一表面的图像的图像传感器或光电检测器阵列之间的光路中时，例如对第一表面进行成像。在这样的设计中，成像模块可以被配置为，当从物镜110和被配置为捕获第二表面的图像传感器或光电检测器阵列之间的光路中去除或不包括补偿光学器件时，对第二表面成像。当使用具有高数值孔径(na)值(例如，对于至少0.6、至少0.65、至少0.7、至少0.75、至少0.8、至少0.85、至少0.9、至少0.95、至少1.0或更高的数值孔径值)的物镜110时，对光学补偿器的需求可能会更加明显。在一些实施方式中，光学补偿光学器件(例如，光学补偿器或补偿器)包括折射光学元件(例如透镜)，光学透明材料板(例如玻璃)，光学透明材料板(例如玻璃)，或者在偏振光束情况下的四分之一波长板或半波长板等。可以采用其他配置以使第一表面和第二表面能够在不同时间成像。例如，一个或多个透镜或光学元件可以被配置为在物镜110和图像传感器之间的光路中移入和移出或沿其平移。
129.然而，在某些设计中，物镜110被配置为提供足够大的聚焦深度和/或景深，以使得第一表面和第二表面能够以相当的光学分辨率成像，无需此类补偿光学器件移入和移出成像模块中的光路，例如物镜与图像传感器或光电检测器阵列之间的光路。类似地，在各种设计中，物镜110被配置为提供足够大的聚焦深度和/或景深，以使得第一表面和第二表面能够以相当的光学分辨率成像，无需移动光学器件，例如无需将一个或多个透镜或其他光学组件沿着成像模块中的光路(例如物镜与图像传感器或光电检测器阵列之间的光路)平移。这种物镜的示例将在下面更详细地描述。
130.在一些实施方式中，物镜(或显微镜物镜)110可以被配置为具有减小的放大率。物镜110可以被配置为例如使得荧光成像模块具有从小于2倍到小于10倍的放大率(如将在下面更详细地讨论的)。这种减小的放大率可以改变设计约束，使得可以实现其他设计参数。
例如，物镜110也可以被配置为使得荧光成像模块具有大的视场(fov)，其范围例如为约1.0mm至约5.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)，如将在下面更详细地讨论的。
131.在一些实施方式中，物镜110可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得fov具有衍射极限性能，例如，在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中小于0.15波的像差，如将在下面更详细地讨论的。
132.在一些实施方式中，物镜110可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得fov具有衍射极限性能，例如，在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中斯特列尔比大于0.8，如将在下面更详细地讨论的。
133.再次参考图2a和2b，第一二向色分束镜或合束镜布置在光源和样品之间的第一光路中，以用一个或多个激发光束照射样品。该第一二向色分束镜或合束镜也在从样品到用于检测荧光发射的不同光学通道的一个或多个第二光路中。因此，第一二向色滤光镜130将由照明源115发射的激发光束的第一光路和由样品样本发射的发射光的第二光路耦合到各个光通道，在所述光通道中，光被导引至相应用于捕获样品图像的图像传感器或光电检测器阵列。
134.在各种实施方式中，第一二向色滤光镜130(例如，第一二向色反射器或分束镜或合束镜)具有被选择为仅在指定的波长带内或可能在多个波长带(包括所需的一个或多个激发波长)内透射来自照明源115的光的通带。例如，第一二向色分束镜130包括具有二向色反射器的反射面，所述二向色反射器具有光谱透射率响应，即例如被配置为透射由光源输出的具有至少一些波长的光，其形成激发光束的一部分。光谱透射率响应可以被配置为不透射(例如，而是反射)一种或多种其他波长的光，例如一种或多种其他荧光发射波长的光。在一些实施方式中，光谱透射率响应也可以被配置为不透射(例如，而是反射)由光源输出的一个或多个其他波长的光。因此，第一二向色滤光镜130可以用于选择光源输出的光的哪个波长或哪些波长到达样品。相反，第一二向色分束镜130中的二向色反射器具有光谱反射率响应，所述光谱反射率响应反射具有与来自样品的期望的荧光发射相对应的一个或多个波长的光，并且可能反射从光源输出的具有一个或多个波长的不意图到达样品的光。因此，在一些实施方式中，二向色反射器具有光谱透射率，其包括一个或多个通带，用于透射要入射到样品上的光；和一个或多个阻带，其反射通带外的光，例如，一种或多种发射波长的光，以及由光源输出的不意图到达样品的可能的一种或多种波长的光。同样，在一些实施方式中，二向色反射器具有光谱反射率，其包括一个或多个光谱区域(该一个或多个光谱区域被配置为反射一个或多个发射波长以及由光源输出的不意图到达样品的可能的一个或多个波长)，并且包括一个或多个在这些反射区域之外透射光的区域。包括在第一二向色滤光镜130中的二向色反射器可以包括反射滤光器，诸如被配置为提供适当的光谱透射和反射分布的干涉滤光器(例如，四分之一波长堆叠)。图2a和图2b还示出了二向色滤光镜105，其可以包括例如二向色分束镜或合束镜，其可以用于引导自动聚焦激光器102穿过物镜并到达样品载体结构。
135.尽管图2a和图2b中示出并且如上所述的成像模块100被配置为使得激发光束被第一二向色滤光镜130透射至物镜110，但在一些设计中，照明源115可以相对于第一二向色滤光镜130布置和/或第一二向色滤光镜被配置(例如取向)为使得激发光束被第一二向色滤光镜130反射到物镜110。类似地，在一些这样的设计中，第一二向色滤光镜130被配置为透
射来自样品的荧光发射，并且可能透射从光源输出的不意图到达样品的具有一个或多个波长的光。如将在下面讨论的那样，透射而不是反射荧光发射的设计可以潜在地减小检测到的发射中的波前误差和/或可能具有其他优点。在任何一种情况下，在各种实施方式中，第一二向色反射器130布置在第二光路中，以接收来自样品的荧光发射，其中至少一些继续到达检测通道120。
136.图3a和3b示出了图2a和2b的多通道荧光成像模块内的光路。在图2a和图3a中显示的示例中，检测通道120被布置为接收来自样品样本的荧光发射，其由物镜110透射并由第一二向色滤光镜130反射。如上文所提及且在下文中更详细地描述的，在一些设计中，检测通道120可以被布置为接收由第一二向色滤光镜透射而不是反射的发射光的一部分。在任一情况下，检测通道120可以包括用于接收至少一部分发射光的光学器件。例如，检测通道120可以包括一个或多个透镜，例如镜筒透镜，并且可以包括一个或多个图像传感器或检测器，例如用于成像或以其他方式基于接收到的光产生信号的光电检测器阵列(例如，ccd或cmos传感器阵列)。镜筒透镜可以例如包括一个或多个透镜元件，其被配置为将样品的图像形成到传感器或光电检测器阵列上以捕获其图像。下文和于2020年1月17日提交的美国临时申请号62/962,723中包含了检测通道的其他讨论，该申请的全部内容通过引用合并于本文。在一些情况下，结合适当的采样方案(包括过采样或欠采样)，使用具有相对较高的灵敏度、小像素和高像素计数的图像传感器可以实现改善的光学分辨率。
137.图3a和3b是示出图2a和2b的照明和成像模块100的光路的射线追迹图。图3a对应于照明和成像模块100的顶视图。图3b对应于照明和成像模块100的侧视图。这些图中示出的照明和成像模块100包括四个检测通道120。然而，将理解，所公开的照明和成像模块可以等同地在包括多于或少于四个检测通道120的系统中实现。例如，在不背离本公开的精神或范围的情况下，本文公开的多通道系统可以用少至一个检测通道120、或多达两个检测通道120、三个检测通道120、四个检测通道120、五个检测通道120、六个检测通道120、七个检测通道120、八个检测通道120或多于八个的检测通道120来实现。
138.图3a和3b中所示的成像模块100的非限制性示例包括四个检测通道120、第一二向色滤光镜130(其反射发射光束150)、第二二向色滤光镜(例如，二向色分束镜)135(其将光束150分成透射部分和反射部分)和两个通道特异性二向色滤光镜(例如，二向色分束镜)140(其进一步将光束150的透射和反射部分在各个检测通道120之间分开)。示出了用于在检测通道之间分离光束150的二向色分束镜135和140中的二向色反射表面相对于光束150的中心光束轴或成像模块的光轴成45度布置。但是，如下所述，可以采用小于45度的角度，并且可以提供诸如从通带到阻带的更陡峭过渡的优点。
139.不同的检测通道120包括成像设备124，成像设备124可以包括图像传感器或光电检测器阵列(例如ccd或cmos检测器阵列)。不同的检测通道120还包括光学器件126，例如透镜(例如，一个或多个镜筒透镜，各自包括一个或多个透镜元件)，其布置成将进入检测通道120的一部分发射光聚焦在与光电检测器阵列124平面重合的焦平面上。与物镜110组合的光学器件126(例如，镜筒透镜)被配置为将样品的图像形成在光电检测器阵列124上以捕获样品的图像，例如，在样品结合到流动池或其他样品载体结构上的表面后，所述表面的图像。因此，样品的这种图像可以包括在样品载体结构的空间范围内的其中样品正在发射荧光的多个荧光发射点或区域。物镜110与光学器件126(例如，镜筒透镜)一起可以提供包括
样品的一部分或整个样品的视场(fov)。类似地，不同检测通道120的光电检测器阵列124可以被配置为捕获由物镜和镜筒透镜或其一部分提供的全视场(fov)的图像。在一些实施方式中，一些或所有检测通道120的光电检测器阵列124可以检测由布置在样品载体结构，例如流动池的表面或其一部分上的样品发射的发射光，并记录代表其图像的电子数据。在一些实施方式中，一些或所有检测通道120的光电检测器阵列124可以检测由样品发射的发射光中的特征，而无需捕获和/或存储布置在流动池表面上的样品的图像和/或由物镜和光学器件126和/或122(例如镜筒透镜的元件)提供的全视场(fov)的图像。在一些实施方式中，所公开的成像模块(例如，由物镜110和光学器件126和/或122的组合所提供的)的fov可以在例如约1mm与5mm之间的范围内(例如在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)，如下所述。可以例如选择fov以提供成像模块的放大率和分辨率之间的平衡和/或基于图像传感器和/或物镜的一个或多个特性选择fov。例如，可以结合更小和更快的成像传感器来提供相对较小的fov以实现高通量。
140.再次参考图3a和3b，在一些实施方式中，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为减少使用光学器件126结合物镜110获取的图像中的光学像差。在一些包括用于以不同的发射波长成像的多个检测通道实施方式中，用于不同的检测通道的光学器件126(例如，镜筒透镜)具有不同的设计，以减少该特定通道被配置用于成像的各个发射波长的像差。在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为当对包括布置在其上的发荧光的样品的样品载体结构上的特定表面(例如，平面、物平面等)成像时，与其他位置(例如，对象空间中的其他平面)相比减小像差。类似地，在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为在对具有布置在其上的发荧光的样品位点的双表面样品载体结构(例如双表面流动池)上的第一表面和第二表面(例如第一平面和第二平面，第一物平面和第二物平面等)成像时，与其他位置(例如，对象空间中的其他平面)相比减小像差。例如，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被设计为与位于距物镜其他距离的其他深度或平面相关的像差相比，减小位于距物镜不同距离的两个深度或平面处的像差。例如，与距物镜约1mm至约10mm的区域中的其他地方相比，用于成像第一表面和第二表面的光学像差可以更小。另外，在一些实施方案中，检测通道中的定制光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为补偿由于发射光穿过样品载体结构的一个或多个部分(诸如包括其上布置样品的表面之一的层以及可能的与其上布置样品的表面邻近并且接触的溶液)的透射而引起的像差。包括其上布置样品的表面之一的层可以包括例如玻璃、石英、塑料或其他具有折射率并且引入光学像差的透明材料。例如，在一些实施方式中，检测通道中的定制光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为补偿由样品载体结构(例如盖玻片或流动池壁)或其他样品载体结构组件以及可能的与布置样品的表面邻近并与其接触的溶液引起的光学像差。
141.在一些实施方式中，检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)被配置为具有减小的放大率。检测通道中的光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为例如使得荧光成像模块具有小于例如10倍的放大率，如将在下面进一步讨论的。这种减小的放大率可以改变设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，光学器件126(例如镜筒透镜)也可以被配置为使得荧光成像模块具有例如至少1.0mm或更大(例如，直径、宽度、长度或最长尺寸方面)的大视场(fov)，如将在下面进一步讨论的。
142.在一些实施方式中，光学器件126(例如，镜筒透镜)可以被配置为向荧光成像模块提供如上所述的视场，使得fov在至少60％、70％、80％、90％或95％的视场中具有小于0.15波的像差，如将在下面进一步讨论的。
143.再次参考图3a和3b，在各种实施方式中，样品位于物镜110的焦点位置112处或附近。如以上参考图2a和2b所述，诸如激光源的光源向样品提供激发光束以诱导荧光。物镜110将荧光发射的至少一部分收集为发射光。物镜110将发射光朝向第一二向色滤光镜130透射，该第一二向色滤光镜130将一部分或全部发射光反射作为光束150，该光束150入射到第二二向色滤光镜135上并到达不同的检测通道，每一个检测通道包括光学器件126，其将样品(例如，样品载体结构的表面上的多个发荧光的样品位点)的图像形成在光电检测器阵列124上。
144.如上所述，在一些实施方式中，样品载体结构包括流动池，例如双表面流动池，其具有两个表面(例如，两个内表面，第一表面和第二表面等)，所述两个表面包含发射荧光发射的样品位点。这两个表面可以沿着激发光束的中心轴和/或物镜的光轴的方向在纵向(z)方向上彼此分开一定距离。该分开可以例如对应于流动池内的流动通道。分析物或试剂可以流过该流动通道并与流动池的第一内表面和第二内表面接触，从而可以使其与结合组合物接触，使得使荧光发射从第一内表面和第二内表面上的多个位点发出。成像光学器件(例如，物镜110)可以被定位在距样品合适的距离(例如，对应于工作距离的距离)处，以在一个或多个检测器阵列124上形成样品的对焦图像。如上所述，在各种设计中，物镜110(可能与光学器件126组合)可具有至少与第一表面和第二表面之间的纵向间距一样大的景深和/或聚焦深度。因此，(每个检测通道的)物镜110和光学器件126可以同时在光电检测器阵列124上形成第一流动池表面和第二流动池表面两者的图像，并且这些第一表面和第二表面的图像都对焦并且具有相当的光学分辨率(或仅通过对物体进行较小的重新聚焦即可进行聚焦，以获取具有相当的光学分辨率的第一表面和第二表面的图像)。在各种实施方式中，补偿光学器件无需移入或移出成像模块的光路(例如，移入或移出第一光路和/或第二光路)以形成具有相当的光学分辨率的第一表面和第二表面的对焦图像。类似地，在各种实施方式中，与用于形成第二表面的对焦图像时所述一个或多个光学元件的位置相比，成像模块(例如，物镜110或光学器件126)中的一个或多个光学元件(例如透镜元件)不需要例如沿着第一光路和/或第二光路在纵向上移动以形成第一表面的对焦图像。在一些实施方式中，成像模块包括自动聚焦系统，其被配置为快速且顺序地将成像模块重新聚焦在第一表面和/或第二表面上，使得图像具有相当的光学分辨率。在一些实施方式中，物镜110和/或光学器件126被配置为使得第一流动池表面和第二流动池表面两者同时以相当的光学分辨率对焦，而无需将光学补偿器移入或移出第一光路和/或第二光路，且无需沿第一光路和/或第二光路纵向移动一个或多个透镜元件(例如，物镜110和/或光学器件126(例如镜筒透镜))。在一些实施方式中，使用本文公开的新颖的物镜和/或镜筒透镜设计顺序地(例如，通过在表面之间重新聚焦)或同时地(例如，无需在表面之间重新聚焦)获取的第一表面和/或第二表面的图像可以使用合适的图像处理算法来进一步处理，以增强图像的有效光学分辨率，使得第一表面和第二表面的图像具有相当的光学分辨率。在各种实施方式中，样品平面足够对焦以分辨第一流动池表面和/或第二流动池表面上的样品位点，样品位点在横向方向(例如，在x和y方向上)上紧密间隔。
145.如上所述，二向色滤光镜可以包括干涉滤光镜，其使用具有不同折射率和特定厚度的光学涂层来基于薄膜干涉原理选择性地透射和反射不同波长的光。因此，在多通道荧光成像模块内实现的二向色滤光镜的光谱响应(例如，透射和/或反射光谱)可以至少部分取决于激发光束和/或发射光束的光入射到二向色滤光镜上的入射角或入射角范围。相对于检测光路的二向色滤光镜(例如，图3a和图3b的二向色滤光镜135和140)，这样的效果可能特别显著。
146.图4是示出二向色滤光镜性能和入射光束角(aoi)之间的关系的图。具体来说，图4的图示出了入射角对二向色滤光镜的过渡宽度或光谱跨度的影响，其对应于光谱响应(例如，透射光谱和/或反射光谱)在二向色滤光片的通带和阻带区域之间过渡的波长范围。因此，具有相对较小的光谱跨度(例如，图4的图中的小δλ值)的透射边缘(或反射边缘)对应于通带和阻带区域之间或透射和反射区域之间(或反之，在反射和透射区域之间)的更陡峭的过渡，而具有相对大的光谱跨度(例如，图4的图中的大δ_λ值)的透射边缘(或反射边缘)对应于通带和阻带区域之间的较不陡峭的过渡。在各种实施方式中，通带和阻带区域之间的更陡峭的过渡通常是期望的。此外，也可能期望在所有或大部分视场和/或光束区域上具有增加的一致性或相对一致的过渡宽度。
147.相应地，其中二向色镜相对于发射光的中心光束轴或光路(例如，物镜和/或镜筒透镜的光路)的光轴成45度角布置的荧光成像模块可以对于示例性二向色滤光镜具有约50nm的过渡宽度，如在图4中所示。因为发射光束没有被准直并且具有一定程度的发散，所以荧光成像模块在光束的相对侧之间可以具有约5度的入射角范围。因此，如图4所示，发射光束的不同部分可以以40度至50度的各种入射角入射在分通道的二向色滤光镜上。相对较大的入射角范围对应于约40nm至约62nm的过渡宽度范围。相对较大的入射角范围因此导致成像模块中的二向色滤光镜的过渡宽度增加。因此，可以通过在整个光束上提供较小的入射角来改善多通道荧光成像模块的性能，从而使透射边缘更陡峭并且可以更好地区分不同的荧光发射带。
148.图5是示出在二向色滤光镜上光束足迹大小(dbs)和入射光束角(dbs角)之间的关系的图。在一些情况下，较小的光束足迹可以是期望的。例如，较小的光束足迹允许使用较小的二向色滤光镜将光束分成不同的波长范围。较小的二向色滤光镜的使用又降低了制造成本，并提高了制造合适的平坦二向色滤光镜的便利性。如图5所示，任何大于0度的入射角(垂直于二向色滤光镜的表面)都会导致椭圆形的光束足迹，其面积大于光束的横截面积。45度的入射角会导致在二向色反射器上产生较大的光束足迹，其大于以零度入射时光束横截面面积的1.4倍。
149.图6a和图6b示意性地示出了多通道荧光成像模块中的二向色滤光镜和检测通道的非限制性示例配置，其中二向色镜相对于发射光的中心光束轴或光路(例如，物镜和/或镜筒透镜的光路)的光轴以小于45度的角度布置。图6a描绘了包括多个检测通道520a、520b、520c、520d的成像模块500。图6b是如图6a所示的圆圈5b内的成像模块500的部分的详细视图。如将更详细地描述的，在图6a和图6b中示出的配置被包括许多方面，这些方面可以导致对常规多通道荧光成像模块设计的重大改善。然而，在一些情况下，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，本公开的荧光成像模块和系统可以用关于图6a和图6b描述的特征中的一个或子集来实现。
150.图6a中描绘的成像模块500包括物镜510和四个检测通道520a、520b、520c和520d，该四个检测通道520a、520b、520c和520d被布置成接收由物镜510透射的发射光和/或对其成像。提供第一二向色滤光镜530以联接激发和检测光路。与图2a和图2b以及图3a和图3b中所示的设计相对照，第一二向色滤光镜530(例如，二向色分束镜或合束镜)被配置为将来自光源的光反射至物镜510和样品，并将来自样品的荧光发射透射至检测通道520a、520b、520c和520d。第二二向色滤光镜535通过透射第一部分550a并反射第二部分550b而在至少两个检测通道520a、520b之间对发射光束进行分束。提供另外的二向色滤光镜540a、540b以进一步对发射光进行分束。二向色滤光镜540a透射发射光的第一部分550a的至少一部分，并将部分550c反射到第三检测通道520c。二向色滤光镜540b透射发射光的第二部分550b的至少一部分，并将部分550d反射到第四检测通道520d。尽管成像模块500被描绘为具有四个检测通道，但是在各个实施方案中，成像模块500可以包括更多或更少的检测通道，并具有相应更大或更小数量的二向色滤光镜，以适当地向每个检测通道提供发射光的一部分。例如，在一些实施方案中，可以在包括仅两个检测通道520a、520b并且省略另外的二向色滤光镜540a、540b的简化的成像模块中以相似的有利效果来实现成像模块500的特征。在一些实施方式中，可以仅包括一个检测通道。可替选地，可以采用三个或更多个检测通道。
151.图6a中示出的检测通道520a、520b、520c、520d可包括与图2a-3b中所示的检测通道120的那些组件相同或相似的组件中的一些或全部。例如，不同的检测通道520a、520b、520c、520d可以包括一个或多个图像传感器或光电检测器阵列，并且可以包括透射光学器件和/或反射光学器件，诸如一个或多个透镜(例如镜筒透镜)，其将检测通道接收的光聚焦到其各自的图像传感器或光电检测器阵列上。
152.物镜510被布置成接收由荧光从样品发出的发射光。特别地，第一二向色滤光镜530被布置为接收由物镜510收集和透射的发射光。如上文所讨论并在图6a中所示，在一些设计中，布置诸如激光源等的照明源(例如，图2a和图2b的照明源115)以提供入射到第一二向色滤光镜530上的激发光束，使得第一二向色滤光镜530将激发光束反射到透射发射光的同一物镜510中，例如，在落射荧光配置中。在一些其他设计中，照明源可以通过其他光学组件沿着不包括同一物镜510的不同光路被引导至样品。在这样的配置中，可以省略第一二向色滤光镜530。
153.类似地，如上文讨论并在图6a中所示，检测光学器件(例如，包括检测通道520a、520b、520c、520d和沿物镜510与检测通道520a、520b、520c、520d之间的光路的任何光学组件，例如二向色滤光镜535、540a、540b)可以布置在第一二向色滤光镜530的透射路径上，而不是布置在第一二向色滤光镜530的反射路径上。在一个示例性实施方式中，布置物镜510和检测光学器件，使得物镜510将发射光的光束550直接朝向第二二向色滤光镜535透射。通过沿着发射光的光束550的路径的第一二向色滤光镜530的存在，可能稍微降低发射光的波前质量(例如，通过向光束550施加一些波前误差)。但是，通过二向色分束镜的二向色反射器透射的光束引入的波前误差通常比从二向色分束镜的二向色反射表面反射的光束的波前误差小得多(例如，小一个数量级)。因此，通过沿着第一二向色滤光镜530的透射光束路径而不是沿着反射光束路径放置检测光学器件，可以实质上改善多通道荧光成像模块中的发射光的波前质量和随后的成像质量。
154.仍参考图6a所示，在成像模块500的检测光学器件中，提供了二向色滤光镜535、
540a和540b，以在检测通道520a、520b、520c、520d之间对发射光的光束550进行分束。例如，二向色滤光镜535、540a和540b基于波长将光束550分束，使得发射光的第一波长或波长带可以被第一检测通道520a接收，发射光的第二波长或波长带可以被第二检测通道520b接收，发射光的第三波长或波长带可以被第三检测通道520c接收，发射光的第四波长或波长带可以被第四检测通道520d接收。在一些实施方式中，检测通道可以接收多个单独的波长或波长带。
155.与图2a和图2b以及图3a和图3b所示的多通道荧光成像模块设计相对照，成像模块500具有二向色滤光镜535、540a和540b，其相对于入射光束的中心光束轴以小于45度的入射角布置。如图6b所示，不同的光束550、550a、550b具有各自的中心光束轴552、552a，552b。在各种实施方式中，中心光束轴552、552a、552b在与光束的传播方向正交的光束的横截面的中心。这些中心光束轴552、552a、552b可以对应于物镜的光轴和/或在分开的通道内的光学器件，例如，相应的镜筒透镜的光轴。每个光束550、550a、550b的另外射线554、554a、554b在图6b中示出，以指示每个光束550、550a、550b的直径。光束直径可以定义为例如最大直径的一半的全宽，d4σ(即4倍σ，其中σ分别是光束的水平或竖直边缘分布的标准偏差)或二阶矩宽或光束直径的任何其他合适定义。
156.发射光束550的中心光束轴552可以用作参考点，以定义光束550在第二二向色滤光镜535上的入射角。因此，光束550的“入射角”(aoi)可以是入射光束550的中心光束轴552与垂直于该光束入射的表面(例如，二向色反射表面)的线n之间的角度。当发射光的光束550以入射角aoi入射在第二二向色滤光镜535的二向色反射表面上时，第二二向色滤光镜535透射发射光的第一部分550a(例如，具有在第二二向色滤光镜535的通带区域内的波长的部分)并且反射发射光的第二部分550b(例如，具有在第二二向色滤光镜535的阻带区域内的波长的部分)。第一部分550a和第二部分550b可各自关于中心光束轴552a、552b类似地描述。如上所述，可替选地或另外地使用光轴。
157.在图6a和图6b中，第二二向色滤光镜535被布置为使得光束550的中心光束轴552以30度的入射角入射。类似地，另外的二向色滤光镜540a、540b被布置成使得光束550的第一部分和第二部分550a、550b的中心光束轴552a、552b也以30度的入射角入射。然而，在各种实施方式中，这些入射角可以是小于45度的其他角度。在一些情况下，例如，入射角可以在约20度至约45度的范围内，如将在下面进一步讨论的。而且，在二向色滤光镜535、540a、540b中的每一个上的入射角不必一定是相同的。在一些实施方案中，二向色滤光镜535、540a、540b中的一些或全部可以被布置为使得它们的入射光束550、550a、550b具有不同的入射角。如上所述，入射角可以相对于成像模块内的光学器件(例如，物镜和/或检测通道中的光学器件(例如镜筒透镜))的光轴和各自的二向色分束镜中的二向色反射表面。相同的入射角范围和值应用于当光轴用于指定aoi时的情况。
158.荧光成像模块系统中的发射光的光束550、550a、550b通常是发散光束。如上所述，发射光的光束可以具有足够大的光束发散度，以使光束直径内的光束区域以相对于光学器件的中心光束轴和/或光轴的入射角相差多达5度或更多的入射角入射到二向色滤光镜上。在一些设计中，物镜510可以被配置为例如具有f数或数值孔径，该f数或数值孔径被选择为对于显微镜的给定视场产生较小的光束直径。在一个示例中，可以选择物镜510的f数或数值孔径，以使得光束550、550a、550b的整个直径以例如在中心光束轴552、552a、552b的入射
角的1度、1.5度、2度、2.5度、3度、3.5度、4度、4.5度或5度以内的入射角入射在二向色滤光镜535、540a、540b上。
159.在一些实施方式中，适合于产生这种窄光束直径的物镜的焦距长度可以比荧光显微镜或成像系统中通常采用的那些焦距长度更长。例如，在一些实施方式中，物镜的焦距长度可以在20mm至40mm的范围内，如将在下面进一步讨论的。在一个示例中，具有36mm的焦距长度的物镜510可以产生光束550，其特征在于发散足够小，使得光束550的整个直径上的光以中心光束轴的入射角的2.5度以内的角度入射到第二二向色滤光镜535上。
160.图7和图8提供了示出由于图6a和6b的成像模块构造(或本文公开的任何成像模块构造)的方面而改善的二向色滤光镜性能的曲线图。图7中的图类似于图4的图，并且示出了入射角对二向色滤光镜的过渡宽度(例如，透射边缘的光谱跨度)的影响。图7示出了一个示例，其中二向色滤光镜(例如，二向色滤光镜535、540a和540b)和其中的二向色反射表面的取向使得其入射光束具有30度而不是45度的入射角。图7显示了减小的入射角如何显著改善整个光束直径上过渡宽度的陡度和均匀性。例如，当在中心光束轴处的45度入射角导致约40nm至约62nm的过渡宽度范围时，在中心光束轴处的30度入射角导致约16nm至约30nm的过渡宽度范围。在此示例中，平均过渡宽度从约51nm减小到约23nm，表明通带和阻带之间的过渡更加陡峭。而且，整个光束直径的过渡宽度变化从22nm范围减小到14nm范围，减少了近40％，这表明整个光束区域的过渡陡度更加均匀。
161.图8示出了可以通过为物镜选择合适的f数或数值孔径以减小本文公开的任何成像模块配置中的光束发散而实现的另外优点。在一些实施方式中，使用更长的焦距长度。在图8的示例中，物镜510具有36mm的焦距长度，其具有适当的数值孔径(例如，小于5)，将光束550内的入射角范围从30度
±
5度减小到30度
±
2.5度。通过这种设计，过渡宽度的范围可以减小到约19nm至约26nm。当与图7的改进系统进行比较时，尽管平均过渡宽度基本相同(例如，光谱跨度约为23nm)，但整个光束直径上的过渡宽度变化进一步减小到7nm范围，表示相对于图4所示的过渡宽度范围减小了近70％。
162.再次参考图5，在中心光束轴线处将入射角从45度减小到30度是进一步有利的，因为它减小了二向色滤光镜上的光束斑尺寸。如在图5中，入射角为45度导致二向色滤光镜上的光束足迹面积大于光束横截面面积的1.4倍。但是，入射角为30度导致在二向色滤光镜上的光束足迹的面积仅约为光束横截面面积的1.15倍。因此，将二向色滤光镜535、540a、540b处的入射角从45度减小到30度导致二向色滤光镜535、540a、540b上的光束足迹的面积减小约18％。光束足迹面积的减小允许使用较小的二向色滤光镜。
163.现在共同参考图9a-b，入射角从45度减小到30度还可以关于由本文公开的任何成像模块配置中的二向色滤光镜引起的表面变形提供改善的性能，如调制传递函数的改善所示。通常，表面变形的量随着更大面积的光学元件而增加。如果在二向色滤光镜上使用较大的面积，则会遇到较大的表面变形量，从而将更多的波前误差引入光束中。图9a示出了折叠角对由于向最后一个反射镜增加1波峰谷(pv)球面光焦度而引起的图像质量下降的影响。图9b示出了折叠角对由于向最后一个反射镜增加0.1波pv球面光焦度而引起的图像质量下降的影响。如图9a和图9b中所示，将入射角减小到30度可以显著减小表面变形的影响，从而达到接近检测光学器件的衍射极限性能。
164.在所公开的成像模块的一些实施方式中，可以利用激发光束的偏振态来进一步改
善本文所公开的多通道荧光成像模块的性能。返回参考图2a、图2b和图6a，例如，本文公开的多通道荧光成像模块的一些实施方式具有落射荧光配置，其中第一二向色滤光镜130或530合并激发光束和发射光束的光路，使得激发光和发射光都透射通过过物镜110、510。如上所述，照明源115可以包括光源，诸如激光或提供形成激发光束的光的其他光源。在一些设计中，光源包括线性偏振光源，并且激发光束可以是线性偏振的。在一些设计中，包括偏振光学器件以使光偏振和/或旋转光的偏振。例如，可以在激发光束的光路中包括偏振器(诸如线性偏振器)以使激发光束偏振。在一些设计中，可以包括延迟器(例如半波延迟器或多个四分之一波延迟器或具有其他延迟量的延迟器)，以旋转线性极化。
165.当线性偏振激发光束入射到任何二向色滤光镜或其他平面界面上时，它可以是p偏振的(例如，具有平行于入射平面的电场分量)、s偏振的(例如，具有垂直于入射平面的电场分量)，或者在光束内可以具有p偏振和s偏振状态的组合。可以通过选择照明源115和/或其一个或多个组件相对于第一二向色滤光镜130、530和/或相对于激发光束将与之相互作用的任何其他表面的取向来选择和/或改变激发光束的p偏振状态或s偏振状态。在光源输出线性偏振光的一些实施方式中，光源可以被配置为提供s偏振光。例如，光源可以包括诸如固态激光器或激光二极管的发射器，其可以围绕其光轴或光束的中心轴旋转以使从其输出的线性偏振光定向。可替选地或另外地，可以采用延迟器来使线性偏振绕光轴或光束的中心轴旋转。如上所述，在一些实施方式中，例如当光源不输出偏振光时，布置在激发光束的光路中的偏振器可使激发光束偏振。例如，在一些设计中，线性偏振器布置在激发光束的光路中。可以旋转该偏振器以提供线性偏振的适当取向，以提供s偏振光。
166.在一些设计中，将线性偏振绕光轴或光束的中心轴旋转，使得s偏振入射在二向色分束镜的二向色反射器上。当s偏振光入射到二向色分束镜的二向色反射器上时，通带和阻带之间的过渡更陡峭，这与p偏振光入射到二向色分束镜的二向色反射器上时相反。
167.如图10a和图10b中所示，使用激发光束的p偏振状态或s偏振状态可以显著影响任何激发滤光镜(例如第一二向色滤光镜130、530)的窄带性能。图10a示出了示例性带通二向色滤光镜在入射角为40度和45度时在610nm和670nm之间的透射光谱，其中入射光束是线性偏振的，并且相对于二向色滤光镜的平面是p偏振的。如图10b中所示，改变光源相对于二向色滤光镜的取向，从而使入射光束相对于二向色滤光镜的平面呈s偏振，导致二向色滤光镜的通带和阻带之间实质上更陡峭的边缘。因此，本文公开的照明和成像模块100、500可以有利地具有相对于第一二向色滤光镜130、530取向的照明源115，使得激发光束相对于第一二向色滤光片130、530的平面是s偏振的。如上所述，在一些实施方式中，可以使用偏振器(诸如线性偏振器)来使激发光束偏振。可以旋转该偏振器以提供与s偏振光相对应的线性偏振光的取向。同样如上所述，在一些实施方式中，可以使用其他旋转线性偏振光的方法。例如，光学延迟器(诸如半波延迟器或多种四分之一波延迟器)可以用于旋转偏振方向。其他设置也是可能的。
168.如本文其他地方所讨论的，减小荧光成像模块和/或物镜的数值孔径(na)可以增加景深，以使得能够对两个表面进行相当的成像。图11a-16b示出了对于较小的数值孔径，相比于较大的数值孔径，在用1mm玻璃隔开的第一表面和第二表面上，mtf如何更相似。
169.图11a和图11b示出了在第一表面(图11a)和第二(图11b)表面处对于na为0.3的mtf。
170.图12a和图12b示出了在第一(图12a)表面和第二(图12b)表面处对于na为0.4的mtf。
171.图13a和图13b示出了在第一(图13a)表面和第二(图13b)表面处对于na为0.5的mtf。
172.图14a和图14b示出了在第一(图14a)表面和第二(图14b)表面处对于na为0.6的mtf。
173.图15a和图15b示出了在第一(图15a)表面和第二(图15b)表面处对于na为0.7的mtf。
174.图16a和图16b示出了在第一(图16a)表面和第二(图16b)表面处对于na为0.8的mtf。这些图的每一个中的第一表面和第二表面对应于例如流动池的顶表面和底表面。
175.图17a-b提供了用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的所计算的斯特列尔比(即，由光学系统聚焦或收集的峰值光强度与由理想光学系统和点光源聚焦或收集的峰值光强度之比)的图。图17a示出了对于不同物镜和/或光学系统数值孔径，作为中间流体层厚度(流体通道高度)的函数的用于通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像的斯特列尔比的图。如图所示，斯特列尔比随着第一表面和第二表面之间的间隔增大而减小。因此，随着两个表面之间的间隔增加，这些表面之一将具有降低的图像质量。与具有较大数值孔径的成像系统相比，对于具有较小数值孔径的成像系统，随着两个表面之间间隔距离的增加，第二表面成像性能的降低得以减小。图17b示出了针对通过第一流动池表面对第二流动池表面进行成像和厚度为0.1mm的中间水层，作为数值孔径的函数的斯特列尔比的图。在较高数值孔径下成像性能的损失可能归因于由用于第二表面成像的流体引起的光学像差增加。随着na的增加，由用于第二表面成像的流体引入的增加的光学像差会大大降低图像质量。但是，通常，减小光学系统的数值孔径会降低可达到的分辨率。通过提供增加的样品平面(或物平面)对比度噪声比，例如通过使用用于核酸测序应用的化学试剂(其增强经标记的核酸簇的荧光发射和/或降低背景荧光发射)，图像质量的损失可以至少部分抵消。在一些情况下，例如，可以使用包括亲水性基质材料和/或亲水性涂层的样品载体结构。在某些情况下，此类亲水性基质和/或亲水性涂层可降低背景噪声。可以在下面找到对样品载体结构、亲水性表面和涂层以及用于增强对比度噪声比的方法(例如用于核酸测序应用)的其他讨论。
