一种激活肌卫星细胞的组合物以及其使用方法与流程

1.本发明涉及保健食品领域，具体地涉及激活肌卫星细胞的组合物以及其使用方法。


背景技术：

2.肌卫星细胞是一种骨骼肌干细胞，主要分布于肌肉纤维周围的基底层之下，在肌肉生长和运动损伤后肌肉修复的过程中发挥着至关重要的作用。肌卫星细胞的数量和功能受正常衰老和一些疾病的影响，例如在肌少症中，肌卫星细胞的增殖能力受影响，导致肌卫星细胞数量的减少。肌卫星细胞数量的减少和功能衰退会导致损伤后恢复效率低下或肌肉萎缩。因此，寻找激活肌卫星细胞、促进肌卫星细胞增殖的方法和组合物在运动后肌肉损伤的修复、刺激肌肉生长和防止老年人肌肉萎缩中发挥有益作用。
3.肌卫星细胞的激活、增殖和分化受到mtor信号通路的调控，mtor信号通路被激活后促进肌卫星细胞的增殖和分化，从而可以加速肌肉的生长和肌肉损伤的修复。在正常的生理状态下肌卫星细胞处于静息状态，当骨骼肌受损时，人体为了修复损伤的肌肉会一定程度的激活肌卫星细胞，启动肌卫星细胞的分裂，受损肌肉的肌卫星细胞被激活后转化为成肌细胞，进行分裂并分化为肌细胞，修复填补受损部位。但当机体衰老或受到一些疾病的影响时，肌肉的生长速度和修复能力就会减弱。因此，激活肌卫星细胞的mtor通路有助于肌卫星细胞的增殖和分化。
4.目前许多专利和文献利用肽类或碳水化合物支持损伤肌肉的修复和肌肉的生长。中国专利申请号为cn 201710726385.3的发明专利公布了一种抗运动性疲劳、促进运动后恢复的组合物及其制备方法，该组合物由5～25份分离乳清蛋白、1～10份软骨胶原蛋白、1～10份胶原蛋白肽、1～5份橄榄果粉、1～5份大枣粉、1～5份山药粉、1～5份葡萄糖、1～5份异麦芽酮糖、0.1～0.5份三氯蔗糖组成，经试验验证具有促进运动后恢复的作用。该组合物能够补充运动损伤修复后过程的蛋白质及能量需求，清除运动中产生的自由基，但对促进运动后恢复的机制未作深入探究和研究。专利申请号为au2017213796a1提供了用于诱导、增强或增加肌卫星细胞增殖的方法，该方法包括使用由激酶抑制剂、g蛋白偶联受体(gpcr)调节剂、组蛋白脱乙酰基酶调节剂、表观遗传调节剂、神经肽、多巴胺受体调节剂、5-羟色胺受体调节剂、组胺受体调节剂、腺苷受体调节剂、离子载体、离子通道调节剂等等药物中的某一种或几种的组合物，经动物试验验证这些化合物可以增强小鼠原代卫星细胞的增殖，但这些药物由于存在较明显的毒副作用，使用成本较高，因此使用场景受限。中国专利cn 113368123 a应用中药淫羊藿茎叶提取物的活性成分鼠李糖基淫羊藿次苷ii促进损伤肌肉的修复和再生，但获得淫羊藿次苷ii单体提取工艺过程繁琐，纯度不高(cn102824394a)。
5.本领域中需要可通过激活骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，促进损伤肌肉的修复和再生的组合物。


技术实现要素：

6.本发明部分基于发明人的以下发现：通过选取人参粉或发酵人参粉、d-核糖和大豆肽并且进行科学配比以形成组合物，该组合物可以协同激活骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，可应用于运动后肌肉损伤修复、增肌、防止肌萎缩产品中。本发明的组合物制备工艺简单，功效成分明确，可通过激活骨骼肌卫星细胞的增殖和分化，促进损伤肌肉的修复和再生。
7.在一方面，本发明提供了组合物，其包含0.1-9重量份人参粉或发酵人参粉、10-60重量份大豆肽和1-15重量份d-核糖。
8.在一个实施方案中，本发明的组合物是用于运动后肌肉损伤修复、增肌、和/或防止肌萎缩的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物是激活骨骼肌卫星细胞的增殖和分化和/或促进损伤肌肉的修复和再生的组合物。
