一种白藜芦醇的生物萃取方法与流程

1.本发明涉及生物萃取技术领域，特别地，涉及一种白藜芦醇的生物萃取方法。


背景技术：

2.白藜芦醇是一种多酚类物质，对人体具有优异的抗菌、抗氧化和清除自由基等作用，可以预防和治疗多种疾病，近年来已经成为防治肿瘤发生的重要药物之一。白藜芦醇被广泛应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域，市场前景广阔。
3.在虎杖、何首乌、葡萄、桑椹、花生等植物中均含有白藜芦醇，特别是虎杖中白藜芦醇含量最高。在虎杖中，白藜芦醇包括游离态和白藜芦醇苷(白藜芦醇3-o-β-d-葡萄糖甙)两种形式，而且，白藜芦醇苷的含量远远高于白藜芦醇，但白藜芦醇苷的生物活性远远不如白藜芦醇。白藜芦醇易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。白藜芦醇在306nm的紫外光照射下产生紫色荧光，遇氨水等碱性溶液显红色，遇醋酸镁的甲醇溶液显粉红色，并能和三氯化铁-铁氰化钾起显色反应。白藜芦醇在低温、避光条件下较为稳定，碱性环境中不稳定。
4.专利申请cn102531851a公开了虎杖中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取与纯化方法，主要包括以下步骤：1)浸膏的制备：称取虎杖药材粗粉，用8-12倍重量的体积浓度为70-85％的乙醇提取1-2次，每次1-2小时，过滤，合并滤液，浓缩至膏状，浸膏水分散，备用；2)化合物的分离纯化：将浸膏水分散液过大孔树脂，先用蒸馏水洗脱，至洗下的洗脱液澄清无色，弃去水洗部分，再用体积浓度为40-60％的乙醇洗脱，收集洗脱液至颜色淡为止，此部分为白藜芦醇和虎杖苷富集部位，将乙醇洗脱液浓缩至干备用；将大孔树脂富集部位通过半制备型高效液相色谱分离纯化，得到白藜芦醇、白藜芦醇苷。该专利申请制取了中药材对照品白藜芦醇和白藜芦醇苷，但是白藜芦醇苷并未转化为生物活性高的白藜芦醇。
5.专利申请cn104087623a公开了一种从虎杖中酶解提取白藜芦醇的方法，涉及从天然植物的虎杖中制备白藜芦醇的方法。该专利技术以市售的虎杖根茎为原料，经酶解反应、醇深度提取和分离浓缩、干燥的简单工艺而制得白藜芦醇晶体粉末产品。虎杖中白藜芦醇主要以白藜芦醇苷形式的存在，它在热水溶中具有良好的溶解度，易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂。在合适ph值一定温度且搅拌条件下，白藜芦醇苷逐步从虎杖中溶出，同时溶液中的酶作用于白藜芦醇苷的β-d糖苷键，使其水解生成白藜芦醇和葡萄糖。另外，酶也可破坏虎杖植物细胞壁，有利于白藜芦醇苷的溶出和转化。但是，该专利技术获得的白藜芦醇纯度并不算理想，收率也较低。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种白藜芦醇的生物萃取方法，以解决白藜芦醇天然提取收率低、纯度低等技术问题。
7.为实现上述目的，本发明提供了一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
8.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净、粉碎后调节水分重量含量为50～60％，进行蒸
汽爆破处理，得到虎杖浆料；
9.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
10.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
11.优选的，步骤(1)中，新鲜虎杖根洗净后粉碎至60～80目。
12.优选的，步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在1～2mpa压力条件下维持5～6分钟进行蒸汽爆破处理。
13.优选的，步骤(2)中，以重量份计，固定化纤维素酶的制备方法如下：
14.(a)先将1～2份壳聚糖均匀分散于100份质量浓度0.1～0.2％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100份液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将1～2份氮化硼纳米片超声分散于8～10份蒸馏水中，400～500w超声振荡30～40分钟，接着加入8～10份六水合硝酸钴、8～9份六亚甲基四胺、70～80份无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应7～9小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
15.(b)将壳聚糖微球分散液加热至40～50℃，逐滴滴入0.2～0.3份吐温-80，搅拌混匀，加入130～150份质量浓度0.7～0.9％戊二醛溶液和0.3～0.5份碳酸钙，保温搅拌60～70分钟，调节ph＝9～10，加热至60～70℃，保温搅拌2～3小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌20～30分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤2～3次，利用2～3份质量浓度2～3％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
16.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1份纤维素酶加入40～50份蒸馏水中，300～500r/min室温搅拌60～70分钟，接着边搅拌边加入1～1.5份赖氨酸和质量浓度20～30％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应20～30分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤2～3次，水透析10～12小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
17.优选的，步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的3～4倍，在柱式反应器中的反应条件为：45～55℃反应28～30小时。
18.优选的，步骤(2)中，水洗次数为2～3次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
19.优选的，步骤(3)中，以重量份计，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.3～0.4份单宁酸溶于水中配制成0.8～1mol/l单宁酸溶液，接着将1份纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，300～500r/min搅拌10～15分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入20～22份水、1～1.2份n-异丙基丙烯酰胺、0.3～0.4份乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.08～0.1份偶氮二异丁腈、0.01～0.02份十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，60～70℃搅拌聚合反应80～100分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤3～5次，即得所述的磁性吸附剂。