176.在一些实施方式中，荧光成像系统、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个被配置为具有减小的放大率，例如小于10倍的放大率，如以下将进一步讨论的。这种减小的放大率可以调整设计约束，使得可以实现其他设计参数。例如，荧光显微镜、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜或镜筒透镜中的任何一个或多个也可以被配置为使得荧光成像模块具有大的视场(fov)，例如，至少3.0mm或更大(例如，在直径、宽度、高度或最长尺寸方面)的视场，如以下将进一步讨论的。荧光成像系统、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个可被配置为向荧光显微镜提供这种视场，该视场使得fov在至少80％的视场上具有小于例如0.1波的像差。类似地，荧光成像系统、照明和成像模块100、成像光学器件(例如，光学器件126)、物镜和/或镜筒透镜中的任何一个或多个可以被配置为使得荧光成像模块具有这种fov并且是受衍射限制的，或者在此fov上受
衍射限制。
177.如上所述，在各种实施方式中，所公开的光学系统提供了大视场(fov)。在一些实施方式中，通过使用较大的图像传感器或光电检测器阵列来部分地促进获得增加的fov。光电检测器阵列例如可以具有其中对角线至少为15mm或更大的有效区域，如将在下面进一步讨论的。如上所述，在一些实施方式中，所公开的光学成像系统提供减小的放大率，例如小于10倍的放大率，这可以促进大的fov设计。尽管放大率降低，但是成像模块的光学分辨率可仍然足够，因为可以使用具有小的像素尺寸或间距的探测器阵列。像素尺寸和/或间距例如可以是约5μm或更小，如将在下面更详细地讨论的。在一些实施方式中，像素尺寸小于由光学成像系统(例如，物镜和镜筒透镜)提供的光学分辨率的两倍，以满足奈奎斯特定理。因此，图像传感器的像素尺寸和/或间距可以使得成像模块的空间采样频率至少是成像模块的光学分辨率的两倍。例如，光电检测器阵列的空间采样频率可以是荧光成像模块(例如，照明和成像模块、物镜和镜筒透镜、检测通道中的物镜和光学器件126、样品载体结构或平台(被配置用于支持样品载体平台)和光电检测器阵列之间的成像光学器件)的光学分辨率的至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍，或者是这些值中的任何之间的范围内的任何空间采样频率。
178.尽管本文针对荧光成像模块讨论了广泛的特征，但是本文描述的任何特征和设计可以应用于其他类型的光学成像系统，包括但不限于明场和暗场成像，并且可以应用于发光或磷光成像。
179.双波长激发/四通道成像系统：图18示出了用于双面成像应用的双激发波长/四通道成像系统，其包括在垂直于光轴的方向上扫描的物镜和镜筒透镜组合，以例如通过平铺多个图像以创建合成图像来提供大面积成像，所述合成图像的总视场(fov)比每个单独的图像大得多。所述系统包括以不同波长工作的两个激发光源，例如激光器或激光二极管，以及自动聚焦激光器。使用一系列反射镜和/或二向色反射器将两个激发光束和自动聚焦激光束组合，然后通过物镜将其递送到流动池的上内表面或下内表面。由拴系在流动池表面之一上的经标记的寡核苷酸(或其他生物分子)发出的荧光被物镜收集，透射通过镜筒透镜，并通过一系列中间二向色反射器根据发射的光的波长被导向到四个成像传感器之一。从流动池表面反射的自动聚焦激光被物镜收集，透射通过镜筒透镜，并通过一系列中间二向色反射器被导向到自动聚焦传感器。所述系统允许物镜/镜筒透镜组合在垂直于物镜光轴的方向上扫描时保持准确的聚焦(例如，通过使用精密的线性致动器、平移台或安装在显微镜转塔上的焦点调节机构来调节流动池表面与物镜之间的相对距离，以减少或最小化自动聚焦图像传感器上的反射光斑尺寸)。双波长激发与四通道(即四波长)成像能力组合使用，提供了流动池的上(近)内表面和下(远)内表面的高通量成像。
180.多路复用光学读取头：
181.在一些情况下，本文描述的任何成像模块的小型化版本可以被组装以可以创建可在一个或多个方向上相对于样品表面(例如流动池的内表面)水平平移的多路复用读取头，以同时对表面的多个部分进行成像。最近在美国公开专利申请号2020/0139375a1中描述了多路复用读取头的非限制性示例。
182.例如，在一些情况下，小型化的成像模块可包括“测微荧光计”，其包括照明或激发光源(例如led或激光二极管)(或连接到外部光源的光纤的尖端)、一个或多个用于准直或
聚焦照明或激发光的透镜、一个或多个二向色反射器、一或多个滤光器、一个或多个反射镜、分束镜、棱镜、光圈等，一个或多个物镜、一个或多个定制镜筒透镜(用于以最小的焦点调整实现双面成像，如本文其他地方所述)、一个或多个图像传感器，或其任何组合，如本文其他地方所述。在一些情况下，小型化的成像模块(例如，“测微荧光计”)还可以包括自动聚焦机构、微处理器、电源和数据传输连接器、不透光的外壳等。所得的小型化成像模块因此可以包括具有小的形状因数的集成成像包装件或单元。在一些情况下，小型化成像模块的最短尺寸(例如，宽度或直径)可以小于5cm、小于4.5cm、小于4cm、小于3.5cm、小于3cm、小于2.5cm、小于2cm、小于1.8cm、小于1.6cm、小于1.4cm、小于1.2cm、小于1cm、小于0.8cm或小于0.6cm。在一些情况下，小型化成像模块的最长尺寸(例如，高度或长度)可以小于16cm、小于14cm、小于12cm、小于10cm、小于9cm、小于8cm、小于7cm、小于5cm、小于5cm、小于4.5cm、小于4cm、小于3.5cm、小于3cm、小于2.5cm、小于2cm、小于1.8cm、小于1.6cm、小于1.4cm、小于1.2cm或小于1cm。在一些情况下，在多路复用读取头内的一个或多个单独的小型化成像模块可以包括自动聚焦机构。
183.在一些情况下，如本文所述的多路复用读取头可包括相对于彼此保持在固定位置的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或多于12个小型化成像模块或测微荧光计的组装件。在一些情况下，各个小型化成像模块或测微荧光计的光学设计规格和性能属性(例如，数值孔径、视场、景深、图像分辨率等)可以相同，如本文其他地方对于所公开成像模块的其他版本所描述的。在一些情况下，多个单独的小型化成像模块可以以包括1、2、3、4行和/或列或多于4行和/或列的线性排列来布置。在一些情况下，多个单独的小型化成像模块可以以例如六边形密堆积排列来布置。在一些情况下，多个单独的小型化成像模块可以以圆形或螺旋形排列、随机分布的排列或本领域技术人员已知的任何其他排列来布置。
184.图43a-b提供了如本文公开的多路复用读取头的非限制性示意图。图43a示出了多路复用读取头的侧视图，其中两行具有公共光学设计规格(例如，数值孔径、视场、工作距离等)的各个微荧光计(从末端看)被配置成对公共表面(例如，流动池的第一内表面)成像。图43b示出了相同的多路复用读取头的顶视图，其示出了当多路复用读取头相对于流动池平移(反之亦然)时由多路复用读取头的各个微荧光计获取的重叠成像路径。在一些情况下，如图43b所示，各个测微荧光计的各个视场可以重叠。在一些情况下，它们可能不会重叠。在一些情况下，可以设计多路复用读取头，使其与流动池内的预定特征(例如，各个流体通道)对齐并成像。
185.图44a-b提供了多路复用读取头的非限制性示意图，其中多个单独的小型化成像模块的第一子集被配置成对第一样品平面(例如流动池的第一内表面)成像，并且多个单独的小型化成像模块的第二子集被配置为同时对第二样品平面(例如流动池的第二内表面)成像。图44a示出了多路复用读取头的侧视图，其中各个测微荧光计的第一子集被配置为对例如流动池的第一内表面或上内表面成像，第二子集被配置为对第二表面(例如流动池的第二内表面或下内表面)成像。图44b示出了图44a的多路复用读取头的顶视图，其示出了由多路复用读取头的各个测微荧光计获取的成像路径。同样，在一些情况下，给定子集中各个测微荧光计的各个视场可能会重叠。在一些情况下，它们可能不会重叠。在一些情况下，可以设计多路复用读取头，使得第一子集和第二子集的各个小型化成像模块与流动池内的预定特征(例如，各个流体通道)对准并成像。
186.用于较厚的盖玻片的改善或优化的物镜和/或镜筒透镜：现有的设计实践包括物镜的设计和/或使用常用的现成显微镜物镜来优化通过薄(例如《200μm厚)显微镜盖玻片获取图像时的图像质量。当用于在流体通道或流动池的两侧成像时，两个表面之间的间隙的额外高度(即，流体通道的高度；通常约为50μm至200μm)会在为流体通道的非最佳侧捕获的图像中引入光学像差，从而导致光学分辨率降低。这主要是因为与最佳盖玻片厚度相比，另外的间隙高度是显著的(典型的流体通道或间隙高度为50-200μm，相对于盖玻片厚度《200μm)。另一种常见的设计实践是，当要在流体通道或流动池的非最佳侧进行成像时，在光路上使用另外的“补偿”透镜。该“补偿”透镜和将其移入或移出光路所需的机构(以便可以对流动池的两侧进行成像)进一步增加了系统复杂性和成像系统停机时间，并可能由于振动等而降低图像质量。
187.在本公开中，成像系统被设计用于与包括较厚的盖玻片或流动池壁(厚度≥700μm)的流动池耗材兼容。可以对于等于真实盖玻片厚度加上有效间隙厚度的一半(例如，700μm 1/2*流体通道(间隙)高度)的盖玻片，改善或优化物镜设计。这种设计显著降低了间隙高度对流体通道两个表面的图像质量的影响，并且平衡了两个表面的图像的光学质量，因为间隙高度相对于盖玻片的总厚度较小，因此对光学质量的影响降低。
188.使用较厚的盖玻片的其他优点包括在制造过程中改善了对厚度公差误差的控制，并降低了盖玻片由于热应力和安装诱导应力产生变形的可能性。盖玻片的厚度误差和变形会对流动池的顶表面和底表面两者的成像质量产生不利影响。
189.为了进一步改善用于测序应用的双表面成像质量，我们的光学系统设计着重于在最适合成像和分辨小斑点或簇的中等空间频率至高空间频率范围内改善或优化mtf(例如，通过改善或优化物镜和/或镜筒透镜设计)。
190.改善或优化的镜筒透镜设计，用于与市售的现成物镜组合使用：对于低成本测序器设计，由于其价格相对较低，因此优选使用市售的现成物镜。但是，如上所述，低成本的现成的物镜主要针对厚度约为170μm的薄盖玻片使用而进行了优化。在一些情况下，所公开的光学系统可以利用镜筒透镜设计，该镜筒透镜设计补偿较厚的流动池盖玻片，同时能够在双表面成像应用中为流动池的两个内表面实现高图像质量。在一些情况下，本文公开的镜筒透镜设计能够在无需将光学补偿器移入或移出流动池和图像传感器之间的光路的情况下，在无需沿光路移动镜筒透镜的一个或多个光学元件或组件情况下，以及在无需将镜筒透镜的一个或多个光学元件或组件移入或移出光路情况下，对流动池的两个内表面进行高质量成像。
191.图19提供了用于低光物镜设计的光学射线追迹图，所述低光物镜设计已进行了改善或优化，以对0.17mm厚的盖玻片的相对侧上的表面进行成像。该物镜的调制传递函数图(如图20所示)表示当与设计用于0.17mm厚的盖玻片一起使用时，近衍射受限的成像性能。
192.图21提供了当用于对0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面成像时，图19中示出的相同物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。在约100线/mm至约800线/mm(或周期/mm)的空间频率范围内，mtf值的相对较小的偏差表明，即使使用0.3mm厚的盖玻片时，所获得的图像质量仍然是合理的。
193.图22提供了当用于对与0.3mm厚的盖玻片相对侧的表面隔开0.1mm厚的水性流体层的表面成像时(即，在对远表面进行成像时，在流动池的双面成像中遇到的那种条件下)，
图19中示出的相同物镜的随空间频率变化的调制传递函数的图。从图22的图中可以看出，在约50lp/mm至约900lp/mm的空间频率范围内，mtf曲线与理想的衍射受限情况的偏差表明成像性能下降。
194.图23和图24提供了当使用图19所示的物镜通过1.0mm厚的盖玻片成像时以及当上内表面和下内表面被0.1mm厚的水性流体层隔开时，流动池的上(或近)内表面(图23)和下(或远)内表面(图24)的随空间频率变化的调制传递函数的图。可以看出，两个表面的成像性能都大大降低。
195.图25提供了用于镜筒透镜设计的射线追迹图，如果与图19中示出的物镜结合使用，则所述镜筒透镜提供通过1mm厚的盖玻片的改善的双面成像。包括复合物镜(透镜元件702、703、704、705、706、707、708、709和710)和镜筒透镜(透镜元件711、712、713和714)的光学设计700得以改善或优化，用于与流动池(其包括厚盖玻片(或壁)，例如，厚度大于700μm，并且流体通道厚度至少为50μm)一起使用，并将内表面的图像从流动池701传输到图像传感器715，其中光学图像质量得到显著改善，并且cnr更高。
196.在一些情况下，镜筒透镜(或镜筒透镜组件)可包括至少两个光学透镜元件、至少三个光学透镜元件、至少四个光学透镜元件、至少五个光学透镜元件、至少六个光学透镜元件、至少七个光学透镜元件、至少八个光学透镜元件、至少九个光学透镜元件、至少十个光学透镜元件或更多，其中光学透镜元件的数量、每个元件的表面几何形状以及它们在组装件中的放置顺序得以改善或优化，以校正由流动池厚壁引起的光学像差，并且在一些情况下，允许人们使用市售的现成物镜，同时仍保持高质量的双面成像能力。
197.在一些情况下，如图25所示，镜筒透镜组装件可依次包括第一不对称凸-凸透镜711、第二凸-平透镜712、第三不对称凹-凹透镜713和第四不对称凸-凹透镜714。
198.图26和图27提供了当使用物镜(针对0.17mm盖玻片校正)和图25所示的镜筒透镜组合通过1.0mm厚的盖玻片成像时以及当上内表面和下内表面被0.1mm厚的水性流体层隔开时，流动池的上(或近)内表面(图26)和下(或远)内表面(图27)的随空间频率变化的调制传递函数的图。可以看出，获得的成像性能几乎是对于衍射受限的光学设计所预期的。
199.图28提供了用于本公开的镜筒透镜设计的射线追迹图(左)，所述镜筒透镜设计已被改善或优化以提供高质量的双面成像性能。由于镜筒透镜不再经无限校正，因此可以将适当设计的零透镜(右)与镜筒透镜组合使用，以补偿出于制造和测试目的而非无限校正的镜筒透镜。
200.特定于成像通道的镜筒透镜的适配或优化：在成像系统设计中，有可能针对所有成像通道在相同波长区域内改善或优化物镜和镜筒透镜两者。通常，相同的物镜由所有成像通道共享(例如，参见图18)，并且每个成像通道或者使用相同的镜筒透镜，或者具有共享相同设计的镜筒透镜。
201.在一些情况下，本文公开的成像系统还可包括用于每个成像通道的镜筒透镜，其中已经针对特定成像通道独立地改善或优化了镜筒透镜，以改善图像质量，例如，以减少或最小化畸变和场曲率，并改善每个通道的景深(dof)性能。由于每个特定成像通道的波长范围(或带通)比所有通道的组合波长范围窄得多，因此，所公开系统中使用的镜筒透镜的特定于波长或通道的适配或优化导致成像质量和性能方面的显著改善。这种特定于通道的适配或优化导致双面成像应用中流动池的顶表面和底表面的图像质量的改善。
202.在流动池中没有流体情况下的双面成像：为了使流动池的顶内表面和底内表面两者都有最佳的成像性能，通常需要运动致动的补偿器来校正由流动池中的流体(通常包括约50-200μm的流体层厚度)引起的光学像差。在所公开的光学系统设计的一些情况中，可以在流动池中存在流体的情况下对流动池的顶内表面进行成像。一旦测序化学循环完成，就可以从流动池中提取流体以对底内表面成像。因此，在一些情况下，即使不使用补偿器，也可以保持底表面的图像质量。
203.使用电光相位板补偿光学像差和/或振动：在一些情况下，通过将电光相位板(或其他矫正透镜)与物镜组合使用以消除由于流体的存在而引起的光学像差，可以在无需从流动池中去除流体的情况下改善双表面图像质量。在一些情况下，可以使用电光相位板(或透镜)来消除由运动致动的补偿器的机械运动引起的振动影响，并且可以为基因组测序应用提供更快的图像获取时间和测序循环时间。
204.改善的对比度噪声比(cnr)、视场(fov)、光谱分离和时序设计，以增加或最大化信息传输和通量：在为基因组学应用设计的成像系统中用于增加或最大化信息传输的另一种方法是增加视场(fov)的大小并减少对特定fov进行成像所需的时间。对于典型的大na光学成像系统，通常是获得面积近似为1mm2的视场的图像，其中在当前公开的成像系统设计中，指定了具有长工作距离的大fov物镜以实现对2mm2或更大的面积进行成像。
205.在某些情况下，所公开的成像系统设计用于与专有的低结合性基质表面和dna扩增方法组合使用，其减少由多种混杂信号(包括但不限于荧光染料对基质表面的非特异性吸附，非特异性核酸扩增产物(例如，在对应于核酸分子克隆扩增簇(即特异性扩增的克隆物)的斑点或特征之间的区域中出现在基质表面的核酸扩增产物)，可能会出现在扩增的克隆物、定相和定相前核酸链中的非特异性核酸扩增产物等)引起的荧光背景。与公开的光学成像系统组合使用低结合性基质表面和dna扩增方法(其降低荧光背景)可以显著减少对每个fov成像所需的时间。
206.当前公开的系统设计可以通过成像序列改善或优化进一步减少所需的成像时间，其中同时或以交叠的时序获取多个通道的荧光图像，并且其中荧光信号的光谱分离被设计为减少荧光检测通道之间以及激发光和荧光信号之间的串扰。
207.当前公开的系统设计可以通过改善或优化扫描运动序列来进一步减少所需的成像时间。在典型方法中，使用x-y平移台将目标fov移动到物镜下方的位置，执行自动聚焦步骤(其中确定最佳焦点位置)，然后将物镜沿z方向移动到确定的焦点位置，然后获取图像。通过循环经过一系列目标fov位置来获取一系列的荧光图像。从信息传输占空比的角度来看，信息仅在该周期的荧光图像获取部分期间进行传输。在当前公开的成像系统设计中，执行其中所有轴(x-y-z)同时重新定位的单步运动，并且自动聚焦步骤用于检查焦点位置误差。仅当焦点位置误差(焦平面位置和样品平面位置之间的差异)超过一定限制(例如指定误差阈值)时，才发出另外的z运动指令。结合高速x-y运动，此方法会增加系统的占空比，从而提高每单位时间的成像通量。
208.此外，通过将设计的光学收集效率、调制传递函数和图像传感器性能特征与输入激发光子通量预期的荧光光子通量、染料效率(与染料消光系数和荧光量子产率有关)匹配，同时考虑到背景信号和系统噪声特性，可以减少或最小化获取高质量(高对比度噪声比(cnr)图像)所需的时间。
209.有效的图像获取与改善或优化的平移台步长和稳定时间的组合导致了快速的成像时间(即每个视场所需的总时间)和更高的通量成像系统性能。
210.伴随着较大的fov和快速的图像获取占空比，所公开的设计还可包括指定图像平面平坦度、荧光检测通道之间的色聚焦性能、传感器平坦度、图像畸变和聚焦质量规格。
211.通过将图像传感器分别对准不同的荧光检测通道，使得每个检测通道的最佳焦平面重叠，可以进一步改善色聚焦性能。设计目标是确保相对于每个通道的最佳焦平面，在
±
100nm(或更小)内获取超过90％视场上的图像，从而增加或最大化单个点强度信号的传输。在一些情况下，所公开的设计还确保相对于每个通道的最佳焦平面，在
±
150nm(或更小)内获取99％视场上的图像，并确保相对于每个成像通道的最佳焦平面，可以在
±
200nm(或更小)内获取整个视场上的更多图像。
212.照明光路设计：用于改善信噪比(snr)、对比度噪声比(cnr)和/或增加通量的另一个因素是增加样品的照明功率密度。在一些情况下，所公开的成像系统可以包括照明路径设计，所述照明路径设计利用与液体光导耦合的高功率激光器或激光二极管。液体光导消除了相干光源(例如激光器和激光二极管)固有的光斑。此外，耦合光学器件被设计为用于底部填充液体光导的进入光圈。液体光导进入光圈的底部填充减小了进入物镜的照明光束的有效数值孔径，从而提高了通过物镜到样品平面上的光传输效率。通过这种设计创新，在大视场(fov)上，照明功率密度可以达到传统设计的三倍。
213.在一些情况下，通过利用s偏振和p偏振的角度依赖性判别，可以使照明光束偏振取向为，以减少到达成像传感器的后向散射和后向反射的照明光的量。结构化的照明系统：在一些情况下，所公开的成像模块和系统可以包括结构化的照明光学设计，以增加成像系统的有效空间分辨率，从而能够在流动池表面上使用克隆扩增的靶核酸序列(簇)的更高表面密度，以提高测序通量。结构化的照明显微镜(sim)利用空间结构化(即周期性)的光图案来照亮样品平面，并依赖于称为莫尔条纹的干涉图案的产生。例如通过移动和/或旋转结构化照明的图案，在稍微不同的照明条件下获取多幅图像，以产生莫尔条纹。对产生的干扰信号进行数学反卷积，可以重建超分辨率图像，其空间分辨率比使用衍射受限成像光学器件具有多达约两倍的改善[lutz(2011),“biological imaging by superresolution light microscopy”,comprehensive biotechnology(第二版),第1卷,第579-589页,elsevier；feiner-gracia,等人(2018),“15-advanced optical microscopy techniques for the investigation of cell-nanoparticle interactions”,smart nanoparticles for biomedicine:micro and nano technologies,第219-236页,elsevier；nylk,等人(2019),“light-sheet fluorescence microscopy with structured light”,neurophotonics and biomedical spectroscopy,第477-501页,elsevier]。最近在hong的美国专利申请公开号2020/0218052中描述了结构化的照明显微镜成像系统的示例。
[0214]
图41提供了成像系统4100的非限制性示意图，成像系统4100包括本文公开的分支的结构化的照明光学设计。系统4100的照明光路的第一分支(或支臂)包括例如光源(光发射器)4110a、用于准直由光源4110a发射的光的光学准直仪4120a、相对于光轴处于第一取向的衍射光栅4130a、旋转窗口4140a和透镜4150a。系统4100的照明光路的第二分支包括例如光源4110b、用于准直由光源4110b发射的光的光学准直仪4120b、相对于光轴处于第二取
向的衍射光栅4130b、旋转窗口4140b和透镜4150b。衍射光栅4130a和4130b可以将光条纹图案投射到样品平面上。
[0215]
在一些情况下，光源4110a和4110b可以是非相干光源(例如，包括一个或多个发光二极管(led))或相干光源(例如，包括一个或多个激光器或激光二极管)。在一些示例中，光源4110a和4110b可以包括耦合至例如led、激光器或激光二极管的光纤，所述led、激光器或激光二极管输出随后被相应的准直透镜4120a和4120b准直的光束。在一些情况下，光源4110a和4110b可以输出相同波长的光。在一些情况下，光源4110a和4110b可以输出不同波长的光。光源4110a和4110b均可以配置为输出本文其他地方所述的任何波长和/或波长范围的光。在成像期间，可以使用例如位于光路上的高速快门(未示出)或通过以预定频率对光源进行脉冲来打开或关闭光源4110a和4110b。
[0216]
在图41所示的示例中，系统4100的第一照明支臂包括固定的竖直光栅4130a，其用于以第一取向将光栅图案(例如，竖直光条纹图案)投射到样品平面(例如，流动池4187的第一内表面4188)上，并且第二照明支臂包括固定的水平光栅4130b，其用于将光栅图案(例如，水平光条纹图案)以第二取向投射到样品平面4188上。有利地，在该非限制性示例中，成像系统4100的衍射光栅不需要在成像期间进行机械旋转或平移，这可以提供改善的成像速度、系统可靠性和系统可重复性。在一些情况下，衍射光栅4130a和/或4130b可以绕其各自的光轴旋转，从而使投射在样品平面上的光条纹图案之间的角度可调。
[0217]
如图41所示，在一些情况下，衍射光栅4130a和4130b可以是透射型衍射光栅，其包括在玻璃基质或其他合适的表面中形成的多个衍射元件(例如，平行狭缝或凹槽)。在一些情况下，光栅可以被实现为相位光栅，其提供光栅材料的折射率的周期性变化。在一些情况下，可以选择凹槽或特征间距以使光以合适的角度衍射和/或调整到成像样品的最小可分辨特征尺寸以用于成像系统4100的操作。在其他情况下，衍射光栅可以是反射衍射光栅。
[0218]
在图41所示的示例中，竖直和水平光条纹图案的取向偏移约90度。在其他情况下，可以使用衍射光栅的其他取向来产生约90度的偏移。例如，衍射光栅可以被取向为使得它们投射出与样品平面(例如，第一内流动池表面)4188的x轴或y轴偏移
±
45度的光条纹图案。在样品载体表面(例如，流动池4187的内表面4188)包括布置在矩形栅格上的规则图案化的特征的情况下，图41所示的成像系统4100的配置可以是特别有利的，因为仅使用两个垂直光栅取向(例如，竖直光栅取向和水平光栅取向)就可以实现使用结构化照明方法提高图像分辨率。
[0219]
在系统4100的示例中，衍射光栅4130a和4130b可以配置为根据以下关系将输入照明光束由于相长干涉而衍射成一系列强度最大值：m＝阶数＝d sin(θ)/λ
[0220]
其中d＝衍射光栅中狭缝或凹槽之间的距离，θ＝照明光相对于衍射光栅表面法线的入射角，λ＝照明光的波长，且m＝对应于衍射光的强度最大值的整数值，例如m＝0，
±
1，
±
2，等。在一些情况下，衍射照明光的特定阶例如，第一阶(m＝
±
1)光可以投射在样品平面例如内流动池表面4188上。在一些情况下，例如，竖直光栅4130a可以将准直光束衍射成第一阶衍射光束(
±
1阶)，其以第一取向聚焦到样品平面上，并且水平光栅4130b可以将准直光束衍射成第一阶衍射光束，其以第二取向聚焦到样品平面上。在一些情况下，使用例如可被插入到衍射光栅之后的光路中的光束阻挡元件(未示出)(例如阶滤波器)，可以将零阶光
束和/或所有其他更高阶光束(例如，m＝
±
2或更高)阻挡，即从投影到样品平面4188的照明图案中滤除。
[0221]
在4100的示例中，结构化照明系统的每个分支都包括光学相位调制器或移相器4140a和4140b，以对由衍射光栅4130a和4130b中的每个透射或反射的衍射光进行相移。在结构化成像期间，每个衍射光束的光学相位可以被偏移结构化图案的每个条纹的间距(x)的某个分数(例如，1/2、1/2、1/4等)。在图41的示例中，相位调制器4140a和4140b可以被实现为例如由旋转致动器或其他致动器机构致动的旋转光学相位板以旋转和调制每个衍射光束的光路长度。例如，光学相位板4140a可以绕竖直轴旋转，以将由竖直光栅4130a投射在样品平面4188上的图像左右移动，光学相位板4140b可以绕水平轴旋转，以在垂直方向上移动由水平光栅4130b投射在样品平面4188上的图像。
[0222]
在其他实施方式中，可以使用改变衍射光的光路长度的其他类型的相位调制器(例如，安装在线性平移台上的光楔等等)。另外，尽管将光学相位调制器4140a和4140b图示为放置在衍射光栅4130a和4130b之后，但在其他实施方式中，它们也可以放置在照明光路中的其他位置。在一些情况下，单个光学相位调制器可以在两个不同的方向上操作以产生不同的光条纹图案，或者可以使用单个运动来调整单个光学相位调制器的位置，以同时调整照明光路两个支臂的光路长度。
[0223]
在图41所示的示例中，光学组件4160可用于组合来自两个照明光路的光。光学组件4160可以包括例如部分镀银的镜、二向色镜(取决于光源4110a和4110b输出的光的波长)、使得来自照明系统两支臂的光以无损或近乎无损的方式组合的包含孔的图案或图案化的反射涂层的镜(例如，除了反射涂层的少量吸收外，没有显著的光功率损失)、偏振分束镜(在光源4110a和4110b被配置为产生偏振光的情况下)等。可以定位光学组件4160，使得在空间上分辨由每个衍射光栅反射或透射的光的所期望的衍射阶，并阻挡不想要的阶的光。在一些情况下，光学组件4160可以使第一照明光路输出的第一阶光通过，并反射第二照明光路输出的第一阶光。在一些情况下，样品表面4188上的结构化照明图案可以通过打开或关闭每个光源，或者通过打开和关闭光源的光路中的光闸来从竖直取向(例如使用衍射光栅4130a)切换到水平取向(例如使用衍射光栅4130b)。在其他情况下，可以通过使用光学开关来切换结构化照明图案，以改变用于照明样品平面的照明光路。
[0224]
再次参考图41，透镜4170、半反射镜或二向色镜4180和物镜4185可用于将结构化照明光聚焦到样品表面4188(例如流动池4187的第一内表面)上。然后，由样品表面4188发射、反射或散射的光被物镜4185收集，通过镜4180透射，并由图像传感器或照相机4195成像。如所述，镜4180可以是二向色镜，用于将从照明光路的每个分支接收到的结构化照明光反射到物镜4185中，以投射到样品平面4188上，并使样品平面4188发出的光通过(例如，荧光，其发出的波长与激发光的波长不同)通过以成像到图像传感器4195上。
[0225]
在一些情况下，系统4100可以任选地包括定制镜筒透镜4190，如本文其他地方所述，使得成像系统的焦点可以从流动池4187的第一内表面4188移到第二内表面4189，以实现只需很少的调整情况下的双表面成像。在一些情况下，透镜4170可以包括定制镜筒透镜，如本文其他地方所述，使得照明光路的焦点可以从流动池4187的第一内表面4188移到第二内表面4189，以实现只需很少的调整情况下的双表面成像。在一些情况下，可以将透镜4170实施为沿光轴铰接以调整结构化照明图案在样品平面上的焦点。在一些情况下，系统4100
可以包括自动聚焦机构(未示出)，以在图像传感器4195的平面处调节照明光的焦点和/或图像的焦点。在一些情况下，由于在光路中不存在偏振器，因此图41所示的系统4100可以提供高的光学效率。根据物镜4185的数值孔径，使用非偏振光可能会或可能不会对照明图案的对比度产生显著影响。
[0226]
为了简单起见，成像系统4100的一些光学组件可能已经从图41和前述讨论中省略。尽管在此非限制性示例中将系统4100示为单通道检测系统，但在其他情况下，它也可以实现为多通道检测系统(例如，使用两个不同的图像传感器和适当的光学器件以及以两种不同波长发射的光源)。此外，尽管在该非限制性示例中将系统4100的照明光路图示为包括两个分支，但在一些情况下，它可以实现为包括例如三个分支、四个分支或多于四个的分支，其中的每个分支包括对于彼此固定或可调相对取向的衍射光栅。
[0227]
在一些情况下，可替选的照明路径光学设计可用于创建结构化照明。例如，在一些情况下，可以在光学组件4160之后放置单个大的旋转光学相位调制器，并代替光学相位调制器4140a和4140b使用来调制由竖直衍射光栅4130a和水平衍射光栅4130b输出的两个衍射光束的相位。在一些情况下，代替相对于衍射光栅之一的光轴平行，单个旋转光学补偿器的旋转轴可以与每个竖直衍射光栅和水平衍射光栅的光轴偏移45度(或偏移另一个角度)，以允许沿两个照明方向的相移。在一些情况下，单个旋转光学相位调制器可以由例如围绕标称光束轴旋转的楔形光学组件代替。
[0228]
在另一种可替选照明光路设计中，可以将衍射光栅4130a和4130b安装在各自的线性运动平台上，以便可以平移它们以改变由衍射光栅4130a和4130b反射或透射的光的光路长度(从而改变相位)。线性运动台的运动轴可以垂直于或以其他方式偏离其各自衍射光栅的取向，以沿样品平面4188提供衍射光栅的条纹图案的平移。合适的平移台可包括例如交叉滚子轴承台、线性马达、高精度线性编码器和/或其他线性致动器技术，以提供衍射光栅的精确线性平移。
[0229]
图42提供了用于获取和处理使用结构化照明的成像以增强成像系统的空间分辨率的工作流程的非限制性示例。在一些情况下，可以执行图42所示的工作流程以对整个样品平面成像(例如，通过图像平铺对流动池的内表面进行成像)，或者对较大样品平面的单个区域成像。图41所示的系统4100的竖直4130a和水平4130b衍射光栅可用于将照明光条纹图案投射到具有不同已知取向和/或不同已知相移的样品平面上。例如，成像系统4100可以使用竖直光栅4130a和水平光栅4130b分别生成水平和竖直照明图案，而光学相位调制器4140a和4140b可以设置为三个不同的位置，以针对每个取向产生所示的三个相移。
[0230]
在操作期间，可以使用第一照明条件(例如，衍射光栅的特定取向和相移设置)将光栅光条纹图案投射在样品平面(例如流动池表面)上。在使用第一照明条件捕获图像之后，可以获取使用一个或多个相移照明图案获取的一个或多个另外图像(例如，使用1、2、3、4、5、6或超过6个相移照明图案获取的1、2、3、4、5、6或超过6个另外图像)。如果成像系统包括照明光路的第二分支，则可以使用第二照明条件作为起点(例如，衍射光栅的第二特定取向和相移设置)来重复图像获取过程，并且可以重复图像获取过程。在一些情况下，可以使用至少5个不同的相移光条纹图案来针对衍射光栅的至少三个不同取向(例如，相对于彼此间隔60度)获取图像。如果不再使用衍射光栅或相移照明光条纹图案的不同取向来获取更多图像，则可以使用图像重建算法来处理所获取的图像并产生重建的超分辨率图像。在一
些情况下，在每个取向上使用至少1、2、3、4、5、6或超过6个不同的相移光条纹图案，来针对衍射光栅的至少1、2、3、4、5、6或超过6个不同取向获取图像。
[0231]
获取用于重建单个超分辨率图像的多个图像的潜在缺点是调整投射的光条纹图案的取向和/或相对相移所需的时间以及获取每个图像所需的曝光时间，以及下游图像处理。因此，优选地是光学设计(所述光学设计可使改变衍射光栅取向和相对相位所需的时间最小化)以及高效的图像重建算法。在一些情况下，与重建常规样品(例如，染色的组织样品)的较高分辨率图像通常所需图像的相比，可以需要更少的图像来重建例如流动池表面的超分辨率图像，所述流动池表面包含拴系至与本文所述的其他地方所述的低非特异性结合表面的经扩增的靶核酸序列的离散的经荧光标记的簇。
[0232]
再次参考图42，例如，在将图像平铺以创建整个流动池表面的较高分辨率图像的情况下，可以针对给定流动池表面的不同区域重复上述循环。在一些情况下，如果例如要对第二流动池表面进行成像，则可以在调整成像系统的焦点之后重复上述循环。
[0233]
其他超分辨率成像技术：在一些情况下，所公开的成像系统可包括使用可替选的超分辨率成像技术，例如光敏定位显微镜(palm)、荧光光敏定位显微镜(fpalm)和/或随机光学重建显微镜(storm)。[参见，例如lutz,等人(2011),“biological imaging by superresolution light microscopy”,comprehensive biotechnology(第二版),第1卷,第579-589页,elsevier)，其是基于将单个分子的点扩散函数(psf)的图像中观察到的强度分布进行统计曲线拟合至高斯分布函数。然后，使用高斯分布函数来定义分子在样品平面中的位置，其精度要比经典分辨率极限所允许的精度高得多。可以使用相同的方法对经荧光标记的分子的小的分散子集(例如栓系在样品载体上的低非特异性结合表面或流动池内表面的靶核酸序列的克隆扩增簇)成像。
[0234]
使用这些方法获得的空间精度或分辨率取决于分子被光漂白之前从分子中收集的光子数量以及背景噪声水平[lutz,等人(2011),同上]。如果背景噪声可以忽略不计，并且每个分子可以收集至少10,000个光子，则证明位置精度为1-2nm。在一些情况下，例如使用本文其他地方所述的通过亲和力测序方法，包含多个荧光标记物(以确保高光子计数)的聚合物-核苷酸缀合物(例如每个缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个标记物)，任选与本文其他地方公开的低非特异性结合表面(以确保非常低的背景信号)组合使用，这可以促进将这些超分辨率成像技术用于基因测试和测序应用。空间精度或分辨率随收集的光子数量的减少而降低，但是，即使在仅收集中等数量的光子的情况下，20nm的定位精度或分辨率也是可能的。在某些情况下，可以实现横向空间分辨率提高10倍或更高。在一些情况下，可以实现优于500nm、400nm、300nm、200nm、175nm、150nm、125nm、100nm、75nm、50nm、25nm或10nm的图像分辨率。
[0235]
此类成像的第二个基本原理是，在任何给定时间对样品内的少量的在空间上分离的荧光分子进行成像。
[0236]
在一些情况下，控制样品平面中小的分散的荧光分子子集的荧光发射的能力是促进超分辨率成像的关键。在荧光光敏定位显微镜(fpalm)和光敏定位显微镜(palm)的情况下，例如，使用可光活化的绿色荧光蛋白(pa-gfp)作为标记物可以允许使用405nm光的短脉冲对样品中的荧光子集进行受控诱导以将pa-gfp从暗的非荧光状态转换为488nm可激发荧光状态，从而产生可以成像的荧光分子的在空间上分离的子集[lutz,等人(2011),同上]。
