一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料。


背景技术：

2.以炎症性肠病(ibd)为代表的肠道疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，属于胃肠道慢性炎症性疾病，是较常见且病因复杂的肠道疾病之一。ibd会导致严重的胃肠道症状，包括腹泻、腹痛、出血、贫血和体重减轻。随着对ibd的深入研究，益生菌制品及其制品逐渐成为治疗ibd的新兴药物，能够通过参与肠道屏障的保护，调节免疫和炎性因子的表达缓解或治疗ibd。
3.益生菌作为一类对机体健康有益的微生物群，被定义为活性微生物补充剂，通过改善肠道微生物平衡对宿主产生有益影响。为了满足消费者对于功能性物质的需求，益生菌的形式现已逐渐多样化，例如，添加了不同益生菌的发酵乳制品、发酵乳饮料以及各种益生菌产品的液体载体。
4.然而部分人群对乳饮品存在乳糖不耐受的问题，使用含益生菌的乳饮品会导致腹胀、腹泻和腹痛现象。


技术实现要素：

5.针对背景技术中存在的问题，提出一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料。为深入研究益生菌植物饮料对改善肠道微生态平衡、提高肠道粘膜屏障和免疫，缓解炎症性肠病提供了一定的理论依据。
6.本发明提出一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料，以植物或植物提取物为主要原料，添加含有4种益生菌的复合菌株，再经过发酵、灭活工艺制备而成。
7.4种益生菌包括植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)、鼠李糖乳杆菌r7970(lactobacillus rhamnosus r7970)、乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactic v9)和干酪乳杆菌zhang(lactobacillus casei zhang)。
8.优选的，植物乳杆菌p-8保藏号为cgmcc no.6312；鼠李糖乳杆菌r7970保藏号为cgmcc no.22244；乳双歧杆菌v9保藏号为cgmcc no.5470；干酪乳杆菌zhang保藏号为cgmcc no.5469。
9.优选的，上述饮料的制备方法如下：
10.s1、混料：将各组分原料按比例混合均匀；
11.s2、化料：在55-60℃条件下对料液搅拌均匀，并调初始ph值至6.20
±
0.02；
12.s3、一次杀菌：对搅拌均匀后的料液进行杀菌；杀菌温度为95℃、时间为300s；
13.s4、冷却：将杀菌后的料液冷却至37℃；
14.s5、接种：向料液中按比例加入复合菌株：植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌r7970、乳双歧杆菌v9和干酪乳杆菌zhang；
15.s6、恒温发酵：于37℃条件下进行恒温发酵，至ph4.60停止发酵；
16.s7、离心：4000
×
g、15min离心，取上清液；
17.s8、二次杀菌：杀菌温度为85℃、时间为15min；
18.s9、无菌灌装：对杀菌后的复合益生菌发酵植物饮料进行无菌灌装，备用。
19.优选的，各组分原料包括0.5％的陈皮粉、6.0％的枸杞粉、0.5％的蘑菇粉、1.0％的菊粉和92.0％的蒸馏水。
20.本发明又提出一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料在调节肠道微生态平衡、改善肠道粘膜屏障和免疫功能中的应用。
21.本发明又提出一种所述改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料在缓解和/或治疗ibd中的应用。
22.优选的，上述饮料的应用不只作用于炎症性肠病，也对肠道微生态平衡、肠道屏障改善和/或免疫调节的均可产生有益效果。可作为功能性食品或功能性保健品。
23.与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
24.本发明提出一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料，以植物或植物提取物为主要原料，添加含有4种益生菌的复合菌株，再经过发酵、灭活工艺制备而成。4种益生菌包括植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌r7970、乳双歧杆菌v9和干酪乳杆菌zhang。
25.与发酵乳制品相比，以植物为基质的益生菌饮料不含乳制品成分，因此降低了乳糖不耐受等不良反应的发生概率。植物发酵产品不仅可提供抗氧化物质、生物活性化合物和矿物质等微量营养素，还可以通过发酵提高类黄酮成分的吸收率和生理活性，从而达到改善肠道健康、增强抗氧化活性和免疫功能的作用。
