一种Eremophilane型倍半萜及其在制备具有抗炎活性的药物中的应用

一种eremophilane型倍半萜及其在制备具有抗炎活性的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药和化学技术领域，特别涉及一种来源于湖北贝母内生真菌boeremia exigua的eremophilane型倍半萜及其在制备具有抗炎活性的药物中的应用。


背景技术：

2.炎症是机体对于损伤性刺激的防御反应，能够调节机体免疫而清除病原体以减少细胞损伤，并通过启动组织修复功能自主修复受损组织。当巨噬细胞在机体受到外来病原微生物入侵时，会分泌多种细胞因子、趋化因子、一氧化氮以及调节炎症相关蛋白而引发炎症和免疫应答。脂多糖(lps)是革兰氏阴性菌细胞壁主要组成成分，细菌死亡溶解或用人工方法破坏细胞后才释放出来，其毒性成分主要为类脂质。巨噬细胞在lps的诱导下，不仅细胞的增殖能力和吞噬能力明显增强，还会释放大量的细胞因子和炎症介质，如一氧化氮(no)、肿瘤坏死因子(tnf-α)、白介素-1β(il-1β)、白介素-6(il-6)等，这些介质会对病原微生物的入侵产生抵御作用，但过量分泌则会引发炎症反应，而持续的炎症反应会导致机体免疫稳态失衡，造成难以修复的组织损伤。炎症是引发癌症、ii型糖尿病、肥胖症、关节炎、肺纤维化、神经退行性疾病和心血管疾病等人类疾病的主要原因之一。针对目前临床抗炎药物容易引起副作用以及药物使用耐药性增强的问题，开发低毒高效的新型抗炎药物是一项值得申请人深入探索的重要课题。
3.一氧化氮(no)在人体内参与细胞信号转导过程，能扩张血管并保护组织器官。no由nos酶(nitric oxide synthase)产生，在血液和组织中被氧化形成硝酸盐和亚硝酸盐，硝酸盐和亚硝酸盐在血液和组织中进行生理循环，形成no和其他生物活性氮氧化物。生理水平的no对于物质代谢、免疫调节和信号传递等生命活动是至关重要的，适量的no能够治疗多种疾病，如高血压、免疫调节和心脑血管疾病等，但持续过度的炎症产生大量的no将导致机体损伤。申请人通常使用靶向性抑制no生成的药物来减轻炎症反应，因此，no常用做体外炎症模型标志物来筛选有效的抗炎药物。
4.湖北贝母是湖北省的道地药材，具有化痰止咳、解毒散结的功效。主治外感风热咳嗽，痰热咳嗽，是老百姓家中日常必备中药。内生真菌是一种独特的微生物群，可以无明显病害症状地在健康植物的活组织中生存繁殖。植物内生真菌与植物宿主在漫长的共进化过程中构成一个复杂且稳定的动态微生态系统。内生真菌的生命活动可参与保护植物免受生长环境中生物和非生物的侵害。基于内生真菌具有资源丰富、种类繁多、培养周期短暂、基因操作可行性高等优势，且萜类化合物具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等，常作为高价值化合物出现在保健品、化妆品、医药产品等领域。申请人对从湖北贝母的内生真菌中分离得到的一个eremophilane型倍半萜的抗炎活性进行探究。