在随机光学重建显微镜(storm)的情况下，例如，花青染料对cy5
–
cy3的光转换特性可以类似的方式使用，以使得能够在任何给定时间从样品中的分子的小子集(例如，在空间上被至少多个分辨率单位隔开的分子的小子集)随机诱导cy5荧光。在一些情况下，例如，当与本文其他地方所述的通过亲合力测序的方法组合时，聚合物-核苷酸缀合物可包含可光活化的绿色荧光蛋白(pa-gfp)或其子结构域或其部分。在一些情况下，聚合物-核苷酸缀合物可以包含缀合物的混合物，其中第一部分用例如cy3标记物标记，而第二部分用例如cy5标记物标记。在一些情况下，聚合物核苷酸缀合物可在同一缀合物内包含例如cy3和cy5标记物的混合物。
[0237]
从在获取的图像的时间堆栈中成像的所有分子或特征(例如，经标记的核酸簇)的高斯拟合总和重建超分辨图像[lutz,等人(2011),同上]，其中强度对应于每个分子或分子子集的位置的位置不确定性。这种数据集的独特之处在于以不同的定位精度或分辨率渲染图像的能力。在一些情况下，包括全内反射荧光(tirf)光学成像设计的成像模块在实施这些超分辨率成像技术的使用中可以是有利的，因为用于激发荧光的隐失波被限制在距样品载体或流动池表面小于200nm的轴向尺寸内，从而抑制了背景荧光信号。在一些情况下，成像系统可包括比本文所公开的其他成像模块设计所使用的数值孔径更高的物镜。使用更高数值孔径的物镜可以有利于实现隐失波激发和从荧光探针高效捕获光子。在一些情况下，使用单光子敏感的em-ccd相机或其他类型的图像传感器进行的宽视场成像可以能够使每帧同时成像许多分子或分子子集(例如，核酸序列簇)，从而提高图像获取的通量。
[0238]
在一些情况下，通过如下来改善成像系统的灵敏度和速度，可以缩短获取足够的图像以实现足够的特征定义和分辨率所需的数据获取时间：通过使用本文公开的通过亲合力测序的试剂和低非特异性结合表面来增加信号，同时减少或消除背景，以及使用改善的图像重建算法。
[0239]
评估图像质量：对于本文公开的光学成像设计的任何实施方案，可以使用本领域技术人员已知的多种性能指标中的任何一种来评估成像性能或成像质量。示例包括但不限于在一个或多个指定的空间频率、散焦、球差、色差、彗形像差、像散、场曲率、图像畸变、对比噪声比(cnr)或其任何组合下的调制传递函数(mtf)的测量。
[0240]
在一些情况下，所公开的用于双面成像的光学设计(例如，所公开的物镜设计、镜筒透镜设计、将电光相板与物镜组合使用等，单独地或组合地)可以显著改善流动池的上(近)内表面和下(远)内表面的图像质量，使得对于上面列出的任何成像性能指标(无论是单独还是组合)，对流动池的上内表面和下内表面进行成像的成像性能指标之差小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。
[0241]
在一些情况下，所公开的用于双面成像的光学设计(例如，包括所公开的镜筒透镜设计、将电光相板与物镜组合使用等)可以显著改善图像质量，使得对于上面列出的任何成像性能指标(无论是单独还是组合)，与常规系统(其包括，例如，物镜、运动致动的补偿器(当对流动池的近内表面或远内表面成像时，其移出或移入光路)，以及图像传感器)相比，用于双面成像的图像质量性能指标提供用于双面成像的成像性能指标方面的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％或至少30％的改善。在一些情况中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，包括所公开的镜筒透镜设计中的一个或多个的荧光成像系统对于双面成像提供了至少相等或
更加改善的成像性能指标。在一些情况中，与包括物镜、运动致动的补偿器和图像传感器的常规系统相比，包括所公开的镜筒透镜设计中的一个或多个的荧光成像系统对于双面成像提供了至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的成像性能指标改善。成像模块规格：
[0242]
激发光波长：在任何所公开的光学成像模块设计中，所公开的成像模块的光源可以产生可见光，例如绿光和/或红光。在一些情况下，光源单独或与一个或多个光学组件(例如，激发光学滤波器和/或二向色分束镜)组合可以产生约350nm、375nm、400nm、425nm、450nm、475nm、500nm、525nm、550m，575nm、600nm、625nm、650nm，675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、800nm、825nm、850nm、875nm或900nm的激发光。本领域技术人员将认识到，激发波长可以具有在该范围内的任何值，例如约620nm。
[0243]
激发光带宽：在任何所公开的光学成像模块设计中，光源单独或与一个或多个光学组件(例如，激发光学滤波器和/或二向色分束镜)组合可以在
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大的带宽内以指定的激发波长产生光。本领域技术人员将认识到，激发带宽可以具有在该范围内的任何值，例如约
±
18nm。
[0244]
光源功率输出：在任何所公开的光学成像模块设计中，光源和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的输出的功率范围可以约0.5w至约5.0w，或更大(如将在下面更详细地讨论的)。在一些情况下，光源的输出和/或从其获得的激发光束的功率可以是至少0.5w、至少0.6w、至少0.7w、至少0.8w、至少1w、至少1.1w、至少1.2w、至少1.3w、至少1.4w、至少1.5w、至少1.6w、至少1.8w、至少2.0w、至少2.2w、至少2.4w、至少2.6w、至少2.8w、至少3.0w、至少3.5w、至少4.0w、至少4.5w或至少5.0w。在一些实施方式中，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率可以是至多5.0w、至多4.5w、至多4.0w、至多3.5w、至多3.0w、至多2.8w、至多2.6w、至多2.4w、至多2.2w、至多2.0w、至多1.8w、至多1.6w、至多1.5w、至多1.4w、至多1.3w、至多1.2w、至多1.1w、至多1w、至多0.8w、至多0.7w、至多0.6w或至多0.5w。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率的范围可以为约0.8w至约2.4w。本领域技术人员将认识到，光源的输出和/或从其获得的激发光束(包括复合激发光束)的功率可以具有该范围内的任何值，例如，约1.28w。
[0245]
光源输出功率和cnr：在所公开的光学成像模块设计的一些实施方式中，光源的输出功率和/或从其获得的一个或多个激发光束(包括复合激发光束)的功率是足够的，与适当的样品组合，以在由照明和成像模块获取的图像中提供至少5、至少10、至少15、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少35、至少40或至少50或更大的对比度噪声比(cnr)，或在由这些值中的任何形成的任何范围内的任何cnr。
[0246]
荧光发射带：在一些情况下，所公开的荧光光学成像模块可以被配置为检测由本领域技术人员已知的各种荧光团中的任何一种产生的荧光发射。用于例如基因分型和核酸测序应用(例如，通过缀合核苷酸、寡核苷酸或蛋白质)的合适的荧光染料的示例包括但不限于荧光素、若丹明、香豆素、花青、及其衍生物，包括花青衍生物花青染料3(cy3)、花青染料5(cy5)、花青染料7(cy7)等。
[0247]
荧光发射波长：在任何所公开的光学成像模块设计中，所公开的光学系统的检测
通道或成像通道可以包括一个或多个光学组件，例如发射光学滤波器和/或二向色分束镜，其被配置为在约350nm、375nm、400nm、425nm、450nm、475nm、500nm、525nm、550m、575nm、600nm、625nm、650nm、675nm、700nm、725nm、750nm、775nm、800nm、825nm、850nm、875nm或900nm处收集发射光。本领域技术人员将认识到，发射波长可以具有在该范围内的任何值，例如，约825nm。
[0248]
荧光发射光带宽：在任何所公开的光学成像模块设计中，检测通道或成像通道可以包括一个或多个光学组件，例如，发射光学滤波器和/或二向色分束镜，其被配置为在
±
2nm、
±
5nm、
±
10nm、
±
20nm、
±
40nm、
±
80nm或更大带宽内收集指定发射波长的光。本领域技术人员将认识到，激发带宽可以具有在该范围内的任何值，例如，约
±
18nm。
[0249]
数值孔径：在一些情况下，在任何所公开的光学系统设计中，物镜和/或光学成像模块(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)的数值孔径可以在约0.1至约1.4的范围内。在一些情况下、数值孔径可以为至少0.1、至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3或至少1.4。在一些情况下，数值孔径可以为至多1.4、至多1.3、至多1.2、至多1.1、至多1.0、至多0.9、至多0.8、至多0.7、至多0.6、至多0.5、至多0.4、至多0.3、至多0.2或至多0.1。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，数值孔径的范围可以为约0.1至约0.6。本领域技术人员将认识到，数值孔径可以具有在该范围内的任何值，例如约0.55。
[0250]
光学分辨率：在一些情况下，根据物镜和/或光学系统(例如包括物镜和/或镜筒透镜)的数值孔径，可以通过任何所公开的光学系统设计实现的样品平面处的最小可分辨光斑(或特征)间隔距离的范围可以为约0.5μm至约2μm。在一些情况下，在样品平面处的最小可分辨光斑间隔距离可以是至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm、至少1.0μm、至少1.2μm、至少1.4μm、至少1.6μm、至少1.8μm或至少1.0μm。在一些情况下，最小可分辨光斑间隔距离可以是至多2.0μm、至多1.8μm、至多1.6μm、至多1.4μm、至多1.2μm、至多1.0μm、至多0.9μm、至多0.8μm、至多0.7μm、至多0.6μm或至多0.5μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，最小可分辨光斑间隔距离可以在约0.8μm至约1.6μm的范围内。本领域技术人员将认识到，最小可分辨光斑间隔距离可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.95μm。
[0251]
在不同深度的第一表面和第二表面的光学分辨率：在一些情况下，在本文公开的任何光学模块或系统中，本文公开的新颖物镜和/或镜筒透镜设计的使用可以在获取第一表面和第二表面的图像之间需要或不需要重新聚焦情况下赋予第一表面和第二表面(例如流动池上内表面和下内表面)相当的光学分辨率。在一些情况下，由此获得的第一表面和第二表面的图像的光学分辨率可以具有彼此的20％、18％、16％、14％、12％、10％、8％、6％、4％、2％、或1％、或在此范围内的任何值内。
[0252]
放大率：在一些情况下，在任何所公开的光学配置中的物镜和/或镜筒透镜、和/或光学系统(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)的放大率可以在约2倍至约20倍的范围内。在一些情况下，光学系统放大率可以是至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、或至少20倍。在一些情况下，光学系统放大率可以是至多20倍、至多15倍、至多10倍、至多9倍、至多8倍、至多7倍、至多6倍、至多5倍、至多4倍、
至多3倍、或至多2倍。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，光学系统放大率可以在约3倍至约10倍的范围内。本领域技术人员将认识到，光学系统放大率可以具有在该范围内的任何值，例如，约7.5倍。
[0253]
物镜焦距长度：在公开的光学设计的一些实施方式中，物镜的焦距长度可以在20mm至40mm的范围内。在一些情况下，物镜的焦距长度可以是至少20mm、至少25mm、至少30mm、至少35mm、或至少40mm。在一些情况下，物镜的焦距可以是至多40mm、至多35mm、至多30mm、至多25mm、或至多20mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，物镜的焦距长度可以在25mm至35mm的范围内。本领域技术人员将认识到，物镜的焦距长度可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约37mm。
[0254]
物镜工作距离：在所公开的光学设计的一些实施方式中，物镜的工作距离可以在约100μm至30mm的范围内。在一些情况下，工作距离可以是至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm，至少1mm、至少2mm、至少4mm、至少6mm、至少8mm、至少10mm、至少15mm、至少20mm、至少25mm、或至少30mm。在一些情况下，工作距离可以是至多30mm、至多25mm、至多20mm、至多15mm、至多10mm、至多8mm、至多6mm、至多4mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，物镜的工作距离可以在500μm至2mm的范围内。本领域技术人员将认识到，物镜的工作距离可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约1.25mm。
[0255]
对于通过厚盖玻片成像而优化的物镜：在所公开的光学设计的一些示例中，可以针对不同流动池厚度的盖玻片来改善或优化物镜的设计。例如，在一些情况下，可以将物镜设计成针对厚度为约200μm至约1,000μm的盖玻片具有最佳的光学性能。在一些情况下，可以将物镜设计成针对厚度是至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、或至少1,000μm的盖玻片具有最佳性能。在一些情况下，可将物镜设计为针对厚度为至多1,000μm、至多为900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm或至多200μm的盖玻片具有最佳性能。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，可以将物镜设计为针对厚度为约300μm至约900μm的盖玻片具有最佳光学性能。本领域技术人员将认识到，可以将物镜设计成针对如下盖玻片具有最佳光学性能：该盖玻片可以具有在该范围内的任何值，例如，约725μm。
[0256]
景深和焦深：在一些情况下，任何所公开的成像模块(例如，包括物镜和/或镜筒透镜)设计的景深和/或焦深的范围可以是约10μm至约800μm，或更大。在一些情况下，景深和/或焦深可以为至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、或至少800μm、或更大。在一些情况下，景深和/或焦深是至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多250μm、至多200μm、至多175μm、至多150μm、至多125μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm、至多10μm、或更小。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形
成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，景深和/或焦深的范围可以为约100μm至约175μm。本领域技术人员将认识到，景深和/或焦深可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约132μm。
[0257]
视场(fov)：在一些实施方式中，任何所公开的成像模块设计(例如，由物镜和检测通道光学器件(例如镜筒透镜)的组合所提供)的fov可以在例如约1mm至约5mm的范围内(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。在一些情况下，fov可以是至少1.0mm、至少1.5mm、至少2.0mm、至少2.5mm、至少3.0mm、至少3.5mm、至少4.0mm、至少4.5mm或至少5.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。在一些情况下，fov可以是至多5.0mm、至多4.5mm、至多4.0mm、至多3.5mm、至多3.0mm、至多2.5mm、至多2.0mm、至多1.5mm、或至多1.0mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，fov的范围可以为约1.5mm至约3.5mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。本领域技术人员将认识到，fov可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约3.2mm(例如，在直径、宽度、长度或最长尺寸方面)。
[0258]
视场(fov)面积：在所公开的光学系统设计的一些示例中，视场的面积可以在约2mm2至约5mm2的范围内。在一些情况下，视场的面积可以是至少2mm2、至少3mm2、至少4mm2或至少5mm2。在一些情况下，视场面积可以是至多5mm2、至多4mm2、至多3mm2或至多2mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，视场的面积可以在约3mm2至约4mm2范围内。本领域技术人员将认识到，视场的面积可以具有在该范围内的任何值，例如，2.75mm2。
[0259]
物镜和/或镜筒透镜mtf的优化：在一些情况下，所公开的成像模块和系统中的物镜和/或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在中等空间频率至高空间频率范围内优化调制传递函数。例如，在一些情况下，所公开的成像模块和系统中的物镜和/或至少一个镜筒透镜的设计被配置为在样品平面中在如下空间频率范围内优化调制传递函数：500个周期/mm至900个周期/mm、700个周期/mm至1100个周期/mm、800个周期/mm至1200个周期/mm、或600个周期/mm至1000个周期/mm。
[0260]
光学像差和衍射极限成像性能：在本文公开的任何光学成像模块设计的一些实施方式中，物镜和/或镜筒透镜可被配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.15波的像差。在一些实施方案中，可将物镜和/或镜筒透镜配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.1波的像差。在一些实施方案中，可将物镜和/或镜筒透镜配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上具有小于0.075波的像差。在一些实施方式中，物镜和/或镜筒透镜可以被配置为向成像模块提供如上所述的视场，使得fov在视场的至少60％、70％、80％、90％或95％上受到衍射限制。
[0261]
光束在二向色反射器、分束镜和合束镜上的入射角：在所公开的光学设计的一些示例中，光束入射在二向色反射器、分束镜或合束镜上的入射角的范围可以为约20度至约45度。在一些情况下，入射角可以是至少20度、至少25度、至少30度、至少35度、至少40度或至少45度。在一些情况下，入射角可以是至多45度、至多40度、至多35度、至多30度、至多25度或至多20度。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范
围，例如，在一些情况下，入射角可以在约25度至约40度的范围内。本领域技术人员将认识到，入射角可以具有在上面指定的值的范围内的任何值，例如，约43度。
[0262]
图像传感器(光电检测器阵列)尺寸：在一些情况下，所公开的光学系统可以包括具有有效区域的图像传感器，所述有效区域的对角线在约10mm至约30mm或更大的范围内。在一些情况下，图像传感器的有效区域的对角线是至少10mm、至少12mm、至少14mm、至少16mm、至少18mm、至少20mm、至少22mm、至少24mm、至少26mm、至少28mm或至少30mm。在一些情况下，图像传感器的有效区域的对角线是至多30mm、至多28mm、至多26mm、至多24mm、至多22mm、至多20mm、至多18mm、至多16mm、至多14mm、至多12mm、或至多10mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，图像传感器可以具有对角线范围为约12mm至约24mm的有效区域。本领域技术人员将认识到，一个或多个图像传感器可以具有对角线具有在以上指定的值的范围内的任何值(例如，约28.5mm)的有效区域。
[0263]
图像传感器像素大小和间距：在一些情况下，针对在所公开的光学系统设计中使用的图像传感器所选择的像素尺寸和/或间距可以在至少一维中在约1μm至约10μm的范围内。在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以是至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少6μm、至少7μm、至少8μm、至少9μm、或至少10μm。在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以是至多10μm、至多9μm、至多8μm、至多7μm、至多6μm、至多5μm、至多4μm、至多3μm、至多2μm、或至多1μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，像素尺寸和/或间距可以在约3μm至约9μm的范围内。本领域技术人员将认识到，像素尺寸和/或间距可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.4μm。
[0264]
过采样：在所公开的光学设计的一些示例中，利用空间过采样方案，其中空间采样频率是光学分辨率x(lp/mm)的至少2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。
[0265]
最大平移台速度：在所公开的光学成像模块的一些示例中，在任何一个轴上的最大平移台速度可以在约1mm/s至约5mm/s的范围内。在一些情况下，最大平移台速度可以是至少1mm/s、至少2mm/s、至少3mm/s、至少4mm/s或至少5mm/s。在一些情况下，最大平移台速度可以是至多5mm/s、至多4mm/s、至多3mm/s、至多2mm/s或至多1mm/s。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最大平移台速度可以在约2mm/s至约4mm/s的范围内。本领域技术人员将认识到，最大平移台速度可以具有在该范围内的任何值，例如，约2.6mm/s。
[0266]
最大平移台加速度：在所公开的光学成像模块的一些示例中，在任何一个运动轴上的最大加速度可以在约2mm/s2至约10mm/s2范围内。在一些情况下，最大加速度可以是至少2mm/s2、至少3mm/s2、至少4mm/s2、至少5mm/s2、至少6mm/s2、至少7mm/s2、至少8mm/s2、至少9mm/s2或至少10mm/s2。在一些情况下，最大加速度可以是至多10mm/s2、至多9mm/s2、至多8mm/s2、至多7mm/s2、至多6mm/s2、至多5mm/s2、至多4mm/s2、至多3mm/s2、或至多2mm/s2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最大加速度可以在约2mm/s2至约8mm/s2的范围内。本领域技术人员将认识到，最大加速度可以具有在该范围内的任何值，例如，约3.7mm/s2。
[0267]
平移台定位重复性：在所公开的光学成像模块的一些示例中，对于任何一个轴的
定位的可重复性可以在约0.1μm至约2μm的范围内。在一些情况下，定位的可重复性可以是至少0.1μm、至少0.2μm、至少0.3μm、至少0.4μm、至少0.5μm、至少0.6μm、至少0.7μm、至少0.8μm、至少0.9μm、至少1.0μm、至少1.2μm、至少1.4μm、至少1.6μm、至少1.8μm或至少2.0μm。在一些情况下，定位的可重复性可以是至多2.0μm、至多1.8μm、至多1.6μm、至多1.4μm、至多1.2μm、至多1.0μm、至多0.9μm、至多0.8μm、至多0.7μm、至多0.6μm、至多0.5μm、至多0.4μm、至多0.3μm、至多0.2μm、或至多0.1μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，定位的可重复性可以在约0.3μm至约1.2μm的范围内。本领域技术人员将认识到，定位的可重复性可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.47μm。
[0268]
fov重新定位时间：在所公开的光学成像模块的一些示例中，相对于光学器件重新定位样品平面(视场)或者反之亦然所需的最长时间，可以在约0.1秒至约0.5秒的范围内。在一些情况下，最长重新定位时间(即，扫描台步长和稳定时间)可以是至少0.1秒、至少0.2秒、至少0.3秒、至少0.4秒或至少0.5秒。在一些情况下，最长重新定位时间可以是至多0.5秒、至多0.4秒、至多0.3秒、至多0.2秒或至多0.1秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，最长重定位时间可以在约0.2秒至约0.4秒的范围内。本领域技术人员将认识到，最长重新定位时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.45秒。
[0269]
自动对焦校正的误差阈值：在所公开的光学成像模块的一些示例中，用于触发自动聚焦校正的指定误差阈值可以在约50nm至约200nm的范围内。在一些情况下，误差阈值可以是至少50nm、至少75nm、至少100nm、至少125nm、至少150nm、至少175nm、或至少200nm。在一些情况下，误差阈值可以是至多200nm、至多175nm、至多150nm、至多125nm、至多100nm、至多75nm或至多50nm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开内的范围，例如，在一些情况下，误差阈值可以在约75nm至约150nm的范围内。本领域技术人员将认识到，误差阈值可以具有在该范围内的任何值，例如，约105nm。
[0270]
图像获取时间：在所公开的光学成像模块的一些情况中，图像获取时间可以在约0.001秒至约1秒的范围内。在一些情况下，图像获取时间可以是至少0.001秒、至少0.01秒、至少0.1秒或至少1秒。在一些情况下，图像获取时间可以是至多1秒、至多0.1秒、至多0.01秒或至多0.001秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，图像获取时间可以在约0.01秒到约0.1秒的范围内。本领域技术人员将认识到，图像获取时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约0.250秒。
[0271]
每个fov的成像时间：在一些情况下，每个视场的成像时间可以在约0.5秒至约3秒的范围内。在一些情况下，每个fov的成像时间可以是至少0.5秒、至少1秒、至少1.5秒、至少2秒、至少2.5秒或至少3秒。在一些情况下，每个fov的成像时间可以是至多3秒、至多2.5秒、至多2秒、至多1.5秒、至多1秒或至多0.5秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，成像时间可以在约1秒至约2.5秒的范围内。本领域技术人员将认识到，成像时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.85秒。
[0272]
视场平坦度：在一些情况下，在相对于每个荧光(或其他成像模式)检测通道的最佳焦平面
±
200nm、
±
175nm、
±
150nm、
±
125nm、
±
100nm、
±
75nm或
±
50nm内获取视场的80％、90％、95％、98％、99％或100％上的图像。
[0273]
用于基因组学和其他应用的系统和系统组件：如上所述，在一些实施方式中，所公开的光学成像模块可以用作被配置用于执行例如基因组学应用(例如，基因测试和/或核酸测序应用)或其他化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的较大系统的模块、组件、子组装件或子系统。图39提供了用于例如本文所公开的测序系统的框图的非限制性示例。除了本文所公开的一个、两个、三个、四个或多于四个的成像模块(每个成像模块可以包括一个或多个照明光路和/或一个或多个检测光路(例如，一个或多个检测通道，其被配置用于将特定波长范围内的荧光发射成像到图像传感器上))，此类系统可以包括一个或多个x-y平移台、一个或多个x-y-z平移台、流动池或盒、流体系统和流体流量控制模块、试剂盒、温度控制模块、流体分配机器人、盒和/或微孔板处理(拾放)机器人、不透光外壳和/或环境控制腔室、一个或多个处理器或计算机、数据存储模块、数据通信模块(例如，蓝牙、wifi、内联网或因特网通信硬件和相关软件)、显示模块，一个或多个基于本地和/或基于云的软件包(例如，仪器/系统控制软件包、图像处理软件包、数据分析软件包)等，或其任何组合。
[0274]
平移台：在本文公开的成像和分析系统(例如，核酸测序系统)的一些实施方式中，所述系统可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个)高精度x-y(或在某些情况下为x-y-z)平移台，用于相对于一个或多个成像模块重新定位一个或多个样品载体结构(例如，一个或多个流动池)，例如，从而平铺一个或多个图像(每个图像对应于成像模块的视场)，以重建整个流动池表面的复合图像。在本文公开的成像系统和基因组分析系统(例如，核酸测序系统)的一些实施方式中，所述系统可以包括一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或多于四个)高精度x-y(或在某些情况下为x-y-z)平移台，用于相对于一个或多个样品载体结构(例如，流动池)重新定位一个或多个成像模块，例如，从而平铺一个或多个图像(每个图像对应于成像模块的视场)，以重建整个流动池表面的一个或多个复合图像。
[0275]
合适的平移台可从许多供应商，例如parker hannifin商购获得。精度平移台系统通常包括多个组件的组合，包括但不限于线性致动器、光学编码器、伺服和/或步进电动机以及电动机控制器或驱动单元。对于本文公开的系统和方法，需要平台移动的高精度和可重复性，以在散布试剂递送和光学检测的重复步骤时，确保例如荧光信号的准确和可再现的定位和成像。
[0276]
因此，本文公开的系统可以包括指定平移台被配置为相对于照明和/或成像光学器件定位样品载体结构(或反之亦然)的精度。在本公开的一方面，一个或多个平移台的精度在约0.1μm至约10μm之间。在其他方面，平移台的精度是约10μm或更小、约9μm或更小、约8μm或更小、约7μm或更小、约6μm或更小、约5μm或更小、约4μm或更小、约3μm或更小、约2μm或更小、约1μm或更小、约0.9μm或更小、约0.8μm或更小、约0.7μm或更小、约0.6μm或更小、约0.5μm或更小、约0.4μm或更小、约0.3μm或更小、约0.2μm或更小、约0.1μm或更小。本领域技术人员将理解，在一些情况下，平移台的定位精度可以落入由这些值中的任何两个值限定的任何范围内(例如，约0.5μm至约1.5μm)。在一些情况下，平移台的定位精度可以具有在该段所包括的值的范围内的任何值，例如，约0.12μm。
[0277]
流动池、微流体装置和盒：本文公开的流动池装置和流动池盒可以用作被设计用于多种化学分析、生化分析、核酸分析、细胞分析或组织分析应用的系统的组件。通常，此类
系统可以包括一个或多个所公开的单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置、毛细管流动池盒和/或本文所述的微流体装置和盒中的一个或多个。所公开的流动池装置和盒的另外的描述可以在pct专利申请公开wo 2020/118255中找到，其全部内容通过引用合并于本文。
[0278]
在一些情况下，本文公开的系统可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多于10个的单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置、毛细管流动池盒和/或微流体装置和盒。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的固定组件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的可移除的、可更换的组件。在一些情况下，单个毛细管流动池装置、多个毛细管流动池装置和/或微流体装置和盒可以是所公开系统的一次性或可消耗组件。
[0279]
在一些实施方式中，所公开的单个毛细管流动池装置(或单个毛细管流动池盒)包括单个毛细管，例如，玻璃或熔融石英毛细管，其内腔形成试剂或溶液可以流过的流体流动路径，并且其内表面可以形成样品载体结构，目的样品被结合或拴系该样品载体结构上。在一些实施方式中，本文公开的多毛细管毛细管流动池装置(或多毛细管流动池盒)可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个的毛细管，其配置用于执行分析技术，该分析技术还包括成像作为检测方法。
[0280]
在一些情况下，可以将一个或多个毛细管包装在机架内以形成便于操作的盒，结合了用于进行外部流体连接的适配器或连接器，并且可以任选地包括另外的集成功能件，例如试剂储存器、废物储存器、阀门(例如，微型阀门)、泵(例如，微型泵)等或其任意组合。
[0281]
图29图示了单个玻璃毛细管流动池装置的一个非限制性示例，该装置包括两个流体适配器(一个固定在一件式玻璃毛细管的每一端)，该流体适配器被设计为与标准od流体管配合，以提供与外部流体控制系统的方便、可交换的流体连接。可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种将流体适配器附接至毛细管，所述技术包括但不限于压配、结合剂结合、溶剂结合、激光焊接等，或其任意组合。
[0282]
通常，在所公开的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒中使用的毛细管将具有至少一个内部轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)，其在毛细管的整个长度上延伸。在一些情况下，毛细管可具有两个、三个、四个、五个或多于五个的内部轴向对齐的流体流动通道(或“内腔”)。
[0283]
用于合适的毛细管(或其内腔)的多个指定的横截面几何形状与本文中的公开内容一致，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些情况下，毛细管(或其内腔)可以具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸(例如，如果内腔是圆形的则为直径，或者如果内腔是正方形或矩形的则为对角线)可以在约10μm至约10mm的范围内。在一些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm或至少10mm。在一些方面，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900
μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在某些情况下，毛细管内腔的最大横截面尺寸可以在约100μm至约500μm的范围内。本领域技术人员将认识到，毛细血管内腔的最大横截面尺寸可以具有该范围内的任何数值，例如，约124μm。
[0284]
