用于制造sn-2棕榈酸三酰基甘油的方法与流程

1.本发明涉及用于制备包含在sn-2位具有棕榈酸残基的甘油三酯的成分的酶促方法，这些甘油三酯存在于哺乳动物母乳，特别是人母乳中。


背景技术：

2.三酰基甘油/甘油三酯(tag)是在人乳中以约39g/l存在的主要脂质，并且它们呈现脂肪酸的独特区域特定分布。tag的区域特定分布有助于人乳的营养有益效果，诸如对于脂肪酸和钙吸收，以及它们的相关有益效果诸如肠道舒适度。
3.婴儿配方食品(if)成分设计一般是相对于人乳组合物和有益效果的结构和功能同源性。
4.在tag中，在甘油部分的外部位置酯化的脂肪酸fa被命名为sn-1(3)或αfa，而在内部位置酯化的fa被命名为sn-2或βfa。乳中存在的fa主要是在乳腺中从头合成的或由饮食提供的fa掺入的。饱和fa的合成受饮食质量的影响，并且已经证明，当哺乳期妇女食用富含碳水化合物的饮食时，乳中6:0
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14:0 fa的水平增加，而源自饮食的18碳fa，例如18:1 n-9和18:2 n-6的含量降低。在多不饱和的fa中，亚油酸(la，18:2n-6)和α亚麻酸(ala，18:3n-3)是必需的，因为它们不是在人体中合成的，因此主要通过饮食获得。它们是花生四烯酸(20:4 n-6)和二十二碳六烯酸(22:6 n-3)的前体，它们与正常的脑发育相关，尤其是在生命早期。棕榈酸(pa，16:0)是人乳中最丰富的饱和fa，其水平相对恒定，占总乳fa的约20％-25％，与原产国和母亲的饮食无关，素食者是例外。在人乳中，超过70％的棕榈酸含量在tag的sn-2位被酯化。当与用其中pa优先在tag的sn-1(3)位酯化的配方食品喂养的婴儿相比时，这种特殊性允许母乳喂养的婴儿更有效地吸收和利用棕榈酸。在消化过程中，胰脂肪酶优先在tag的sn-1(3)位释放fa，以产生fa和2-单酰基甘油。在单酰基甘油的sn-2位酯化的pa大部分被吸收，而游离pa可与钙反应形成不溶性钙皂，该钙皂不容易被吸收并且存在于粪便中。一些研究已经观察到饱和fa的钙皂的形成可能导致婴儿产生更硬的粪便和便秘[giuffrida等人，molecules.2019年1月；24(1):22)]。
[0005]
人母乳脂质的甘油三酯分布也已经是研究的对象[例如在giuffrida等人，molecules.2019年1月；24(1):22)或h.kallio等人/food chemistry 233(2017)351
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360中]显示人母乳包含几种具有被棕榈酸残基占据的sn-2位的甘油三酯，例如opo(18:1-16:0-18:1)、opl(18:1-16:0-18:2)、ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)。另外kallio等人[h.kallio等人/food chemistry 233(2017)351
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360]指出具有被棕榈酸残基占据的sn-2位的人母乳甘油三酯中的丰度，芬兰乳样品中最丰富的tag为18:1/16:0/18:1(所有tag的9.4％)、18:2/16:0/18:1(5.4％)、18:1/16:0/12:0(3.5)、18:1/16:0/18:0(3.2)和18:1/16:0/16:0(3.0％)，而中国样品中最丰富的化合物的相应值为18:2/16:0/18:1(10.3％)、18:1/16:0/18:1(7.1％)、18:2/16:0/18:2(4.5％)、18:1/16:0/18:0(2.4)、18:1/16:0/16:0(2.4％)和18:1/16:0/12:0(2.1％)。
[0006]
因此，需要适于制备婴儿配方食品的脂质部分的基于甘油三酯的成分，以尽可能
接近地反映在位置sn-2处具有棕榈酸残基的甘油三酯的人母乳分布。类似于人母乳，此类成分应该包含tag，其具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量，并且在最丰富的甘油三酯中，在sn-2位具有棕榈酸的比例与在人母乳中存在的比例相似。
[0007]
目前没有经济上可行的生产适用于婴儿配方食品的甘油三酯的方法，理想的是，该甘油三酯在sn-2位包含超过75％的棕榈酸(也称为结构化脂质)。如今，此类用于婴儿配方食品的脂质是通过单步的无溶剂的酶促酸解反应制备的，其中棕榈酸含量高的脂肪与油酸反应生成opo。该反应是平衡控制的，并且为了获得高转化率，需要使用高过量(当量)的油酸(akoh，2017)。
[0008]
为了改变三酰基甘油(tag)的脂肪酸组分，可以使用脂肪酶将tag中的脂肪酸与添加到反应混合物中的游离脂肪酸交换。例如，通过在诸如三棕榈酸甘油酯的底物上使用sn-1(3)特异性脂肪酶并通过向反应混合物中添加油酸，可以产生opo成分。该方法的主要缺点是反应平衡是热力学控制的，并且需要过量的游离脂肪酸才能将平衡推向产物侧。添加过量的游离脂肪酸会增加工艺成本(例如考虑到额外的纯化步骤)和/或限制可能的产物产率。和是两种模拟人乳脂肪的商业脂肪(loders croklaan，aak)，均通过用sn-1(3)特异性脂肪酶(akoh，2017)酸解产生。
[0009]
作为生产具有高sn-2棕榈酸含量的结构化脂质的替代方法，文献描述了通过将甘油三酯醇解为2-甘油单酯中间体(schmid等人，1999)以及随后用ffa(游离脂肪酸)将其酯化的酶促两步法，其提供更高的反应控制、纯度和产率。然而，该两步法需要使用溶剂以及昂贵的起始材料(纯三棕榈酸甘油酯)和中间体纯化步骤。
[0010]
需要溶剂有两个原因：i)溶解甘油三酯底物，即三棕榈酸甘油酯，和ii)用于稀释以限制在醇解步骤中醇(甲醇、乙醇)对脂肪酶的抑制。通过在有机溶剂中重结晶或通过在强真空下蒸馏进行中间体纯化。
[0011]
此外，用于醇解的tag起始材料的sn-2fa含量对最终tag产物分布具有显著影响，以最大限度地提高最终产物中的sn-2棕榈酸酯。这就是在该方法中使用纯三棕榈酸甘油酯的原因。
[0012]
因此，为了使酶促两步法变得经济上可行和工业上适用，应考虑成本和起始材料组合物。为此，需要减少或去除溶剂的使用并且必须简化中间体纯化，同时保持所获得的opo成分的高纯度和高选择性，例如至少50％的总opo纯度和至少70％的sn-2位的总pa。
[0013]
因此，还需要提供经济上可行和工业上适用的用于制备包含tag的成分的方法，该tag具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量，并且在最丰富的甘油三酯中，在sn-2位具有棕榈酸的比例与在人母乳中存在的比例相似。


技术实现要素：

[0014]
本发明通过提供用于生产甘油三酯成分的简化的、无溶剂的两步酶促方法解决了上述问题，该甘油三酯成分具有大于70％，例如75％的在sn-2位的棕榈酸总含量，并且在最丰富的甘油三酯中，在sn-2位具有棕榈酸的比例与在人母乳中存在的比例相似。这种简化的酶促法概念为甘油三酯成分的生产提供了经济上可行的途径。
[0015]
在一个方面，本发明提供了如所附权利要求中所述的甘油三酯成分和用于制备甘油三酯成分的方法。
附图说明
[0016]
本发明的另外的特征和优点在下文参照附图给出的目前优选的实施方案的说明中有所描述，并且这些特征和优点将从该说明中显而易见，其中：
[0017]
图1示出了根据本发明的一个实施方案的总体方法的示意图。