20.优选的，步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，300～500r/min搅拌20～30分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为2～3：100。
21.优选的，步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为55～65ml/min，超声波频率为18～20khz，超声波功率为200～220w，解吸附时间为25～35分钟。
22.本发明具有以下有益效果：
23.本发明以新鲜虎杖根为原料，制成虎杖浆料后，利用固定化纤维素酶进行提取获得提取浆料，再利用磁性吸附剂对提取浆料进行吸附，最后解吸附即得白藜芦醇。本发明实现了新鲜虎杖根中白藜芦醇的生物萃取，收率高，所得白藜芦醇的纯度高。
24.1、以新鲜虎杖根为原料，洗净、粉碎后调节水分重量含量为50～60％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料。蒸汽爆破处理可以破坏虎杖根的细胞壁，使得虎杖根中的白藜芦醇苷、白藜芦醇等充分游离出来，为提高白藜芦醇收率提供良好的基础。
25.2、为了提高白藜芦醇的收率，申请人尝试将虎杖浆料中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，该转化过程的关键是固定化纤维素酶。纤维素酶主要有两个作用：第一，对蒸汽爆破处理起到补充作用，破坏细胞壁结构，使得包裹在内的成分充分游离出来；第二，促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。但是，纤维素酶的大量使用成本较高，且纤维素酶易受环境影响，从而影响酶解效果，故申请人对纤维素酶进行了固定化处理。
26.具体来说，本发明以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶。在固定化纤维素酶制备过程中，利用壳聚糖微球上的部分氨基通过戊二醛的作用实现交联，形成网状结构的交联壳聚糖树脂，再将二环己基碳二亚胺作为缩合剂，使得壳聚糖的剩余氨基与赖氨酸的羧基发生缩合反应，形成立体网状结构，在此过程中，纤维素酶在戊二醛作用下参与交联、缩合，并固定于立体网状结构中，同时氮化硼纳米片表面生成氧化钴，均匀分散于立体网状结构中，比表面积大，吸附性强，进一步强化了纤维素酶的反应效果。本技术还进一步引入了致孔剂碳酸钙，生成更多孔隙。
27.固定化纤维素酶具有丰富的孔隙，增大了与虎杖浆料中白藜芦醇苷的接触面积，大大提高了白藜芦醇苷水解反应产白藜芦醇的转化率，减少纤维素酶用量，降低纤维素酶使用成本，提高白藜芦醇收率。本发明的固定化纤维素酶性质稳定，可循环使用，有利于节约酶用量，进一步降低纤维素酶使用成本。
28.固定化纤维素酶的使用方法如下：将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，最重要的是，在固定化纤维素酶的处理过程中，并不进行其他分离操作，在促进白藜芦醇苷水解反应生成白藜芦醇的同时，避免了白藜芦醇苷和白藜芦醇流失，从根源上保证了白藜芦醇收率。
29.3、本发明以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂。白藜芦醇含有酚羟基，单宁酸含有大量羟基，聚(n-异丙基丙烯酰胺)含有大量酰胺基，该磁性吸附剂通过其含有的羟基、酰胺基等对白藜芦醇具有良好的吸附效果，实现了提取浆料中白藜芦醇的吸附富集，从而提高白藜芦醇的纯度。现有技术通常使用吸附树脂实现白藜芦醇分离，但是这些吸附树脂的重复利用性差，使用成本高，且吸附、解吸附效果也不算好，导致产品收率、纯度都会受到影响。而在本技术中，由于该吸附剂具有磁性，可以方便地进行磁铁分离等操作，大大避免了资源浪费，产品收率和纯度也得到
大幅度提升。
30.吸附后的吸附剂在无水乙醇循环流动环境中，与通常的浸渍法相比，无水乙醇循环流动大大增加了吸附后吸附剂与无水乙醇的接触面积，并结合超声波振荡的空化作用，使得吸附剂吸附的白藜芦醇充分、迅速溶入无水乙醇中，实现了白藜芦醇成分的有效脱离，保证了白藜芦醇收率和纯度。
31.除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。
具体实施方式
32.以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
33.为便于比较，本发明的新鲜虎杖根均采集于湖北省宜昌市。
34.实施例1：
35.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
36.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至60目，调节水分重量含量为50％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
37.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
38.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
39.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在1mpa压力条件下维持5分钟进行蒸汽爆破处理。
40.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
41.(a)先将1g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.1％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将1g氮化硼纳米片超声分散于8g蒸馏水中，400w超声振荡30分钟，接着加入8g六水合硝酸钴、8g六亚甲基四胺、70g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应7小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
42.(b)将壳聚糖微球分散液加热至40℃，逐滴滴入0.2g吐温-80，搅拌混匀，加入130g质量浓度0.7％戊二醛溶液和0.3g碳酸钙，保温搅拌60分钟，调节ph＝9，加热至60℃，保温搅拌2小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌20分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤2次，利用2g质量浓度2％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
43.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入40g蒸馏水中，300r/min室温搅拌60分钟，接着边搅拌边加入1g赖氨酸和质量浓度20％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二
环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应20分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤2次，水透析10小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