在一些情况下，例如，其中流动池装置或盒中的一个或多个毛细管的内腔具有正方形或矩形横截面，第一内表面(例如，顶表面或上表面)和第二内表面(例如，底表面或下表面)之间的距离(其限定流体流动通道的间隙高度或厚度)的范围可以为约10μm到约500μm。在一些情况下，间隙高度可以是至少10μm、至少20μm、至少30μm、至少40μm、至少50μm、至少60μm、至少70μm、至少80μm、至少90μm、至少100μm、至少125μm、至少150μm、至少175μm、至少200μm、至少225μm、至少250μm、至少275μm、至少300μm、至少325μm、至少350μm、至少375μm、至少400μm、至少425μm、至少450μm、至少475μm或至少500μm。在一些情况下，间隙高度可以是至多500μm、至多475μm、至多450μm、至多425μm、至多400μm、至多375μm、至多350μm、至多325μm、至多300μm、至多275μm、至多250μm、至多225μm、至多200μm、至多175μm、至多150μm、至多125μm、至多100μm、至多90μm、至多80μm、至多70μm、至多60μm、至多50μm、至多40μm、至多30μm、至多20μm或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，间隙高度可以在约40μm至约125μm的范围内。本领域技术人员将认识到，间隙高度可以具有在该段的值的范围内的任何值，例如，约122μm。
[0285]
在一些情况下，用于制造所公开的毛细管流动池装置或流动池盒的一个或多个毛细管的长度可以在约5mm至约5cm或更大的范围内。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm或至少5cm。在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以是至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm或至多5mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，一个或多个毛细管的长度可以在约1.5cm至约2.5cm的范围内。本领域技术人员将认识到，一个或多个毛细管的长度可以具有在该范围内的任何数值，例如，约1.85cm。在一些情况下，装置或盒可以包括多个两个或更多个相同长度的毛细管。在一些情况下，装置或盒可包括多个两个或更多个不同长度的毛细管。
[0286]
用于构造所公开的毛细管流动池装置或毛细管流动池盒的毛细管可以由本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种制成，包括但不限于玻璃(例如，硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、熔融石英(石英)、聚合物(例如聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hdpe)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚二甲基硅氧烷(pdms)等)、聚醚酰亚胺(pei)和全氟弹性体(ffkm)作为化学惰性更高的替代品，或其任意组合。就成本和化学兼容性而言，pei在聚碳酸酯和peek之间。ffkm也称为kalrez。
[0287]
用于制造毛细管的一种或多种材料通常是光学透明的，以利于与基于光谱或基于成像的检测技术一起使用。在一些情况下，整个毛细管将是光学透明的。可替选地，在一些情况下，仅毛细管的一部分(例如，光学透明的“窗口”)将是光学透明的。
[0288]
可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制造用于构造所公开
的毛细管流动池装置和毛细管流动池盒的毛细管，其中制造技术的选择通常取决于材料的选择，反之亦然。合适的毛细管制造技术的示例包括但不限于挤出、拉伸、精密计算机数控(cnc)机械加工和镗削、激光烧蚀等。
[0289]
在一些实施方式中，在所公开的毛细管流动池装置和盒中使用的毛细管可以是现成的商业产品。提供精密毛细管的商业供应商的示例包括accu-glass(st.louis,mo；精密玻璃毛细管)，polymicro technologies(phoenix,az；精密玻璃和熔融石英毛细管)，friedrich&dimmock，inc.(millville,nj；定制精密玻璃毛细管)和drummond scientific(broomall,pa；oem玻璃和塑料毛细管)。
[0290]
附接于本文公开的毛细管流动池装置和盒的毛细管的流体适配器，以及毛细管流动池装置或盒的其他组件，可以使用多种合适的技术中的任一种(例如挤压成型、注射成型、压缩成型、精密cnc加工等)和材料(例如玻璃、熔融石英、陶瓷、金属、聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hope)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)等)来制造，其中制造技术的选择还是通常取决于所用材料的选择，反之亦然。
[0291]
图30提供了毛细管流动池盒的非限制性示例，其包括两个玻璃毛细管、流体适配器(在此示例中，每个毛细管两个)以及与毛细管和/或流体适配器匹配的盒底座，从而毛细管相对于盒保持在固定的取向。在一些情况下，流体适配器可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，盒可以包括与毛细管和/或毛细管流体适配器匹配的另外适配器。如本文其他地方所述，在一些情况下，盒可以包括另外的功能组件。在一些情况下，毛细管会永久安装在盒中。在一些情况下，将盒底座设计为允许流动池盒的一个或多个毛细管可互换地移除和更换。例如，在一些情况下，盒底座可以包括铰接的“翻盖”构造，该构造允许其被打开，从而可以去除和更换一个或多个毛细管。在一些情况下，盒底座被配置成安装在例如荧光显微镜的载物台上或安装在本公开的荧光成像模块或仪器系统的盒保持器内。
[0292]
在一些情况下，所公开的流动池装置可以包括微流体装置(或“微流体芯片”)和盒，其中微流体装置通过在一个或多个层合适材料中形成流体通道来制造，并且包括一个或多个流体通道(例如，“分析”通道)，其被配置用于执行分析技术，该技术还包括成像作为检测方法。在一些实施方式中，本文公开的微流体装置或盒可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个流体通道(例如，“分析”流体通道)，其被配置用于执行分析技术，该技术还包括成像作为检测方法。在一些情况下，所公开的微流体装置还可以包括另外的流体通道(例如，用于试剂的稀释或混合)、试剂储存器、废物储存器、用于进行外部流体连接的适配器等，以提供装置内集成的“芯片实验室”功能。
[0293]
微流体流动池盒的非限制性示例包括：具有在芯片上形成的两个或更多个平行玻璃通道的芯片、与芯片联接的流体适配器、以及与芯片和/或流体适配器匹配的盒底座，以使芯片相对于盒以固定的取向放置。在一些情况下，流体适配器可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，盒可以包括与芯片和/或流体适配器匹配的附加适配器。在一些情况下，芯片被永久地安装在盒中。在一些情况下，将盒底座设计为允许流动池盒中的一个或多个芯片可互换地移除和更换。在一些情况下，盒底座可以包括铰接的“翻盖”构造，该构造允许其被打开，从而可以去除和更换一个或多个芯片。在一些情况下，盒底座被配置成安装在例如
显微镜系统的载物台上或成像系统的盒保持器内。在非限制性示例中，即使仅描述一个芯片，也应当理解，在微流体流动池盒中可以使用多于一个的芯片。本公开内容的流动池盒可包括单个微流体芯片或多个微流体芯片。在一些情况下，本公开内容的流动池盒可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或超过20个微流体芯片。在盒内包装一个或多个微流体装置可以有利于易于操作并在光学成像系统中正确定位装置。
[0294]
所公开的微流体装置和盒内的流体通道可具有多种横截面几何形状，包括但不限于圆形、椭圆形、正方形、矩形、三角形、圆角正方形、圆角矩形或圆角三角形横截面几何形状。在一些情况下，流体通道可具有任何指定的横截面尺寸或尺寸组。例如，在一些情况下，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸(例如，如果流体通道具有正方形、圆角正方形、矩形或圆角矩形横截面则为对角线)可以在约10μm至约10mm范围内。在一些方面，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以是至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、至少1mm、至少2mm、至少3mm、至少4mm、至少5mm、至少6mm、至少7mm、至少8mm、至少9mm、或至少10mm。在一些方面，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以是至多10mm、至多9mm、至多8mm、至多7mm、至多6mm、至多5mm、至多4mm、至多3mm、至多2mm、至多1mm、至多900μm、至多800μm、至多700μm、至多600μm、至多500μm、至多400μm、至多300μm、至多200μm、至多100μm、至多75μm、至多50μm、至多25μm、或至多10μm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些情况下，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以在约20μm至约200μm范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的高度(例如，间隙高度)、宽度或最大横截面尺寸可以具有在该范围内的任何值，例如，约122μm。
[0295]
在一些情况下，所公开的微流体装置和盒中的流体通道的长度可以在约5mm至约10cm或更大的范围内。在一些情况下，流体通道的长度可以是小于5mm、至少5mm、至少1cm、至少1.5cm、至少2cm、至少2.5cm、至少3cm、至少3.5cm、至少4cm、至少4.5cm、至少5cm、至少6cm、至少7cm、至少8cm、至少9cm、或至少10cm。在一些情况下，流体通道的长度可以是至多10cm、至多9cm、至多8cm、至多7cm、至多6cm、至多5cm、至多4.5cm、至多4cm、至多3.5cm、至多3cm、至多2.5cm、至多2cm、至多1.5cm、至多1cm、或至多5mm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，流体通道的长度可以在约1.5cm至约2.5cm的范围内。本领域技术人员将认识到，流体通道的长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约1.35cm。在一些情况下，微流体装置或盒可以包括多个相同长度的流体通道。在一些情况下，微流体装置或盒可包括多个长度不同的流体通道。
[0296]
所公开的微流体装置将包括具有在其中形成一个或多个流体通道的材料的至少一个层。在一些情况下，微流体芯片可包括结合在一起以形成一个或多个流体通道的两个层。在一些情况下，微流体芯片可以包括结合在一起以形成一个或多个流体通道的三个层或更多个层。在一些情况下，微流体通道可以具有敞开的顶部。在一些情况下，微流体通道可以被制造在一个层(例如，底层的顶表面)内，并且可以通过将底层的顶表面结合到材料的顶层的底表面来密封。在一些情况下，微流体通道可以被制造在一个层内，例如作为图案化通道，所述图案化通道的深度延伸穿过该层的整个厚度，然后被夹在两个非图案化层之间并结合到其上以密封流体通道。在一些情况下，通过去除基质表面上的牺牲层来制造微
流体通道。该方法不需要将本体基质(例如，玻璃或硅晶片)蚀刻掉。相反，流体通道位于基质的表面上。在一些情况下，微流体通道可以在基质的表面内或表面上制造，然后通过在基质的表面上沉积保形膜或层来密封以在芯片中形成次表面或埋设的流体通道。
[0297]
可以使用微制造工艺的组合来制造微流体芯片。因为装置是微制造的，所以通常将基于它们与已知的微制造技术(例如，光刻、湿法化学蚀刻、激光烧蚀、激光辐照、空气磨蚀技术、注射成型、压花和其他技术)的兼容性来选择基质材料。通常还选择基质材料以使其与微流体装置可能暴露的整个条件范围兼容，所述整个条件范围包括极端的ph、温度、盐浓度以及电磁场(例如，光)或电场的施加。
[0298]
所公开的微流体芯片可以由本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种制成，包括但不限于玻璃(例如硼硅酸盐玻璃、钠钙玻璃等)、石英玻璃(石英)、硅、聚合物(例如聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hope)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)、聚二甲基硅氧烷(pdms)等)、聚醚酰亚胺(pei)和全氟弹性体(ffkm)(作为化学惰性更高的替代品)，或其任意组合。在一些优选的情况下，基质材料可以包括基于二氧化硅的基质，如硼硅酸盐玻璃和石英，以及其他合适的材料。
[0299]
可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来制造所公开的微流体装置，其中制造技术的选择通常取决于所用材料的选择，反之亦然。芯片上的微流体通道可以使用适合于在基质表面上形成微结构或微图案的技术来构造。在一些情况下，流体通道通过激光辐照形成。在一些情况下，微流体通道通过聚焦的飞秒激光辐射形成。在一些情况下，微流体通道通过光刻和蚀刻形成，包括但不限于化学蚀刻、等离子体蚀刻或深反应离子蚀刻。在一些情况下，使用激光蚀刻形成微流体通道。在一些情况下，使用直写光刻技术形成微流体通道。直写光刻的示例包括电子束直写和聚焦离子束研磨。
[0300]
在另外的优选示例中，基质材料可以包括聚合物材料，例如，塑料(例如聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(teflon
tm
)、聚氯乙烯(pvc)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚砜等)。使用诸如上述的微细加工技术，可以容易地对此类聚合物基质进行图案化或微加工。在一些情况下，微流控芯片可以使用众所周知的成型技术(例如，注射成型、压花、压模、或通过在模具中使聚合物前体材料聚合(参见，例如，美国专利号5,512,131))由聚合物材料制成，例如由微加工的母盘(master)制成。在一些情况下，此类聚合物基质材料是优选的，因为它们易于制造、成本低且具有可处置性，以及它们对大多数极端反应条件的一般惰性。如同由其他材料(例如，玻璃)制成的流动池装置一样，例如，由这些聚合材料制成的流动池装置可以包括经过处理的表面(例如，衍生化或涂覆的表面)，以增强其在微流体系统中的效用，在下面将更详细地讨论。
[0301]
通常使用上述微制造技术将微流体装置的流体通道和/或流体腔室作为微尺度通道(例如，凹槽，凹口等)制造到第一基质的上表面中。第一基质包括具有第一平坦表面的顶侧和底侧。在根据本文描述的方法制备的微流体装置中，多个流体通道(例如，凹槽和/或凹口)形成在第一平坦表面上。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基质之前)具有底壁和侧壁，其中顶部保持敞开。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，凹槽和/或凹口)(在结合到第二基质之前)具有底壁和侧壁，并且顶部保持封闭。在一些情况下，在第一平坦表面中形成的流体通道(例如，
凹槽和/或凹口)(在结合到第二基质之前)仅具有侧壁，而没有顶表面或底表面(即，流体通道跨越第一基质的整个厚度。
[0302]
流体通道和腔室可通过将第一基质的第一平坦表面放置成与第二基质的平坦表面接触并结合来密封，以形成装置的位于这两个组件的接界处的通道和/或腔室(例如，内部)。在一些情况下，在将第一基质结合到第二基质之后，可以将结构进一步放置成与第三基质接触并结合到第三基质。在一些情况下，第三基质可以被放置成与第一基质的不与第二基质接触的一侧接触。在一些情况下，第一基质被放置在第二基质和第三基质之间。在一些情况下，第二基质和第三基质可以覆盖和/或密封在第一基质上形成的凹槽、凹口或孔口，以在这些组件的接界处形成装置的通道和/或腔室(例如，内部)。
[0303]
该装置可以具有开口，该开口被取向为使得它们与形成在该装置的内部中的流体通道和/或流体腔室中的至少一个流体连通，从而形成流体入口和/或流体出口。在一些情况下，开口形成在第一基质上。在一些情况下，开口形成在第一基质和第二基质上。在一些情况下，开口形成在第一基质、第二基质和第三基质上。在一些情况下，开口位于装置的顶侧。在一些情况下，开口位于装置的底侧。在一些情况下，开口位于装置的第一端和/或第二端，并且通道沿着从第一端到第二端的方向延伸。
[0304]
本领域技术人员通常广泛地理解可将基质结合在一起的条件，并且基质的这种结合通常通过多种方法中的任何一种来进行，其选择可根据使用的基质材料的性质而变化。例如，可以将基质的热结合应用于许多基质材料，包括例如，基于玻璃或二氧化硅的基质以及一些基于聚合物的基质。这样的热结合技术通常包括在升高的温度和在某些情况下施加外部压力的条件下使待结合的基质表面配合。所使用的精确温度和压力通常将根据所用材料基质的性质而变化。
[0305]
例如，对于基于二氧化硅的基质材料，即，玻璃(硼硅酸盐玻璃、pyrex
tm
、钠钙玻璃等)、熔融石英(石英)等，通常在约500℃至约1400℃，并且优选约500℃至约1200℃范围的温度下对基质进行热结合。例如，钠钙玻璃通常在约550℃的温度下结合，而硼硅酸盐玻璃通常在800℃或接近800℃的温度下热结合。另一方面，石英基质通常在1200℃或接近1200℃的温度下热结合。这些结合温度通常是通过将要结合的基质放入高温退火炉中来实现。
[0306]
另一方面，热结合的聚合物基质通常将使用比基于二氧化硅的基质更低的温度和/或压力，以防止基质过度熔化和/或变形，例如装置的内部(即流体通道或腔室)变平。通常，用于结合聚合物基质的此类升高的温度将从约80℃至约200℃变化，这取决于所使用的聚合物材料，并且优选在约90℃至约150℃之间。由于结合聚合物基质所需的温度大大降低，因此通常可以进行这种结合而无需用于结合基于二氧化硅的基质的高温烘箱。如下文更详细地描述的，这允许将热源并入单个集成的结合系统中。
[0307]
结合剂也可以根据众所周知的方法用于将基质结合在一起，所述方法通常包括在要结合的基质之间施加一层结合剂并将它们压在一起直至结合剂固化。根据这些方法，可以使用各种结合剂，包括例如可商购的uv可固化结合剂。根据本发明，也可以使用可替选方法将基质结合在一起，包括例如聚合物部件的声波或超声波焊接和/或溶剂焊接。
[0308]
通常，将使用例如“晶片级”制造同时制造多个所述微流体芯片或装置。例如，可将聚合物基质压印或模制成大的可分离片，然后将其配对并结合在一起。然后可以通过切割或切块将单个装置或结合的基质从较大的片分离。类似地，对于基于二氧化硅的基质，可以
由更大的基质晶片或板来制造单个装置，从而允许更高的制造工艺产量。具体地，可以在第一基质晶片或板上制造多个流体通道结构，然后将其用第二基质晶片或板覆盖并与其结合，并且任选地，进一步用第三基质晶片或板覆盖并与其结合。然后，使用已知的方法例如锯切、划片和断裂等，将各个装置从较大的基质上分割下来。
[0309]
如上所述，顶部或第二基质覆盖在底部或第一基质上以密封各种通道和腔室。在根据本公开的方法进行结合过程中，第一基质和第二基质结合可以使用真空和/或压力来执行以保持两个基质表面处于最佳接触。特别地，可以通过例如使底部基质的平坦表面与顶部基质的平坦表面匹配并通过经穿过顶部基质设置的孔施加真空来保持底部基质与顶部基质的最佳接触。通常，通过将顶部基质放置在真空卡盘上来进行向顶部基质中的孔施加真空，该真空卡盘通常包括具有集成真空源的安装台或表面。在基于二氧化硅的基质的情况下，使结合的基质经受高温以产生初始结合，从而可以然后将结合的基质转移到退火炉中，而相对彼此之间没有任何偏移。
[0310]
用于与本文描述的装置结合的可替选的结合系统包括例如结合剂分配系统，用于在基质的两个平坦表面之间施加结合剂层。这可以通过在匹配基质之前施加结合剂层，或通过在相邻基质的一个边缘放置一定量的结合剂，并允许两个配对基质的芯吸作用将结合剂拉过两个基质之间的空间来完成。
[0311]
在某些情况下，整个结合系统可以包括用于将顶部和底部基质放置在安装表面上并对齐它们以进行后续结合的自动化系统。通常，此类系统包括用于相对于彼此移动安装表面或一个或多个顶部和底部基质的平移系统。例如，机器人系统可用于将顶部和底部基质中的每一个依次提升、平移并将其放置在安装台上，并放置在对齐结构内。在结合过程之后，此类系统还可以从安装表面上移走成品，并将这些配对的基质转移到后续操作中，例如分离或切块操作，基于二氧化硅的基质的退火炉等，然后再在其上放置其他基质以进行结合。
[0312]
在一些情况下，微流体芯片的制造包括将两个或更多个层的基质(例如，图案化和非图案化的聚合物片)层叠或层压，以生产芯片。例如，在微流体装置中，该装置的微流体特征通常通过激光辐照、蚀刻或以其他方式将特征制造到第一层的表面中来产生。然后将第二层层压或结合到第一层的表面以密封这些特征并提供装置的流体元件，例如，流体通道。
[0313]
如上所述，在一些情况下，可将一个或多个毛细管流动池装置或微流体芯片安装在盒底座中以形成毛细管流动池盒或微流体盒。在一些情况下，毛细管流动池盒或微流体盒可进一步包括与盒集成的附加组件，以为特定应用提供增强的性能。可以集成到盒中的附加组件的示例包括但不限于用于与系统其他组件进行流体连接的适配器或连接器、流体流量控制组件(例如，微型阀、微型泵、混合歧管等)、温度控制组件(例如，电阻加热元件、用作热源或散热器的金属板、用于加热或冷却的压电(珀耳帖)装置、温度传感器)或光学组件(例如，光学透镜、窗口、滤光镜、反射镜、棱镜、光纤和/或发光二极管(led)或其他微型光源，这些光源可共同用于促进一个或多个毛细管或流体通道的光谱测量和/或成像。
[0314]
流体适配器、盒底座和其他盒组件可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种连接至毛细管、毛细管流动池装置、微流体芯片(或芯片内的流体通道)，所述技术包括但不限于压配合、结合剂结合、溶剂结合、激光焊接等或其任何组合。在一些情况下，微流体芯片中的微流体通道的入口和/或出口是芯片顶表面上的孔，并且流体适配器可以附接
到或联接至芯片内微流体通道的入口和/或出口。在一些情况下，盒可以包括与芯片和/或流体适配器配合并帮助将芯片定位在盒内的附加适配器(即，除了流体适配器之外)。可以使用与上文针对流体适配器概述的制造技术和材料相同的制造技术和材料来构造这些适配器。
[0315]
盒底座(或“外壳”)可以由金属和/或聚合物材料制成，例如铝、经阳极氧化的铝、聚碳酸酯(pc)、丙烯酸类(pmma)或ultem(pei)，而其他材料也与本公开一致。外壳可以使用cnc机加工和/或模制技术来制造，并且被设计为使得一个、两个或多于两个的毛细管或微流体芯片以固定的取向被底座约束以产生一个或多个独立的流动通道。可以使用例如压配设计或通过与由硅酮或含氟弹性体制成的可压缩适配器配合而将毛细管或芯片安装在底座中。在一些情况下，使用例如螺钉、夹子、钳子或其他紧固件来组装盒底座的两个或更多个组件(例如，上半部和下半部)，使得这两个半部是可分离的。在一些情况下，使用例如结合剂、溶剂结合或激光焊接来组装盒底座的两个或更多个组件，使得两个或更多个组件被永久地附接。
[0316]
流动池表面涂层：在一些情况下，可以使用本领域技术人员已知的多种表面改性技术或聚合物涂层中的任一种来涂覆所公开的流动池装置中的毛细管腔或微流体通道的一个或多个内表面。在一些情况下，可以配制涂层以增加或最大化一个或多个内表面上的可用结合位点(例如，拴系的寡核苷酸衔接子/引物序列)的数量，以增加或最大化前景信号，例如，由经标记的核酸分子与拴系的寡核苷酸衔接子/引物序列杂交产生的荧光信号。在一些情况下，可以配制涂层以减少或最小化荧光团与其他小分子或经标记或未标记的核苷酸、蛋白质、酶、抗体、寡核苷酸或核酸分子(例如，dna、rna、等)的非特异性结合，以减少或最小化背景信号，例如由经标记的生物分子的非特异性结合或样品载体结构的自发荧光产生的背景荧光。在一些情况下可以通过使用所公开的涂层来实现的增加的前景信号和减少的背景信号的组合因此可以在光谱测量中提供改善的信噪比(snr)或在成像方法中提供改善的对比度噪声噪比(cnr)。
[0317]
如以下将更详细讨论的，所公开的亲水性聚合物涂覆的流动池装置(任选地与改善的杂交和/或扩增方案组合使用)产生固相生物测定反应，该反应表现出：(i)蛋白质和其他反应组分的可忽略的非特异性结合(从而减少或最小化基质背景)，(ii)可以忽略的非特异性核酸扩增产物，以及(iii)提供可调的核酸扩增反应。尽管本文主要在核酸杂交、扩增和测序测定的背景下进行了描述，但本领域技术人员将理解，所公开的低结合性载体可以用于多种其他生物测定形式中的任何一种，包括但不限于三明治免疫测定、酶联免疫吸附测定(elisa)等。
[0318]
在优选的方面，可将一层或多层涂层材料施加到内部流动池装置表面，其中选择层数和/或每一层的材料组成以调节内部流动池装置表面的一种或多种表面性质，如美国专利申请号16/363,842中所述。可以调节的表面性质的示例包括但不限于表面亲水性/疏水性、总涂层厚度、化学反应性官能团的表面密度、接枝的连接分子或寡核苷酸衔接子/引物的表面密度等。在一些优选的应用中，调节毛细管或通道内腔的一个或多个表面性质以例如，(i)提供非常低的蛋白质、寡核苷酸、荧光团以及化学或生物学分析应用的其他分子组分的非特异性结合，包括固相核酸扩增和/或测序应用，(ii)提供改进的固相核酸杂交特异性和效率，并且(iii)提供改进的固相核酸扩增速率、特异性和效率。
[0319]
本领域技术人员已知的多种分子中的任何一种(包括但不限于硅烷、氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物、或它们的组合)都可以用于产生内部流动池装置表面上的一个或多个化学改性层，其中使用的组分的选择可能会发生变化，以改变载体表面的一种或多种性质，例如，官能团和/或拴系的寡核苷酸引物的表面密度、载体表面的亲水性/疏水性、或载体表面的三个三维性质(即，“厚度”)。
[0320]
用于将第一化学改性层接枝到流动池(毛细管或通道)内表面的附接化学通常取决于制造流动池装置的材料和该层的化学性质两者。在一些情况下，第一层可以共价附接到内部流动池装置表面。在一些情况下，第一层可以例如通过非共价相互作用如静电相互作用、氢键或第一层的表面与分子组分之间的范德华相互作用非共价连接例如吸附到表面上。无论哪种情况，都可以在附接或沉积第一层之前对基质表面进行处理。本领域技术人员已知的多种表面处理技术中的任何一种都可以用于清洁或处理载体表面。例如，可以使用piranha溶液(硫酸(h2so4)和过氧化氢(h2o2)的混合物)酸洗玻璃或硅表面和/或使用氧等离子体处理方法进行清洁。
[0321]
硅烷化学法构成一种非限制性方法，用于共价修饰玻璃或硅表面上的硅烷醇基以连接更多的反应性官能团(例如胺基或羧基)，其然后可用于将接头分子(例如各种长度的线性烃分子，例如c6、cl2、c18烃或线性聚乙二醇(peg)分子)或层分子(例如，支链的peg分子或其他聚合物)偶联在表面上。可用于产生任何所公开的低结合性载体表面的合适硅烷的示例包括但不限于(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(aptms)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)以及多种peg-硅烷(例如，具有1k、2k、5k、10k、20k等的分子量)、氨基-peg硅烷(即具有游离的氨基官能团)、马来酰亚胺-peg硅烷、生物素-peg硅烷等中的任何一种。
[0322]
可用于在任何所公开的载体表面中产生一层或多层低非特异性结合材料的优选聚合物的示例包括但不限于各种分子量和分支结构的聚乙二醇(peg)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、右旋糖酐、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物，或其任意组合。可以用于将一个或多个层的材料(例如，聚合物层)接枝到载体表面和/或使层彼此交联的缀合化学的示例包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变型)、his标签
–
ni/nta缀合化学、甲氧基醚缀合化学、羧酸盐缀合化学、胺缀合化学、nhs酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷。
[0323]
在一些情况下，内部流动池装置表面上的聚合物或其他化学层的层数可以在1至约10或大于10的范围内。在一些情况下，层的数量是至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个。在一些情况下，层的数量可以是至多10个、至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，层的数量可以在约2个至约4个的范围内。在一些情况下，一个或多个层可以全部包含相同的材料。在一些情况下，每个层可以包含不同的材料。在一些情况下，多个层可以包含多种材料。
[0324]
多层表面的一层或多层可以包含支化聚合物或可以是线性的。合适的支化聚合物的示例包括但不限于：支化的peg、支化的聚乙烯醇(支化的pva)、支化的聚(乙烯基吡啶)、支化的聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化的pvp)、支化的)、聚(丙烯酸)(支化的paa)、支化的聚丙烯酰胺、支化的聚(n-异丙基丙烯酰胺)(支化的pnipam)、支化的聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化
的pma)、支化的聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化的phema)、支化的聚(低聚(乙二醇)单甲醚甲基丙烯酸酯(支化的poegma)、支化的聚谷氨酸(支化的pga)、支化的聚赖氨酸、支化的聚葡萄糖苷和右旋糖酐。
[0325]
在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的支化聚合物可以包括至少4个分支、至少5个分支、至少6个分支、至少7个分支、至少8个分支、至少9个分支、至少10个分支、至少12个分支、至少14个分支、至少16个分支、至少18个分支、至少20个分支、至少22个分支、至少24个分支、至少26个分支、至少28个分支、至少30个分支、至少32个分支、至少34个分支、至少36个分支、至少38个分支或至少40个分支。分子通常显示出“2的幂”数量个分支，例如2、4、8、16、32、64或128个分支。
[0326]
在一些情况下，在沉积一个层或多个层例如聚合物层之后，远离表面的所得官能端基可以包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸盐、胺、nhs酯、马来酰亚胺和双硅烷。
[0327]
用于形成本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可是至少500道尔顿、至少1,000道尔顿、至少1,500道尔顿、至少2,000道尔顿、至少2,500道尔顿、至少3,000道尔顿、至少3,500道尔顿、至少4,000道尔顿、至少4,500道尔顿、至少5,000道尔顿、至少7,500道尔顿、至少10,000道尔顿、至少12,500道尔顿、至少15,000道尔顿、至少17,500道尔顿、至少20,000道尔顿、至少25,000道尔顿、至少30,000道尔顿、至少35,000道尔顿、至少40,000道尔顿、至少45,000道尔顿、或至少50,000道尔顿。在一些情况下，用于形成本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以是至多50,000道尔顿、至多45,000道尔顿、至多40,000道尔顿、至多35,000道尔顿、至多30,000道尔顿、至多25,000道尔顿、至多20,000道尔顿、至多17,500道尔顿、至多15,000道尔顿、至多12,500道尔顿、至多10,000道尔顿、至多7,500道尔顿、至多5,000道尔顿、至多4,500道尔顿、至多4,000道尔顿、至多3,500道尔顿、至多3,000道尔顿、至多2,500道尔顿、至多2,000道尔顿、至多1,500道尔顿、至多1,000道尔顿、或至多500道尔顿。该段落中描述的下限值和上限值中任何一个可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，用于形成本文公开的任何多层表面中的任何一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以在约1,500道尔顿至约20,000道尔顿的范围内。本领域技术人员将认识到，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以具有在该范围内的任何数值，例如，约1,260道尔顿。
[0328]
在一些情况下，两层或更多层可以彼此共价偶联或内部交联以提高所得表面的稳定性。在一些情况下，例如，其中多层表面的至少一层包括支化聚合物，被沉积的层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以在每个分子约一个共价键和每个分子约32个共价键的范围内。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以为每个分子至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30、至少32或多于32个共价键。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以为至多32、至多30、至多28、至多26、至多24、至多22、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量范围
可以为约4至约16。本领域技术人员将认识到，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以具有在该范围内的任何数值，例如，在一些情况下为约11，或在其他情况下平均值为约4.6。
[0329]
在材料层偶联至内部流动池装置表面之后残留的任何反应性官能团可通过使用高产率偶联化学法偶联小的惰性分子来选择性地封闭。例如，在使用胺偶联化学法将新材料层连接到前一层的情况下，任何残留的胺基随后可通过与小氨基酸(例如，甘氨酸)偶联而被乙酰化或失活。
[0330]
为了缩放结合位点表面密度，例如，寡核苷酸衔接子/引物表面密度并为亲水或两性表面增加维度，已经开发了包含peg和其他亲水聚合物的多层涂层的基质。通过使用亲水和两性的表面层化方法(所述方法包括但不限于以下所述的聚合物/共聚物材料)，可以显著增加表面上的衔接子/引物装载密度。传统的peg涂覆方法使用单层引物沉积，其已被测试并报道用于单分子测序应用，但在核酸扩增应用中不会产生高拷贝数。如本文所述，“层化”可以使用任何相容的聚合物或单体亚单元使用传统的交联方法来完成，使得可以顺序地构建包含两个或更多个高度交联的层的表面。合适的聚合物的示例包括但不限于链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、右旋糖苷、聚赖氨酸以及聚赖氨酸和peg的共聚物。在一些情况下，不同的层可以通过各种缀合反应相互交联，所述缀合反应包括但不限于生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-nhs酯反应、硫醇-马来酰亚胺反应、带正电的聚合物和带负电的聚合物之间的离子相互作用。在一些情况下，可以在溶液中构建高衔接子/引物密度的材料，然后通过多个步骤将其层化在表面上。
[0331]
示例性的peg多层包括在peg-胺-aptes上的peg(8臂、16臂、8臂)。对于在暴露于8um引物的peg-胺-aptes上的3层多臂peg(8臂、16臂、8臂)和(8臂、64臂、8臂)以及使用星形peg-胺代替16臂和64臂的3层多臂peg(8臂、8臂、8臂)观察到相似的浓度。还考虑了具有可比较的第一peg层、第二peg层和第三peg层的peg多层。
[0332]