[0018]
图2示出了实施例1的结果，并报告了使用脂肪酶lipozyme 435和tl im与不同醇进行的醇解反应在反应时间内2-单棕榈酸甘油酯的转化率。转化率计算为mol 2-单棕榈酸甘油酯/mol初始三棕榈酸甘油酯。
[0019]
图3示出了由如实施例1所述的lipozyme tl im催化的三棕榈酸甘油酯异丙醇解的转化率曲线。
[0020]
图4示出了实施例2的反应混合物中的每种定量物质占总定量的含棕榈酸化合物的百分比。
[0021]
图5示出了醇解产物的含量与来自相同混合物分级的沉淀物含量的比较(实施例4)。
具体实施方式
[0022]
定义
[0023]
在本发明的上下文中，术语“哺乳动物母乳”表示哺乳动物，例如人、狗、猫在哺乳期间产生的乳。
[0024]
在本发明的上下文中，术语“opo”或“18:1-16:0-18:1”是指1,3-油酰-2-棕榈酸甘油酯和/或2-(棕榈酰氧基)丙烷-1,3-二油酸酯和/或(2-(棕榈酰氧基)-1,3-丙烷取代基(9z,9'z)双(-9-十八烯酸酯)(cas号：1716-07-0)
[0025]
在本发明的上下文内，术语“poo”是指3-(棕榈酰氧基)-1,2-丙烷取代基(9z,9'z)双(-9-十八碳烯酸酯)(oop，cas号：14960-35-1)、和/或1-(棕榈酰氧基)-2,3-丙烷取代基(9z,9'z)双(-9-十八碳烯酸酯)(poo，cas号：14863-26-4)二者。应当指出的是，当提及“poo”的量时，这也包括存在于成分中的oop的量。
[0026]
在本发明的上下文中，术语“opl”、“lpo”或“18:2-16:0-18:1”是指1-油酰-2-棕榈酰-3-亚油酸甘油酯(cas号：2534-97-6)和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-亚油酸甘油酯。应注意的是，当提及“opl”、“lpo”或“18:2-16:0-18:1”的量时，其包括1-油酰-2-棕榈酰-3-亚油酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-亚油酸甘油酯的量。
[0027]
在本发明的上下文中，术语“opp”或“ppo”或“16:0-16:0-18:1”是指1-油酰-2,3-二棕榈酸甘油酯和/或3-油酰-1,2-二棕榈酸甘油酯(cas号：1867-91-0)。应注意的是，当提及“opp”或“ppo”或“16:0-16:0-18:1”的量时，其包括1-油酰-2,3-二棕榈酸甘油酯和/或3-油酰-1,2-二棕榈酸甘油酯的量。
[0028]
在本发明的上下文中，术语“ops”、“spo”或“18:0-16:0-18:1”是指2-棕榈酰-3-硬脂酰-1-油酸甘油酯和/或2-棕榈酰-1-硬脂酰-3-油酸甘油酯(cas号：35984-52-2)。应注意的是，当提及“ops”、“spo”或“18:0-16:0-18:1”的量时，其包括2-棕榈酰-3-硬脂酰-1-油酸甘油酯和/或2-棕榈酰-1-硬脂酰-3-油酸甘油酯的量。
[0029]
在本发明的上下文中，术语“opla”、“lapo”或“12:0-16:0-18:1”是指1-油酰-2-棕榈酰-3-月桂酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-月桂酸甘油酯(cas号：120932-38-9)。应
注意的是，当提及“opla”、“lapo”或“12:0-16:0-18:1”的量时，其包括1-油酰-2-棕榈酰-3-月桂酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-月桂酸甘油酯的量。
[0030]
在本发明的上下文中，术语“opm”、“mpo”或“(18:1-16:0-14:0)”是指1-油酰-2-棕榈酰-3-肉豆蔻酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-肉豆蔻酸甘油酯(cas号：110585-93-8)。应注意的是，当提及“opm”、“mpo”或“(18:1-16:0-14:0)”的量时，其包括1-油酰-2-棕榈酰-3-肉豆蔻酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-肉豆蔻酸甘油酯的量。
[0031]
在本发明的上下文中，术语“oppa”、“papo”或“(16:1-16:0-18:1)”是指1-油酰-2-棕榈酰-3-棕榈酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-棕榈酸甘油酯(cas号：114356-98-8)。应注意的是，当提及“oppa”、“papo”或“(16:1-16:0-18:1)”的量时，其包括1-油酰-2-棕榈酰-3-棕榈酸甘油酯和/或3-油酰-2-棕榈酰-1-棕榈酸甘油酯的量。
[0032]
在本发明的上下文中，术语“lpp”、“ppl”或“(16:0-16:0-18:2)”是指1,2-二棕榈酰-3-亚油酸甘油酯和/或2,3-二棕榈酰-1-亚油酸甘油酯(cas号：2535-35-5)。应注意的是，当提及“lpp”、“ppl”或“(16:0-16:0-18:2)”的量时，其包括1,2-二棕榈酰-3-亚油酸甘油酯和/或2,3-二棕榈酰-1-亚油酸甘油酯的量。
[0033]
在本发明的上下文中，术语“lpl”或“(18:2-16:0-18:2)”是指2-棕榈酰-1,3-二亚油酸甘油酯(cas号：2190-16-1)。
[0034]
在本发明的上下文中，术语“lppa”、“papl”或“(16:1-16:0-18:2)”是指3-亚油酰-2-棕榈酰-1-棕榈酸甘油酯和/或1-亚油酰-2-棕榈酰-3-棕榈酸甘油酯(cas号：907216-76-6)。应注意的是，当提及“lppa”，“papl”或“(16:1-16:0-18:2)”的量时，其包括3-亚油酰-2-棕榈酰-1-棕榈酸甘油酯和/或1-亚油酰-2-棕榈酰-3-棕榈酸甘油酯的量。
[0035]
在本发明的上下文中，术语“opo成分”或“富含opo的成分”或“1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯成分”或简称为“opo”表示包含纯度高于50g/100g该成分的1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯(opo)的可食用成分。在本发明的一个实施方案中，根据该方法制备的opo成分还具有在sn-2位的棕榈酸含量，其等于或高于总棕榈酸含量的70％。
[0036]
在本发明的上下文中，术语“tag”是指三酰基甘油或甘油三酯。
[0037]
在本发明的上下文中，术语“tag成分”或“sn-2棕榈酸tag成分”或“富含tag的成分”或“甘油三酯成分”或“合成甘油三酯组合物”表示包含甘油三酯的合成来源的可食用组合物，此类成分具有等于或高于总棕榈酸含量的70％的在sn-2位的棕榈酸含量，并且具有在sn-2位具有棕榈酸残基的甘油三酯的定制分布。
[0038]
在本发明的上下文中，术语“甘油三酯脂肪共混物”表示旨在用于婴儿配方食品的甘油三酯混合物，其可通过将本发明的甘油三酯成分与包含有限量的棕榈酸的植物油级分混合而获得。
[0039]