44.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的3倍，在柱式反应器中的反应条件为：45℃反应28小时。
45.步骤(2)中，水洗次数为2次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
46.步骤(3)中，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.3g单宁酸溶于水中配制成0.8mol/l单宁酸溶液，接着将1g纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，300r/min搅拌10～15分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入20g水、1gn-异丙基丙烯酰胺、0.3g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.08g偶氮二异丁腈、0.01g十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，60℃搅拌聚合反应80分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤3次，即得所述的磁性吸附剂。
47.步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，300r/min搅拌20分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为2：100。
48.步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为55ml/min，超声波频率为18khz，超声波功率为200w，解吸附时间为25分钟。
49.实施例2：
50.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
51.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至80目，调节水分重量含量为60％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
52.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
53.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
54.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在2mpa压力条件下维持6分钟进行蒸汽爆破处理。
55.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
56.(a)先将2g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.2％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将2g氮化硼纳米片超声分散于10g蒸馏水中，500w超声振荡40分钟，接着加入10g六水合硝酸钴、9g六亚甲基四胺、80g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应9小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
57.(b)将壳聚糖微球分散液加热至50℃，逐滴滴入0.3g吐温-80，搅拌混匀，加入150g质量浓度0.9％戊二醛溶液和0.5g碳酸钙，保温搅拌70分钟，调节ph＝10，加热至70℃，保温搅拌3小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌30分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙
醇交替洗涤3次，利用3g质量浓度3％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
58.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入50g蒸馏水中，500r/min室温搅拌70分钟，接着边搅拌边加入1.5g赖氨酸和质量浓度30％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应30分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤3次，水透析12小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
59.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的4倍，在柱式反应器中的反应条件为：55℃反应30小时。
60.步骤(2)中，水洗次数为3次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
61.步骤(3)中，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.4g单宁酸溶于水中配制成1mol/l单宁酸溶液，接着将1g纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，500r/min搅拌15分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入22g水、1.2gn-异丙基丙烯酰胺、0.4g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.1g偶氮二异丁腈、0.02g十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，70℃搅拌聚合反应100分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤5次，即得所述的磁性吸附剂。
62.步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，500r/min搅拌30分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为3：100。
63.步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为65ml/min，超声波频率为20khz，超声波功率为220w，解吸附时间为35分钟。
64.实施例3：
65.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
66.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至60目，调节水分重量含量为60％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
67.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
68.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
69.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在1mpa压力条件下维持6分钟进行蒸汽爆破处理。