在一些情况下，内部流动池装置表面上的结合位点的所得表面密度，例如，寡核苷酸衔接子/引物表面密度，可以在约100个引物分子/μm2至约1,000,000个引物分子/μm2的范围内。在一些情况下，结合位点的表面密度可以是至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少5,500、至少6,000、至少6,500、至少7,000、至少7,500、至少8,000、至少8,500、至少9,000、至少9,500、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，结合位点的表面密度可以是至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,
000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,500、至多9,000、至多8,500、至多8,000、至多7,500、至多7,000、至多6,500、至多6,000、至多5,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3,500、至多3,000、至多2,500、至多2,000、至多1,500、至多1,000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200、或至多100个分子/μm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，结合位点的表面密度可以在约10,000个分子至约100,000个分子/μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，结合位点的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，在一些情况下为约3,800个分子/μm2，在其他情况下为约455,000个分子/μm2。在一些情况下，如将在下面针对核酸测序应用进一步讨论的那样，最初与拴系到内流动池装置表面的衔接子或引物序列杂交的模板库核酸序列(例如样品dna分子)的表面密度可以小于或等于针对结合位点的表面密度所示的。在一些情况下，如还将在下面进一步讨论的，与内流动池装置表面上的衔接子或引物序列杂交的经克隆扩增的模板文库核酸序列的表面密度可以跨与拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度所指示的相同范围或不同范围。
[0333]
如上所列出，内流动池装置表面上结合位点的局部表面密度并不排除整个表面上的密度变化，因此表面可以包括结合位点密度为例如500,000/um2的区域，而且还包括具有基本上不同的局部表面密度的至少第二区域。
[0334]
在一些情况下，捕获探针例如，具有不同碱基序列和碱基修饰的寡核苷酸引物(或其他生物分子，例如酶或抗体)可以各种表面密度拴系在所得表面的一个或多个层上。在一些情况下，例如，可以改变表面官能团密度和用于偶联的捕获探针浓度两者，以针对某个捕获探针表面密度范围。此外，可以通过用其他带有用于偶联至表面的相同反应性官能团的“惰性”分子稀释捕获探针来控制捕获探针的表面密度。例如，经胺标记的寡核苷酸探针可以在与nhs酯涂覆的表面反应中用胺标记的聚乙二醇稀释，以降低最终引物密度。在寡核苷酸衔接子/引物的情况下，在杂交区域和表面附接官能团之间具有不同长度的接头的探针序列也可以用于改变表面密度。合适的接头的示例包括在引物的5’端的多聚胸苷酸(poly-t)链和多聚腺苷酸(poly-a)链(例如0至20个碱基)、peg接头(例如3至20个单体单元)和碳链(例如c6、c12，c18等)。为了测量或估计捕获探针表面密度，可以将荧光标记的捕获探针拴系在表面上，然后读取荧光读数，然后与包含已知浓度的荧光团的校准溶液相比。
[0335]
在一些情况下，可以例如通过测量水接触角来评估所公开的载体表面(例如，内流动池装置表面)的亲水性(或水溶液情况下的“润湿性”)程度，其中将小滴的水放置在表面上，并使用例如光学张力计测量其与表面的接触角。在一些情况下，可以确定静态接触角。在一些情况下，可以确定前进或后退接触角。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以在约0度至约50度的范围内。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以不超过50度、45度、40度、35度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在许多情况下，接触角不超过该范围内的任何数值，例如不超过40度。本领域技术人员将认识到，本公开内容的给定的亲水性、低结合性的载体表面可以表现出具有在该范围内的任何数值的水接触角，例如约27度。在一些情况下，所公开的低非特异性结合表面的水接触角小于45度。在一些情况下，所公开的低非
typhoon(ge healthcare lifesciences，pittsburgh,pa)仪器上对384孔板成像，其中pmt增益设置为800且分辨率为50-100μm。为了进行更高分辨率的成像，在olympus ix83显微镜(olympuscorp.，centervalley，pa)上收集图像，所述显微镜具有全内反射荧光(tirf)物镜(20倍，0.75na或100倍，1.5na，olympus)、scmos andor照相机(zyla4.2.二向色镜购自semrock(idex health&science,llc,rochester，纽约)，例如405、488、532或633nm二向色反射器/分束镜)，并选择带通滤波器作为532lp或645lp，其与适当的激发波长一致。本文公开的一些修饰的表面显示出小于0.25个分子/μm2的染料分子的非特异性结合。
[0338]
在一些情况下，本文公开的涂覆的流动池装置表面可以表现出荧光团例如cy3的特异性与非特异性结合的比率为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或本文范围内的任何中间值。
[0339]
在一些情况下，可使用诸如化学气相沉积(cvd)的技术将一个或多个表面修饰和/或聚合物层施加至内流动池装置表面。在一些情况下，可通过在用于预期用途之前使一种或多种合适的化学偶联剂或涂覆剂流过毛细管或流体通道，来将一种或多种表面修饰和/或聚合物层施加到内流动池装置表面。在一些情况下，可以将一种或多种涂覆剂添加到所使用的缓冲液中，例如核酸杂交、扩增反应和/或测序反应缓冲液中，以动态涂覆内流动池装置表面。
[0340]
在一些情况下，化学改性层可以均匀地施加在基质或载体结构的表面上。或者，基质或载体结构的表面可以不均匀地分布或图案化，使得化学改性层被限制在基质的一个或多个离散区域中。例如，可以使用光刻技术对基质表面进行图案化，以在表面上形成化学修饰区域的有序阵列或随机图案。可替选地或组合地，可以使用例如接触印刷和/或喷墨印刷技术对基质表面进行图案化。在一些情况下，化学修饰的离散区域的有序阵列或随机图案可包含至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400，500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多个离散区域，或本文范围内的任何中间数量的离散区域。
[0341]
在一些情况下，当核酸分子用cy3标记并且使用olympus ix83倒置荧光显微镜获取图像时，所公开的低非特异性结合表面(当用于例如核酸杂交或扩增应用中以产生杂交或克隆扩增的核酸分子的簇时(例如，已经用荧光团直接或间接标记的“离散区域”))的荧光图像显示出至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250的对比度噪声比(cnr)，所述olympus ix83倒置荧光显微镜配备有20倍0.75na物镜、532nm光源、针对532nm长通激发和cy3荧光发射滤光器进行了调整或优化的带通和二向色镜滤光镜组、semrock 532nm二向色反射镜和照相机(andor scmos，zyla 4.2)，其中调整激发光强度以避免信号饱和，并在获取图像时将表面浸入缓冲液(例如25mm aces，ph 7.4缓冲液)中。如本文所用，对比度噪声比(cnr)计算为：cnr＝(s
–
b)/噪声
[0342]
其中s＝前景信号(例如，是从样品载体表面上的经标记核酸克隆物或簇产生的图像中测得的荧光信号)，b＝背景信号(其中b＝b
间质
b
细胞内
)，b
间质
＝在经标记的核酸克隆物或簇之间的样品载体表面上的位置处测得的背景信号，b
细胞内
＝在核酸克隆物或簇的位置处测得的背景信号(例如，通过使样品载体表面与经标记的非互补寡核苷酸接触并测量所得的荧光来确定)并且噪声＝信号噪声。例如，测序表面的图像的对比度噪声比(cnr)为评估核
酸扩增特异性和载体上的非特异性结合提供了关键指标。虽然信噪比(snr)通常被认为是整体信号质量的基准，但可以表明，改善的cnr相对于snr作为要求快速图像捕获的成像应用(例如，必须将循环时间最小化的核酸测序应用)中信号质量的基准，具有明显的优势。
[0343]
在一些情况下，聚合物涂覆的样品载体结构，例如，包括所公开的亲水性聚合物涂层的内流动池装置表面，可以表现出对重复暴露于溶剂、温度变化、ph变化或长期储存的改善的稳定性。
[0344]
流体系统和流体流量控制模块：在一些实施方式中，所公开的成像和/或分析系统可以提供流体流量控制能力，以将样品或试剂输送到连接到系统一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)。试剂和缓冲液可以存储在瓶子、试剂和缓冲液盒或其他合适的容器中，这些容器通过管道和阀门歧管连接到流动池入口。所公开的系统还可以包括用于收集毛细管流动池装置或毛细管流动池盒下游流体的瓶子、盒或其他合适的容器形式的经处理的样品和废物储存器。在一些实施方案中，流体流量(或“流体学”)控制模块可以提供不同源之间的流量的可编程切换，所述不同源例如，位于仪器中的样品或试剂储存器或瓶子，以及中心区域(例如，毛细管流动池或微流体装置，或大流体腔室(例如微流体装置内的大流体腔室))的一个或多个入口。在一些情况下，流体流量控制模块可以提供来自中心区域(例如，毛细管流动池或微流体装置)的一个或多个出口与连接到系统的不同的收集点(例如，处理过的样品储存器、废物储存器等)之间的流量的可编程切换。在一些情况下，可以将样品、试剂和/或缓冲液储存在与流动池盒或微流体盒本身集成在一起的储存器中。在一些情况下，可以将处理过的样品、用过的试剂和/或使用过的缓冲液储存在与流动池盒或微流体装置盒本身集成在一起的储存器中。
[0345]
在一些实施方式中，一个或多个流体流量控制模块可以被配置为控制流体到一个或多个毛细管流动池、毛细管流动池盒、微流体装置、微流体盒或其任何组合的输送。在一些情况下，一种或多种流体学控制器可以被配置为控制一种或多种流体或试剂的体积流速、一种或多种流体或试剂的线性流速、一种或多种流体或试剂的混合比或其任何组合。通过所公开的系统的流体流量的控制通常将使用泵(或其他流体致动机构)和阀(例如，可编程泵和阀)来执行。合适的泵的示例包括但不限于注射泵、可编程注射泵、蠕动泵、隔膜泵等。合适的阀的示例包括但不限于止回阀、机电两通或三通阀、气动两通和三通阀等。在一些情况下，可通过对试剂和缓冲液容器的一个或多个入口或并入流动池盒(例如，毛细管流动池或微流体盒)的一个或多个入口施加正气压来控制通过系统的流体流量。在一些实施方案中，可通过在废物储存器的一个或多个出口处或并入流动池盒(例如，毛细管流动池或微流体盒)中的一个或多个出口处抽真空来控制通过系统的流体流量。
[0346]
在一些情况下，在测定或分析程序中的不同点使用不同的流体流量控制模式，例如正向流动(相对于给定毛细管流动池装置的入口和出口)、反向流动、振荡或脉动流动或其组合。在一些应用中，例如，在分析洗涤/漂洗步骤期间，可以采用振荡或脉动流动，以促进一个或多个流动池装置或流动池盒(例如，毛细管流动池装置或盒和微流体装置或盒)内流体的完全或有效交换。
[0347]
类似地，在一些情况下，可以在流动池装置内的不同位置或测定或分析过程工作流程中的不同点使用不同的流体流速，例如，在一些情况下，体积流速可以从-100ml/s至 100ml/s变化。在一些实施方式中，体积流速的绝对值可以为至少0.001ml/秒、至少0.01ml/
秒、至少0.1ml/秒、至少1ml/秒、至少10ml/秒或至少100ml/秒。在一些实施方式中，体积流速的绝对值可以是至多100ml/秒、至多10ml/秒、至多1ml/秒、至多0.1ml/秒、至多0.01ml/秒或至多0.001ml/秒。流动池装置在给定位置或给定时间点的体积流速可以具有此范围内的任何值，例如正向流速为2.5ml/s，反向流速为-0.05ml/s，或值为0ml/s(即，停止流动)。
[0348]
在一些实施方式中，流体系统可以被设计成最小化执行例如，基因组分析应用所需的关键试剂(例如，昂贵的试剂)的消耗。例如，在一些实施方式中，所公开的流体系统可以包括容纳第一试剂或溶液的第一储存器、容纳第二试剂或溶液的第二储存器以及中心区域(例如，中心毛细管流动池或微流体装置)，其中第一储存器的出口和第二储存器的出口通过至少一个阀流体联接到中心毛细管流动池或微流体装置的入口，使得从第一储存器的出口到中心毛细管流动池或微流体装置的入口每单位时间流动的第一试剂或溶液的体积小于从第二储存器的出口到中心区域的入口每单位时间流动的第二试剂或溶液的体积。在一些实施方式中，第一储存器和第二储存器可以被集成到毛细管流动池盒或微流体盒中。在一些情况下，至少一个阀也可以集成到毛细管流动池盒或微流体盒中。
[0349]
在一些情况下，第一储存器通过第一阀流体联接至中心毛细管流动池或微流体装置，第二储存器通过第二阀流体联接至中心毛细管流动池或微流体装置。在一些情况下，第一和/或第二阀可以是例如隔膜阀、夹管阀、闸阀或其他合适的阀。在一些情况下，第一储存器被定位成紧邻中心毛细管流动池或微流体装置的入口，以减少用于输送第一试剂溶液的死体积。在一些情况下，第一储存器比第二储存器放置更靠近中心毛细管流动池或微流体装置的入口。在一些情况下，第一储存器被定位为紧靠第二阀，以便相对于用于从多个“第二”储存器(例如，两个，三个，四个、五个、或六个或更多个“第二”储存器)输送多种“第二”试剂(例如，两种、三种、四种、五种或六种或更多种“第二”试剂)的死体积，减小用于输送第一试剂的死体积。
[0350]
上述的第一储存器和第二储存器可以用于容纳相同或不同的试剂或溶液。在一些情况下，容纳在第一储存器中的第一试剂不同于容纳在第二储存器中的第二试剂，并且第二试剂包括至少一种试剂，其被在中心毛细管流动池或微流体装置中发生的多个反应共同使用。在一些情况下，例如，在被配置用于在中心毛细管流动池或微流体装置内执行核酸测序化学的流体系统中，第一试剂包括选自由以下组成的组中的至少一种试剂：聚合酶、核苷酸和核苷酸类似物。在一些情况下，第二试剂包括低成本试剂，例如溶剂。
[0351]
在一些情况下，可以基于要执行的特定应用(例如，核酸测序)来调节中心区域(例如，中心毛细管流动池盒或包括一个或多个流体通道或流体腔室的微流体装置)的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适合于测序真核基因组的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适合于测序原核基因组的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适合于测序病毒基因组的内部体积。在一些实施方案中，中心区域包括适合于测序转录组的内部体积。例如，在一些实施方案中，中心区域的内部体积可包括小于0.05μl、在0.05μl至0.1μl之间、在0.05μl至0.2μl之间、在0.05μl至0.5μl之间、在0.05μl至0.8μl之间、在0.05μl至1μl之间、在0.05μl至1.2μl之间、在0.05μl至1.5μl之间、在0.1μl至1.5μl之间、在0.2μl至1.5μl之间，在0.5μl至1.5μl之间、在0.8μl至1.5μl之间、在1μl至1.5μl之间、在1.2μl至1.5μl之间或大于1.5μl或上述任意两个定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于0.5μl、在0.5μ1至1μl之间、在0.5μl至2μl之间、在0.5μl至5μl之间、
在0.5μl至8μl之间、在0.5μl至10μl之间、在0.5μl至10μl之间、在0.5μl至12μl之间、在0.5μl至15μl之间、在1μl至15μl之间、在2μl至15μl之间、在5μl至15μl之间、在8μl至15μl之间、在10μl至15μl之间、在12μl至15μl之间或大于15μl或由前述任意两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于5μl、在5μl至10μl之间、在5μl至20μl之间、在5μl至500μl之间、在5μl至80μl之间、在5μl至100μl之间、在5μl至120μl之间、在5μl至150μl之间、在10μl至150μl之间、在20μl至150μl之间、在50μl至150μl之间、在80μl至150μl之间、在100μl至150μl之间、在120μl至150μl之间或大于150μl或由前述任意两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于50μl、在50μl至100μl之间、在50μl至200μl之间、在50μl至500μl之间、在50μl至800μl之间、在50μl至1000μl之间、在50μl至1200μl之间、在50μl至1500μl之间、在100μl至1500μl之间、在200μl至1500μl之间、在500μl至1500μl之间、在800μl至1500μl之间、在1000μl至1500μl之间、在1200μl至1500μl之间或大于1500μl或由前述任意两个定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于500μl、在500μl至1000μl之间、在500μl至2000μl之间、在500μl至5ml之间、在500μl至8ml之间、在500μl至10ml、在500μl至12ml之间、在500μl至15ml之间、在1ml至15ml之间、在2ml至15ml之间、在5ml至15ml之间、在8ml至15ml之间、在10ml至15ml之间、在12ml至15ml之间或大于15ml或上述任意两个所定义的范围的体积。在一些实施方式中，中心区域的内部体积可包括小于5ml、在5ml至10ml之间、在5ml至20ml之间、在5ml至50ml之间、在5ml至80ml之间、在5ml至100ml之间、在5ml至120ml之间、在5ml至150ml之间、在10ml至150ml之间、在20ml至150ml之间、在50ml至150ml之间、在80ml至150ml之间、在100ml之间150ml、在120ml至150ml之间或大于150ml，或由前述任意两个所定义的范围的体积。在一些实施方案中，本文描述的系统包括流动池装置或系统的阵列或集合，其包括多个离散的毛细管、微流体通道、流体通道、腔室或内腔区域，其中组合的内部体积为，包含或包括本文公开范围内的一个或多个值。
[0352]
在一些情况下，用于将第一试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速与用于将第二试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速的比可以小于1:20、小于1:16、小于1:12、小于1:10、小于1:8、小于1:6或小于1:2。在一些情况下，用于将第一试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速与用于将第二试剂输送到中心毛细管流动池或微流体装置的体积流速的比可以具有在这些值跨越的范围内的任何值，例如小于1:15。
[0353]
如所指出的，与通过例如其他测序装置和系统，特别是在各种测序化学步骤中对于各种使用的昂贵试剂所实现的相比，本文公开的流动池装置和/或流体系统可以被配置为实现对试剂的更有效使用。在一些情况下，第一试剂包括比第二试剂更昂贵的试剂。在一些情况下，第一试剂包括反应特异性试剂，第二试剂包括对在中心毛细管流动池或微流体装置区域中进行的所有反应共用的非特异性试剂，并且其中反应特异性试剂比非特异性试剂更昂贵。
[0354]
在一些情况下，利用本文所公开的流动池装置和/或流体系统可以在减少昂贵试剂的消耗方面传达优势。在一些情况下，与操作例如当前的市售核酸测序系统时遇到的试剂消耗相比，例如，利用本文公开的流动池装置和/或流体系统可导致试剂消耗减少至少5％、至少7.5％、至少10％、至少12.5％、至少15％、至少17.5％、至少20％、至少22.5％、至
少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。
[0355]
图31示出了简单的流体系统的非限制性示例，其包括连接到各种流体流量控制组件的单个毛细管流动池，其中该单个毛细管是光可进入的并且在各种成像应用中与安装在显微镜载物台或定制成像仪器中兼容。多个试剂储存器与单个毛细管流动池装置的入口端流体联接，其中在任何给定时间点流经毛细管的试剂均通过可编程的旋转阀进行控制，该可编程的旋转阀允许用户控制试剂流动的定时和持续时间。在该非限制性示例中，借助于可编程的注射泵来控制流体流量，该可编程注射泵提供对体积流体流量和流体流速的精确控制和定时。
[0356]
图32示出了流体系统的非限制性示例，其包括具有集成的隔膜阀(用于减小或最小化死体积并保存某些关键试剂)的毛细管流动池盒。微型隔膜阀集成到盒中，允许将阀紧靠毛细管的入口定位，从而减少或最小化装置内的死体积，并减少昂贵试剂的消耗。阀和其他流体控制组件在毛细管流动池盒中的集成还允许将更大的流体流量控制功能整合到盒设计中。
[0357]
图33图示了与显微镜装置组合使用的基于毛细管流动池盒的流体系统的非限制性示例，其中该盒与诸如金属板的温度控制组件结合或配对，该温度控制组件与盒内的毛细管接触并用作热源/散热器。显微镜装置由照明系统(例如，包括激光、led或卤素灯等作为光源)、物镜、成像系统(例如，cmos或ccd照相机)和平移台(用于相对于光学系统移动盒)组成，这使得例如随着台移动获取毛细管流动池的不同区域的荧光和/或明场图像。
[0358]
温度控制模块：在一些实施方式中，所公开的系统将包括温度控制功能，以促进测定或分析结果的准确性和可重复性。可以并入仪器系统(或毛细管流动池盒)设计中的温度控制组件的示例包括但不限于电阻加热元件、红外光源、珀耳帖加热或冷却装置、散热器、热敏电阻、热电偶等等。在一些情况下，温度控制模块(或“温度控制器”)可以在执行特定的测定或分析步骤之前的指定的可调时间提供可编程的温度变化。在一些情况下，温度控制器可以在指定的时间间隔内提供可编程的温度变化。在一些实施方式中，温度控制器可以进一步提供具有指定频率和斜率的两个或更多个设定温度之间的温度循环，从而可以执行用于扩增反应的热循环。
[0359]
图34示出了通过使用放置成与流动池盒接触的金属板来控制流动池(例如，毛细管流动池或基于微流体装置的流动池)的温度的一个非限制性示例。在一些情况下，金属板可以与盒底座集成在一起。在一些情况下，可以使用珀耳帖或电阻加热器对金属板进行温度控制。
[0360]
图35图示了一个包括非接触式热控制机构的用于流动池(例如，毛细管或微流体通道流动池)的温度控制的非限制性方法。在这种方法中，使用空气温度控制系统将温度受控的空气流引导通过流动池盒(例如，朝向单个毛细管流动池装置或微流体通道流动池装置)。空气温度控制系统包括热交换器(例如电阻加热器线圈)、附接到珀耳帖装置的散热片等，其能够加热和/或冷却空气并将其保持在用户指定的恒定温度下。空气温度控制系统还包括空气输送装置，例如风扇，该空气输送装置将加热或冷却的空气流引导至毛细管流动池盒。在一些情况下，可以将空气温度控制系统设置为恒定温度t1，以使气流以及因此流动池或盒(例如，毛细管流动池或微流体通道流动池)保持在恒定温度t2，取决于环境温度、空气流速等，在一些情况下t2可能会与设定温度t1有所不同。在一些情况下，可以在毛细管流
动池装置或流动池盒周围安装两个或更多个此类空气温度控制系统，以便通过控制在给定的时间下激活哪个空气温度控制系统来使得毛细管或盒可以在多个不同温度之间快速循环。在另一种方法中，可以改变空气温度控制系统的温度设置，从而可以相应地改变毛细管流动池或盒的温度。
[0361]
流体分配机器人：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括自动化的可编程的流体分配(或液体分配)系统，用于将试剂或其他溶液分配到例如微板、毛细管流动池装置和盒、微流体装置和盒等中。合适的自动化的可编程的流体分配系统可从许多供应商，例如beckman coulter、perkin elmer、tecan、velocity 11和许多其他供应商购得。在所公开的系统的优选方面，流体分配系统还包括多通道分配头，例如4通道、8通道、16通道、96通道或384通道分配头，用于同时将可编程体积的液体(例如，范围为约1微升至几毫升)输送到流动池盒或微流体盒上的多个孔或位置。
[0362]
盒和/或微孔板处理(拾放)机器人：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括盒和/或微孔板处理机器人系统，用于相对于光学成像系统自动更换和定位微板、毛细管流动池盒或微流体装置盒，或者用于任选地在光学成像系统和流体分配系统之间移动微板、毛细管流动池盒或微流体装置盒。合适的自动化的可编程微孔板处理机器人系统可从许多供应商处购得，包括beckman coulter、perkin elmer、tecan、velocity 11和许多其他供应商。在所公开的系统的优选方面，自动化的微板处理机器人系统被配置为将包含样品和/或试剂的微孔板的集合移入和移出例如冷藏储存单元。
[0363]
光谱或成像模块：如上所述，在一些实施方式中，所公开的分析系统将包括光学成像能力，并且还可以包括其他光谱测量能力。例如，所公开的成像模块可以被配置为以本领域技术人员已知的多种成像模式中的任何一种进行操作，包括但不限于，明场、暗场、荧光、发光或磷光成像。在一些情况下，流体子系统的一个或多个毛细管流动池或微流体装置包括窗口，其允许每个流动池或微流体装置中的一个或多个毛细管或一个或多个流体通道的至少一部分被照射并成像。
[0364]
在一些实施方式中，可以执行单波长激发和发射荧光成像。在一些实施方式中，可以执行双波长激发和发射(或多波长激发或发射)荧光成像。在一些情况下，成像模块被配置为获取视频图像。成像模式的选择可以影响流动池装置或盒的设计，因为所有或部分毛细管或盒在所关注的光谱范围内都必须是光学透明的。在一些情况下，毛细管流动池盒中的多个毛细管可在单个图像内以其整体成像。在一些情况下，毛细管流动池盒内的仅单个毛细管或毛细管子集或其部分可在单个图像内成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建盒内的一个、两个、几个或全部多个毛细管的单个高分辨率图像。在一些情况下，微流体芯片内的多个流体通道可在单个图像内以其整体成像。在一些情况下，微流体芯片内的仅单个流体通道或流体通道的子集或其部分可以在单个图像内成像。在一些情况下，一系列图像可以被“平铺”以创建盒内一个、两个、几个或全部多个流体通道的单个高分辨率图像。
[0365]
光谱学或成像模块可以包括例如配备有ccd照相机的cmos的显微镜。在一些情况下，光谱学或成像模块可以包括例如被配置为执行所关注的特定光谱学或成像技术的定制仪器，例如一种本文所述的成像模块。通常，与光谱或成像模块关联的硬件可以包括光源、检测器和其他光学组件，以及处理器或计算机。
[0366]
光源：可以使用多种光源中的任何一种来提供成像或激发光，包括但不限于钨丝灯、钨卤素灯、弧光灯、激光器、发光二极管(led)或激光二极管。在一些情况下，一个或多个光源与其他光学组件(例如透镜、滤光器、光阑、光圈、反射镜等)的组合可被配置为照明系统(或子系统)。
[0367]
检测器：各种图像传感器均可以用于成像目的，包括但不限于光电二极管阵列、电荷耦合装置(ccd)照相机或互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器。如本文所使用的，“图像传感器”可以是一维(线性)或二维阵列传感器。在许多情况下，一个或多个图像传感器与其他光学组件(例如透镜、滤光器、光阑、光圈、反射镜等)的组合可被配置为成像系统(或子系统)。在一些情况下，例如，在由系统而不是成像执行光谱学测量的情况下，合适的检测器可以包括但不限于光电二极管、雪崩光电二极管和光电倍增管。
[0368]
其他光学组件：光谱学测量或成像模块的硬件组件可能还包括用于操控、整形、过滤或聚焦通过系统的光束的各种光学组件。合适的光学组件的示例包括但不限于透镜、反射镜、棱镜、光阑、衍射光栅、有色玻璃滤波器、长通滤波器、短通滤波器、带通滤波器、窄带干涉滤波器、宽带干涉滤波器、二向色性反射器、光纤、光波导等。在一些情况下，如上文所述，光谱学测量或成像模块还可以包括一个或多个平移台或其他运动控制机构，以相对于照明和/或检测/成像子系统移动毛细管流动池装置和盒，或者反之亦然。
[0369]
全内反射：在一些情况下，可以将光学模块或子系统设计为将流动池装置和盒中的毛细管或微流体通道的全部或部分的光学透明壁用作波导，以通过全内反射将激发光传输至毛细管或通道内腔。当入射的激发光以相对于表面法线的大于临界角(由毛细管或通道壁材料以及毛细管或通道内的水性缓冲液的相对折射率确定)的角度入射到毛细管或通道内腔的表面时，全内反射发生在表面，并且光沿着毛细管或通道的长度传播通过毛细管或通道壁。全内反射在管腔表面产生隐失波，该隐失波穿透管腔内部非常短的距离，并且可以用于选择性激发表面的荧光团，例如通过固相引物延伸反应已被聚合酶掺入到正在生长的寡核苷酸中的经标记的核苷酸。
[0370]
不透光外壳和/或环境控制腔室：在一些实施方式中，所公开的系统可以包括不透光的外壳，以防止杂散的环境光产生强光并遮蔽例如相对微弱的荧光信号。在一些实施方式中，所公开的系统可以包括环境控制腔室，其能够使系统在严格控制的温度、湿度水平等下运行。
[0371]
处理器和计算机：在一些情况下，所公开的系统可以包括一个或多个处理器或计算机。处理器可以是硬件处理器，例如中心处理单元(cpu)、图形处理单元(gpu)、通用处理单元或计算平台。处理器可以由各种合适的集成电路、微处理器、逻辑装置、现场可编程门阵列(fpga)等中的任何一个组成。在一些情况下，处理器可以是单核或多核处理器，或者可以将多个处理器配置为并行处理。尽管参考处理器描述了本公开内容，但是也可以应用其他类型的集成电路和逻辑装置。处理器可以具有任何合适的数据操作能力。例如，处理器可以执行512位、256位、128位、64位、32位或16位数据操作。
[0372]
处理器或cpu可以执行一系列机器可读指令，其可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置中。指令可以针对cpu，其随后可以对cpu进行编程或以其他方式配置cpu以实现例如本公开内容的系统控制方法。cpu执行的操作的示例可以包括获取、解码、执行和回写。
[0373]
一些处理器可以包括计算机系统的处理单元。该计算机系统可以实现基于云的数据存储和/或计算。在一些情况下，计算机系统可以借助于通信接口可操作地耦合到计算机网络(“网络”)。该网络可以是互联网、内联网和/或外联网，与互联网通信的内联网和/或外联网或局域网(lan)。在一些情况下，该网络是电信和/或数据网络。该网络可以包括一个或多个计算机服务器，其可以启用分布式计算，例如基于云的计算。
[0374]
计算机系统还可包括计算机存储器或存储器位置(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口(例如，网络适配器)，以及外围装置(例如缓存，其他存储单元，数据存储单元和/或电子显示适配器)。在一些情况下，通信接口可以允许计算机与一个或多个附加装置进行通信。该计算机可能够从耦合的装置接收输入数据以进行分析。存储器单元、存储单元、通信接口和外围装置可以通过例如可并入主板中的通信总线(实线)与处理器或cpu进行通信。存储器或存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。存储器或存储单元可以存储文件，例如驱动程序、库和保存的程序。存储器或存储单元可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。
[0375]
本文所述的系统控制、图像处理和/或数据分析方法可以通过存储在计算机系统的电子存储位置(例如，存储器或电子存储单元)中的机器可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器执行。在一些情况下，可以从存储单元检索代码并将其存储在存储器中，以供处理器随时访问。在一些情况下，可以去掉电子存储单元，将机器可执行指令存储在存储器中。
[0376]
在一些情况下，代码可以被经预编译并配置为与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用。在一些情况下，可以在运行时期间编译代码。可以以编程语言提供代码，可以选择该编程语言以使该代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。
[0377]
本文提供的系统和方法的一些方面可以用软件来体现。可以将该技术的各个方面视为通常以一定类型的机器可读介质上携带或体现的机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，例如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，例如可随时提供用于软件编程的非暂时性存储的各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等。软件的全部或部分有时可以通过互联网或其他各种电信网络进行通信。这样的通信例如可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括诸如跨本地装置之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路而使用的光波、电波和电磁波。携载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用，除非限制于非暂时性、有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
[0378]
在一些情况下，本公开的系统控制、图像处理和/或数据分析方法可以通过一种或多种算法来实现。可以在中心处理单元执行时通过软件来实现算法。
[0379]
系统控制软件：在一些情况下，系统可以包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括代码，所述代码用于提供用户界面以及对所有系统功能的手动、
半自动或全自动控制(例如，控制流体流量控制模块、温度控制模块和/或光谱学或成像模块)，以及其他数据分析和显示选项。系统计算机或处理器可以是系统的集成组件(例如，嵌入仪器中的微处理器或主板)，也可以是独立模块，例如大型计算机、个人计算机或便携式计算机。由系统控制软件提供的流体流量控制功能的示例包括但不限于体积流体流量、流体流速、样品和试剂添加的时机和持续时间、缓冲液添加和冲洗步骤。系统控制软件提供的温度控制功能的示例包括但不限于指定温度设定点以及控制温度变化的时机、持续时间和升温速率。系统控制软件提供的光谱学测量或成像控制功能的示例包括但不限于自动聚焦能力、照明或激发光曝光时间和强度的控制、图像采集速率、曝光时间的控制以及数据存储选项。
[0380]
图像处理软件：在一些情况下，系统还可以包括计算机(或处理器)和计算机可读介质，该计算机可读介质包括用于提供图像处理和分析能力的代码。可由软件提供的图像处理和分析能力的示例包括但不限于手动、半自动或全自动图像曝光调整(例如，白平衡、对比度调整、信号平均和其他降噪能力等)、自动边缘检测和对象识别(例如，用于识别毛细管流动池装置内腔表面上经荧光标记的寡核苷酸的克隆扩增簇)、自动化统计分析(例如，用于确定每单位面积的毛细管内腔表面识别的克隆扩增的寡核苷酸簇的数量，或用于核酸测序应用中的自动核苷酸碱基检出)以及手动测量能力(例如，用于测量簇或其他对象之间的距离等)。任选地，仪器控制和图像处理/分析软件可以编写为单独的软件模块。在一些实施方式中，仪器控制和图像处理/分析软件可以被结合到集成包装中。
[0381]
本领域技术人员已知的多种图像处理方法中的任何一种都可以用于图像处理/预处理。示例包括但不限于canny边缘检测方法、canny-deriche边缘检测方法、一阶梯度边缘检测方法(例如，sobel运算子)、二阶差分边缘检测方法、相位一致性(相位相干性)边缘检测方法、其他图像分割算法(例如，强度阈值化、强度聚类方法、基于强度直方图的方法等)、特征和模式识别算法(例如用于检测任意形状的广义霍夫变换、圆形霍夫变换，等)和数学分析算法(例如傅里叶变换、快速傅里叶变换、小波分析、自相关法等)或其任意组合。