在本发明的上下文中，术语“在sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯”是指甘油三酯和/或甘油三酯成分，其中甘油三酯主链中高于70％的sn-2位被棕榈酸残基占据。在一个实施方案中，在sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯在甘油三酯主链中sn-2位被棕榈酸残基占据的比例高于80％。在一个实施方案中，在sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯是富含包含棕榈酸的甘油三酯的棕榈油级分，诸如(bunge loders croklaan)，其具有60％w/w的三棕榈酸甘油酯含量，并且其中甘油三酯主链中sn-2位被棕榈酸残基占据的比例高于80％。
[0040]
在本发明的上下文中，术语“醇解”是指甘油三酯中存在的脂肪酸通过选择性酶的
作用与醇(甲醇、乙醇、丁醇
…
)发生酯交换反应。该反应导致相应醇的甘油单酯和脂肪酸酯的形成。
[0041]
在本发明的上下文中，术语“脂肪酶”或“sn-1,3脂肪酶”是指作用于酯键的水解酶(ec 3.1)并且属于羧酸酯水解酶类(ec 3.1.1)，并且更具体地讲，具有用于水解甘油三酯主链中的sn-1和sn-3酯键的高区域选择性。具有高1,3-选择性的脂肪酶可以来源于例如南极念珠菌(candidata antarctica)(脂肪酶b)、疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)、米黑根毛霉(rhizomucor miehei)、稻根霉(r.oryza)、德氏根霉(rhizopus delemar)等。
[0042]
在本发明的上下文中，术语“除臭”是指蒸汽蒸馏方法，其中在高温(通常》200℃)和高真空(通常《20mbar)的条件下将蒸汽注入油中以除去挥发性组分，如游离脂肪酸(ffa)、脂肪酸酯、甘油单酯和甘油二酯，并获得由tag组成的无味油。
[0043]
在本发明的上下文中，术语“分级”是指在相变期间将一定量的混合物(固体、液体、悬浮液)分离成级分的分离方法。这些级分的组成不同，因此通常允许在一个级分中富集物质并随后分离和/或纯化。
[0044]
在本发明的上下文中，术语“选择性沉淀”或“选择性结晶”表示分离和/或纯化技术，其中通过调节沉淀的温度从包含其他潜在沉淀物的溶液中产生一种或几种特定沉淀物(固体)。例如，熔点高于沉淀过程温度的物质在这些条件下不会形成沉淀物。在本发明的一个实施方案中，选择性沉淀导致所需产物的结晶。
[0045]
在本发明的上下文中，术语“固定形式”是指酶(即脂肪酶)以共价或非共价形式连接(例如吸附)到固体载体材料上。合适载体的非限制性示例是：由具有例如环氧基、丁基或氨基的甲基丙烯酸酯树脂与合适的连接分子(例如戊二醛)一起制成的用于共价连接的大孔疏水载体；经由大孔载体通过疏水相互作用进行非共价固定的载体，该载体由例如聚苯乙烯类吸附剂、甲基丙烯酸十八烷基酯、聚丙烯、不可压缩硅胶制成；经由离子相互作用，使用离子交换树脂，例如聚苯乙烯离子交换树脂或二氧化硅进行非共价吸附的载体。
[0046]
固定形式的sn-1,3脂肪酶的非限制性示例是：吸附于二氧化硅上的来自疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanoginosus)的脂肪酶(例如lipozyme tl im，novozymes)、吸附于甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯共聚物上的来自南极念珠菌(candida antarctica)的脂肪酶b(例如lipozyme 435，novozymes)、经由离子交换连接在苯乙烯/dvb聚合物上的来自米黑根毛霉(rhizomucor miehei)的脂肪酶(例如40086，novozymes)或经由疏水相互作用连接在大孔聚丙稀上的脂肪酶(accurel ep 100)。
[0047]
合成甘油三酯组合物(甘油三酯成分)
[0048]
本发明的发明人进一步研究了人母乳脂质的甘油三酯分布，其分析了来自欧洲和中国哺乳期妇女的人母乳样品并发现了以下结果(也参见实验部分中的实施例a)：
[0049] 欧洲人乳中国人乳分析物名称％％18:1-16:0-18:113.913.818:1-16:0-18:25.9513.816:0-16:0-18:15.685.7
16:0-16:0-18:21.53.418:2-16:0-18:2《14.418:0-16:0-18:15.15416:1-16:0-18:12.132.5114:0-16:0-18:12.461.8718:1-16:0-18:3《11.6212:0-16:0-18:12.863.0514:0-16:0-18:2《11.2816:1-16:0-18:2《12.9418:0-16:0-18:2《11.7410:0-16:0-18:11.271.79
[0050]
基于所发现的在sn-2位具有棕榈酸的甘油三酯的分布，本技术的发明人确定了对包含tag的甘油三酯成分的需要，该tag具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量，并且在sn-2位具有棕榈酸的甘油三酯的比率尽可能接近已被发现的在人母乳中存在的比率，如上所述。
[0051]
因此，一方面，本发明提供了甘油三酯成分，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，并且包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内。
[0052]
在本发明的一个实施方案中，提供了甘油三酯成分，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含至少一种选自由以下组成的组的甘油三酯：ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2-1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05-1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05-1:0.5的范围内。
[0053]
在另一个实施方案中，提供了甘油三酯成分，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)甘油三酯，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2-1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05-1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05-1:0.5的范围内。
[0054]
在本发明的一个实施方案中，提供了甘油三酯成分，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含至少一种选自由以下组成的组的甘油三酯：ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)、lapo(12:0-16:0-18:1)、opm(18:1-16:0-14:0)、oppa(16:1-16:0-18:1)、lpp(16:0-16:0-18:2)、lpl(18:2-16:0-18:2)和lppa(16:1-16:0-18:2)，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2至1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于opm在1:0.05至1:0.3的范围内，对于oppa在1:
0.05至1:0.3的范围内，对于lpp在1:0.05至1:0.4的范围内，对于lpl在1:0至1:0.5的范围内，并且对于lppa在1:0至1:0.5的范围内。
[0055]
在另一个实施方案中，提供了甘油三酯成分，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)、opm(18:1-16:0-14:0)、oppa(16:1-16:0-18:1)、lpp(16:0-16:0-18:2)、lpl(18:2-16:0-18:2)和lppa(16:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2至1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于opm在1:0.05至1:0.3的范围内，对于oppa在1:0.05至1:0.3的范围内，对于lpp在1:0.05至1:0.4的范围内，对于lpl在1:0至1:0.5的范围内，并且对于lppa在1:0至1:0.5的范围内。
[0056]
在本发明的一个实施方案中，甘油三酯成分包含20％至25％范围内的opo量、20％至25％范围内的opl量、7％至15％范围内的ppo量、1％至5％范围内的spo量和1％至5％范围内的lapo量。
[0057]
在本发明的一个实施方案中，甘油三酯成分包含20％至25％范围内的opo量、10％至25％范围内的opl量、7％至15％范围内的ppo量、1％至5％范围内的spo量、1％至5％范围内的lapo量、1％至5％范围内的opm量、1％至5％范围内的oppa量和0.5％至7％范围内的lpp量、0％至7％范围内的lpl量，以及0％至5％范围内的lppa量。
[0058]
在本发明的一个实施方案中，甘油三酯成分包含在sn2位具有棕榈酸的甘油三酯，其比率类似于在中国人母乳样品中观察到的比率。
[0059]
在此类实施方案中，根据本发明的甘油三酯成分包含20％至25％范围内的opo量、10％至25％范围内的opl量、7％至15％范围内的ppo量、1％至5％范围内的spo量、1％至5％范围内的opla量、1％至5％范围内的opm量、1％至5％范围内的oppa量和0.5％至7％范围内的lpp量、2％至7％范围内的lpl量以及0％至5％范围内的lppa量。
[0060]
在本发明的另一个实施方案中，本发明的甘油三酯成分包含在sn-2位具有棕榈酸的甘油三酯，其比率类似于在欧洲人母乳样品中观察到的比率。
[0061]
甘油三酯成分的用途
[0062]
在本发明的一个方面，提供了根据本发明的甘油三酯成分用于制备要掺入婴儿配方产品中的脂肪共混物的用途，其中它将代表婴儿配方食品脂质部分的至少一部分。
[0063]
根据本发明的甘油三酯成分包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，并且包含在sn-2位具有棕榈酸的特定tag，其比率类似于人乳样品中存在的比率。由于其性质，本发明的sn-2tag成分可以方便地与任何植物油(包含最小量的棕榈酸残基)混合，并且适合用于婴儿配方食品中，以允许制备用于婴儿配方食品的脂肪共混物，其类似于人母乳中存在的在sn-2位具有棕榈酸的tag的分布。
[0064]
甘油三酯脂肪共混物
[0065]
因此，在一个方面，本发明还提供了甘油三酯脂肪共混物，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，并且包含在sn-2位具有棕榈酸的特定tag，其比率类似于人乳样品中存在的比率。
[0066]
在一个实施方案中，本发明提供了甘油三酯脂肪共混物，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，并且包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内。
[0067]
在本发明的一个实施方案中，提供了甘油三酯脂肪共混物，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含至少一种选自由以下组成的组的甘油三酯：ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2-1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05-1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05-1:0.5的范围内。
[0068]
在另一个实施方案中，提供了甘油三酯脂肪共混物，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)甘油三酯，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2-1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05-1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05-1:0.5的范围内。
[0069]
在本发明的一个实施方案中，提供了甘油三酯脂肪共混物，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含至少一种选自由以下组成的组的甘油三酯：ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)、lapo(12:0-16:0-18:1)、opm(18:1-16:0-14:0)、oppa(16:1-16:0-18:1)、lpp(16:0-16:0-18:2)、lpl(18:2-16:0-18:2)和lppa(16:1-16:0-18:2)，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2至1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于opm在1:0.05至1:0.3的范围内，对于oppa在1:0.05至1:0.3的范围内，对于lpp在1:0.05至1:0.4的范围内，对于lpl在1:0至1:0.5的范围内，并且对于lppa在1:0至1:0.5的范围内。
[0070]
在另一个实施方案中，提供了甘油三酯脂肪共混物，其包含具有70％或更多的在sn-2位酯化的棕榈酸含量的tag，包含opo(18:1-16:0-18:1)和opl(18:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中opo与opl甘油三酯之间的比率在1:0.3至1:1.5的范围内，并且还另外包含ppo(16:0-16:0-18:1)、spo(18:0-16:0-18:1)和lapo(12:0-16:0-18:1)、opm(18:1-16:0-14:0)、oppa(16:1-16:0-18:1)、lpp(16:0-16:0-18:2)、lpl(18:2-16:0-18:2)和lppa(16:1-16:0-18:2)甘油三酯，其中当存在时，opo与此类甘油三酯中的每一种之间的比率对于ppo在1:0.2至1:0.6的范围内，对于lapo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于spo在1:0.05至1:0.5的范围内，对于opm在1:0.05至1:0.3的范围内，对于oppa在1:0.05至1:0.3的范围内，对于lpp在1:0.05至1:0.4的范围内，对于lpl在1:0至1:0.5的范围内，并且对于lppa在1:0至1:0.5的范围内。