70.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
71.(a)先将1g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.2％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将1g氮化硼纳米片超声分散于10g蒸馏水中，400w超声振荡40分钟，接着加入8g六水合硝酸钴、9g六亚甲基四胺、70g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应9小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
72.(b)将壳聚糖微球分散液加热至40℃，逐滴滴入0.3g吐温-80，搅拌混匀，加入130g质量浓度0.9％戊二醛溶液和0.3g碳酸钙，保温搅拌70分钟，调节ph＝9，加热至70℃，保温搅拌2小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌20分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤3次，利用2g质量浓度3％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
73.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入40g蒸馏水中，500r/min室温搅拌60分钟，接着边搅拌边加入1.5g赖氨酸和质量浓度20％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应30分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤2次，水透析12小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
74.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的3倍，在柱式反应器中的反应条件为：55℃反应28小时。
75.步骤(2)中，水洗次数为3次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
76.步骤(3)中，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.3g单宁酸溶于水中配制成1mol/l单宁酸溶液，接着将1g纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，300r/min搅拌15分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入20g水、1.2gn-异丙基丙烯酰胺、0.3g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.1g偶氮二异丁腈、0.01g十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，70℃搅拌聚合反应80分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤5次，即得所述的磁性吸附剂。
77.步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，300r/min搅拌30分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为2：100。
78.步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为65ml/min，超声波频率为18khz，超声波功率为220w，解吸附时间为25分钟。
79.实施例4：
80.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
81.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至80目，调节水分重量含量为50％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
82.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
83.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
84.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在2mpa压力条件下维持5分钟进行蒸汽爆破处理。
85.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
86.(a)先将2g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.1％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分
散液；将2g氮化硼纳米片超声分散于8g蒸馏水中，500w超声振荡30分钟，接着加入10g六水合硝酸钴、8g六亚甲基四胺、80g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应7小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
87.(b)将壳聚糖微球分散液加热至50℃，逐滴滴入0.2g吐温-80，搅拌混匀，加入150g质量浓度0.7％戊二醛溶液和0.5g碳酸钙，保温搅拌60分钟，调节ph＝10，加热至60℃，保温搅拌3小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌30分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤2次，利用3g质量浓度2％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
88.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入50g蒸馏水中，300r/min室温搅拌70分钟，接着边搅拌边加入1g赖氨酸和质量浓度30％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应20分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤3次，水透析10小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
89.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的4倍，在柱式反应器中的反应条件为：45℃反应30小时。
90.步骤(2)中，水洗次数为2次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