技术实现要素：

5.针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种eremophilane型倍半
萜及其在制备具有抗炎活性的药物中的应用。
6.一种具有抗炎活性的eremophilane型倍半萜，其结构式如下：
[0007][0008]
分子式：c
17h22
o6[0009]
所述eremophilane型倍半萜在制备可抑制no生成的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
[0010]
本发明的再一个目的是提供一种所述eremophilane型倍半萜应用于制备针对生理水平过量的no引起的物质代谢、免疫调节和信号传递相关疾病的药物。
[0011]
在本发明中，所述的抗炎活性具体体现在：能显著降低lps诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw264.7)产生no炎症效应。本发明的实验证明，所述eremophilane型倍半萜低毒高效，可剂量依赖性地抑制lps刺激产生的no，具有可用于制备新型抗炎药物的潜在用途。
[0012]
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
[0013]
1、本发明揭示一种来源于湖北贝母内生真菌boeremia exigua的eremophilane型倍半萜，其可剂量依赖性地抑制lps刺激产生的no。
[0014]
2、本发明提供一种具有抗炎活性的eremophilane型倍半萜，低毒高效，可剂量依赖性地抑制lps刺激产生的no，具有可用于制备新型抗炎药物的潜在用途。
[0015]
3、本发明拟保护其用途的eremophilane型倍半萜，可通过从植物内生真菌中提取纯化来获取。具有培养周期短暂、操作可行性高、无化学污染、绿色环保等优势。
附图说明
[0016]
图1为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的氢谱图(600mhz,meod)；
[0017]
图2为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的碳谱图(150mhz,meod)和dept图；
[0018]
图3为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的hmqc图；
[0019]
图4为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的hmbc图；
[0020]
图5为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的1h-1
h cosy图；
[0021]
图6为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的roesy图；
[0022]
图7为具体实施方式中实施例1制备得到的化合物的no抑制图，注：与空白组相比，###p＜0.001，与lps组相比，***p＜0.001；
[0023]
图8为实施例1制备得到的化合物在有无lps刺激下对raw264.7细胞活力的影响。
具体实施方式
[0024]
为使本技术的发明目的、发明内容呈现得更加清楚，下面申请人将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0025]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026]
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]
实施例1：
[0028]
原料湖北贝母内生真菌分离自湖北贝母新鲜植株的根部，贝母采自湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市新塘乡双河社区，菌株自编号为贝21，经its序列测定结果对比得知，该序列与boeremia exigua的最大相似度高达100％，基因库登录号：mt154621.1。故将其鉴定为boeremia exigua，该菌株保藏于中南民族大学药学院微生物菌种库(已经公开，见：吕晓，叶可，马旭军等.湖北贝母内生真菌boeremia exigua化学成分及其抗炎活性研究[j].中南民族大学学报(自然科学版)，2022，41(2)：174-179)。
[0029]
上述湖北贝母内生真菌贝21的具体分离过程为：取湖北贝母(新鲜植株的根部)，用自来水冲洗干净后将其切成小块，经75％v/v乙醇润洗60s，无菌水漂洗3次，0.1％升汞(1g氯化汞溶解于1000g蒸馏水中)浸泡消毒40s，无菌水再漂洗3次，用经过高压灭菌的过滤纸吸干水分，剪去湖北贝母根部两端的切口后从中间划开，在无菌条件下将这些小块接至含有青链霉素混合液的马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基上，将其放置于25℃的恒温培养箱中培养。待真菌菌丝长出后，挑取菌丝进行纯化培养得到单一菌株，将所得单一菌株转移至装有pda培养基的试管中，放置于4℃冰箱中保存。
[0030]
采用大米固体发酵对该菌株贝21进行扩大培养：将试管从冰箱取出，在无菌常温环境中放置1小时后，在无菌环境下从试管中取直径为5mm的菌块接种至平板pda培养基上，待其生长约8天后，菌落长满pda，备用。大米培养基配比：大米50g/瓶，蒸馏水50ml/瓶，置于500ml培养瓶中，经120℃高温灭菌20分钟，冷却后在无菌环境中从平板pda培养基上挑取直径为5mm的菌块接种到大米培养基上，共340瓶，培养条件：在25℃下暗培养30d。
[0031]
权利要求书和说明书发明内容中所述化合物eremophilane型倍半萜的分离纯化过程：将上述发酵完成的大米固体培养基(共17kg)用甲醇浸泡5次，每次8h。将5次离心后的提取液合并，减压浓缩蒸干溶剂后，用少量水溶解，并用乙酸乙酯萃取6次，将乙酸乙酯部分合并后减压浓缩得到粗提浸膏800g。用80-100目正相硅胶色谱柱层析(ch2cl
2-meoh:1:0,20:1,10:1,5:1,1:1,0:1，v/v)梯度洗脱粗划段得到a
–
f六个组分。
[0032]
将c组分(二氯甲烷/甲醇的体积比为10:1时洗脱出的组分，35.8g)经过高效中压液相制备色谱(biotage sp1，反相填料材料：rp-18，20-45μm,fuji silysia chemical ltd.,japan)甲醇水体系(甲醇/水＝20:80,40:60,60:40,80:20,100:0，v/v)，流速20ml/min进行梯度洗脱，每个比例洗脱时间为40min。用薄层色谱(展开剂为氯仿：甲醇＝10:1，v/v；薄层层析硅胶板，青岛海洋化工厂)检测并显色，将相同或者类似的组分合并，最后合并成五个亚组分c1-c5。c1组分(甲醇/水的体积比为20:80时洗脱出的组分，5.8g)经正相硅胶色谱柱(200-300目),二氯甲烷甲醇体系(二氯甲烷/甲醇＝10:1-1:1，v/v)，梯度洗脱得到4个亚组分c1-1－c1-4。c1-1(二氯甲烷/甲醇的体积比为3:1时洗脱出的组分，678mg)经sephadex lh-20凝胶柱色谱(pharmacia fine chemical co.,ltd.,sweden)用甲醇洗脱后，将所得108mg产物再经高效液相制备色谱(agilent 1260；色谱柱：agilent zorbax sb-c18，规格：9.4mm
×
150mm，5μm；乙腈-水，25:75-35:65，v/v；流速：4ml/min)梯度洗脱30min，制备得2mg本发明的化合物(保留时间为12min)。
[0033]
化合物的结构鉴定：将本实施例1制备所得的化合物eremophilane型倍半萜，加0.5ml的氘代甲醇溶解，用200μl移液枪转移至核磁管中，在核磁共振仪(德国布鲁克avance iii 600mhz)上检测氢谱、碳谱以及二维谱图(如图1-6)。综合各理化数据解得该化合物的
结构并将其命名为boeremialane d。
[0034]
所得eremophilane型倍半萜的核磁共振数据：
[0035][0036]
eremophilane型倍半萜的其他理化数据：
[0037]
外观：黄色粉末；比旋光度136.0(c 0.1,meoh)；uv(meoh)λ
max
(log
ε
)240(3.47)nm；高分辨质谱hr-esi-ms m/z 345.13064[m na]