9.在一个实施方案中，组合物包含3-9重量份人参粉或发酵人参粉。
10.在一个实施方案中，组合物包含5-15重量份d-核糖。在一个实施方案中，组合物包含10-15重量份d-核糖。
11.在一个实施方案中，组合物包含14-60重量份大豆肽。在一个实施方案中，组合物包含14-30重量份大豆肽。
12.在一个实施方案中，人参粉或发酵人参粉的人参总皂苷含量是1wt％-10wt％。在一个实施方案中，大豆肽中的肽含量是70wt％-99wt％。
13.在一个实施方案中，发酵人参粉是人参粉原料经过酵母发酵和乳酸菌发酵得到的发酵人参粉。
14.在一个实施方案中，组合物包含肌肽。在一个实施方案中，组合物不包含肌肽。
15.在一个实施方案中，组合物包含药品或食品中的辅料或添加剂。在一个实施方案中，辅料或添加剂为甜味剂、酸调节剂、填充剂、矫味剂、着色剂、抗氧化剂、增稠剂、稳定剂、乳化剂、抗结剂、助流剂、润滑剂中的一种或多种。
16.在一个实施方案中，组合物是口服制剂，优选地，所述口服制剂为粉剂、胶囊剂、片剂、或乳剂。
17.在一个方面，本发明提供了在体外激活肌卫星细胞中的mtor信号通路或激活肌卫星细胞的增殖和分化的方法，其包括使肌卫星细胞与本发明的组合物接触。在一个实施方案中，肌卫星细胞分化为成肌细胞或肌细胞。
18.在另一个方面，本发明提供了在受试者中激活肌卫星细胞的方法，促进受试者的肌肉修复的方法，促进运动后恢复的方法或者刺激肌肉生长或增肌的方法。这些方法可以是非治疗目的的方法。方法可以包括对受试者施用本发明的组合物。
19.本发明的优点包括：
20.(1)本发明提供了一种新的组合物，其激活肌卫星细胞的增殖和分化，增多肌卫星细胞的数量，强化肌卫星细胞的功能，具有广泛的应用范围，不仅可以应用于促进运动后恢复的产品，还可应用于刺激肌肉生成和防止肌萎缩的产品中。
21.(2)本发明的组合物可以含有发酵人参粉，其是经食品级酵母菌、乳酸菌发酵的人参粉，降低了人参的燥性，获得更多的稀有人参皂苷，提高了人参皂苷的吸收利用度问题。
22.(3)与现有技术(au2017213796a1)中激酶抑制剂等小分子药物相比，本发明的组
合物的组分为食品级的人参粉或发酵人参粉、大豆肽、d-核糖，其使用更加安全，无毒副作用，更加贴近日常生活的使用需求，可应用于运动营养食品或普通食品。
23.(4)与专利cn201710726385.3相比，本发明具有更明确的、更深入的作用机制；与专利cn 113368123 a所用的促进肌肉损伤修复的中药淫羊藿苷相比，本发明组合物的制备工艺简单，避免了提取高纯度淫羊藿苷单体的繁琐工艺流程以及提取过程中引入的有机溶剂，提高了安全性。
附图说明
24.图1显示了edu法检测卫星细胞的增殖的荧光显微照片。
25.图2显示了不同组别处理后edu法测定的细胞数目的柱状图。注：柱状图上字母a、b表示不同组别的比较结果，任意两组之间无相同字母出现则表示这两组存在显著差异(p＜0.05)，两组之间有重复字母表示这两组无显著差异。
26.图3显示了不同组别处理对肌卫星细胞周期的影响。注：柱状图上字母a、b、c表示不同组别的比较结果，任意两组之间无相同字母出现则表示这两组存在显著差异，两组之间有重复字母表示这两组无显著差异
27.图4显示了不同组别处理的免疫印迹图以及相应的定量结果。
具体实施方式
28.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明提供了激活肌卫星细胞的组合物。该组合物可以用于激活骨骼肌卫星细胞的增殖和/或分化；增多肌卫星细胞的数量；强化肌卫星细胞的功能；运动后肌肉损伤修复；增肌；和/或辅助性防止肌萎缩。
30.本发明的组合物可以包含人参粉、大豆肽和d-核糖。