26.通过靶向代谢组学技术对饮料中的功能性物质进行检测，检测出其中丰度较高的代谢物有氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类和碳水化合物类，因此可以作为功能性保健品应用于调节肠道微生态平衡、改善肠道粘膜屏障和免疫功能中。再通过饮料治疗炎症性肠炎(ibd)动物试验，发现其对肠道屏障和免疫功能具有改善作用，可以作为功能性保健品，应用于缓解和/或治疗ibd中，具有极大的推广价值。
附图说明
27.图1为本发明一种实施例中代谢物分类示意图。
28.图2本发明一种实施例中代谢物各类物质占比示意图。
29.图3本发明一种实施例中氨基酸种类示意图。
30.图4本发明一种实施例中涉及ibd治疗的影响实验设计流程图。
31.图5本发明一种实施例中涉及ibd治疗时不同处理方式下组大鼠结肠h&e染色结果示意图。
32.图6本发明一种实施例中涉及ibd治疗时不同处理方式下组大鼠体重变化示意图。
33.图7本发明一种实施例中涉及ibd治疗时不同处理方式下组大鼠组织学损伤评分示意图。
34.图8本发明一种实施例中涉及ibd治疗时不同处理组对ibd大鼠免疫因子的影响示意图。
具体实施方式
35.实施例一
36.本发明提出一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料，以植物或植物提取物为主要原料，添加含有4种益生菌的复合菌株，再经过发酵、灭活工艺制备而成。
37.4种益生菌包括植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)、鼠李糖乳杆菌r7970(lactobacillus rhamnosus r7970)、乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactic v9)和干酪乳杆菌zhang(lactobacillus casei zhang)。
38.进一步的，植物乳杆菌p-8保藏号为cgmcc no.6312；鼠李糖乳杆菌r7970保藏号为cgmcc no.22244；乳双歧杆菌v9保藏号为cgmcc no.5470；干酪乳杆菌zhang保藏号为cgmcc no.5469。
39.实施例二
40.本发明提出一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料，以植物或植物提取物为主要原料，添加含有4种益生菌的复合菌株，再经过发酵、灭活工艺制备而成。
41.4种益生菌包括植物乳杆菌p-8(lactobacillus plantarum p-8)、鼠李糖乳杆菌r7970(lactobacillus rhamnosus r7970)、乳双歧杆菌v9(bifidobacterium lactic v9)和干酪乳杆菌zhang(lactobacillus casei zhang)。
42.进一步的，上述饮料的制备方法如下：
43.s1、混料：将各组分原料按比例混合均匀；
44.s2、化料：在55-60℃条件下对料液搅拌均匀，并调初始ph值至6.20
±
0.02；
45.s3、一次杀菌：对搅拌均匀后的料液进行杀菌；杀菌温度为95℃、时间为300s；
46.s4、冷却：将杀菌后的料液冷却至37℃；
47.s5、接种：向料液中按比例加入复合菌株：植物乳杆菌p-8、鼠李糖乳杆菌r7970、乳双歧杆菌v9和干酪乳杆菌zhang；
48.s6、恒温发酵：于37℃条件下进行恒温发酵，至ph4.60停止发酵；
49.s7、离心：4000
×
g、15min离心，取上清液；
50.s8、二次杀菌：杀菌温度为85℃、时间为15min；
51.s9、无菌灌装：对杀菌后的复合益生菌发酵植物饮料进行无菌灌装，备用。
52.进一步的，各组分原料包括0.5％的陈皮粉、6.0％的枸杞粉、0.5％的蘑菇粉、1.0％的菊粉和92.0％的蒸馏水。
53.实施例三
54.本发明通过靶向代谢组学技术对上述复合益生菌发酵植物饮料中的功能性物质进行检测。
55.1、实验方法
56.1.1、实施例制备得到含有复合益生菌的发酵植物饮料。
57.1.2、实验分组：将制备得到的复合益生菌发酵植物饮料，采集三份平行样品，30克/份，无菌自封袋包装。
58.1.3、采用靶向代谢组学技术进行检测：样品在冰浴下解冻，将20μl复合益生菌的发酵植物饮料样品添加至96孔板。然后将板转移到eppendorf epmotion工作站(eppendorf inc.，humburg,germany)。加入冰水预冷的甲醇溶液(含内标)120微升，并剧烈涡旋5分钟。
将板4℃下离心(4000g，30min)。然后将板放回工作站。每个孔中加入20μl新鲜配制的衍生化试剂，将板密封，置于30℃进行60min的衍生化。然后加入330μl冰浴的50％甲醇溶液稀释样品，接着在4℃下离心(4000g，30min)，吸取135μl上清液，转移至新的96孔板，每个孔中加入10μl的内标。在左边孔中加入衍生化的标准品原液的梯度稀释液，最后将板密封，用于lc-ms分析。
59.复合益生菌发酵植物饮料的代谢物检测结果如下：