(calcd for c
17h22
o6na

,345.13086).
[0038]
根据上述检测的结果，确认本实施例所得化合物的结构式为：
[0039][0040]
分子式：c
17h22
o6[0041]
实施例2：mtt检测细胞活力
[0042]
原理：mtt法即mtt比色法，是一种操作简便、灵敏度高、经济实惠、结果直观的测试细胞活力的方法。mtt是一种四甲基偶氮唑盐，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，性状为黄色粉末。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶具有还原外源性mtt的作用，可将mtt还原为不溶于水的蓝色(或蓝紫色)晶体甲臜(formazan)，而死细胞无此作用。dmso(二甲亚砜)可以溶解沉积在细胞中的甲臜，通过酶标仪在570nm波长下进行吸光值测定，从而可以测出甲臜的含量。一般情况下，由于甲臜生成量与活细胞数量成正比，则可以根据光密度od值计算得出活细胞的相对数量(将空白对照
组活细胞设定为100％)
[0043]
用含有10％胎牛血清(fbs,pan,germany)的dmem(hyclone，usa)培养基在恒温培养箱中(5％co2,37℃)传代培养raw264.7巨噬细胞(中国科学院昆明细胞库)。取对数生长期生长状态良好的raw264.7巨噬细胞，用含有10％胎牛血清的dmem培养基配制成细胞悬液，以5
×
104个/孔，接种到96孔板中，每孔100μl，为避免边缘效应，只在中间区域6
×
10孔接种细胞，在细胞孔外围孔中每孔加入100μl无菌pbs缓冲液(ph＝7.4，0.01m)，5％co2、37℃条件下培养6-12h。使用无血清dmem培养基配制40μm浓度的实施例1所得化合物的溶液，药物组1(加lps)加入1μg/ml的lps以及40μm实施例1所得化合物的溶液共孵育，药物组2(不加lps)仅加入40μm实施例1所得化合物的溶液共孵育，空白组1加入1μg/ml的lps以及不含血清的培养基，空白组2加入不含血清的培养基，每孔100μl，3个复孔。在培养箱中孵育24小时后，用移液枪吸取原培养基，每孔加入mtt试剂(sigma)(0.5mg/ml)，放入培养箱继续孵育4h，弃去上清，加入150μl dmso(biosharp)溶解紫色结晶，待摇匀后，用酶标仪(德国tecan)检测570nm的吸光值。细胞存活率的计算公式为：细胞存活率％＝药物组/空白组
×
100％
[0044]
实验结果：通过mtt法检测该化合物与raw264.7巨噬细胞共培养后细胞毒性。由实验结果得知加入40μm浓度的该化合物孵育，加入lps(1μg/ml)刺激或不加lps刺激24h，细胞的存活率都大于70％，表明该化合物对正常和lps诱导的raw264.7巨噬细胞均无明显的细胞毒性。
[0045]
实施例3：抗炎活性测定
[0046]
原理：在含h