91.步骤(3)中，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.4g单宁酸溶于水中配制成0.8mol/l单宁酸溶液，接着将1g纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，500r/min搅拌10分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入22g水、1gn-异丙基丙烯酰胺、0.4g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.08g偶氮二异丁腈、0.02g十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，60℃搅拌聚合反应100分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤3次，即得所述的磁性吸附剂。
92.步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，500r/min搅拌20分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为3：100。
93.步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为55ml/min，超声波频率为20khz，超声波功率为200w，解吸附时间为35分钟。
94.实施例5：
95.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
96.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至70目，调节水分重量含量为55％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
97.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
98.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
99.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在1.5mpa压力条件下维持5分钟进行蒸汽爆破处理。
100.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
101.(a)先将1.5g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.15％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将1.5g氮化硼纳米片超声分散于9g蒸馏水中，500w超声振荡35分钟，接着加入9g六水合硝酸钴、8.5g六亚甲基四胺、75g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应8小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
102.(b)将壳聚糖微球分散液加热至45℃，逐滴滴入0.25g吐温-80，搅拌混匀，加入140g质量浓度0.8％戊二醛溶液和0.4g碳酸钙，保温搅拌65分钟，调节ph＝10，加热至65℃，保温搅拌2.5小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌25分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤3次，利用2.5g质量浓度2.5％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
103.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入45g蒸馏水中，400r/min室温搅拌65分钟，接着边搅拌边加入1.2g赖氨酸和质量浓度25％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应25分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤3次，水透析11小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
104.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的3.5倍，在柱式反应器中的反应条件为：50℃反应29小时。
105.步骤(2)中，水洗次数为3次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
106.步骤(3)中，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.35g单宁酸溶于水中配制成0.9mol/l单宁酸溶液，接着将1g纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，400r/min搅拌12分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入21g水、1.1gn-异丙基丙烯酰胺、0.35g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.09g偶氮二异丁腈、0.015g十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，65℃搅拌聚合反应90分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤4次，即得所述的磁性吸附剂。
107.步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，400r/min搅拌25分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为2.5：100。
108.步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为60ml/min，超声波频率为19khz，超声波功率为210w，解吸附时间为30分钟。
109.对比例1
110.用纤维素酶替换固定化纤维素酶。
111.其余同实施例1。
112.对比例2
113.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
114.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至60目，调节水分重量含量为50％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
115.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，
得到提取浆料；
116.(3)然后以纳米四氧化三铁为核，单宁酸为中间吸附层，聚(n-异丙基丙烯酰胺)为外壳，得到磁性吸附剂；接着利用该磁性吸附剂对提取浆料进行吸附处理，磁铁收集吸附后的吸附剂，最后将吸附后的吸附剂完全浸没于无水乙醇中，在无水乙醇循环流动和超声波振荡条件下进行解吸附，磁铁分离除去解吸附后的吸附剂，浓缩，干燥，即得白藜芦醇。
117.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在1mpa压力条件下维持5分钟进行蒸汽爆破处理。
118.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