[0382]
核酸测序系统和应用：核酸测序提供了所公开的流动池装置(例如，毛细管流动池装置或盒以及微流体装置和盒)和成像系统的应用的一个非限制性示例。许多“第二代”和“第三代”测序技术利用大规模并行的循环阵列方法来进行通过核苷酸掺入测序，其中，拴系在固体载体上的单链模板寡核苷酸序列的准确解码取决于成功分类的信号，所述信号是由于聚合酶将a、g、c和t核苷酸逐步添加到互补寡核苷酸链而产生。这些方法通常需要用固定长度的已知衔接子序列修饰寡核苷酸模板，通过与跟衔接子序列互补的已知序列的表面拴系捕获探针(在本文中也称为拴系至内流动池表面的“衔接子”或“引物”)杂交，以随机或有图案的阵列固定在固相载体(例如，所公开的毛细管流动池装置或微流体芯片的一个或多个内腔表面)上，然后通过一系列循环的单碱基添加引物延伸反应(使用例如经荧光标记的核苷酸)进行探测，来鉴定模板寡核苷酸中的碱基序列。因此，这些过程需要使用小型化的流体系统，其可提供对将试剂引入进行测序反应的流动池的时机的精确、可重现的控制，以及提供小体积以减少或最小化昂贵试剂的消耗。
[0383]
现有的商业上可用的ngs流动池由已经通过其他方法蚀刻、研磨和/或处理的玻璃层构成，以满足成像、冷却和/或其他要求所需的严格的尺寸公差。当流动池用作消耗品时，其制造所需的昂贵制造工艺导致每次测序运行的成本过高，而无法使研究和临床领域的科
学家和医学专业人员常规地进行测序。
[0384]
本公开提供了低成本流动池架构的示例，其包括低成本的玻璃或聚合物毛细管或微流体通道、流体适配器和盒底座。使用以其最终横截面几何形状挤出的玻璃或聚合物毛细管可以消除对多个高精度且昂贵的玻璃制造工艺的需求。牢固地限制毛细管或微流体通道的取向，并使用模制塑料和/或弹性体组件提供方便的流体连接，进一步降低了成本。激光结合聚合物盒底座的组件提供了一种快速有效的密封毛细管或微流体通道并在结构上稳定毛细管或通道以及流动池盒的方法，而无需使用紧固件或结合剂。
[0385]
所公开的装置和系统可以被配置为使用多种“通过核苷酸掺入测序”，“通过核苷酸结合测序”，“通过核苷酸碱基配对测序”和“通过亲和力测序”测序生物化学中的任何一种来执行核苷酸测序。本文公开的流动池装置设计的改进(例如，包括亲水涂覆的表面，该亲水涂覆的表面使例如布置在其上的经荧光标记核酸簇的前景信号最大化，同时使背景信号最小化)与用于通过改进的物镜和/或套筒透镜设计(提供更大的景深和更大的视场)实现的快速双表面流动池成像(包括对内流动池表面的同时或近乎同时成像)的光学成像系统设计的改进相结合，可以引起改善用于碱基识别目的的图像的cnr，并且减少试剂消耗(通过改进的流动池设计实现)可引起显著提高碱基识别准确度、缩短成像周期时间、缩短总体测序反应周期时间以及在对于每个碱基降低的成本下提高通量核酸测序。
[0386]
本文公开的系统可以被配置为使用多种不同的测序化学来实施多种不同的测序方法中的任何一种。例如，图40提供了用于实现通过亲和力测序的方法的流程图的非限制性示例。聚合物-核苷酸缀合物可用于形成多价结合复合物，其中多个引物化的靶核酸序列被拴系在载体表面上，例如流动池的一个或多个内表面，使得多价结合复合物表现出的持久时间比单个核苷酸和单个引物化的靶核酸序列之间的结合相互作用所提供的持久时间显著更长。通常，这种通过亲和力测序的方法将包含以下一个或多个步骤：靶核酸序列与拴系在载体表面上的衔接子/引物序列的杂交；克隆扩增以在载体表面上产生扩增的靶序列簇；使载体表面与包含与聚合物核缀合的多个核苷酸部分的聚合物-核苷酸缀合物接触，其中所述聚合物-核苷酸缀合物还可以包含一个或多个可检测标记，例如荧光团，以产生稳定的多价结合复合物；洗去任何多余的未结合的聚合物-核苷酸缀合物；例如，通过载体表面的荧光成像检测多价结合复合物；鉴定靶核酸序列中的核苷酸(碱基识别)；例如，通过改变缓冲液的离子强度、离子组成和/或ph来破坏多价结合复合物的稳定性；冲洗流动池；并进行引物延伸反应以添加包含所鉴定的核苷酸的互补碱基的核苷酸。可以重复该循环以鉴定序列中的其他核苷酸碱基，然后处理和组装序列数据。在一些情况下，数据处理可以包括在执行测序运行时实时地或作为运行后数据处理步骤的一部分计算测序性能指标，例如q得分。
[0387]
在一些情况下，与本文公开的光学成像系统组合使用的所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置可为核酸测序系统带来以下一项或多项另外优势：(i)减少了流体洗涤时间(由于减少了非特异性结合，因此测序周期时间更快)、(ii)减少成像时间(因此测定读数和测序周期的周转时间更快)、(iii)减少了总体工作流程时间要求(由于减少了周期时间)、(iv)降低了检测仪器成本(由于cnr的改进)、(v)提高了读数(碱基检出)的准确性(由于cnr的改进)、(vi)提高了试剂的稳定性并降低了试剂的使用要求(从而降低了试剂成本)，以及(vii)由于核酸扩增失败而导致的运行失败更少。
[0388]
本文公开的用于执行核酸测序的方法、装置和系统适用于各种测序应用，并且适用于对源自各种样品和来源中的任何一种的核酸分子进行测序。在一些情况下，可以从各种生物样品中提取核酸，例如，血液样品、唾液样品、尿液样品、细胞样品、组织样品等。例如，所公开的装置和系统可以用于分析源自本领域技术人员已知的各种不同细胞、组织或样品类型中的任一种的核酸分子。例如，可以从源自真核生物(例如动物、植物、真菌、原生生物)、古细菌或真细菌的细胞或包含一种或多种类型细胞的组织样品中提取核酸。在一些情况下，可以从原核或真核细胞，例如贴壁或非贴壁真核细胞中提取核酸。从各种各样地例如原代或永生的啮齿动物、猪、猫、犬、牛、马、灵长类或人细胞系中提取核酸。可以从各种不同的细胞、器官或组织类型(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子或来自心脏、肺、大脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠或小肠的细胞)中提取核酸。可以从正常或健康细胞中提取核酸。可替选地或组合地，从患病细胞(例如癌细胞)或感染宿主的致病细胞中提取酸。某些核酸可以从细胞类型的不同子集中提取，所述细胞类型例如免疫细胞(例如t细胞、细胞毒性(杀伤性)t细胞、辅助性t细胞、αβt细胞、γδt细胞、t细胞祖细胞、b细胞、b细胞祖细胞、淋巴干细胞、骨髓祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、浆细胞、记忆细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞或任何它们的组合)、未分化的人类干细胞、已被诱导分化的人类干细胞、稀有细胞(例如循环肿瘤细胞(ctc)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞或滋养细胞)。可预期其他细胞并且与本文的公开内容一致。
[0389]
核酸可以任选地例如通过共价键合或非共价键以核酸的5’或3’端连接到一个或多个非核苷酸部分，例如标记和其他小分子、大分子(例如蛋白质、脂质、糖等)和固体或半固体载体。标记包括使用本领域技术人员已知的各种检测方法中的任何一种可检测的任何部分，并因此使得所连接的寡核苷酸或核酸具有相似的可检测性。一些标记，例如荧光团，会发出可光学检测或可见的电磁辐射。可替选地或组合地，一些标记包括使经标记的寡核苷酸或核酸在质谱数据中可见的质量标签，或使经标记的寡核苷酸或核酸可通过安培法或伏安法检测的氧化还原标签。一些标记包括有助于经标记的寡核苷酸或核酸的分离和/或纯化的磁性标签。核苷酸或多核苷酸通常不连接在标记上，并且直接检测寡核苷酸或核酸的存在。
[0390]
被配置用于测序的流动池装置：在一些情况下，根据本公开的一个或多个流动池装置可以被配置用于核酸测序应用，例如，其中两个或更多个内流动池装置表面包含亲水性聚合物涂层，其还包含一种或多种捕获寡核苷酸，例如本文公开的衔接子/引物寡核苷酸或任何其他寡核苷酸。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可以包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于测序真核生物基因组。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可以包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于测序原核生物基因组或其部分。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于测序病毒基因组或其部分。在一些情况下，所公开的流动池装置的经亲水性聚合物涂覆的表面可包含多个拴系在其上的寡核苷酸，所述寡核苷酸已经被选择用于测序转录组。
[0391]
在一些情况下，本公开的流动池装置可包括以大体上面向流动通道的内部的取向的第一表面、以大体上面向流动通道的内部并且还大体上面向或平行于第一表面的取向的第二表面、大体上面向第二流动通道的内部的第三表面和大体上面向第二流动通道的内部并且与第三表面相对或平行的第四表面；其中所述第二表面和第三表面可以位于大体上平坦的基质(其可以是反射、透明或半透明基质)的相对侧或附接到其上。在一些情况下，流动池内的一个或多个成像表面可以位于流动池的中心内，或者位于流动池的两个子单元或子分区之间的分区内或作为其一部分，其中，所述流动池可以包括顶表面和底表面，其中之一或两者可以对于可以使用的检测模式可以是透明的；并且其中可以将包含拴系到一个或多个聚合物涂层的寡核苷酸衔接子/引物的表面放置或插入流动池的内腔内。在一些情况下，顶表面和/或底表面不包括附接的寡核苷酸衔接子/引物。在一些情况下，顶表面和/或底表面确实包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。在一些情况下，顶表面或所述底表面可包含附接的寡核苷酸衔接子/引物。放置或插入流动池内腔内的一个或多个表面可以位于或附接到大体上平坦的基质(其可以是反射、透明或半透明基质)的一侧、相对侧或两侧。
[0392]
通常，流动池装置表面上的一层或多层低非特异性结合涂层中的至少一层可包含用于共价或非共价附接寡核苷酸分子的官能团，例如衔接子或引物序列，或至少一层在其沉积在载体表面上时可能已经包含共价或非共价附接的寡核苷酸衔接子或引物序列。在一些情况下，拴系到至少一个第三层的聚合物分子的寡核苷酸可以在整个层中以多个深度分布。
[0393]
在一些情况下，即在将聚合物偶联或沉积在表面上之前，将寡核苷酸衔接子或引物分子与聚合物在溶液中共价偶联。在一些情况下，在寡核苷酸衔接子或引物分子已经偶联或沉积在表面上之后，其被共价偶联至聚合物。在一些情况下，至少一个亲水性聚合物层包含多个共价附接的寡核苷酸衔接子或引物分子。在一些情况下，至少两层、至少三层、至少四层或至少五层亲水聚合物包含多个共价连附的衔接子或引物分子。
[0394]
在一些情况下，可使用本领域技术人员已知的各种合适的缀合化学中的任一种将寡核苷酸衔接子或引物分子偶联至一层或多层亲水聚合物。例如，寡核苷酸衔接子或引物序列可包含与胺基、羧基、硫醇基等反应的部分。可以使用的合适的胺反应性缀合化学反应的示例包括但不限于涉及异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰基叠氮化物基团、nhs酯基、磺酰氯基、醛基、乙二醛基、环氧化物基团、环氧乙烷基、碳酸酯基、芳基卤化物基团、酰亚胺酯基、碳二亚胺基、酸酐基和氟苯基酯基的反应。合适的羧基反应性缀合化学反应的示例包括但不限于涉及碳二亚胺化合物的反应，例如水溶性edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺hcl)。合适的巯基反应性缀合化学反应的示例包括马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。
[0395]
可以将一种或多种类型的寡核苷酸分子附接或拴系在载体表面上。在一些情况下，一种或多种类型的寡核苷酸衔接子或引物可包含间隔子序列、用于与衔接子连接的模板文库核酸序列杂交的衔接子序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物和/或分子条形码化序列或其任何组合。在一些情况下，可以将1个引物或衔接子序列栓系至表面的至少一层。在一些情况下，可以将至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个不同的引物或衔接子序列拴系在表面的至少一层上。
[0396]
在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以在约10个核苷
酸至约100个核苷酸的范围内。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个核苷酸。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以是至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个核苷酸。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以在约20个核苷酸至约80个核苷酸的范围内。本领域技术人员将认识到，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以具有在该范围内的任何数值，例如约24个核苷酸。
[0397]
在一些情况下，选择涂层的数量和/或每一层的材料组成，以便调节在涂覆的内流动池表面上寡核苷酸衔接子/引物(或其他附接的分子)的所得表面密度。在一些情况下，寡核苷酸衔接子/引物的表面密度可以在约1,000个引物分子/μm2至约1,000,000个引物分子/μm2的范围内。在一些情况下，寡核苷酸引物的表面密度可以是至少1,000、至少10,000、至少100,000个分子/μm2或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，寡核苷酸引物的表面密度可以是至多1,000,000、至多100,000、至多10,000个分子/μm2或至多1,000个分子/μm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中所包括的范围，例如，在一些情况下，引物的表面密度可以在约10,000个分子/μm2至约100,000个分子/μm2的范围内。本领域技术人员将认识到，引物分子的表面密度可以具有在该范围内的任何值，例如，约455,000个分子/μm2。在一些情况下，可以调节毛细管或通道内腔涂层的表面性质，包括拴系的寡核苷酸引物的表面密度，以改善或优化例如固相核酸杂交特异性和效率，和/或固相核酸扩增速率、特异性和效率。
[0398]
在一些情况下，拴系的衔接子或引物序列可以包含设计成促进在低结合性载体上进行的核酸扩增的特异性和效率的修饰。例如，在一些情况下，引物可包含聚合酶终止点，使得在表面缀合点和修饰位点之间的引物序列的伸展始终为单链形式，并充当一些依赖解旋酶的等温扩增方法中的5’至3’解旋酶的加载位点。可用于产生聚合酶终止点的引物修饰的其他示例包括但不限于将peg链朝向5’端插入引物主链的两个核苷酸之间、插入无碱基核苷酸(即，既没有嘌呤也没有嘧啶碱基的核苷酸)或可被解旋酶绕过的病变部位。
[0399]
核酸杂交：在一些情况下，当单独使用或与改善的缓冲液制剂组合使用以进行固相核酸杂交和/或固相核酸扩增反应作为基因分型或核酸测序应用的一部分时，本文公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置表面可提供优点。在一些情况下，本文公开的经聚合物涂覆的流动池装置可在改善的核酸杂交速率和特异性以及改善的核酸扩增速率和特异性方面提供优点，这可以通过本公开的以下一个或多个其他方面来实现：(i)引物设计(例如，序列和修饰)，(ii)控制固相载体上拴系的引物密度，(iii)固相载体的表面组成，(iv)固体载体的表面聚合物密度，(v)在扩增之前和期间使用改进的杂交条件，和/或(vi)使用减少非特异性引物扩增或提高模板扩增效率的改进的扩增制剂。
[0400]
在一些情况下，可能需要改变拴系在经涂覆流动池表面上的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度和/或拴系的衔接子或引物离开经涂覆流动池表面的间距(例如，通过改变用于将衔接子或引物栓系到表面的接头分子的长度)，以便在例如使用给定的扩增方法时“调节”载体以获得最佳性能。在一些情况下，调整拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度可能会影响表面上观察到的特异性和/或非特异性扩增的水平，其方式会根据所选的扩增方
法而有所不同。在一些情况下，可以通过调节用于产生载体表面的分子组分的比例来改变拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度。例如，在使用寡核苷酸引物-peg缀合物产生低结合性载体的最终层的情况下，可以改变寡核苷酸引物-peg缀合物与非缀合的peg分子的比例。然后可以使用本领域技术人员已知的各种技术中的任何一种来评估或测量所栓系的引物分子的表面密度。示例包括但不限于使用放射性同位素标记和计数方法、可裂解分子的共价偶联，所述可裂解分子包括可从限定区域的载体表面裂解的光学可检测标签(例如，荧光标签)，将其收集在固定体积的适当溶剂中，然后通过将荧光信号与已知光学标签浓度的校准溶液的荧光信号进行比较或使用荧光成像技术(只要已注意标记反应条件和图像采集设置)以确保荧光信号与表面上的荧光团数量线性相关(例如，表面上的荧光团没有明显的自猝灭)。
[0401]
在一些情况下，单独或与改进或优化的缓冲液制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可以产生是常规杂交方案的约2倍至约20倍快的相对杂交速率。在一些情况下，相对杂交速率可以是常规杂交方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍或至少40倍。
[0402]
在一些情况下，单独或与改进或优化的缓冲液制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置对于这些完成指标中的任何一个可产生少于60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟的总的杂交反应时间(即，达到该杂交反应的90％、95％、98％或99％完成所需的时间)。
[0403]
在一些情况下，单独或与改进或优化的缓冲液制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可产生与常规杂交方案相比提高的杂交特异性。在一些情况下，可以实现的杂交特异性优于在10个杂交事件中发生1个碱基错配、在20个杂交事件中发生1个碱基错配、在30个杂交事件中发生1个碱基错配、在40个杂交事件中发生1个碱基错配、在50个杂交事件中发生1个碱基错配、在75个杂交事件中发生1个碱基错配、在100个杂交事件中发生1个碱基错配、在200个杂交事件中发生1个碱基错配、在300个杂交事件中发生1个碱基错配、在400个杂交事件中发生1个碱基错配、在500个杂交事件中发生1个碱基错配、在600个杂交事件中有1个碱基错配、在700个杂交事件中发生1个碱基错配、在800个杂交事件中发生1个碱基错配、在900个杂交事件中发生1个碱基错配、在1,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在2,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在3,000个杂交事件中发生1碱基错配、在4,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在5,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在6,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在7,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在8,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在9,000个杂交事件中发生1个碱基错配，或在10,000个杂交事件中发生1个碱基错配。
[0404]
在一些情况下，单独或与改进或优化的缓冲液制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可产生与常规杂交方案相比提高的杂交效率(例如，与靶寡核苷酸序列成功杂交的载体表面上的可用寡核苷酸引物的分数)。在一些情况下，对于下文指定的任何输入靶寡核苷酸浓度以及在上述任何指定的杂交反应时间内可获得的杂交效率均优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些情况下，例如，其中杂交效率小于100％，与载体表面杂交的靶核酸序列的所得表面密度可以小于该表面上的寡核
苷酸衔接子或引物序列的表面密度。
[0405]
在一些情况下，使用常规杂交(或扩增)方案或改进或优化的杂交(或扩增)方案将所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置用于核酸杂交(或核酸扩增)应用中可导致对与载体表面接触的靶(或样品)核酸分子的输入浓度的需求降低。例如，在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以约10pm至约1μm的浓度与载体表面接触(即，在退火或扩增之前)。在一些情况下，可以以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至少10pm、至少20pm、至少30pm、至少40pm、至少50pm、至少100pm、至少200pm、至少300pm、至少400pm、至少500pm、至少600pm、至少700pm、至少800pm、至少900pm、至少1nm、至少10nm、至少20nm、至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少200nm、至少300nm、至少400nm、至少500nm、至少600nm、至少700nm、至少800nm、至少900nm或至少1μm。在一些情况下，可以以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至多1μm、至多900nm、至多800nm、至多700nm、至多600nm、至多500nm、至多400nm、至多300nm、至多200nm、至多100nm、至多90nm、至多80nm、至多70nm、至多60nm、至多50nm、至多40nm、至多30nm、至多20nm、至多10nm、至多1nm、至多900pm、至多800pm、至多700pm、至多600pm、至多500pm、至多400pm、至多300pm、至多200pm、至多100pm、至多90pm、至多80pm、至多70pm、至多60pm、至多50pm、至多40pm、至多30pm、至多20pm或至多10pm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，可以以约90pm至约200nm的浓度范围施用靶(或样品)核酸分子。本领域技术人员将认识到，可以以在具有该范围内的任何数值例如约855nm的浓度来施用靶(或样品)核酸分子。
[0406]
在一些情况下，单独或与改进或优化的杂交缓冲液制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(即，在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的范围为约0.0001个靶寡核苷酸分子/μm2至约1,000,000个靶寡核苷酸分子/μm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至少0.0001、至少0.0005、至少0.001、至少0.005、至少0.01、至少0.05、至少0.1、至少0.5、至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少5,500、至少6,000、至少6,500、至少7,000、至少7,500、至少8,000、至少8,500、至少9,000、至少9,500、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000或至少1,000,000个分子/μm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多
55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,500、至多9,000、至多8500、至多8000、至多7500、至多7000、至多6500、至多6000、至多5500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3500、至多3,000、至多2500、至多2,000、至多1,500、至多1,000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多400、至多300、至多200、至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20、至多10、至多5、至多1、至多0.5、至多0.1、至多0.05、至多0.01、至多0.005、至多0.001、至多0.0005或至多0.0001个分子/μm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以在约3,000个分子/μm2至约20,000个分子/μm2范围内。本领域技术人员将认识到，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以具有在该范围内的任何数值，例如约2,700个分子/μm2。
[0407]
换句话说，在一些情况下，单独或与改进的优化的杂交缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可能会导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子(即在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的表面密度为为约100个杂交的靶寡核苷酸分子/mm2至约1
×
10
12
个杂交的靶寡核苷酸分子/mm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至少100、至少500、至少1,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
×
107、至少1
×
108、至少5
×
108、至少1
×
109、至少5
×
109、至少1
×
10
10
、至少5
×
10
10
、至少1
×
10
11
、至少5
×
10
11
或至少1
×
10
12
个分子/mm2。在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以是至多1
×
10
12
、至多5
×
10
11
、至多1
×
10
11
、至多5
×
10
10
、至多1
×
10
10
、至多5
×
109、至多1
×
109、至多5
×
108、至多1
×
108、至多5
×
107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以在约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2范围内。本领域技术人员将认识到，杂交的靶寡核苷酸分子的表面密度可以具有在该范围内的任何数值，例如，约50,700个分子/mm2。
[0408]
在一些情况下，与附接于低结合性载体表面的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度范围可以为约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至
少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少0.6kb、至少0.7kb、至少0.8kb、至少0.9kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb或至少40kb，或本文所述范围内的任何中间值，例如长度至少为0.85kb。
[0409]
在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包含单链或双链的多聚核酸分子(例如，多联体)，所述多聚核酸分子还包含重复的规则存在的单体单元。在一些情况下，单链或双链多聚核酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb，或在本文所述范围内的任何中间值，例如长度为约2.45kb。
[0410]
在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单链或双链多聚核酸分子(例如，多联体)，所述多聚核酸分子包含约2至约100个规则重复的单体单元的拷贝。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有该范围内的任何数值，例如约17。因此，在一些情况下，即使杂交效率小于100％，就每单位面积的载体表面上的靶序列的拷贝数而言，杂交靶序列的表面密度也可能超过寡核苷酸引物的表面密度。
[0411]
核酸表面扩增(nasa)：如本文所用，短语“核酸表面扩增”(nasa)可与短语“固相核酸扩增”(或简称为“固相扩增”)互换使用。在本公开的一些方面，描述了核酸扩增制剂，其与所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置组合，提供了提高的扩增速率、扩增特异性和扩增效率。如本文所用，特异性扩增是指已经共价或非共价拴系在固体载体上的模板文库寡核苷酸链的扩增。如本文所用，非特异性扩增是指引物二聚体或其他非模板核酸的扩增。如本文所用，扩增效率是在给定的扩增循环或扩增反应期间成功扩增的载体表面上的栓系寡核苷酸的百分比的量度。在本文公开的表面上进行的核酸扩增可获得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％(例如98％或99％)的扩增效率。
[0412]
各种热循环或等温核酸扩增方案中的任何一种均可与所公开的低结合性载体一起使用。可以与公开的低结合性载体一起使用的核酸扩增方法的示例包括但不限于聚合酶链反应(pcr)、多置换扩增(mda)、转录介导的扩增(tma)、基于核酸序列的扩增(nasba)、链置换扩增(sda)、实时sda、桥扩增、等温桥扩增、滚环扩增、环间扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增或单链结合(ssb)蛋白依赖性扩增。
[0413]
在一些情况下，单独或与扩增反应组分的制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置，可以实现扩增速率、扩增特异性和扩增效率的改善。除了包含核苷
酸、一种或多种聚合酶、解旋酶、单链结合蛋白等(或其任意组合)以外，还可以通过各种方式调节扩增反应混合物以实现改善的性能，包括但不限于缓冲液类型、缓冲液ph值、有机溶剂混合物、缓冲液粘度、去污剂和两性离子组分、离子强度(包括一价和二价离子浓度的调节)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、bsa、聚乙二醇、右旋糖酐硫酸酯、甜菜碱、其他添加剂等的选择。
[0414]
单独或与改进或优化的扩增反应制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置与使用常规载体和扩增方案获得的那些扩增速率相比可以产生提高的扩增速率。在一些情况下，对于上述任何一种扩增方法，可以达到的相对扩增速率可以是使用常规的载体和扩增方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍或至少20倍。
[0415]
在一些情况下，单独或与改进或优化的缓冲液制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置对于这些完成指标中的任何一个可产生少于180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、1分钟、50秒、40秒、30秒、20秒或10秒的总的扩增反应时间(即，达到90％、95％、98％或99％的完成扩增反应所需的时间)。
[0416]
在一些情况下，单独或与改进或优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可以实现不超过60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟的更快的扩增反应时间(即，达到90％、95％、98％或99％的完成扩增反应所需的时间)。类似地，单独使用所公开的低结合性载体或与改进或优化的缓冲液制剂组合使用可使扩增反应在一些情况下以不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个周期，或不超过30个周期完成。
[0417]
在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案相比，单独或与改进或优化的扩增反应制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可产生增加的特异性扩增和/或减少的非特异性扩增。在一些情况下，可以实现的特异性扩增与非特异性扩增的所得比值为至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1或1,000:1。
[0418]
在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案相比，单独或与改进或优化的扩增反应制剂组合使用经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可产生提高的扩增效率。在一些情况下，在上述指定的任何扩增反应时间内，可实现的扩增效率均优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。
[0419]
在一些情况下，与附接在经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置表面上的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度可以为约0.02千碱基(kb)至约2kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，克隆扩增的靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或本文所述范围内的任何中间值，例如长度为至少0.85kb。
[0420]
在一些情况下，克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单链或双链的多聚核酸分子(例如，多联体)，其还包含重复的规则存在的单体单元。在一些情况下，克隆扩增的单链或双链多聚核酸分子的长度可以为至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、
至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或本文所述范围内的任何中间值，例如长度约为2.45kb。
[0421]
在一些情况下，克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单链或双链多聚核酸分子(例如，多联体)，其包含约2至约100个规则重复的单体单元的拷贝。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以为至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有该范围内的任何数值，例如约12个。因此，在一些情况下，就每单位面积的载体表面上的靶序列的拷贝数而言，即使杂交和/或扩增效率小于100％，克隆扩增的靶序列的表面密度也可能超过寡核苷酸引物的表面密度。