环境中，一氧化氮与重氮盐磺胺能发生重氮反应并生成重氮化合物，重氮化合物进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应生成红色化合物，该红色化合物在540-560nm处出现最大吸收峰。在适当的浓度范围内，红色化合物的浓度与吸光度值大小线性相关，反应生成的红色化合物浓度与一氧化氮浓度具有线性关系，因此可通过吸光度(od值)推算no浓度。进而探究实施例1所得化合物对lps诱导的raw264.7巨噬细胞产生no炎症效应的抑制作用。
[0047]
实验步骤：
[0048]
(1)细胞培养：用含有10％胎牛血清(fbs,pan,germany)的dmem培养基(hyclone，usa)在恒温培养箱(5％co2,37℃)中传代培养raw264.7巨噬细胞(中国科学院昆明细胞库)。取对数生长期生长状态良好的raw264.7巨噬细胞，用含有10％胎牛血清的dmem培养基配制成细胞悬液，调整细胞浓度为5
×
104个/孔，接种到96孔板中，每孔100μl，为避免边缘效应，只在中间区域6
×
10孔接种细胞，在细胞孔外围孔中每孔加入100μl无菌pbs缓冲液(ph＝7.4，0.01m)，5％co2、37℃条件下培养6-12h。
[0049]
(2)加药处理：用不含胎牛血清的dmem培养基配制六个浓度梯度的实施例1所得化合物的溶液，分别为40、30、20、10、5、1μm，待细胞贴壁后，将孔中的dmem培养基吸出弃去，药物组加入1μg/ml的lps以及不同浓度的实施例1所得化合物的溶液共孵育，100μl/孔，空白组每孔加入100μl无血清dmem培养基，模型组加入浓度为1μg/ml的lps溶液，阳性对照组加入pdtc50μm(碧云天，s1809)，lps和pdtc均用无血清dmem培养基配制成溶液，将96孔板置于恒温培养箱中继续培养18h。
[0050]
(3)显色：在96孔板离心机中，2000r/min离心5min，将上清转移至新的96孔板中，每孔50μl。使用griess试剂盒(promega,usa)使其生成红色物质。
[0051]
(4)比色：在酶标仪540nm波长处测量各孔的吸光值，根据od值和no标准曲线计算no浓度，进而求得各待测化合物的ic
50
值。
[0052]
no生成率％＝(药物组-空白组)/(模型组-空白组)
×
100％
[0053]
实验结果：
[0054]
药物的毒性会影响到细胞存活率，进而影响到no的生成，所以在研究药物的抗炎活性时需要考虑到细胞存活率。通过mtt试验检测细胞毒性，结果表明该化合物在40μm浓度下细胞存活率大于70％，所以深入研究其抗炎机制是有意义的。抗炎结果如图7(lps＝1μg/ml)所示，通过体外活性测试，该eremophilane型倍半萜对lps诱导的raw264.7巨噬细胞产生no炎症有显著的抑制活性，与空白组相比，lps刺激18h后no的水平明显升高，这说明lps诱导的炎症模型成功建立。在给药组中，不同浓度的化合物处理后能以剂量依赖性方式显著抑制no生成，其ic
50
为8.621μm，强于阳性对照药pdtc(ic
50
＝23.1μm)约3倍。这些结果表明，该化合物对lps刺激raw264.7巨噬细胞产生的no的具有低毒高效的抑制作用。