[0071]
在本发明的一个实施方案中，甘油三酯脂肪共混物包含10％至15％范围内的opo量、10％至15％范围内的opl量、4％至9％范围内的opp量、0.5％至3％范围内的ops量和0.5％至3％范围内的opla量。
[0072]
在本发明的一个实施方案中，甘油三酯脂肪共混物包含10％至15％范围内的opo量、5％至15％范围内的opl量、4％至9％范围内的opp量、0.5％至3％范围内的ops量和0.5％至3％范围内的opla量、0.5％至3％范围内的opm量、0.5％至3％范围内的oppa量和0.5％至5％范围内的lpp量、0％至5％范围内的lpl量以及0％至5％范围内的lppa量。
[0073]
在本发明的一个实施方案中，甘油三酯脂肪共混物包含在sn2位具有棕榈酸的甘油三酯，其比率类似于在中国人母乳样品中观察到的比率。
[0074]
在此类实施方案中，根据本发明的甘油三酯脂肪共混物包含10％至15％范围内的opo量、10％至15％范围内的opl量、4％至9％范围内的opp量、0.5％至3％范围内的ops量和0.5％至3％范围内的opla量、0.5％至3％范围内的opm量、0.5％至3％范围内的oppa量和0.5％至5％范围内的lpp量、0％至5％范围内的lpl量以及0％至5％范围内的lppa量。
[0075]
在本发明的另一个实施方案中，本发明的甘油三酯脂肪共混物包含在sn2位具有棕榈酸的甘油三酯，其比率类似于在欧洲人母乳样品中观察到的比率。
[0076]
制备甘油三酯成分(sn-2tag成分)的方法
[0077]
醇解[步骤a)]
[0078]
三棕榈酸甘油酯选择性醇解为2-单棕榈酸甘油酯的挑战是三棕榈酸甘油酯的高熔点(65℃)。由于化学醇解是非特异性的，因此它不能用于生产2-单棕榈酸甘油酯。相反，酶促醇解可导致sn-1,3位的高选择性醇解，使得2-单棕榈酸甘油酯的高纯度合成成为可能。使用酶的问题是大多数商业酶的热稳定性相对较差，并且当反应在高于50℃下进行时会导致脂肪酶失活。为了在较低温度(《50℃)下最大限度地减少脂肪酶失活并实现底物(例如三棕榈酸甘油酯)的完全溶解，通常使用有机溶剂，最常见的是丙酮、正己烷或mtbe。然而，在工业应用中使用溶剂会增加工艺复杂性和操作(溶剂去除和处理、安全性)，因此会增加工艺成本(溶剂成本、更大的反应体积以及设备/反应器)并造成环境负担(溶剂回收)。
[0079]
在本发明的上下文中，从常用的醇，甲醇和乙醇转换为以高摩尔比(15当量)提供的正丁醇令人惊讶地允许底物在50℃下溶解而不会使酶失活，产生了具有90％纯度的2-单棕榈酸甘油酯。
[0080]
在本发明的一个实施方案中，醇解步骤a)用正丁醇、正戊醇、异丙醇或它们的混合物进行。
[0081]
在本发明的一个实施方案中，醇解步骤a)用过量的正丁醇进行。
[0082]
通过在步骤a)中使用正丁醇(醇解)，反应在50℃下在没有任何溶剂的情况下进行。丁醇同时作为甘油三酯的底物和增溶剂，从而能够进行无溶剂反应，获得高转化率(过量)和脂肪酶活性。
[0083]
在本发明的一个实施方案中，用于步骤a)的起始材料是在sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯混合物，诸如(其是bunge loders croklaan的市售产品)。
[0084]
在本发明的一个实施方案中，步骤a)在40℃至70℃范围内的温度，例如在45℃至55℃范围内的温度进行。
[0085]
在一个实施方案中，步骤a)在sn-1,3脂肪酶的存在下进行，该sn-1,3脂肪酶选自由以下组成的组：吸附于二氧化硅上的来自疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanoginosus)的脂肪酶(例如lipozyme tl im，novozymes)、吸附于甲基丙烯酸酯/二乙烯基苯共聚物上的来自南极念珠菌(candida antarctica)的脂肪酶b(例如lipozyme 435，
novozymes)、经由离子交换连接在苯乙烯/dvb聚合物上的来自米黑根毛霉(rhizomucor miehei)的脂肪酶(例如40086，novozymes)或经由疏水相互作用连接在大孔聚丙稀上的脂肪酶(accurel ep 100)。
[0086]
在另一个实施方案中，步骤a)在sn-1,3脂肪酶的存在下进行，所述sn-1,3脂肪酶为吸附于二氧化硅上的来自疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanoginosus)的脂肪酶(例如lipozyme tl im，novozymes)。
[0087]
在步骤a)中，固定酶制剂允许将脂肪酶适当地分散在诸如脂肪和溶剂的非水介质中，并且能够回收和再利用，使得该方法更具成本效益。
[0088]
因此，本发明所述的醇解步骤为根据本发明的方法提供了几个优点，例如：
[0089]-无溶剂反应允许更小的反应器体积(增加的体积生产率)、降低了工艺成本并且省略了安全处理方面、溶剂的去除和回收(出于质量和安全原因，溶剂去除对于针对婴儿营养的成分是特别重要的)；
[0090]-固定脂肪酶，诸如lipozyme tl im(novozymes)，是可以工业规模获得的市售脂肪酶。
[0091]
中间体纯化[步骤b)]
[0092]
根据本发明的两步酶促方法比生产opo的常规方法，例如单步酸解更复杂，然而，适度增加复杂性能够显著改善最终产物的质量，即更高的sn-2棕榈酸酯含量，使其更适合用于if。
[0093]
两步方法需要中间体的纯化，并且重要的是，质量的提高不会被可能源自中间体纯化[步骤b)]的成本的增加抵消。
[0094]
目前用于中间体纯化的技术包括分子蒸馏、溶剂结晶和色谱法，但是所有这三种方法对于目标应用而言都太昂贵，需要进行改进/简化。例如，溶剂分级方法通常需要使用溶剂和低温(《-10℃)。
[0095]
根据本发明的方法，中间体纯化步骤b)可以通过2-单棕榈酸甘油酯的选择性结晶来进行。在该纯化步骤中去除的副产物是醇(甲醇、乙醇、丁醇
…
)与1,3位存在的脂肪酸(主要是棕榈酸)的反应产物。根据所用的醇，所得的酯具有不同的熔点。具体地讲，棕榈酸丁酯具有比棕榈酸甲酯和棕榈酸乙酯(分别为30℃和24℃)更低的熔点(17℃)，从而提供了2-单棕榈酸甘油酯(60℃)与要去除的副产物之间更大的熔点差值。这种较高的差值有利于分离过程。在醇解步骤a)之后，通过在0℃至10℃范围内的温度分级粗产物，可以有效地去除包括醇解中使用的过量醇的此类副产物，由此2-单棕榈酸甘油酯经历选择性结晶，并且副产物保持为液态并且可以被滤出，例如。
[0096]
因此，粗产物的高于0℃的分级温度和不添加溶剂允许2-单棕榈酸甘油酯的简单且廉价的纯化步骤。
[0097]
使用无溶剂分级，目标产物(2-单棕榈酸甘油酯)的选择性结晶可以在较高温度进行，并且不需要执行通过蒸馏去除溶剂的步骤。
[0098]
在本发明的一个实施方案中，通过将反应混合物的温度降低至0℃至10℃范围内的温度来执行步骤b)，通过2-单棕榈酸甘油酯选择性沉淀和通过滤出上清液进行分级。
[0099]
无溶剂酯化[步骤c)]
[0100]
2-单棕榈酸甘油酯的无溶剂酶促酯化形成opo已在之前的文献中描述过。在通过