[0422]
在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案相比，单独或与改进或优化的扩增反应制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可产生增加的克隆拷贝数。在一些情况下，例如其中克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子包含单体靶序列的串联的多聚体重复序列，其克隆拷贝数可能比使用常规载体和扩增方案获得的克隆拷贝数少得多。因此，在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的群落约1个分子至约100,000个分子(例如靶序列分子)。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的群落至少1、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000或至少100,000个分子。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的群落至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,000、至多8,000、至多7,000、至多6,000、至多5,000、至多4,000、至多3,000、至多2,000、至多1,000、至多500、至多100、至多50、至多10、至多5或至多1个分子。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，克隆拷贝数可以在约2,000个分子至约9,000个分子的范围内。本领域技术人员将认识到，克隆拷贝数可以具有该范围内的任何数值，例如在一些情况下约为2,220个分子，在其他情况下约为2个分子。
[0423]
如上所述，在一些情况下，扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单体靶序列的串联的多聚体重复序列。在一些情况下，扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含多个分子，每个分子均包含单个单体靶序列。因此，单独或与改进或优化的扩增反应制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可导致靶序列拷
贝的表面密度为约100个靶标序列拷贝/mm2至约1
×
10
12
个靶标序列拷贝/mm2。在一些情况下，靶标序列拷贝的表面密度可以为至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
×
107至少1
×
108、至少5
×
108、至少1
×
109、至少5
×
109、至少1
×
10
10
、至少5
×
10
10
、至少1
×
10
11
、至少5
×
10
11
或至少1
×
10
12
个克隆扩增的靶序列分子/mm2。在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以为至多1
×
10
12
、至多5
×
10
11
、至多1
×
10
11
、至多5
×
10
10
、至多1
×
10
10
、至多5
×
109、至多1
×
109、至多5
×
108、至多1
×
108、至多5
×
107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多90万、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个靶标序列拷贝/mm2。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，靶序列拷贝的表面密度可以在约1,000个靶序列拷贝/mm2至约65,000个靶序列拷贝/mm2的范围内。本领域技术人员将认识到，靶序列拷贝的表面密度可以具有在该范围内的任何数值，例如约49,600个靶序列拷贝/mm2。
[0424]
在一些情况下，单独或与改进或优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度范围为约100个分子/mm2至约1
×
10
12
个群落/mm2。在一些情况下，克隆的扩增分子的表面密度可以为至少100、至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000、至少100,000、至少150,000、至少200,000、至少250,000、至少300,000、至少350,000、至少400,000、至少450,000、至少500,000、至少550,000、至少600,000、至少650,000、至少700,000、至少750,000、至少800,000、至少850,000、至少900,000、至少950,000、至少1,000,000、至少5,000,000、至少1
×
107、至少5
×
107、至少1
×
108、至少5
×
108、至少1
×
109、至少5
×
109、至少1
×
10
10
、至少5
×
10
10
、至少1
×
10
11
、至少5
×
10
11
或至少1
×
10
12
个分子/mm2。在一些情况下，克隆的扩增分子的表面密度可以为至多1
×
10
12
、至多5
×
10
11
、至多1
×
10
11
、至多5
×
10
10
、至多1
×
10
10
、至多5
×
109、至多1
×
109、至多5
×
108、至多1
×
108、至多5
×
107、至多1
×
107、至多5,000,000、至多1,000,000、至多950,000、至多900,000、至多850,000、至多800,000、至多750,000、至多700,000、至多650,000、至多600,000、至多550,000、至多500,000、至多450,000、至多400,000、至多350,000、至多300,000、至多250,000、至多200,000、至多150,000、至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,
000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多5,000、至多1,000、至多500或至多100个分子/mm2。该段落中描述的下限值和上限值中的任一个可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，克隆扩增的分子的表面密度可以为约5,000个分子/mm2至约50,000个分子/mm2。本领域技术人员将认识到，克隆扩增的群落的表面密度可以具有在该范围内的任何数值，例如，约48,800个分子/mm2。
[0425]
在一些情况下，单独或与改进或优化的扩增反应制剂组合使用所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置可从经扩增和标记的核酸群体中产生信号(例如，荧光信号)，其变异系数不大于50％，例如50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或小于5％。
[0426]
类似地，在一些情况下，单独或与改善或优化的扩增反应制剂组合使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置可以从经扩增的且未标记的核酸群体中产生信号，其具有不大于50％，例如50％、40％、30％、20％、10％、5％、或小于5％的变异系数。
[0427]
经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置的表面的荧光成像：所公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置包括例如安设在其上的经标记靶核酸分子的克隆簇，可用于各种核酸分析应用中的任何一种，例如核酸碱基鉴别、核酸碱基分类、核酸碱基检出、核酸检测应用、核酸测序应用以及基于核酸的(遗传和基因组)诊断应用。在许多这些应用中，荧光成像技术可用于监测在低结合性载体上进行的杂交、扩增和/或测序反应。荧光成像可以使用本文公开的任何光学成像模块进行，也可以使用各种荧光团、荧光成像技术和本领域技术人员已知的其他荧光成像仪器。
[0428]
在一些情况下，可以使用荧光成像技术评估使用公开的经亲水性的聚合物涂覆的流动池装置和反应缓冲制剂进行的核酸杂交和/或扩增反应的性能，其中图像的对比度噪声比(cnr)提供了评估载体上的扩增特异性和非特异性结合的关键指标。cnr通常定义为：cnr＝(信号-背景)/噪声。背景项通常被认为是在指定的关注区域(roi)中围绕特定特征(衍射极限光斑，dls)的间隙区域测量的信号。如上所述，虽然信噪比(snr)通常被认为是整体信号质量的基准，但可以表明，在需要快速图像捕获的应用(例如，应当减少或最小化循环时间的测序应用)中，提高的cnr可以提供优于作为信号质量基准的snr的显著优势。在高cnr的情况下，即使在cnr中等改善的情况下，也可以显著减少达到准确信号区分度(因此在测序应用情况下准确的碱基检出)所需的成像时间。
[0429]
在大多数基于整体的测序方法中，通常将背景项测量为与“间质”区域相关的信号。除了“间质”背景(b
间质
)外，“细胞内”背景(b
细胞内
)还存在于被扩增的dna克隆物占据的离散区域内。这两个背景信号项的组合决定了图像中可实现的cnr，随后直接影响光学仪器的需求、架构成本、试剂成本、运行时间、成本/基因组，最终影响基于循环阵列的测序应用的准确性和数据质量。b
间质
背景信号来自以下各种来源；一些示例包括来自消耗性流动池的自发荧光、检测分子的非特异性吸附(这会产生可能会掩盖来自roi的前景信号的杂散荧光信号)，以及非特异性dna扩增产物(例如，由引物二聚体产生的扩增产物)的存在。在典型的下一代测序(ngs)应用中，当前视场(fov)中的背景信号会随时间平均并减去。来自各个dna克隆物的信号(即fov中的(s)-b
间质
)产生了可分类的、可识别的特征。在一些情况下，细胞内背景(b
细胞内
)可以贡献一个混杂的荧光信号，该信号不是特定于目标靶点的，而是存在于相同的roi中，因此很难被平均和减去。
[0430]
在本公开内容的经亲水性的聚合物涂覆的基质表面上实施核酸扩增可通过减少非特异性结合来降低b
间质
背景信号，可导致特异性核酸扩增的改善，并可导致非特异性扩增的减少，所述非特异性扩增会影响由间质和细胞内区域产生的背景信号。在一些情况下，所公开的低非特异性结合性载体表面，任选地与改进的杂交和/或扩增反应缓冲制剂组合使用可以比使用常规载体和杂交、扩增和/或测序方案获得的那些cnr将cnr提高2倍、5倍、10倍、100倍、200倍、500倍或1000倍。尽管此处在使用荧光成像作为读出或检测模式的背景下进行了描述，但相同的原理也适用于将公开的低非特异性结合性载体以及核酸杂交和扩增制剂用于其他检测模式，包括光学检测模式和非光学检测模式。
[0431]
可替选的测序生物化学：除了上述通过核苷酸掺入测序的方法外，本公开的流动池装置和光学成像系统也与其他新兴的核酸测序生物化学方法兼容。示例包括在美国专利第10,655,176b2号中描述的“通过核苷酸结合测序”方法和在美国专利第10,768,173b2中描述的“通过亲和力测序”方法。
[0432]
目前，由omniome,inc.(san diego，ca)开发的“通过核苷酸结合测序”的方法基于执行重复循环，在防止同源核苷酸共价掺入引物中的条件下，检测沿模板在每个位置形成的稳定复合物(例如，三元复合物，其包括引物化的模板(拴系到样品载体结构)、聚合酶和该位置的同源核苷酸)，然后延伸引物以允许检测沿模板的下一个位置。在通过结合的测序方法中，在将引物延伸至下一个位置之前，先检测模板各位置的核苷酸。通常，该方法用于通过唯一地标记每种类型的三元复合物(即，其所含核苷酸类型不同的不同类型的三元复合物)或者通过单独递送形成每种类型的三元复合物所需的试剂来区分可存在于沿核酸模板位置处的四种不同核苷酸类型。在一些情况下，标记可以包括参与三元复合物的例如同源核苷酸或聚合酶的荧光标记。因此，该方法与所公开的流动池装置和成像系统兼容。
[0433]
目前，由element biosciences,inc.(san diego，ca)开发的“通过亲和力测序”方法依赖于形成包含多个单独的非共价结合相互作用的复合物而获得的增加的亲和力(或“官能性亲和力”)。element的方法基于对在经荧光标记的聚合物-核苷酸缀合物、聚合酶和拴系在样品载体结构上的多个引物化的靶核酸分子之间形成的多价结合复合物的检测，其允许检测/碱基检出步骤与核苷酸掺入步骤分开。荧光成像用于检测结合的复合物，从而确定靶核酸序列中n 1核苷酸的身份(其中引物延伸链的长度为n个核苷酸)。在成像步骤之后，将多价结合复合物破坏并洗掉，将正确的封闭核苷酸掺入引物延伸链中，并重复该循环。
[0434]
在一些情况下，本公开的聚合物-核苷酸缀合物可以包含直接地或经由接头例如通过核苷酸的5’端缀合至聚合物核心的多个核苷酸部分或核苷酸类似物部分。作为非限制性示例，核苷酸部分可包括核糖核苷酸部分、核糖核苷酸类似物部分、脱氧核糖核苷酸部分、脱氧核糖核苷酸类似物部分或其任何组合。在一些情况下，核苷酸或核苷酸类似物可包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、腺苷、鸟苷、5-甲基-尿苷和/或胞苷。在一些情况下，核苷酸或核苷酸类似物部分可以包含已被修饰以在聚合酶反应或测序反应期间抑制伸长的核苷酸，例如其中至少一个核苷酸或核苷酸类似物是缺少3'羟基基团的核苷酸；已被修饰为在3'位含有封闭基团的核苷酸；和/或已被3'-0-叠氮基、3'-0-叠氮甲基、3'-0-烷基羟氨基、3'-硫代磷酸酯基、3'-丙二酰基或3'-0-苄基修饰的核苷酸。
[0435]
在一些情况下，聚合物核心可以包括线性或支化聚合物，例如，线性或支化聚乙二
醇(peg)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙醇酸、聚甘氨酸、聚乙酸乙烯酯、右旋糖酐、蛋白质、或其他此类聚合物，或整合上述任意两种或更多种的共聚物、或整合本领域已知的其他聚合物的共聚物。在一些情况下，聚合物是peg。在一些情况下，聚合物是支化peg。在一些情况下，支化聚合物可包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多的分支或支臂，或2、4、8、16、32、64或更多的分支或臂。在一些情况下，分支或支臂可从中心部分辐射。
[0436]
在一些情况下，聚合物-核苷酸缀合物还可以包含一种或多种可检测标记，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或超过20种的可检测标记。在一些情况下，一种或多种可检测标记可以包含一种或多种荧光团(例如，花青染料3(cy3)、花青染料5(cy5)等)、一个或多个量子点、荧光共振能量转移(fret)供体和/或fret受体。
[0437]
在一些情况下，聚合物-核苷酸缀合物还可以包含结合部分，其结合至聚合物核心的每个分支或分支的子集。合适的结合部分的示例包括但不限于生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素或类似物、聚组氨酸结构域、互补配对的核酸结构域、g-四联体形成性核酸结构域、钙调蛋白、麦芽糖结合蛋白、纤维素酶、麦芽糖、蔗糖、谷胱甘肽-s-转移酶、谷胱甘肽、0-6-甲基鸟嘌呤-dna甲基转移酶、苄基鸟嘌呤及其衍生物、苄基半胱氨酸及其衍生物、抗体、表位、蛋白a或蛋白g。结合部分可以是本领域已知的结合至或促进蛋白质之间、蛋白质与配体之间、蛋白质与核酸之间、核酸之间或小分子相互作用结构域或部分之间的相互作用的任何相互作用分子或其片段。
[0438]
如上所述，在通过亲合力测序方法中，当聚合物-核苷酸缀合物的核苷酸部分与靶序列的核苷酸残基互补时，在例如经荧光标记的聚合物-核苷酸缀合物、聚合酶和拴系到样品载体结构(例如，流动池表面)的多个引物化的靶核酸分子之间形成多价结合复合物。由此形成的多价结合复合物的稳定性使得测序反应循环中的检测/碱基检出步骤与核苷酸掺入步骤分离。
[0439]
多价结合复合物(聚合物-核苷酸缀合物的两个或多个核苷酸部分、两个或多个聚合酶分子和两个或多个引物化的靶核酸序列之间形成的三元复合物)的稳定性可以通过复合物的延长的持久时间来证明。例如，在一些情况下，所述多价结合复合物(三元复合物)可以具有小于0.5秒、小于1秒、大于1秒、大于2秒、大于3秒、大于4秒、大于5秒、大于10秒、大于15秒、大于20秒、大于30秒、大于60秒、大于120秒、大于360秒、大于720秒、大于1,440秒、大于3600秒或更长的持久时间，或由这些值中的任意两个或更多个值所定义的范围内的时间。
[0440]
使用聚合物-核苷酸缀合物与聚合酶和引物化的靶核酸形成多价结合复合物可导致核苷酸的有效局部浓度增加，该浓度比使用单个未缀合或不受拴系的核苷酸所获得的平均核苷酸浓度高出许多倍，这继而既提高了复合物的稳定性，又增加了洗涤步骤后的信号强度。高信号强度在整个结合、洗涤和成像步骤中持续存在，并有助于缩短图像获取时间。在成像步骤之后，可以例如通过改变缓冲液的离子组成、离子强度和/或ph来使多价结合复合物不稳定，并被洗去。然后可以进行引物延伸反应以将互补链延伸一个碱基。
[0441]
核酸测序系统性能：在一些情况下，所公开的核酸测序系统(包括与一个或多个所公开的光学成像系统组合使用的一个或多个所公开的流动池装置，并且任选地利用新兴的测序生物化学法之一，例如上文所述的“通过捕获测序”(或“通过亲合力测序”)方法)可以在以下方面提供改善的核酸测序性能：例如，减少样品输入要求，减少图像获取周期时间，
减少测序反应周期时间，减少测序运行时间，提高碱基检出的准确性，减少试剂消耗和成本，提高测序通量，并降低测序成本。
[0442]
核酸样品输入(pm)：在一些情况下，由于使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置和成像系统，可以获得改善的杂交和扩增效率，并且可以获取用于碱基检出的高cnr图像，因此可以显著降低所公开系统的样品输入要求。在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约1pm至约10,000pm的范围内。在一些情况下，核酸样品输入要求可以是至少1pm、至少2pm、至少5pm、至少10pm、至少20pm、至少50pm、至少100pm、至少200pm、至少500pm、至少1,000pm、至少2,000pm、至少5,000pm、至少10,000pm。在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以是至多10,000pm、至多5,000pm、至多2,000pm、至多1,000pm、至多500pm、至多200pm、至多100pm、至多50pm、至多20pm、至多10pm、至多5pm、至多2pm、或至多1pm。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约5pm至约500pm的范围内。本领域技术人员将认识到，核酸样品输入要求可以具有在该范围内的任何值，例如，约132pm。在一示例性情况下，约100pm的核酸样品输入足以产生用于可靠碱基检出的信号。
[0443]
核酸样品输入(纳克)：在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求可以在约0.05纳克至约1,000纳克的范围内。在一些情况下，核酸样品输入要求是至少0.05纳克、至少0.1纳克、至少0.2纳克、至少0.4纳克、至少0.6纳克、至少0.8纳克、至少1.0纳克、至少2纳克、至少4纳克、至少6纳克、至少8纳克、至少10纳克、至少20纳克、至少40纳克、至少60纳克、至少80纳克、至少100纳克、至少200纳克、至少400纳克、至少600纳克、至少800纳克、或至少1,000纳克。在一些情况下，核酸样品输入要求可以是至多1,000纳克、至多800纳克、至多600纳克、至多400纳克、至多200纳克、至多100纳克、至多80纳克、至多60纳克、至多40纳克、至多20纳克、至多10纳克、至多8纳克、至多6纳克、至多4纳克、至多2纳克、至多1纳克、至多0.8纳克、至多0.6纳克、至多0.4纳克、至多0.2纳克、至多0.1纳克、或至多0.05纳克。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，所公开系统的核酸样品输入要求的范围可以为约0.6纳克至约400纳克。本领域技术人员将认识到，核酸样品输入要求可以具有在该范围内的任何值，例如，约2.65纳克。
[0444]
#平铺流动池所需的fov图像：在一些情况下，所公开的光学成像模块的视场(fov)足够大，以至于本公开的多通道(或多泳道)流动池(即其流体通道部分)可以通过平铺约10个fov图像(或“帧”)至约1,000个fov图像(或“帧”)来成像。在一些情况下，整个多通道流动池的图像可能需要平铺至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少750、至少800、至少850、至少900、至少950、或至少1,000个fov图像(或“帧”)。在一些情况下，整个多通道流动池的图像可能需要平铺至多1,000、至多950、至多900、至多850、至多800、至多750、至多700、至多650、至多600、至多550、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多90、至多80、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20、或至多10个fov图像(或“帧”)。该段落中描述的任何下限值和上限值都可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，整个多通道流动池的图像可能需要平铺约30个至约100个fov图像。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，所需的fov图像的数量可以具有在该范围
内的任何值，例如，约54个fov图像。
[0445]
成像周期时间：在一些情况下，大的fov、图像传感器响应灵敏度和/或快速的fov过渡时间的组合使得能够缩短成像周期时间(即，获取足够数量的fov图像以平铺整个多通道流动池(或其流体通道部分)所需的时间)。在一些情况下，成像循环时间可以在约10秒至约10分钟的范围内。在一些情况下，成像周期时间可以是至少10秒、至少20秒、至少30秒、至少40秒、至少50秒、至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟。至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟或至少10分钟。在一些情况下，成像周期时间可以是至多为10分钟、至多9分钟、至多8分钟、至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟、至多1分钟、至多50秒、至多40秒、至多30秒、至多20秒、或至多10秒。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成包括在本公开中的范围，例如，在一些情况下，成像周期时间可以在约20秒至约1分钟的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，成像周期时间可以具有在该范围内的任何值，例如，约57秒。
[0446]
测序周期时间：在一些情况下，缩短的测序反应步骤(例如，由于减少了所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池的洗涤时间要求)可导致缩短整个测序周期时间。在一些情况下，所公开系统的测序周期时间可以在约1分钟至约60分钟的范围内。在一些情况下，测序周期时间可以是至少1分钟、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少6分钟、至少7分钟、至少8分钟、至少9分钟、至少10分钟、至少15分钟、至少20分钟、至少25分钟、至少30分钟、至少35分钟、至少40分钟、至少45分钟、至少50分钟、至少55分钟、或至少60分钟。在一些情况下，测序反应周期时间可以是至多60分钟、至多55分钟、至多50分钟、至多45分钟、至多40分钟、至多35分钟、至多30分钟、至多25分钟、至多20分钟、至多15分钟、至多10分钟、至多9分钟、至多8分钟、至多7分钟、至多6分钟、至多5分钟、至多4分钟、至多3分钟、至多2分钟、或至多1分钟。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序周期时间可以在约2分钟至约15分钟的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序周期时间可具有在该范围内的任何值，例如，约1分钟、12秒。
[0447]
测序读取长度：在一些情况下，增强的cnr图像可以通过使用所公开的经亲水性聚合物涂覆的流动池装置与所公开的成像系统组合来实现，并且在一些情况下，使用较温和的测序生物化学法可以使得能够针对公开的系统实现更长的测序读取长度。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以在约50bp至约500bp的范围内。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以是至少50bp、至少100bp、至少150bp、至少200bp、至少250bp、至少300bp、至少350bp、至少400bp、至少450bp、或至少500bp。在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以是至多500bp、至多450bp、至多400bp、至多350bp、至多300bp、至多250bp、至多200bp、至多150bp、至多100bp、或至多50bp。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以在约100bp至约450bp的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，最大(单读取)读取长度可以具有在该范围内的任何值，例如，约380bp。
[0448]
测序运行时间：在一些情况下，所公开的核酸测序系统的测序运行时间可以在约8小时至约20小时的范围内。在一些情况下，测序运行时间是至少8小时、至少9小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时、或至少20小时。在一些情况下，测
序运行时间是至多20小时、至多18小时、至多16小时、至多14小时、至多12小时、至多10小时、至多9小时、或至多8小时。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开中包括的范围，例如，在一些情况下，测序运行时间可以在约10小时至约16小时的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序运行时间可以具有该范围内的任何值，例如，约7小时35分钟。
[0449]
平均碱基检出准确度：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以在测序运行过程中提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少有98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％的平均碱基检出准确度。在一些情况下，所公开的核酸测序系统每检出1,000个碱基、10,0000个碱基、25,000个碱基、50,000个碱基、75,000个碱基或100,000个碱基可以提供至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％或至少99.9％正确的平均碱基检出准确度。
[0450]
平均q得分：在一些情况下，可以通过计算phred质量得分(也称为质量得分或“q得分”)来评估测序运行的质量或准确性，该质量得分表示给定碱基被测序系统错误地检出的概率。例如，在一些情况下，针对对已知核酸序列的文库进行测序运行而得出的大量经验数据集，可以评估特定测序化学和/或测序系统的碱基检出准确度。然后可以根据以下等式计算q得分：q＝-10log
10 p其中p是碱基检出错误概率。例如，q得分为30，表示在每1000个碱基检出中，碱基检出错误的概率为1(或碱基检出准确性为99.9％)。
[0451]
在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以提供更准确的碱基读出。例如，在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以提供针对测序运行中的碱基检出准确度的q得分，其范围为约20至约50。在一些情况下，运行的平均q得分可以是至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50。本领域技术人员将认识到，平均q得分可以具有在该范围内的任何值，例如约32。
[0452]
q得分相对于鉴定的核苷酸％：在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于20的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于25的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于30的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于35的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于40的q得分。在一些情况下，所公开的核酸测序系统对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于45的q得分。在一些情况下，所公开的用于核酸测序的组合物
和方法对于鉴定的末端(或n 1)核苷酸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％可以提供大于50的q得分。
[0453]
试剂消耗：在一些情况下，由于例如使用使流体通道体积和死体积最小化的所公开的流动池装置和流体系统，所以所公开的核酸测序系统可以具有较低的试剂消耗率和成本。因此，在一些情况下，与illumina miseq测序仪消耗的试剂相比，所公开的核酸测序系统每gbase测序可能需要的试剂按体积剂平均减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％。
[0454]
测序通量：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可提供的测序通量在约50gbase/运行至约200gbase/运行范围内。在一些情况下，测序通量可以是至少50gbase/运行、至少75gbase/运行、至少100gbase/运行、至少125gbase/运行、至少150gbase/运行、至少175gbase/运行、或至少200gbase/运行。在一些情况下，测序通量可以是至多200gbase/运行、至多175gbase/运行、至多150gbase/运行、至多125gbase/运行、至多100gbase/运行、至多75gbase/运行、或至多50gbase/运行。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序通量的范围可以为约75gbase/运行至约150gbase/运行。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序通量可以具有在该范围内的任何值，例如，约119gbase/运行。
[0455]
测序成本：在一些情况下，所公开的核酸测序系统可以以每gbase约5美元至每gbase约30美元的成本提供核酸测序。在一些情况下，测序成本可以是每gbase至少5美元、每gbase至少10美元、每gbase至少15美元、每gbase至少20美元、每gbase至少25美元或每gbase至少30美元。在一些情况下，测序成本可以是每gbase至多30美元、每gbase至多25美元、每gbase至多20美元、每gbase至多15美元、每gbase至多10美元、或者每gbase至多30美元。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开所包括的范围，例如，在一些情况下，测序成本可以在每gbase约10美元至每gbase约15美元的范围内。本领域技术人员将认识到，在一些情况下，测序成本可以具有在该范围内的任何值，例如每gbase约7.25美元。实施例
[0456]
提供这些示例仅出于说明性目的，并不限制本文提供的权利要求的范围。实施例1-用于基因组学的荧光成像模块的设计规范
[0457]
在表1中提供了本公开的荧光成像模块的设计规范的非限制性示例。
[0458]
表1.用于基因组学的荧光成像模块的设计规范示例。
实施例2
–
玻璃微流体流动池装置的制造
[0459]
用作流动池的微流体装置的晶片级制造可以使用图36a-36c所示的处理方法之一
以及诸如聚焦飞秒激光光烧蚀和/或激光玻璃结合的处理技术，由例如一层、两层或三层玻璃构建，所述玻璃例如硼硅酸盐玻璃、熔融石英玻璃或石英。
[0460]
在图36a中，用激光器(例如，产生飞秒激光辐射的激光器)处理第一晶片以烧蚀晶片材料并提供图案化的表面。图案化的晶片表面可以包括多个微流体装置(例如，12个装置/210mm直径晶片)，每个微流体装置可以包括多个流体通道。然后可以将处理过的晶片切成包括开放流体通道的单个微流体芯片，所述开放流体通道可以任选地随后被密封，例如，通过用膜密封或将装置夹紧到另一个载体表面。
[0461]
在图36b中，处理第一晶片以形成图案化的表面，然后可以将其放置成与第二晶片接触并与其结合以密封流体通道。取决于所使用的材料，例如，玻璃晶片、硅晶片等，可以使用例如热结合工艺、阳极结合工艺、激光玻璃结合工艺等进行结合。第二晶片覆盖和/或密封具有图案化表面的晶片上的凹槽、凹口和/或孔，以形成位于两个晶片组件接界处装置的流体通道和/或流体腔室(例如，内部部分)。然后可以将结合的结构切成单独的微流体芯片，例如，12个微流体芯片/210mm直径晶片。
[0462]
在图36c中，处理第一晶片以形成流体通道的图案，贯穿晶片的整个厚度将其切割或蚀刻(即，在晶片的任一表面上开口)。然后将第一晶片夹在一侧上的第二晶片和另一侧上的第三晶片之间并与其结合。取决于所使用的材料，例如，玻璃晶片、硅晶片等，可以使用例如热结合工艺、阳极结合工艺、激光玻璃结合工艺等进行结合。第二晶片和第三晶片覆盖和/或密封第一晶片中的凹槽、凹口和/或孔，以形成装置的流体通道和/或流体腔室(例如，内部部分)。然后可以将结合的结构切成单独的微流体芯片，例如，12个微流体芯片/210mm直径晶片。
[0463]
实施例3
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用亲水性聚合物涂层涂覆流动池表面
[0464]
通过以下对玻璃流动池装置进行涂覆：用koh清洗所制备的玻璃通道，然后用乙醇冲洗，然后在65℃硅烷化30分钟。将流体通道表面用edc-nhs活化30分钟，然后通过将活化的表面与5μm引物温育20分钟来接枝寡核苷酸引物，然后用30μm的氨基封端聚乙二醇(peg-nh2)钝化。
[0465]
按照上述方法制成多层表面，其中在peg-nh2钝化步骤之后，使多支臂peg-nhs流经流体通道，然后再添加peg-nh2，任选地再与peg-nhs一起温育，然后任选地再与多支臂peg-nh2一起温育。对于这些表面，可以在任何步骤接枝引物，尤其是在最后添加多支臂peg-nh2之后。实施例4
–
用于核酸测序的流动池装置
[0466]
图37a示出了一件式玻璃微流体芯片/流动池设计的非限制性示例。在该设计中，可以使用例如聚焦的飞秒激光辐射来制造流体通道和入口孔/出口孔。流动池装置中有两个流体通道(“泳道”)，每个流体通道包括例如两行，每行26帧(即，其中一“帧”是与相应的成像模块的视场等效的图像区域)，使得平铺2
×
26＝52张图像就足以对整个流体通道成像。流体通道可以具有例如约100μm的深度。流体通道1具有入口孔a1和出口孔a2，并且流体通道2具有入口孔b1和出口孔b2。流动池装置还可包括1d线性、人可读和/或机器可读的条形码、以及任选的2d矩阵条形码。
[0467]
图37b示出了两件式玻璃微流体芯片/流动池设计的非限制性示例。在该设计中，可以使用例如聚焦飞秒激光光烧蚀或光刻和化学蚀刻工艺来制造流体通道和入口孔/出口