[0031]“发酵人参粉”是人参粉原料经过溶配、灭菌、酵母发酵、乳酸菌发酵、过滤、喷粉、过筛，得到的含多种稀有人参皂苷的发酵人参粉。“发酵人参粉”是人参粉原料经过溶配、灭菌、酵母发酵、乳酸菌发酵、过滤、喷粉、过筛，得到的含多种稀有人参皂苷的发酵人参粉。本发明的组合物可以包含0.1-9重量份人参粉或发酵人参粉。特别地，本发明的组合物可以组合物包含3-9重量份人参粉或发酵人参粉。例如，本发明的组合物可以包含0.2、0.5、0.8、1、2、3、4、5、6、7或8重量份的人参粉或发酵人参粉。本发明中使用的人参粉或发酵人参粉中的人参总皂苷含量可以是1wt％以上，例如1wt％-10wt％，可商业购买获得。例如，人参粉或发酵人参粉中的人参总皂苷含量可以是2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、或9wt％。本发明中使用的人参粉可以符合关于人参粉的国家或地方标准或行业标准(诸如dbs22/033)。发酵人参粉一般包含1wt％以上的人参总皂苷。除此以外，发酵人参粉包含比人参粉更多的稀有人参皂苷。
[0032]“大豆肽”是大豆蛋白质经大豆蛋白酶解制得的肽。本发明的组合物可以包含10-60重量份的大豆肽。特别地，组合物可以包含14-60重量份大豆肽，优选地14-30重量份大豆
肽。例如，本发明的组合物可以包含15、20、25、30、35、40、45、50或55重量份的大豆肽。本发明中使用的大豆肽中的肽含量可以是70wt％-99wt％，可商业购买获得。例如，本发明中使用的大豆肽中的肽含量可以是71wt％、72wt％、73wt％、74wt％、75wt％、76wt％、77wt％、78wt％、79wt％、80wt％、81wt％、82wt％、83wt％、84wt％、85wt％、86wt％、87wt％、88wt％、89wt％、90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％、96wt％、97wt％或98wt％。本发明中使用的大豆肽可以符合关于人参粉的国家或地方标准或行业标准(qb/t 2653
–
2004)。
[0033]
本发明的组合物还可以包含5-15重量份d-核糖。特别地，本发明的组合物可以包含10-15重量份d-核糖。例如，本发明的组合物可以包含6、7、8、9、10、11、12、13或14重量份的d-核糖。
[0034]
根据需要，本发明的组合物还可以包含其他活性成分。例如，本发明的组合物还可以包含肌肽。本发明的组合物也可以不包含肌肽。
[0035]“肌肽”是一种天然小分子二肽，以相当高浓度存在于哺乳动物和人类的肌肉及脑组织中。肌肽具有抗氧化性和抗糖基化作用，并且被认为可能改善肌肉功能，使肌肉在疲劳中复原。在本文中，组合物可以添加或不添加肌肽。发明人发现添加肌肽未能提升本发明的组合物的效果。
[0036]
为了将本发明的组合物制备成消费品，组合物可以进一步包含药品或食品中的辅料或添加剂。例如，辅料或添加剂为甜味剂、酸调节剂、填充剂、矫味剂、着色剂、抗氧化剂、增稠剂、稳定剂、乳化剂、抗结剂、助流剂、润滑剂中的一种或多种。本发明的组合物可以制备成口服制剂，例如粉剂、胶囊剂、片剂、或乳剂。
[0037]
本发明的组合物可以用于在体外激活肌卫星细胞的方法，也可以用于在受试者中激活肌卫星细胞，促进肌肉修复，刺激肌肉生长或增肌的非治疗目的的方法。
[0038]
实施例
[0039]
下面结合实施例对本发明的发明目的、技术特点和有益效果作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0040]
实施例1-5：激活肌卫星细胞的组合物的制备
[0041]
人参粉、大豆肽和d-核糖均为商业途径购买，实施例中使用的人参粉含6％人参总皂苷，实施例中使用的大豆肽的肽含量≥85％(以干基计)。
[0042]
如表1中所示的组分和含量，将各组分混合制备实施例1-5的组合物以及对比例1-3的组合物。
[0043]