60.检测出共有201种代谢物(见图1)，可分为14类，分别是短链脂肪酸类、吡啶类、苯丙素类、酚类、有机酸类、核苷酸类、吲哚类、脂肪酸类、肉碱类、碳水化合物类、胆汁酸类、苯甲酸类、苯环型化合物类和氨基酸类。其中丰度较高的代谢物有：氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类和碳水化合物类(见图2)。
61.进一步分析，脂肪酸类检测结果如表1所示，有机酸类检测结果如表2所示，氨基酸类检测结果如表3所示。糖酵解和三羧酸循环相关代谢物检测结果如表4所示。肉碱类代谢物检测结果如表5所示。苯甲酸类代谢物检测结果如表6所示。吡啶类\苯丙素类代谢物检测结果如表7所示。
62.表1脂肪酸名称及含量
[0063][0064]
表2有机酸名称及含量
[0065]
[0066][0067]
表3氨基酸名称及含量
[0068]
[0069][0070]
表4糖酵解/三羧酸循环相关代谢物名称及含量
[0071]
[0072][0073]
表5肉碱类代谢物名称及含量
[0074][0075]
表6苯甲酸类代谢物名称及含量
[0076][0077]
表7吡啶类\苯丙素类代谢物名称及含量
[0078][0079]
脂肪酸能提供热量，是很好的能量来源。可以贮存在脂肪细胞中，以备人体不时之需。能保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能。使胆固醇酯化，降低血液中胆固醇和甘油三酯含量。可以提高脑细胞活性，增强记忆力和思维能力。有机酸类具有抑菌、利胆、消炎、降血糖、抗氧化以及调节机体免疫等作用，能够增加冠状动脉血流量、抑制脑组织脂质过氧化物生成、软化血管、促进钙、铁元素的吸收，同时帮助胃液消化脂肪，还能够预防疾病和促进新陈代谢等作用。氨基酸类成分可以增加饮料的风味，又可以作为营养物资，参与身体代谢。糖酵解和三羧酸循环相关代谢物、肉碱类代谢物、苯甲酸类代谢物、吡啶类\苯丙素类代谢物均是利于人体健康的成分。因此，本发明中的复合益生菌发酵植物饮料中富含对人体健康有益的功能物质。基于上述检测结果，本发明中的一种改善肠道屏障和免疫功能的复合益生菌发酵植物饮料可以作为功能性保健品应用于调节肠道微生态平衡、改善肠道粘膜屏障和免疫功能中，推广价值大。
[0080]
实施例四
[0081]
本发明又提出复合益生菌发酵植物饮料治疗炎症性肠炎(ibd)动物试验，试验内容如下：选择33只6周龄wistar雄性大鼠。将其分为正常组(12只)、模型组(12只)、饮料组(9只)。从0天开始正常组灌胃2ml生理盐水，其余组灌胃2ml 3％dss(葡聚糖硫酸钠)持续7天，从第8天开始正常组和模型组灌胃2ml生理盐水，饮料组每只大鼠灌胃2ml稀释后的复合益生菌发酵植物饮料(0.5ml饮料用生理盐水稀释到2ml)，持续三周。在第0天、第7天和第21天分别收集粪便和血清样品。结合h&e染色、体重、血清中细胞因子和组织学损伤评分综合评估复合益生菌发酵植物饮料对大鼠炎症性肠病的影响。具体实验方案参考图4。结果如下：
[0082]
1.不同处理组大鼠结肠h&e染色结果
[0083]
将灌胃复合益生菌发酵植物饮料的大鼠进行结肠切片，结肠h&e染色结果显示，与模型组相比较，饮料组固有层肠腺数量丰富，可见较多杯状细胞，肌纤维形态正常，未见明显炎症。说明复合益生菌发酵植物饮料可显著改善ibd大鼠结肠组织损伤。见图5。
[0084]
2.不同处理组大鼠体重变化
[0085]
将灌胃复合益生菌发酵植物饮料的大鼠进行称重，结果显示：模型组在诱导ibd大鼠后出现体重下降现象，在灌胃复合益生菌发酵植物饮料后发现，与模型组相比较饮料组可明显提高大鼠体重。说明复合益生菌发酵植物饮料可有效改善炎症性肠病(ibd)，见图6。
[0086]
3.不同处理组大鼠组织学损伤评分
[0087]
将灌胃复合益生菌发酵植物饮料的大鼠进行组织学评分，结果显示：模型组在诱导ibd大鼠后的结肠组织损伤严重，评分明显高于正常组。在灌胃复合益生菌发酵植物饮料后发现，饮料组可明显降低大鼠组织学损伤评分。说明复合益生菌发酵植物饮料可有效改善炎症性肠病(ibd)，见图7。
[0088]
4.不同处理组对ibd大鼠免疫因子的影响
[0089]
将灌胃复合益生菌发酵植物饮料的大鼠在收集其粪便和血清后监测不同处理组对ibd大鼠免疫因子的影响。结果显示：模型组在诱导ibd大鼠后与正常组相比il-1β、tnf-α和il-6含量均有所增加，在灌胃复合益生菌发酵植物饮料后发现，饮料组均可降低ibd大鼠血清中的il-1β、tnf-α和il-6含量。说明复合益生菌发酵植物饮料可有效改善炎症性肠病(ibd)，见图8。
[0090]
因此，所述复合益生菌发酵植物饮料对肠道屏障和免疫功能具有改善作用，可以作为功能性保健品，应用于缓解和/或治疗ibd中，推广价值极大。
[0091]
上面结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于此，在所属技术领域的技术人员所具备的知识范围内，在不脱离本发明宗旨的前提下还可以作出各种变化。