脂肪酶催化高选择性合成1,3-油酰基-2-棕榈酰基甘油(schmid等人，1999)的研究中，使用固定在不同载体材料上的来自米赫根毛霉(rhizomucormiehei)和德氏根霉(rhizopusdelemar)的sn-1,3特异性脂肪酶合成opo。反应在50℃下用3当量的油酸和高度纯化的2-单棕榈酸甘油酯(在-25℃通过溶剂结晶)进行。基于2-单棕榈酸甘油酯的重量，使用10％至25％的固定脂肪酶，并且作者指出，在16小时的反应之后，使用固定在大孔聚丙烯(ep 100)上的德氏根霉(rhizopus delemar)脂肪酶，用96％的sn-2棕榈酸获得78％的opo。然而，相同的研究揭示了此类固定的德氏根霉(r.delemar)脂肪酶的有限的温度稳定性(在52℃下)，并且此外，在2-单棕榈酸甘油酯酯化期间需要很长的反应时间才能达到高opo浓度。
[0101]
在预筛选测试中，使用纯2-单棕榈酸甘油酯作为起始材料，并评价三种不同的固定脂肪酶；lipozyme 435、lipozyme tl im、novozymes 40145ns。形成tag时最有效的脂肪酶是novozymes ns 40145和tl im。
[0102]
选择lipozyme tl im，因为已经证明它在丁醇醇解反应中最有效。
[0103]
另外，在两个反应步骤中使用相同的脂肪酶使该方法更具成本效益，并且允许在两个方法步骤a)和c)中重复使用相同的固定酶制剂。从到sn-2tag成分的整个过程可以仅使用一种脂肪酶进行：lipozyme tl im。
[0104]
在步骤c)中，固定酶制剂允许将脂肪酶适当地分散在诸如脂肪和溶剂的非水介质中，并且能够回收和再利用，使得该方法更具成本效益。
[0105]
在本发明的一个实施方案中，步骤c)在35℃至60℃范围内的温度，例如在40℃至50℃范围内的温度进行。
[0106]
在一个实施方案中，步骤c)的固定脂肪酶是来源于吸附于二氧化硅上的疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosis)的脂肪酶(例如来自novozymes的lipozyme tl im)。
[0107]
在一个实施方案中，步骤c)在总共2当量至3当量(摩尔比)的脂肪酸混合物的存在下进行。
[0108]
在一个实施方案中，在步骤c)中用于进行酯化的脂肪酸混合物包含50％至70％的油酸、25％至30％的亚油酸、1％至3％的肉豆蔻酸、1％至3％的棕榈油酸、2％至4％的月桂酸和2％至4％的硬脂酸，其中此类量是相对于脂肪酸混合物的总含量。
[0109]
除臭[步骤d)]
[0110]
来源于根据本发明方法的步骤c)的最终tag产物混合物的除臭可以作为任选的纯化步骤进行，以去除过量的游离脂肪酸、剩余的脂肪酸烷基酯以及甘油单酯和甘油二酯。
[0111]
通常，需要纯化的混合物和/或产物的除臭可以在高于》200℃的温度和低于20mbar的压力的真空条件下进行。
[0112]
实验部分
[0113]
实施例a
[0114]
欧洲和中国哺乳期妇女的人母乳样品分析
[0115]
分析了来自欧洲和中国哺乳期妇女的人母乳样品中的tag分布。使用-gottlieb(iso 1211)方法作为总脂质定量的参考方法。为了减少分析所需的样本量，该方法稍作修改：将样本量降低至100μl，并减小溶剂体积，以保持与参考方法相同的样本/溶剂比例。作为内标准溶液，使用1,3(d5)-二棕榈酰-2-硬脂酰-甘油0.4μmol l-1
。如前所述进行
分析[nagy等人2012,j.lipid res.2013,54,290-305]。简言之，色谱分离是用配备有agilent poroshell 120ec-c18柱(150x 2.1(i.d.)mm,2.7μm:agilent technologies,santa clara,ca,usa)的液相色谱仪实现的。溶剂a由正己烷和异丙醇(1:1，v:v)组成。溶剂b是溶解在甲醇中的10mmol l-1
甲酸铵。使用ltq-orbitrap elite混合质谱仪(thermofisher scientific)鉴定tag区域异构体。orbitrap以30,000的分辨率工作，质荷比(m/z)在200与1500之间。根据包括准确质量的氨化tag的包含列表，应用
±
5ppm的母体质量宽度标准产生数据相关事件。通过计算由人乳中最丰富的fa的组合获得的tag的准确质量来创建用于数据依赖型采集的包含列表。使用氨化加合物与钠化加合物之间的m/z 4.95540的质量标签，但只有氨化加合物被片段化。tag产物离子光谱中的峰允许测定fa残基，它们的强度允许根据前述数学模型测定fa区域异构位置。
[0116]
分析结果记录在下表a中，并示出了样品的完整tag分布。
[0117][0118][0119]
实施例1
[0120]
不同条件下通过无溶剂醇解生产2-单棕榈酸甘油酯
[0121]
材料和方法
[0122]
使用异丙醇、正丁醇或正戊醇作为醇，在无溶剂条件下对纯三棕榈酸甘油酯进行醇解。
[0123]
进行该研究，以评估使用链长为c3-c5的醇对三棕榈酸甘油酯进行无溶剂醇解以产生2-单棕榈酸甘油酯的可行性。为了使工艺步骤可行，必须实现高转化率，以避免产生会影响纯化过程和反应产率的副产物(例如甘油二酯)。
[0124]
设备：
[0125]
·
10x 1.5ml agilent gc玻璃小瓶，带隔膜的螺帽
[0126]
·
热混合器，具有改进的加热块以适合1.5ml agilent gc小瓶和温度控制
[0127]
化学品：
[0128]
·
三棕榈酸甘油酯，甘油三棕榈酸酯，98％，alfa aesar，lot#10184933
[0129]
·
2-丙醇，honeywell，chromasolv lc-ms
[0130]
·
1-丁醇，sigma-aldrich，≥99％
[0131]
·
1-戊醇，sigma-aldrich，≥99％
[0132]
在实验之前将醇在分子筛上干燥。
[0133]
酶：
[0134]
·
固定在疏水载体(丙烯酸树脂)上的lipozyme 435，novozymes，南极念珠菌(candida antarctica)脂肪酶b
[0135]
·
固定在硅胶载体(不可压缩)上的lipozyme tl im，novozymes，疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)脂肪酶
[0136]
工序
[0137]
·
将热混合器加热至50℃。
[0138]
·
将称量的175mg三棕榈酸甘油酯加入带有紧密螺帽的1.5ml玻璃小瓶中，该螺帽包含用于取样的橡胶隔膜。
[0139]
·
将醇添加到小瓶中，然后封闭小瓶。
[0140]
·
将封闭的小瓶放置于热混合器中，以650rpm的速度摇动，直至底物完全溶解。
[0141]
·
在反应开始之前(0分钟)，取样(10μl)。
[0142]
·
通过添加脂肪酶开始反应。
[0143]
·
在0、30、60、120、180和240分钟后取样。
[0144]
下表1记录了实验中使用的脂肪酶和醇以及每个反应小瓶中的质量和体积。制备双份混合物，制备总共10个小瓶并测试。
[0145]
表1
[0146][0147]
结果与讨论
[0148]
结果表明，可以使用任何所测试的脂肪酶，在无溶剂的情况下用链长为c3-c5的醇进行模型底物的酶促醇解。对于每个样品点，计算每个反应的三棕榈酸甘油酯至2-单棕榈酸甘油酯的转化产率(并记录在图2中)。使用lipozyme tl im和正丁醇，试验中实现的最佳转化产率为97％。
[0149]
在50℃下，三棕榈酸甘油酯完全溶解并与所测试的醇混溶。
[0150]
作为初步测试，已经在无溶剂的乙醇中进行了醇解。由于三棕榈酸甘油酯的高熔点，需要将反应温度提高至65℃，以具有溶解的三棕榈酸甘油酯，但在这些条件下，仅可观察到三棕榈酸甘油酯至2-单棕榈酸甘油酯的低转化率(33％，在lipozyme 435，novozymes存在下)。在50℃下通过添加较大体积的乙醇尝试溶解三棕榈酸甘油酯效果很差，因为脂质