表1.激活肌卫星细胞的组合物的重量份数组成
实施例4208
±
2实施例5198
±
5对比例1158
±
19对比例2158
±
15对比例3174
±
10
[0050]
实施例7：流式细胞术检测卫星细胞的细胞周期
[0051]
将大鼠骨骼肌卫星细胞(购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，cp-r223，培养基为含fbs、生长添加剂、青霉素、链霉素的dmem培养基)接种于6孔培养板中，置于37℃，含5％co2培养箱中培养24小时后，用各实施例和对比例样品(各样品完全溶解于dmem培养基中，0.45μm滤膜过滤后使用)处理大鼠骨骼肌卫星细胞24小时(37℃、5％co2)。24小时后，用胰酶消化细胞、收集细胞，细胞数为2
×
105～2
×
106个，2000rpm/min离心3分钟，弃去含胰酶的培养基，再用pbs洗涤1次，2000rpm/min离心3分钟，弃去pbs。用pi(碘化丙啶，购自杭州联科生物技术股份有限公司，70-ccs012)对细胞进行染色，每组细胞中加入600μl pi染色液(1％v/v)，涡旋混匀5～10秒，室温孵育30分钟后，用流式细胞仪(pcy 5.5通道收集细胞)检测大鼠骨骼肌卫星细胞的细胞周期。实验结果如图2及表3所示。
[0052]
利用流式细胞术检测各处理组对大鼠骨骼肌卫星细胞周期分布的影响。g0期的细胞处于沉默或者静止状态，因此g0期细胞又称静止期细胞。g1期的细胞通常处于生长物质准备阶段，s期的细胞进行dna的复制，g2/m期即细胞的有丝分裂时期。因此，处于g0/g1时期下的二倍体细胞越多，表示处于细胞增殖、分裂时期的细胞就越少。反之，g0/g1期的细胞越少，s g2/m期细胞越多，表示处于细胞增殖、分裂时期的细胞就越多。由图3及表3的统计结果可知，与空白对照和各对比例组相比，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5组处理24小时后，可显著降低处于g0/g1期的细胞比例，提高处于s g2/m期的细胞比例，说明以特定比例复配的组合物可以激活处于沉默或静止状态的大鼠骨骼肌卫星细胞，加速细胞进入增殖和分裂的细胞周期进程。
[0053]
根据表3可知，实施例3中s g2/m期的细胞比例38.10％，相对于空白对照增加8.92％；对比例1、对比例2和对比例3相对于空白对照分别增加1.22％、0.18％、4.99％，三者之和6.39％，实施例3对于s g2/m期细胞的增加比例大于对比例1-3各自对s g2/m期细胞的增加比例的总和，表明本发明组合物可协同加速细胞进入增殖和分裂的细胞周期进程。
[0054]
表3：不同组别处理对卫星细胞周期分布的影响
[0055]
[0056][0057]
实施例8：免疫印迹法检测卫星细胞mtor信号通路活性
[0058]
将大鼠骨骼肌卫星细胞(购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，cp-r223，培养基为含fbs、生长添加剂、青霉素、链霉素的dmem培养基)接种于12孔培养板中，置于37℃，含5％co2培养箱中培养24小时后，用各实施例和对比例样品(各样品完全溶解于dmem培养基中，0.45μm滤膜过滤后使用)处理(37℃、5％co2)大鼠骨骼肌卫星细胞24小时。
[0059]
(1)细胞蛋白样品制样
[0060]
1)各实施例和对比例样品处理细胞24小时后，弃去12孔板的培养基，预冷的pbs清洗一遍后弃去pbs，每孔加入90μl预冷的np-40细胞裂解液，放置于冰上静置裂解10分钟；
[0061]
2)用细胞刮将上述裂解后的细胞刮下，裂解液转移至离心管中，将离心管放在漩涡振荡仪上振荡5秒，然后插到冰上静置5分钟，重复该步骤3次，使细胞裂解完全，然后将离心管置于提前预冷至4℃的低温离心机中，12000g离心10分钟，吸取2μl上清液用于测量蛋白浓度；