孔。可以使用上述各种技术中的任何一种将2个件结合在一起。入口孔和出口孔可以定位在结构的顶层上，并以使得它们与形成在装置的内部中的流体通道和/或流体腔室中的至少一个以流体连通的方式取向。在流动池装置中有两个流体通道，如在图37a中所示的装置，每个流体通道包括例如2行，其中每行26帧。流体通道可以具有例如约100μm的深度。流体通道1具有入口孔a1和出口孔a2，并且流体通道2具有入口孔b1和出口孔b2。流动池装置还可包括1d线性、人可读和/或机器可读的条形码、以及任选的2d矩阵条形码。
[0468]
图37c示出了三件式玻璃微流体芯片/流动池设计的非限制性示例。在该设计中，可以使用例如聚焦飞秒激光光烧蚀或光刻和化学蚀刻工艺来制造流体通道和入口孔/出口孔。可以使用上述各种技术中的任何一种将3个件结合在一起。第一晶片(包括流体通道或流体腔室的贯穿图案)可以被夹在一侧的第二晶片和另一侧的第三晶片之间并与其结合。入口孔和出口孔可以定位在结构的顶层上，并以使它们与形成在装置内部的流体通道和/或流体腔室中的至少一个流体连通的方式取向。在流动池装置中有两个流体通道，如图37a和图37b中所示，每个流体通道有2行，其中每行26帧。流体通道的深度可为例如约100μm。流体通道1具有入口孔a1和出口孔a2，并且流体通道2具有入口孔b1和出口孔b2。流动池装置还可包括1d线性、人可读和/或机器可读的条形码、以及任选的2d矩阵条形码。实施例5
–
毛细管流动池中核酸簇的成像
[0469]
在毛细管内建立核酸簇并进行荧光成像。使用具有毛细管的流动装置进行测试。所产生的簇图像的示例在图38中给出。该图表明，可以可靠地形成和可视化通过在本文公开的毛细管流动池装置的内腔中扩增而形成的核酸簇。实施例6
–
塑料样品载体结构
[0470]
在一些情况下，所公开的样品载体结构可以由聚合物制造。可用来制造样品载体结构，例如，毛细管流动池装置，的材料的示例包括但不限于聚苯乙烯(ps)、大孔聚苯乙烯(mpps)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚丙烯(pp)、聚乙烯(pe)、高密度聚乙烯(hope)、环烯烃聚合物(cop)、环烯烃共聚物(coc)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)或它们的任意组合。构成玻璃和塑料基质的各种组成也都是可以预期的。
[0471]
为了本文公开的表面涂覆目的而对聚合物表面进行修饰涉及使表面对其他化学基团(-r)包括胺具有反应性。在一些情况下，当在合适的基质上制备时，这些反应性表面可以在室温下长期保存例如至少3个月或更长时间。如本文其他地方所述，此类表面可以进一步用r-peg和r-引物低聚物接枝以用于核酸的表面扩增。可以使用本领域已知的许多方法中的任何一种来修饰塑料表面，例如环烯烃聚合物(cop)。例如，可以使用ti：蓝宝石激光烧蚀、uv介导的甲基丙烯酸乙二醇酯光接枝、等离子处理或机械搅拌(例如喷砂或抛光等)处理它们，以产生可对许多化学基团例如胺基保持数月之久的反应性的亲水性表面。然后，这些基团可以使钝化聚合物(例如peg)或生物分子(例如dna或蛋白质)结合，而不会损失生化活性。例如，dna引物低聚物的连接允许在钝化的塑料表面上扩增dna，同时减少或最小化蛋白质、荧光团分子或其他疏水性分子的非特异性吸附。
[0472]
另外，在一些情况下，可以将表面修饰与例如激光印刷或uv掩膜结合以产生图案化的表面。这允许dna低聚物、蛋白质或其他部分的图案化附接，从而提供基于表面的酶活性、结合、检测或加工。例如，dna低聚物可仅用于在图案化特征内扩增dna，或以图案化方式捕获扩增的长dna串联体。在一些实施方式中，可以在能够与基于溶液的基质反应的图案化
区域中产生酶岛。因为塑料表面特别适合于这些加工模式，所以在本文考虑的一些实施方案中，塑料样品载体表面或流动池装置可以被认为是特别有利的。
[0473]
此外，与玻璃基质相比，塑料可以更容易地被注塑、压花、压印或3d打印以形成包括微流体装置在内的任何形状，并且因此可以用来生成用于结合和分析在多种配置(例如，用于生物标记物检测或dna测序的样品-结果微流体芯片)中的生物样品的表面。
[0474]
可以在修饰的塑料表面上进行特定且局部的dna扩增，从而当用荧光标记探测时，产生具有超高的对比度噪声比和非常低的背景的核酸斑点。
[0475]
可以制备具有胺-引物和胺-peg的亲水化胺反应性环状烯烃聚合物表面，并且证明它支持滚环扩增。当用经荧光团标记的引物探测时，或当通过聚合酶将经标记的dntp添加到杂交引物中时，观察到dna扩增子的亮点表现出大于100的信噪比，背景极低，表明高度特异性扩增，并且超低水平的非特异性蛋白质和疏水性荧光团结合，这是系统(例如基于荧光的dna测序仪)所需的高精度检测的标志。实施例7
–
使用结构化的照明成像系统进行测序的预示性示例
[0476]
结构化的照明成像系统4100，例如图41中所示的非限制性示例，可与包含低非特异性结合表面的流动池4187组合使用以进行核酸测序。靶核酸序列与以高表面密度附接到流动池4187内部的低非特异性结合表面4188上的衔接子/引物序列杂交，并使用为所述表面特别配制的杂交和扩增缓冲液克隆扩增以增强特异性杂交和扩增速率。
[0477]
将流动池4187安装在结构化的照明成像系统4100中，并启动测序反应循环，所述测序反应循环包括使用例如上述聚合物-核苷酸缀合物化学和图40中所示的工作流程。如果聚合物-核苷酸缀合物的核苷酸部分与靶序列的核苷酸互补，则将经荧光标记的聚合物核苷酸缀合物引入流动池4187中并与使其表面4188接触以形成多价结合复合物。然后冲洗掉多余的未结合的聚合物-核苷酸缀合物。
[0478]
对于每个检测步骤，通过在照明光路的至少一个分支中以及在光相位调制器(例如，4140a)的多个不同位置，使用衍射光栅(例如，4130a)的不同取向以将照明光条纹图案投射到表面4188上，来捕获表面4188的一系列图像。图像获取后，使用图像重建算法处理该一系列图像，以生成比仅使用衍射极限光学器件可获得的分辨率更高的分辨率图像。可以对表面4188上的多个位置重复该过程，以创建内流动池表面的平铺图像。任选地，可以调整焦平面，并且可以重复该过程以生成第二内流动池表面4189的高分辨率图像。
[0479]
高对比度噪声比图像(使用所公开的低结合表面和多重标记的聚合物-核苷酸缀合物测序化学法实现)与使用结构化的照明成像系统以超分辨率(因此能够使用更高的靶序列簇表面密度)对流动池表面进行成像所获取的相对少量图像的有效处理相组合，可能有助于提高总体测序通量。实施例8
–
使用多路复用读取头进行双表面成像的预示性示例
[0480]
诸如图44a和图44b中示意性示出的多路复用读取头被设计用于执行双面成像。读取头包括多个测微荧光计，这些测微荧光计被组装成使它们相对于彼此保持在固定的位置，并且可以在与一对相对的内部流动池表面水平的方向上进行扫描，以获取每个表面的细长列的图像。如在图44a中，多个测微荧光计的第一子集被配置为获取第一内流动池表面的图像，并且多个测微荧光计的第二子集被配置为获取面向第一内表面并通过中间流体通道的厚度与其隔开的第二内流动池表面的图像。
[0481]
包含低非特异性结合表面涂层的流动池用于进行核酸测序。将靶核酸序列与附接到流动池内部的低非特异性结合表面上的衔接子/引物序列杂交，并使用专门为所述表面配制的杂交和扩增缓冲液进行克隆扩增，以增强特异性杂交和扩增速率。
[0482]
将流动池安装在成像系统中，该成像系统包括多路复用读取头，并启动测序反应循环，该测序反应循环包括使用例如上述聚合物-核苷酸缀合物化学和图40中所示的工作流程。如果聚合物-核苷酸缀合物的核苷酸部分与靶序列的核苷酸互补，则将经荧光标记的聚合物核苷酸缀合物引入流动池并使其与内表面接触以形成多价结合复合物。然后冲洗掉多余的未结合的聚合物-核苷酸缀合物。
[0483]
对于每个检测步骤，如在图44b中所示，在平行于流动池内表面的至少一个方向上扫描多路复用读取头(或者可以相对于多路复用读取头扫描流动池)，并同时获取第一内流动池表面和第二内流动池表面的图像，同时自动对焦机构可在多路复用读取头的物镜与内流动池表面的至少一个之间维持适当的工作距离。
[0484]
使用流动池的单次通过扫描同时成像两个流动池表面的能力(取决于读取头的设计)可以大大提高测序通量。另外编号的实施方案
[0485]
本公开还提供了以下示例性实施方案。1.一种核酸分子测序系统，包括：a)具有内表面的流动池，所述内表面包含与其偶联的多个引物化的靶核酸序列，其中所述多个引物化的靶核酸序列中的引物化的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；b)流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为控制试剂向所述流动池的所述内表面的顺序输送和迭代输送；c)成像模块，所述成像模块包括：i)结构化的照明系统；和ii)图像获取系统，所述图像获取系统被配置为获取所述流动池的所述内表面的图像；以及d)处理器，其中对所述处理器进行编程以指示所述系统执行迭代方法，所述迭代方法包括：i)使偶联至所述流动池的所述内表面的所述多个引物化的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引物化的靶核酸序列的核苷酸互补时，在所述多个引物化的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；和ii)对所述流动池的所述内表面进行成像以检测所述瞬时结合复合物，从而确定所述引物化的靶核酸序列的核苷酸的身份。2.如实施方案1所述的系统，其中所述结构化的照明系统包括光学系统，所述光学系统被设计成将周期性光图案投射在所述流动池的所述内表面上，并且其中能够以已知的方式改变多个所述周期性光图案的相对取向或相移。3.如实施方案1所述的系统，其中所述结构化的照明系统包括第一光学支臂，所述第一光学支臂包括：第一光发射器，用于发射光；以及第一分束镜，用于将由所述第一光发射器发射的光分束，以在所述流动池的所述内表面上投射第一多个条纹。4.如实施方案3所述的系统，其中所述结构化的照明系统还包括第二光学支臂，所
述第二光学支臂包括：第二光发射器，用于发射光；以及第二分束镜，用于将由所述第二光发射器发射的光分束，以在所述流动池的所述内表面上投射第二多个条纹。5.如实施方案4所述的系统，其中所述结构化的照明系统还包括光学元件，用于组合所述第一支臂和所述第二支臂的光路。6.如实施方案4或实施方案5所述的系统，其中所述第一分束镜包括第一透射衍射光栅，并且所述第二分束镜包括第二透射衍射光栅。7.如实施方案4或实施方案5所述的系统，其中所述第一光发射器和所述第二光发射器发射非偏振光，并且其中所述第一透射衍射光栅和所述第二透射衍射光栅将衍射由所述第一光发射器和所述第二光发射器中的相应一个发射的非偏振光。8.如实施方案6或实施方案7所述的系统，其中用于组合所述第一多个条纹和所述第二多个条纹的光路的光学元件包括具有孔的反射镜，其中所述反射镜被布置成反射由所述第一透射衍射光栅衍射的光，并且所述孔被布置成至少使由所述第二透射衍射光栅衍射的第一阶光穿过。9.如实施方案8所述的系统，还包括：一个或多个光学元件，用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹相移。10.如实施方案9所述的系统，其中用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹相移的所述一个或多个光学元件包括使所述第一多个条纹相移的第一旋转光学窗口和使所述第二多个光学条纹相移的第二旋转光学窗口。11.如实施方案9或实施方案10所述的系统，其中用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹相移的所述一个或多个光学元件包括用于平移所述第一衍射光栅的第一线性运动台和用于平移所述第二衍射光栅的第二线性运动台。12.如实施方案9至11中任一项所述的系统，其中用于使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹相移的所述一个或多个光学元件包括单个旋转光学窗口，其中，所述单个旋转光学窗口位于在通往所述样品的光路中的具有孔的所述反射镜之后。13.如实施方案12所述的系统，其中所述单个旋转光学窗口的旋转轴与每个光栅的光轴偏移约45度。14.如实施方案9至13中任一项所述的系统，其中所述第一多个条纹与所述第二多个条纹在所述样品平面上在角度上偏移约90度。15.如实施方案14所述的系统，其中所述样品包括以矩形阵列或六边形阵列规则地图案化的多个特征。16.如实施方案9至15中任一项所述的系统，还包括:物镜，用于将所述第一多个条纹和所述第二多个条纹中的每一个投射到所述样品上。17.如实施方案9至16中任一项所述的系统，还包括:一个或多个光束阻挡器，用于阻挡由所述第一衍射光栅和所述第二衍射光栅中的每一个发射的零阶光。18.如实施方案17所述的系统，其中所述一个或多个光束阻挡器包括布拉格光栅。19.如实施方案6至18中任一项所述的系统，其中用于组合所述第一支臂和所述第二支臂的光路的所述光学元件包括偏振分束镜，其中所述第一衍射光栅衍射竖直偏振光，并且其中所述第二衍射光栅衍射水平偏振光。20.如实施方案4至19中任一项所述的系统，其中所述第一分束镜和所述第二分束
镜各自包括分束镜立方体或板。21.如实施方案3至20中任一项所述的系统，其中所述第一分束镜包括第一反射衍射光栅，并且所述第二分束镜包括第二反射衍射光栅。22.如实施方案1至21中任一项所述的系统，其中所述结构化的照明系统包括多个分束镜滑动件，所述分束镜滑动件包括安装在线性平移台上的多个分束镜，使得所述多个分束镜相对于所述系统的光轴具有固定的取向。23.如实施方案22所述的系统，其中所述多个分束镜包括多个衍射光栅。24.如实施方案23所述的系统，其中所述多个衍射光栅包括两个衍射光栅。25.如实施方案1至24中任一项所述的系统，其中所述结构化的照明系统包括固定的二维衍射光栅，所述固定的二维衍射光栅与空间滤光轮组合使用，以将一维衍射图案投射到所述流动池的所述内表面。26.如实施方案1至25中任一项所述的系统，其中所述图像获取系统包括定制的镜筒透镜，所述定制的镜筒透镜与物镜组合，能够以基本相同的图像分辨率对第一内流动池表面和第二内流动池表面进行成像。27.如实施方案1至26中任一项所述的系统，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。28.如实施方案27所述的系统，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含缀合至聚合物核心的多个核苷酸部分。29.如实施方案28所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。30.如实施方案28或实施方案29所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。31.如实施方案1至30中任一项所述的系统，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。32.一种核酸分子测序方法，包括：a)提供拴系在表面上的多个引物化的靶核酸序列，其中所述多个引物化的靶核酸序列中的引物化的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；b)使所述多个引物化的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引物化的靶核酸序列的核苷酸互补时，在所述多个引物化的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；以及c)检测所述瞬时结合复合物，以确定所述引物化的靶核酸序列的核苷酸的身份，其中所述检测包括：i)在第一组照明条件下，使用由结构化的照明系统提供的光照射所述表面，以在所述表面上投射在特定方向上取向的第一多个条纹；ii)捕获所述表面的第一多个相位图像，其中在捕获所述第一多个图像的过程中，所述第一多个条纹的位置在所述表面上移动；iii)在第二组照明条件下，使用由所述结构化的照明系统提供的光照射所述表面，以在所述表面上投射第二多个条纹，其中所述第二多个条纹与所述第一多个条纹在所述表面上在角度上偏移；和
iv)捕获用所述第二多个条纹照射的所述表面的第二多个相位图像，其中在捕获所述第二多个条纹的过程中，所述第二多个条纹的位置在所述表面上移动。33.如实施方案32所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括第一光学支臂，所述第一光学支臂包括：第一光发射器，用于发射光；以及第一衍射光栅，用于衍射由所述第一光发射器发射的光，以将在特定方向上取向的所述第一多个条纹投射在所述表面上。34.如实施方案33所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括第二光学支臂，所述第二光学支臂包括：第二光发射器，用于发射光；以及第二衍射光栅，用于衍射由所述第二光发射器发射的光，以将与所述第一多个条纹在角度上偏移的所述第二多个条纹投射在所述表面上。35.如实施方案32至34中任一项所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括多个分束镜滑动件，所述分束镜滑动件包括安装在线性平移台上的多个分束镜，使得所述多个分束镜相对于所述系统的光轴具有固定的取向，并且其中所述第一组照明条件对应于所述线性平移台的第一位置，并且所述第二组照明条件对应于所述线性平移台的第二位置。36.如实施方案35所述的方法，其中所述多个分束镜包括多个衍射光栅。37.如实施方案36所述的方法，其中所述多个衍射光栅包括两个衍射光栅。38.如实施方案32至37中任一项所述的方法，其中所述结构化的照明系统包括与空间滤光轮组合使用的固定二维衍射光栅，以在所述表面上投射一维衍射图案，并且其中所述第一组照明条件对应于所述空间滤光轮的第一位置，并且所述第二组照明条件对应于所述空间滤光轮的第二位置。39.如实施方案34至38中任一项所述的方法，其中所述第一衍射光栅和所述第二衍射光栅是透射衍射光栅，其中所述结构化的照明系统包括具有孔的反射镜，以反射由所述第一衍射光栅衍射的光并使由所述第二衍射光栅衍射的至少第一阶光穿过。40.如实施方案32至39中任一项所述的方法，还包括：至少使用所述第一多个捕获的相位图像和所述第二多个捕获的相位图像来计算地重构一个或多个具有比所述第一多个捕获的相位图像和所述第二多个捕获的相位图像中的每一个更高的分辨率的图像。41.如实施方案40所述的方法，其中所述第一多个条纹与所述第二多个条纹在所述表面上在角度上偏移约90度。42.如实施方案32至41中任一项所述的方法，其中所述表面包括以矩形阵列或六边形阵列规则地图案化的多个特征。43.如实施方案32至42中任一项所述的方法，其中通过旋转位于所述表面与所述第一衍射光栅和所述第二衍射光栅中的每一个之间的光路中的单个光学窗口，使所述第一多个条纹和所述第二多个条纹相移，其中所述单个旋转光学窗口的旋转轴与所述衍射光栅中的每一个的光轴偏移。44.如实施方案34至43中任一项所述的方法，其中在捕获所述第一多个相位图像之后，关闭所述第一光学支臂，并打开所述结构化的照明系统的所述第二光学支臂。45.如实施方案34至44中任一项所述的方法，其中在图像捕获期间，所述第一衍射光栅和所述第二衍射光栅被机械地固定。46.如实施方案32至45中任一项所述的方法，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。
47.如实施方案46所述的方法，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含缀合至聚合物核心的多个核苷酸部分。48.如实施方案47所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。49.如实施方案47或实施方案48所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。50.如实施方案32至49中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定所述引物化的靶核酸序列的引物链的n 1或末端核苷酸的身份。51.如实施方案32至50中任一项所述的方法，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。52.一种检测装置，包括：a)包括多个测微荧光计的读取头组装件，其中所述多个测微荧光计相对于彼此保持在固定位置，以形成多路复用读取头，其中所述多个测微荧光计的第一子集中的至少一个被配置为获取第一样品平面的不同区域的宽场图像，并且其中，所述多个测微荧光计的第二子集中的至少一个被配置为获取第二样品平面的不同区域的宽场图像。53.如实施方案52所述的检测装置，还包括平移台，所述平移台被配置为在平行于所述第一样品平面和所述第二样品平面的至少一个方向上移动所述读取头组装件。54.如实施方案52或53所述的检测装置，还包括样品台，所述样品台被配置为保持包括第一内表面和第二内表面的流动池，使得所述第一内表面被保持在所述第一样品平面，并且所述第二内表面被保持在所述第二样品平面。55.如实施方案52至54中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计中的至少一个测微荧光计被配置为获取具有至少1mm的视场的宽场图像。56.如实施方案52至55中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计中的至少一个测微荧光计被配置为获取具有至少1.5mm的视场的宽场图像。57.如实施方案52至56中任一项所述的检测装置，其中所述测微荧光计中的至少一个还包括专用的自动聚焦机构。58.如实施方案57所述的检测装置，其中针对第一测微荧光计的自动聚焦机构被配置为集成来自针对第二测微荧光计的自动聚焦机构的数据，从而，针对所述第一测微荧光计的自动聚焦机构基于所述第一测微荧光计的焦点位置和所述第二测微荧光计的焦点位置来改变所述第一测微荧光计的焦点。59.如实施方案52至58中任一项所述的检测装置，其中单独的测微荧光计还包括物镜、分束镜和检测器，其中所述分束镜被定位成将来自激发辐射源的激发辐射引导至所述物镜，并将来自所述物镜的发射辐射引导至所述检测器。60.如实施方案59所述的检测装置，其中至少一个单独的测微荧光计还包括单独的激发辐射源。61.如实施方案59或60所述的检测装置，其中所述激发辐射源将所述激发辐射引导至所述多个测微荧光计中的两个或更多个单独的测微荧光计的物镜，使得所述两个或更
多个单独的测微荧光计共享所述激发辐射源。62.如实施方案59至61中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计中的两个或更多个单独的测微荧光计还包括或共享至少两个激发辐射源。63.如实施方案59至62中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计中的单独的测微荧光计的物镜的数值孔径是0.2至0.5。64.如实施方案52至63中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计中的测微荧光计被配置为以足以区分相距小于50微米的特征的分辨率获取图像。65.如实施方案52至64中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计中的测微荧光计被配置为具有小于所述流动池的所述第一内表面和所述第二内表面之间的间隔距离的景深。66.如实施方案52至65中任一项所述的检测装置，其中所述多个测微荧光计的所述第一子集被配置为在第一荧光发射波长下获取宽场图像，并且所述多个测微荧光计的所述第二子集被配置为在第二荧光发射波长下获取宽场图像。67.一种用于确定靶核酸序列中核苷酸身份的方法，包括：a)提供多个引物化的靶核酸序列，其中所述多个引物化的靶核酸序列中的引物化的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；b)使所述多个引物化的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引物化的靶核酸序列的核苷酸互补时，在所述多个引物化的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；以及c)检测所述瞬时结合复合物，以确定所述引物化的靶核酸序列的核苷酸的身份，其中所述检测包括：在平行于所述多个引物化的靶核酸序列所拴系的表面的至少一个方向上平移多路复用读取头，其中所述多路复用读取头包括相对于彼此保持在固定位置的多个测微荧光计，并且其中，所述多个测微荧光计中的至少一个测微荧光计被配置为获取与所述多个测微荧光计中的其他微荧光计不同的表面区域的宽场图像。68.如实施方案67所述的方法，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。69.如实施方案68所述的方法，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含缀合至聚合物核心的多个核苷酸部分。70.如实施方案69所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。71.如实施方案69或实施方案70所述的方法，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。72.如实施方案67至71中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定所述引物化的靶核酸序列的引物链的n 1或末端核苷酸的身份。73.如实施方案67至72中任一项所述的方法，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。
74.如实施方案67至73中任一项所述的方法，其中所述多个引物化的靶核酸序列被拴系到流动池的第一内表面和第二内表面，并且其中所述多个测微荧光计的第一子集被配置为获取所述流动池的所述第一内表面的不同区域的宽场图像，并且所述多个测微荧光计的第二子集被配置为获取所述流动池的所述第二内表面的不同区域的宽场图像。75.一种核酸分子测序系统，包括：a)具有至少一个内表面的流动池，所述内表面包含与其偶联的多个引物化的靶核酸序列，其中所述多个引物化的靶核酸序列中的引物化的靶核酸序列具有与其结合的聚合酶；b)流体流量控制器，所述流体流量控制器被配置为控制试剂向所述流动池的所述至少一个内表面的顺序输送和迭代输送；c)成像模块，所述成像模块被配置成对所述流动池的所述至少一个内表面成像，其中所述成像模块包括：多路复用读取头组装件，所述多路复用读取头组装件包括相对于彼此保持在固定位置的多个测微荧光计；其中，所述多个测微荧光计中的至少一个测微荧光计被配置为获取与所述多个测微荧光计中的其他微荧光计不同的至少一个表面区域的宽场图像；以及d)处理器，其中对所述处理器进行编程以指示所述系统执行迭代方法，所述迭代方法包括：i)使偶联至所述流动池的所述至少一个内表面的所述多个引物化的靶核酸序列与核苷酸组合物接触，以当所述核苷酸组合物的核苷酸部分与所述引物化的靶核酸序列的核苷酸互补时，在所述多个引物化的靶核酸序列与多个核苷酸部分之间形成瞬时结合复合物；以及ii)使用所述多路复用读取头对所述流动池的所述至少一个内表面进行成像以检测所述瞬时结合复合物，从而确定所述引物化的靶核酸序列的核苷酸的身份。76.如实施方案75所述的系统，其中所述核苷酸组合物包括缀合的聚合物-核苷酸组合物。77.如实施方案76所述的系统，其中所述缀合的聚合物-核苷酸组合物包含缀合至聚合物核心的多个核苷酸部分。78.如实施方案77所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括核苷酸、核苷酸类似物或其任何组合。79.如实施方案77或实施方案78所述的系统，其中所述多个核苷酸部分包括多个相同的核苷酸部分。80.如实施方案75至79中任一项所述的系统，其中所述方法用于确定所述引物化的靶核酸序列的引物链的n 1或末端核苷酸的身份。81.如实施方案75至80中任一项所述的系统，其中在形成所述瞬时结合复合物之前，所述核苷酸组合物缺乏聚合酶。82.如实施方案75至81中任一项所述的方法，其中所述多个引物化的靶核酸序列被拴系到所述流动池的第一内表面和第二内表面，并且其中所述多个测微荧光计的第一子集被配置为获取所述流动池的所述第一内表面的不同区域的宽场图像，并且所述多个测微
荧光计的第二子集被配置为获取所述流动池的所述第二内表面的不同区域的宽场图像。83.如实施方案75至82中任一项所述的系统，还包括平移台，所述平移台被配置为在平行于所述第一样品平面和第二样品平面的至少一个方向上移动所述多路复用读取头组装件。84.如实施方案75至83中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的至少一个测微荧光计被配置为获取具有至少1mm的视场的宽场图像。85.如实施方案75至84中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的至少一个测微荧光计被配置为获取具有至少1.5mm的视场的宽场图像。86.如实施方案74至85中任一项所述的系统，其中所述测微荧光计中的至少一个还包括专用的自动聚焦机构。87.如实施方案86所述的系统，其中针对第一测微荧光计的自动聚焦机构被配置为集成来自针对第二微荧光计的自动聚焦机构的数据，从而，针对所述第一测微荧光计的自动聚焦机构基于所述第一测微荧光计的焦点位置和所述第二测微荧光计的焦点位置来改变所述第一测微荧光计的焦点。88.如实施方案75至87中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的单独的测微荧光计还包括物镜、分束镜和检测器，其中所述分束镜被定位成将来自激发辐射源的激发辐射引导至所述物镜，并将来自所述物镜的发射辐射引导至所述检测器。89.如实施方案88所述的系统，其中至少一个单独的测微荧光计还包括单独的激发辐射源。90.如实施方案89所述的系统，其中所述激发辐射源将所述激发辐射引导至所述多个测微荧光计中的两个或更多个单独的测微荧光计的物镜，使得所述两个或更多个单独的测微荧光计共享所述激发辐射源。91.如实施方案88至90中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的两个或更多个单独的测微荧光计还包括或共享至少两个激发辐射源。92.如实施方案88至91中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的单独微荧光计的物镜的数值孔径是0.2至0.5。93.如实施方案75至92中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的测微荧光计被配置为以足以区分相距小于50微米的特征的分辨率获取图像。94.如实施方案82至93中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计中的测微荧光计被配置为具有小于所述流动池的所述第一内表面和第二内表面之间的间隔距离的景深。95.如实施方案82至94中任一项所述的系统，其中所述多个测微荧光计的所述第一子集被配置为在第一荧光发射波长下获取宽场图像，并且所述多个测微荧光计的所述第二子集被配置为在第二荧光发射波长下获取宽场图像。96.一种核酸分子测序方法，所述方法包括：a)提供表面；其中所述表面包含：i)基质；ii)至少一个亲水性聚合物涂层；iii)附接至至少一个亲水性聚合物涂层的多个寡核苷酸分子；和
iv)所述表面的至少一个离散区域，其包含固定至所述多个附接的寡核苷酸分子上的多个经克隆扩增的样品核酸分子，其中所述多个固定的经克隆扩增的样品核酸分子以小于λ/(2*na)的距离存在，其中，λ是激发能量源的中心波长，并且na是成像系统的数值孔径。b)同时对所述多个经克隆扩增的样品核酸分子应用随机光切换化学法，以通过随机光切换，使所述多个经克隆扩增的样品核酸分子以多达四种不同的颜色在开和关事件中发出荧光；以及c)当针对所述多个经克隆扩增的样品核酸分子的所述开和关事件发生时，实时检测每种颜色的颜色通道中的所述开和关事件，以确定所述经克隆扩增的样品核酸分子的核苷酸的身份。97.如实施方案96所述的方法，其中用于所述随机光切换的试剂的浓度足够高，使得所述多个经克隆扩增的样品核酸分子中给定的经克隆扩增的样品核酸分子的给定的核苷酸的开事件与跟所述给定的经克隆扩增的样品核酸分子相邻的经克隆扩增的样品核酸分子的给定的核苷酸的开事件同时发生的概率小于约0.5％。98.如实施方案96所述的方法，还包括控制所述开和关事件发生的速率，以控制给定的经克隆扩增的样品核酸分子的给定的核苷酸的开事件与跟所述给定的经克隆扩增的样品核酸分子相邻的经克隆扩增的样品核酸分子的核苷酸的开事件同时发生的概率。99.如实施方案98所述的方法，其中控制所述开和关事件发生的所述速率包括调节所述随机光切换化学法中核苷酸和酶的浓度。100.如实施方案96所述的方法，还包括确定颜色通道中检测事件的照射强度是否大于预定阈值。101.如实施方案96所述的方法，还包括确定颜色通道中检测事件的光斑大小是否大于预定阈值。102.如实施方案96所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含peg。103.如实施方案96所述的方法，其中检测包括获取所述表面的图像，其中所述图像表现出至少40的对比度噪声比(cnr)。104.如实施方案96所述的方法，其中检测包括获取所述表面的图像，其中所述图像表现出至少60的对比度噪声比(cnr)。105.如实施方案96所述的方法，其中所述基质包括玻璃。106.如实施方案96所述的方法，其中所述基质包括塑料。107.如实施方案96所述的方法，其中所述表面位于所述流动通道的内部。108.如实施方案96所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物层包含具有至少8个分支的支化亲水性聚合物。109.如实施方案96所述的方法，其中在所述表面的从所述至少一个离散区域横向移位的区域处测量的背景荧光强度不大于在所述克隆扩增之前在所述至少一个离散区域处测量的强度的2倍。110.如实施方案96所述的方法，其中所述样品核酸分子包括单链多聚核酸分子，所述单链多聚核酸分子包含规则存在的单体单元的重复。111.如实施方案110所述的方法，其中所述单链多聚核酸分子的长度至少为10kb。
112.如实施方案110所述的方法，还包括规则存在的单体单元的双链单体拷贝。113.如实施方案96所述的方法，其中所述表面包括第一层，其包含拴系至所述基质的表面的聚合物分子单层；第二层，其包含拴系至所述第一层的所述聚合物分子的聚合物分子；第三层，其包含拴系至所述第二层的所述聚合物分子的聚合物分子，其中至少一个层包含支化聚合物分子。114.如实施方案113所述的方法，其中所述第三层还包含拴系至所述第三层的所述聚合物分子的寡核苷酸。115.如实施方案114所述的方法，其中拴系至所述第三层的所述聚合物分子的所述寡核苷酸在所述第三层的多个深度处分布。116.如实施方案113所述的方法，还包括第四层，其包含拴系至所述第三层的所述聚合物分子的支化聚合物分子；以及第五层，其包含拴系至所述第四层的所述支化聚合物分子的聚合物分子。117.如实施方案116所述的方法，其中所述第五层的所述聚合物分子还包含拴系至所述第五层的所述聚合物分子的寡核苷酸。118.如实施方案117所述的方法，其中拴系至所述第五层的所述聚合物分子的所述寡核苷酸在所述第五层的多个深度处分布。119.如实施方案96所述的方法，其中所述至少一个亲水性聚合物涂层包含选自由以下组成的组中的分子：聚乙二醇(peg)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(pvp)、聚(丙烯酸)(paa)、聚丙烯酰胺、聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(pma)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚(寡(乙二醇)单甲醚甲基丙烯酸酯)(poegma)、聚谷氨酸(pga)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素和右旋糖酐。
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虽然已经示出和在本文所述了本发明的优选实施方案，但对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过举例的方式来提供此类实施方案。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本发明时可以以任何组合采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同方案的范围内的方法和结构。