和醇不完全混溶，得到浑浊悬浮液，并且未观察到酶促转化。
[0151]
lipozyme tl im
[0152]
使用lipozyme tl im用两种醇获得更高的产率：正丁醇和正戊醇。正丁醇反应转化率在2小时后达到最大，正戊醇反应在3小时后达到最大。用lipozyme tl im在正丁醇中实现了最高的转化率，反应2小时后达到》95％。对于lipozyme tl im，使用异丙醇的反应速率低于其他两种醇的反应速率，并且反应不完全。
[0153]
图3示出了以初始甘油酯含量的摩尔分数表示的三棕榈酸甘油酯、1,2-二棕榈酸甘油酯和2-单棕榈酸甘油酯的量。还示出了三个分数的总和。
[0154]
lipozyme 435
[0155]
在与正丁醇反应3小时后，使用lipozyme 435实现的最高转化率低于50％。使用异丙醇、lipozyme 435实现了比lipozyme tl im更高的反应速率。用异丙醇实现的最高转化率为40％，在与lipozyme 435反应2小时后达到。
[0156]
实施例2
[0157]
用lipozyme tl im对富含sn-2棕榈酸酯的脂肪进行无溶剂丁醇醇解
[0158]
在无溶剂条件下用工业上相关的起始材料进行富含sn-2棕榈酸酯的脂肪的醇解，以生产2-单棕榈酸甘油酯。
[0159]
实验证实，对于在使用正丁醇和lipozyme tl im的反应条件下进行的2-单棕榈酸甘油酯的酶促生产而言，(类似于三棕榈酸甘油酯)可以是sn-2棕榈酸酯的可行来源。
[0160]
设备：
[0161]
·
配备有螺帽和气体喷射管的500ml schott烧瓶
[0162]
·
磁力搅拌器，搅拌器板
[0163]
·
具有加热器/温度控制的水浴
[0164]
·
2个100ml具有带橡胶内衬的螺帽的schott烧瓶
[0165]
·
具有温度控制的adolf k
ü
hner lab-therm lab摇动器
[0166]
化学品：
[0167]
·
1-丁醇，sigma-aldrich，≥99％，经分子筛干燥
[0168]
·
[0169]
酶：
[0170]
·
固定在硅胶载体(不可压缩)上的lipozyme tl im，novozymes，疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)脂肪酶
[0171]
工序：
[0172]
干燥
[0173]
·
称量100g 并加入500ml schott烧瓶中
[0174]
·
将烧瓶放置于70℃的水浴中并用氮气喷射6小时。
[0175]
反应(重复)
[0176]
·
向100ml schott烧瓶中加入：
[0177]
ο10g干燥的
[0178]
ο17ml干燥正丁醇
[0179]
·
将烧瓶放置于70℃的水浴中直至脂肪完全溶解于丁醇中(澄清的浅黄色液体)。
[0180]
·
将烧瓶放置于50℃和1400rpm下的实验室摇动器中1小时
[0181]
·
反应开始前0分钟取样(10μl)
[0182]
·
通过添加1.5g lipozyme tl im开始反应。
[0183]
·
30、60、90、120和150分钟后收集样品
[0184]
脂肪酶可重复使用性
[0185]
高酶稳定性和可重复使用性是酶促工艺中工艺经济性和成本的一个重要驱动因素。在醇解期间测试lipozyme tl im的再循环使用性，方法是：在达到完全转化后去除(过滤)脂肪酶，将其转移到新鲜的底物溶液中，然后比较三个连续反应的转化产率和产物分布。
[0186]
工序：
[0187]
干燥
[0188]
·
称量100g并加入500ml schott烧瓶中
[0189]
·
将烧瓶放置于70℃的水浴中并用氮气喷射6小时。
[0190]
以与实施例2中所述相同的方式进行醇解反应，即使用1.5g lipozyme tl im作为生物催化剂，使10g干燥的cristal green与17ml正丁醇反应。反应进行2.5小时，然后停止。
[0191]
然后通过滤出酶终止反应。然后将相同的酶在相同的反应中重复使用三个循环。结果显示，可以在三个醇解反应中重复使用固定脂肪酶tl，而不会失去其活性，因为每个反应循环都获得了类似的产物分布。
[0192]
结果与讨论
[0193]
图4示出了使用的醇解反应的反应进程，其示出了包含棕榈酸(并且可通过gc定量)的所有物质的消耗和形成。基于sn-2位的棕榈酸含量，在该无溶剂醇解反应中从向2-单棕榈酸甘油酯的转化率总计为94％。起始原料在sn-2位包含32％的pa(其他pa位于sn-1和/或sn-3位)，并且在最终的2-单棕榈酸甘油酯产物中回收了这32％的pa的30％，导致94％的转化率。在少量副产物，即棕榈酸丁酯和1,2-dag中发现了不存在于sn-2位的剩余的6％的pa。最初存在于起始材料的sn-1和sn-3中的pa也被转化为棕榈酸丁酯。
[0194]
实施例3
[0195]
通过无溶剂分级(通过选择性沉淀)纯化2-单棕榈酸甘油酯的研究
[0196]
如实施例2所述，使用lipozyme tl im，通过对进行正丁醇醇解来制备2-单棕榈酸甘油酯，并经由选择性结晶而通过无溶剂分级来纯化。向2-单棕榈酸甘油酯中添加2当量的脂肪酸烷基酯和13当量的醇以产生用于研究的模型混合物(如下表2中所述)。然后通过在水浴中逐渐降低温度来分级这些混合物。
[0197]
表2：
[0198][0199]
部分i-制备棕榈酸烷基酯
[0200]
由棕榈酸和醇类甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇和正戊醇制备脂肪酸烷基酯。对于甲醇和乙醇反应，该反应在mtbe中进行。其他反应在无溶剂的情况下进行。脂肪酶435催化该反应。
[0201]
设备
[0202]
·
5个100ml具有带橡胶内衬的螺帽的schott烧瓶
[0203]
·
具有温度控制的adolf k
ü
hner lab-therm lab摇动器
[0204]
·bü
chi旋转蒸发器-实验室级蒸发器
[0205]
·
真空过滤装置
[0206]
·
5个50ml圆形烧瓶
[0207]
对于异丙醇、丁醇和戊醇，1克棕榈酸使用1克lipozyme 435在10ml醇中反应。用1ml醇和10ml mtbe进行甲醇和乙醇制备。将分子筛添加到混合物中以去除水。
[0208]
反应在50℃和1400rpm的摇动速度下进行。通过添加脂肪酶开始反应并进行12小时。通过滤出脂肪酶终止反应。在反应停止后，在旋转蒸发器中蒸发剩余的醇和溶剂。
[0209]
将来自蒸发的保留相转移到透明的2ml玻璃小瓶中并称重。如表2所示，计算2-单棕榈酸甘油酯和醇的相应量并将它们加入管中。
[0210]
部分ii-脂肪酸烷基酯、2-单棕榈酸甘油酯和各种醇的混合物的结晶/分级行为
[0211]
将在部分i中制备的混合物放置于40℃的水浴中。然后逐渐降低温度，对于以下5种混合物，观察到混合物的相变和沉淀行为(如表2所示)：
[0212]
棕榈酸甲酯 2-单棕榈酸酯 甲醇
[0213]
棕榈酸乙酯 2-单棕榈酸酯 乙醇
[0214]
棕榈酸异丙酯 2-单棕榈酸酯 异丙醇
[0215]
棕榈酸正丁酯 2-单棕榈酸甘油酯 正丁醇
[0216]
棕榈酸正戊酯 2-单棕榈酸甘油酯 正戊醇
[0217]
熔点：
[0218]
2-单棕榈酸甘油酯：65℃
[0219]
棕榈酸甲酯：30℃
[0220]
棕榈酸乙酯：24℃
[0221]
棕榈酸正丙酯：20.4℃
[0222]
棕榈酸正丁酯：16.9℃
[0223]
结果与讨论
[0224]
作为实验的结果，可以分级异丙基-、正丁基-和正戊基-混合物，因为2-单棕榈酸
甘油酯和1,2-二棕榈酸甘油酯沉淀，而醇及其相应的棕榈酸烷基酯保留在溶液中。甲基-和乙基-混合物不能分级。