119.(a)先将1g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.1％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将1g氮化硼纳米片超声分散于8g蒸馏水中，400w超声振荡30分钟，接着加入8g六水合硝酸钴、8g六亚甲基四胺、70g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应7小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
120.(b)将壳聚糖微球分散液加热至40℃，逐滴滴入0.2g吐温-80，搅拌混匀，加入130g质量浓度0.7％戊二醛溶液，保温搅拌60分钟，调节ph＝9，加热至60℃，保温搅拌2小时，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤2次，得到交联壳聚糖树脂；
121.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入40g蒸馏水中，300r/min室温搅拌60分钟，接着边搅拌边加入1g赖氨酸和质量浓度20％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应20分钟，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌20分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤2次，水透析10小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
122.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的3倍，在柱式反应器中的反应条件为：45℃反应28小时。
123.步骤(2)中，水洗次数为2次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
124.步骤(3)中，所述磁性吸附剂的制备方法如下：先将0.3g单宁酸溶于水中配制成0.8mol/l单宁酸溶液，接着将1g纳米四氧化三铁加入单宁酸溶液中，300r/min搅拌10～15分钟，使得单宁酸包覆于纳米四氧化三铁表面；然后加入20g水、1gn-异丙基丙烯酰胺、0.3g乙二醇二甲基丙烯酸酯、0.08g偶氮二异丁腈、0.01g十二烷基苯磺酸钠，在氮气保护条件下，60℃搅拌聚合反应80分钟，过滤取固体，无水乙醇、水交替洗涤3次，即得所述的磁性吸附剂。
125.步骤(3)中，吸附处理的具体方法为：将磁性吸附剂加入提取浆料中，300r/min搅拌20分钟即可；其中，磁性吸附剂与提取浆料的质量比为2：100。
126.步骤(3)中，解吸附的工艺条件为：无水乙醇循环流动速度为55ml/min，超声波频率为18khz，超声波功率为200w，解吸附时间为25分钟。
127.对比例3
128.在解吸附时略去无水乙醇循环流动和超声波振荡处理。
129.其余同实施例1。
130.对比例4
131.一种白藜芦醇的生物萃取方法，具体步骤如下：
132.(1)先以新鲜虎杖根为原料，洗净，粉碎至60目，调节水分重量含量为50％，进行蒸汽爆破处理，得到虎杖浆料；
133.(2)再以纤维素酶、壳聚糖、赖氨酸、戊二醛溶液、氮化硼纳米片、六水合硝酸钴为原料，制成固定化纤维素酶，接着将虎杖浆料泵入装有固定化纤维素酶的柱式反应器中进行反应，收集流出浆料，并对柱式反应器进行水洗，收集水洗浆料，合并流出浆料和水洗液，得到提取浆料；
134.(3)最后将提取浆料泵入市售活化的xad-7hp吸附树脂进行提纯，提取浆料的每小时泵入量为吸附树脂的2倍，直至流出液中出现白藜芦醇即可停止；利用无水乙醇洗脱吸附后的吸附树脂(洗脱次数为2次，每次洗脱所用的无水乙醇与吸附树脂等体积)，收集洗脱液，浓缩，干燥，即得所述的白藜芦醇。
135.步骤(1)中，蒸汽爆破处理的工艺条件为：在1mpa压力条件下维持5分钟进行蒸汽爆破处理。
136.步骤(2)中，固定化纤维素酶的制备方法如下：
137.(a)先将1g壳聚糖均匀分散于100g质量浓度0.1％盐酸溶液中，得到壳聚糖分散液，接着边搅拌边将壳聚糖分散液缓慢加入100g液体石蜡中，搅拌混匀，得到壳聚糖微球分散液；将1g氮化硼纳米片超声分散于8g蒸馏水中，400w超声振荡30分钟，接着加入8g六水合硝酸钴、8g六亚甲基四胺、70g无水乙醇，加热至回流，保温搅拌反应7小时，离心取沉淀，得到复合纳米材料；
138.(b)将壳聚糖微球分散液加热至40℃，逐滴滴入0.2g吐温-80，搅拌混匀，加入130g质量浓度0.7％戊二醛溶液和0.3g碳酸钙，保温搅拌60分钟，调节ph＝9，加热至60℃，保温搅拌2小时，加入步骤(a)所得复合纳米材料，保温搅拌20分钟，过滤取固体，石油醚、无水乙醇交替洗涤2次，利用2g质量浓度2％盐酸溶液溶解碳酸钙，水洗至中性，得到交联壳聚糖树脂；
139.(c)然后将交联壳聚糖树脂、0.1g纤维素酶加入40g蒸馏水中，300r/min室温搅拌60分钟，接着边搅拌边加入1g赖氨酸和质量浓度20％二环己基碳二亚胺乙醇溶液，使得二环己基碳二亚胺乙醇溶液所含二环己基碳二亚胺的摩尔数与赖氨酸的摩尔数相等，室温搅拌反应20分钟，过滤取固体，无水乙醇洗涤2次，水透析10小时，再次过滤取固体，干燥，即得固定化纤维素酶。
140.步骤(2)中，虎杖浆料的每小时泵入量为柱式反应器体积的3倍，在柱式反应器中的反应条件为：45℃反应28小时。
141.步骤(2)中，水洗次数为2次，每次水洗所用的水量与柱式反应器等体积。
142.对比例5
143.在制备固定化纤维素酶时略去氮化硼纳米片、六水合硝酸钴，其余同实施例1。
144.分别对实施例1～5和对比例1～5的白藜芦醇收率和纯度进行考察，结果见表1。
145.其中，白藜芦醇收率＝白藜芦醇质量/新鲜虎杖根质量
×
100％。
146.表1.白藜芦醇收率和纯度比较
[0147] 收率(％)纯度(％)实施例11.68≥99.99实施例21.69≥99.99
实施例31.71≥99.99实施例41.73≥99.99实施例51.76≥99.99对比例11.2499.01对比例21.5199.11对比例31.5399.99对比例41.4298.05对比例51.4399.36
[0148]
由表1可知，实施例1～5所得白藜芦醇的收率高，纯度高，大大提高了新鲜虎杖根的应用价值，避免资源浪费。
[0149]
对比例1用纤维素酶替换固定化纤维素酶，产品收率明显下降，纯度变差，说明固定化纤维素酶可以更好促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，从而提高产品收率，酶处理过程中也有助于白藜芦醇与其他成分充分剥离，从而提高产品纯度。
[0150]
对比例2在制备固定化纤维素酶时，略去碳酸钙，产品收率明显下降，纯度变差，说明碳酸钙的致孔作用有助于改善酶处理效果，从而提高产品收率和纯度。
[0151]
对比例3在解吸附时略去无水乙醇循环流动和超声波振荡处理，产品收率明显下降，说明解吸附的特殊处理可避免产品损失，提高产品收率。
[0152]
对比例4用市售活化的xad-7hp吸附树脂替换磁性吸附剂，产品收率和纯度明显下降，说明本发明的吸附剂可以有效吸附体系中的白藜芦醇，从而提高产品收率和纯度。
[0153]
对比例5在制备固定化纤维素酶时略去氮化硼纳米片、六水合硝酸钴，产品收率明显下降，纯度变差，说明在制备固定化纤维素酶时引入复合纳米材料可以更好促进白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，从而提高产品收率，酶处理过程中也有助于白藜芦醇与其他成分充分剥离，从而提高产品纯度。
[0154]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。