[0062]
3)bca法测定蛋白浓度，根据蛋白浓度测定结果，计算蛋白裂解液的吸取量，用np-40裂解液补齐各个样品的体积，加入相应量的5
×
上样缓冲液使之为1
×
工作浓度，漩涡振荡仪上振荡5秒混匀后，置于蛋白样品加热器煮样5分钟，常温离心机中10000g离心1分钟，将制备好的蛋白样品用于后续跑胶或者放置于-20℃冰箱中保存。
[0063]
(2)免疫印迹法检测蛋白表达
[0064]
1)电泳：制备sds-聚丙烯酰胺凝胶，将上述方法制得的蛋白样品加到凝胶的上样孔中，安装好电泳仪，插好电线和电源，90v的电压下恒压进行电泳，待目的条带跑到合适的位置时，停止电泳；
[0065]
2)转膜：将凝胶取下，转移到转膜夹中，插到转膜装置中置于转膜槽中，倒入冷的1
×
电转缓冲液，插上冰砖，插好电线和电源，90v的电压下恒压转膜1小时；
[0066]
3)封闭：转膜完成后将膜取出，置于5％的脱脂牛奶中，置于摇床上室温封闭1小时；
[0067]
4)孵育一抗：将目的条带裁剪下来，一抗原液p-mtor(购自cst，phospho-mtor(ser2448)(d9c2)xprabbit mab#5536)和mtor(购自cst，mtor(7c10)rabbit mab#2983)均按1：1000比例稀释在含1％脱脂牛奶的tbst溶液中，将条带放在合适大小的抗体孵育槽中，加入相应抗体稀释液，置于4℃冰箱中的摇床中孵育过夜；次日回收一抗，用1
×
tbst在转速较快的摇床上洗膜，10分钟换一次液，一共洗3次；
[0068]
5)孵育二抗：按1：10000的比例稀释兔二抗原液，将二抗稀释液加到膜上，置于慢速摇床上，室温孵育1小时，然后弃去二抗，用1
×
tbst在转速较快的摇床上洗膜，10分钟换一次液，一共洗4次；
[0069]
6)显影：将ecl的a液和b液按照1：1的比例混匀，均匀滴加到膜上，然后将膜转移到显影夹中的干净玻璃纸上，立即到暗房中显影，获得结果条带；
[0070]
7)用image j图像处理软件统计p-mtor和mtor灰度，计算p-mtor和mtor的比值，数据汇总于表4总，实验结果如图4所示。
[0071]
表4：不同组别处理对p-mtor/mtor比值的影响
[0072]
处理组p-mtor/mtor空白对照0.162
±
0.006实施例10.37
±
0.008实施例20.425
±
0.021实施例30.453
±
0.002实施例40.336
±
0.003对比例10.213
±
0.011对比例20.136
±
0.004对比例30.176
±
0.005
[0073]
肌卫星细胞的激活和增殖受到mtor信号通路的调控。因此，发明人利用免疫印迹法检测不同组别处理后，大鼠骨骼肌卫星细胞内mtor通路的活性。实验结果如图4所示。实施例1、实施例2、实施例3、实施例4组显著提高了大鼠骨骼肌卫星细胞中p-mtor的表达量，而对比例1、对比例2、对比例3对于p-mtor的表达量提高不明显，各实施例组对于p-mtor/mtor比例的提高显著优于各对比例。根据表4可知，实施例3中p-mtor/mtor的均值为0.453，相对于空白对照增加0.291；而对比例1、对比例2和对比例3相对于空白对照分别增加0.051、-0.026、0.014，三者之和0.039，实施例3对于mtor通路的激活效果优于对比例1-3各自对mtor通路激活效果的总和，可见，本发明以特定比例复配的组合物可以激活mtor信号通路且具有协同作用。结合以上实验结果可知，组合物通过激活骨骼肌卫星细胞中的mtor信号通路，进而促进骨骼肌卫星细胞的增殖活性。
[0074]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。