[0225]
衍生自较长链醇的混合物形成1,2-二棕榈酸甘油酯和2-单棕榈酸甘油酯的白色晶体。
[0226]
衍生自较短链的混合物不能分级，而是整个混合物固化。
[0227]
从这些结果可以推断，在醇解步骤中使用长链醇有助于分级并且使无溶剂分级成为可能。
[0228]
因此，具有c3-c5醇为所需产物(2-单棕榈酸甘油酯)提供了简化中间体纯化步骤的附加的意想不到的有益效果。
[0229]
实施例4
[0230]
中间体纯化-通过由的无溶剂丁醇醇解获得的产物混合物的选择性结晶而进行的无溶剂分级
[0231]
进行该研究以经由选择性沉淀而通过无溶剂分级从如实施例2中所述的醇解步骤的产物中纯化2-单棕榈酸甘油酯。
[0232]
设备：
[0233]
·
50ml锥形瓶
[0234]
·
带有xxx玻璃过滤器的真空过滤装置
[0235]
化学品：
[0236]
·
从如实施例2中所述的醇解步骤，在2.5小时反应后获得由约0.95当量2-甘油单酯、0.05当量1,2-甘油二酯、2当量脂肪酸正丁酯、13当量正丁醇组成的最终反应混合物。
[0237]
·
正庚烷
[0238]
工序：
[0239]
·
通过过滤脂肪酶终止醇解反应
[0240]
·
将滤液转移到50ml锥形瓶中
[0241]
·
将烧瓶在4℃下放置过夜。
[0242]
·
将部分分级混合物倒在玻璃过滤器上。溶液通过，留下白色晶体滤饼。通过在晶体上滴加庚烷同时仍然运行真空来洗涤晶体。然后停止真空，并将晶体从过滤器上刮下。
[0243]
·
干燥器中干燥晶体并称重。
[0244]
从分级和过滤中回收1.62g晶体级分。
[0245]
如实施例2和4中所述获得的总工艺收率高达50％。
[0246]
结果和讨论
[0247]
成功地对来自的丁醇醇解的最终反应混合物进行了中间体纯化，该中间体纯化经由2-单棕榈酸甘油酯的选择性结晶而通过分级来进行。棕榈酸丁酯的量减少了90％。这表明该方法对于例如通过过滤从液体棕榈酸丁酯和丁醇中分离2-单棕榈酸甘油酯(晶体)是可行的。
[0248]
实施例5
[0249]
用于制备sn2 tag成分的来源于丁醇醇解的2-单棕榈酸甘油酯的无溶剂酯化
[0250]
将根据实施例4中所述的工序获得的2-单棕榈酸甘油酯产物用脂肪酸的混合物进
行酯化，以产生类似于人母乳的甘油三酯混合物。
[0251]
设备：
[0252]
·
2个25mm pyrex玻璃管，带有橡胶帽，橡胶帽配备有气体喷射管
[0253]
·
具有加热器/温度控制的水浴
[0254]
化学品：
[0255]
·
油酸，≥99％，sigma-aldrich，lot#0000051240
[0256]
·
亚油酸，≥99％，sigma-aldrich，lot#slcc7896
[0257]
·
棕榈油酸，≥99％，nu-chek prep，lot#u-40a-a25-b
[0258]
·
肉豆蔻酸，≥99％，nu-chek prep，lot#n-14a-f14-j
[0259]
·
月桂酸，≥98％，sigma-aldrich，lot#mkbx6772v
[0260]
·
2-单棕榈酸甘油酯，通过crystal green丁醇醇解产生，通过无溶剂分级结晶纯化
[0261]
酶：
[0262]
·
lipozyme tl im，novozymes，硅胶载体(不可压缩)，批次la331755
[0263]
一式两份：
[0264]
·
水浴加热至45℃
[0265]
·
添加到每个pyrex 25mm玻璃管中：
[0266]
ο1g 2-单棕榈酸甘油酯(如实施例4所述制备)
[0267]
ο总共2.6当量脂肪酸，其由以下组成：
[0268]
·
1.43ml油酸(60％)
[0269]
·
706μl亚油酸(30％)
[0270]
·
45μl棕榈油酸(2％)
[0271]
·
35mg肉豆蔻酸(2％)
[0272]
·
45mg月桂酸(3％)
[0273]
·
65mg硬脂酸(3％)
[0274]
·
将pyrex管放置于具有氮气喷射的水浴中，通过油2-单棕榈酸甘油酯/脂肪酸混合物，直到混合物变澄清，2-单棕榈酸甘油酯完全溶解
[0275]
·
0分钟取样(10μl)
[0276]
·
通过添加250mg lipozyme tl im开始反应
[0277]
2反应3小时后取样，进行lc-ms分析
[0278]
分析样品中的tag分布。使用-gottlieb(iso 1211)方法作为总脂质定量的参考方法。为了减少分析所需的样本量，该方法稍作修改：将样本量降低至100μl，并减小溶剂体积，以保持与参考方法相同的样本/溶剂比例。作为内标准溶液，使用1,3(d5)-二棕榈酰-2-硬脂酰-甘油0.4μmol l-1
。如前所述进行分析[nagy等人2012,j.lipid res.2013,54,290-305]。简言之，色谱分离是用配备有agilent poroshell 120ec-c18柱(150x 2.1(i.d.)mm,2.7μm:agilent technologies,santa clara,ca,usa)的液相色谱仪实现的。溶剂a由正己烷和异丙醇(1:1，v:v)组成。溶剂b是溶解在甲醇中的10mmol l-1
甲酸铵。使用ltq-orbitrap elite混合质谱仪(thermofisher scientific)鉴定tag区域异构体。orbitrap以30,000的分辨率工作，质荷比(m/z)在200与1500之间。根据包括准确质量的氨
化tag的包含列表，应用
±
5ppm的母体质量宽度标准产生数据相关事件。通过计算由人乳中最丰富的fa的组合获得的tag的准确质量来创建用于数据依赖型采集的包含列表。使用氨化加合物与钠化加合物之间的m/z 4.95540的质量标签，但只有氨化加合物被片段化。tag产物离子光谱中的峰允许测定fa残基，它们的强度允许根据前述数学模型测定fa区域异构位置。
[0279]
结果
[0280]
分析获得的组合物，一些获得的tag的结果记录在下表3中。结果表示为tag(g)占100g所获得组合物中全部甘油三酯的比率。
[0281]
表3
[0282][0283][0284]
实验表明，令人惊讶的是，在lypozyme tl im存在下，添加到混合物中的所有脂肪酸都可以掺入到所获得的产物中，并且根据本发明人的发现，所获得的在sn2位具有棕榈酸残基的tag的比率反映了在人乳样品中观察到的比率，如实施例a中所报告。
[0285]
实施例6
[0286]
从根据本发明的甘油三酯成分开始制备用于婴儿配方食品的具有类似于中国人母乳的sn2 tag分布的甘油三酯脂肪共混物
[0287]
将根据实施例5中所述的工序获得的甘油三酯成分与具有低棕榈酸含量的植物油混合物混合，该植物油混合物由例如纯的或混合的菜籽油、高油酸向日葵油、向日葵油组成。添加的植物油混合物占甘油三酯成分的40％，达到存在于tag成分中的tag的稀释效果，因为植物油不包含在sn-2位具有棕榈酸残基的tag。所得的甘油三酯脂肪共混物包含：
[0288]
分析物名称％18:1-16:0-18:113.9718:1-16:0-18:213.5616:0-16:0-18:16.7818:0-16:0-18:11.6316:0-16:0-18:23.5218:2-16:0-18:23.3016:1-16:0-18:11.1914:0-16:0-18:11.0616:1-16:0-18:20.37
12:0-16:0-18:11.46
[0289]
应当理解，对本文所述的目前优选的实施方案作出的各种变化和修改对于本领域的技术人员将为显而易见的。可在不脱离本发明的实质和范围并在不减少所伴随的优点的情况下作出这些变化和修改。因此，此类变化和修改旨在由所附权利要求书涵盖。