一种降低蛋白质变性温度的方法及其突变体与应用

1.本发明涉及生物工程、分子生物学技术领域，具体涉及一种降低蛋白质变性温度的方法及利用该方法获得的蛋白质变性温度降低的突变体，以及该突变体在制备减毒活疫苗中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.蛋白质具有一级，二级，三级和四级结构，这些结构由氨基酸之间的键和相互作用维持。蛋白质的折叠取决于氨基酸的序列，蛋白质由决定其氨基酸序列的基因编码。氨基酸一级结构顺序组装，氨基酸的适当相互作用形成二级结构，最终最小化蛋白质内的能量，蛋白质折叠成稳定的构象，产生稳定的3d结构，这种3d结构为蛋白质提供了稳定性，使其具有功能活性。
4.蛋白质的稳定性包括动力稳定性和热力稳定性，其中蛋白质的变性温度是体现蛋白质热稳定性的一个可视指标。蛋白质工程旨在通过提高蛋白质的稳定性和活性来克服其在恶劣条件下的自然限制，大多数情况下，变性温度越高，蛋白质的稳定性就越好，在环境中保持活性的时间也越长。
5.在酶工程领域，优化各种工业用酶、诊断用酶、抗体、抗原等产品具有重要意义：在大部分情况下，人们希望这些产品的热稳定性越高越好，这样能够大幅度减少相关蛋白质产品的用量，对降低成本具有关键作用。为满足这一需求，人们开发了多种提高蛋白质热稳定性的方法。例如：引入二硫键、增加离子相互作用、多聚化、化学交联固定化、定点突变等方法。这些方法有利于提高蛋白质的热变性温度，提高其工作寿命。
6.上述提高蛋白质变性温度、增强稳定性已经有很多研究和应用，但是在特殊情况下，降低蛋白质的热变性温度也会具有重要的用途。例如：使某一个酶催化反应只在期望的低温下发生；另外一个重要的潜在用途是疫苗的设计，通过降低天然病毒编码蛋白质的热变性温度，使病毒在人体环境中处于不稳定状态，可以得到毒性大幅度减弱的毒株，从而有可能获得一种特殊的减毒疫苗。但是，目前降低蛋白质热变性温度的方法研究却很少。申请人研究中发现，只有在定点突变时，可能随机出现蛋白质变性温度降低的情况，而且如果只有一个碱基突变，就容易发生回复突变。突变氨基酸若有2-3个密码子碱基与原始氨基酸的密码子不同，回复突变的概率减小，即能保证回复突变概率低。经检索，有关利用选择在蛋白质结构核的较大侧链的疏水氨基酸进行改造实现降低蛋白质变性温度的方法及利用该方法获得的蛋白质变性温度降低的突变体，以及该突变体在制备减毒活疫苗中的应用还未见报道。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种降低蛋白质变性温度的方法及利用该方法获得的蛋白质变性温度降低的突变体，以及该突变体在制备减毒活疫苗中的应用。
8.本发明所述降低蛋白质变性温度的方法，步骤是：
9.(1)分析和选择蛋白质单个结构域的突变氨基酸位点，对pdb数据库(网址是https://www1.rcsb.org)公开的相关蛋白质结构进行分析，选择在结构核的较大侧链的疏水氨基酸进行改造，设法制备密码子不易回复突变的突变氨基酸；
10.(2)设计氨基酸突变引物，对含有编码所述蛋白质单个结构域基因的大肠杆菌表达质粒进行突变，得到至少2-3个密码子碱基与原始氨基酸密码子不同的突变氨基酸的表达质粒，然后转化大肠杆菌得到设计的突变氨基酸的表达菌株；
11.(3)培养制得的大肠杆菌表达菌株至od
600
为0.6-0.8，进行iptg诱导表达，收集菌体即得到产目的蛋白菌体；
12.(4)将收集的菌体破碎后离心，把含目的蛋白的上清液加到ni-nta亲和层析柱上，然后用ppase或ulp1酶切，用洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来，即得到不需要再进一步纯化的高纯度突变体蛋白；
13.(5)得到突变体蛋白后，利用荧光定量pcr试剂protein thermal shift dye kit进行蛋白质变性温度测定实验，得到rox荧光信号随温度升高的熔解曲线，根据熔解曲线计算突变体蛋白的变性温度，确定是否得到蛋白质变性温度降低的突变体。
14.上述降低蛋白质变性温度的方法中：步骤(1)所述蛋白质单个结构域优选是新型冠状病毒结构蛋白n蛋白n端结构域ntd、新型冠状病毒结构蛋白n蛋白c端结构域ctd或新型冠状病毒非结构蛋白nsp7；选择的突变氨基酸位点优选是新型冠状病毒结构蛋白n蛋白n端结构域ntd结构核的108位色氨酸或132位色氨酸，新型冠状病毒结构蛋白n蛋白c端结构域ctd结构核的301位色氨酸、330位色氨酸或331位的亮氨酸，新型冠状病毒非结构蛋白nsp7结构核的29位色氨酸、31位的谷氨酰胺；所述结构核的较大侧链的疏水氨基酸优选是色氨酸、苯丙氨酸、组氨酸或酪氨酸。
15.上述降低蛋白质变性温度的方法中，进一步优选的实施方式是：步骤(1)所述所述蛋白质单个结构域是新型冠状病毒结构蛋白n蛋白n端结构域ntd，选择的突变氨基酸位点是新型冠状病毒结构蛋白n蛋白n端结构域ntd结构核的132位色氨酸，所述结构核的较大侧链的疏水氨基酸是色氨酸。因为色氨酸(w)只由一个密码子tgg编码，而其他氨基酸存在密码子简并性，由2-6个密码子编码，所以突变色氨酸，并且三个碱基均不同于tgg为最优选择，回复突变的概率最小。
16.上述降低蛋白质变性温度的方法中：步骤(2)所述所述的2-3个密码子碱基与原始氨基酸的密码子不同的突变氨基酸优选是亮氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；所述大肠杆菌表达载体优选pet-15b、pet-32a或pet-28b-mbp载体；所述大肠杆菌优选是e.coli bl21(de3)。
17.本发明提供了一种获得新型冠状病毒结构蛋白n蛋白n端结构域ntd蛋白质变性温度降低的突变体的方法，步骤是：
18.(1)在pdb数据库(网址是https://www1.rcsb.org/structure/7cdz)下载ntd结
构，在coot软件中打开，分析其氨基酸位置，其中132位的色氨酸位于结构核，选择对132位色氨酸进行突变；
19.(2)利用基因合成技术合成ntd基因，通过聚合酶链式反应扩增得到编码ntd基因核苷酸序列，并通过无缝克隆将其连接入pet-15b表达载体，得到表达质粒；将132位色氨酸突变成与其密码子tgg三个碱基皆不同的，氨基酸密码子为cat的组氨酸；设计氨基酸突变引物ntd w132h上游引物：ggtattattcatgtggcaaccgaaggtgca，ntd w132h下游引物：ggttgccacatgaataataccatccttatttgcaccata，利用quick change方法，得到ntd w132h突变体表达质粒，将该表达质粒转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，得到色氨酸(w)突变成组氨酸(h)的突变氨基酸的表达菌株；
20.(3)将表达菌株接种于lb培养基中，菌株培养至od
600
为0.6-0.8，添加iptg进行诱导表达过夜，收集菌体，重悬菌体，高压破碎离心，把含目的蛋白的上清液加到ni-nta亲和层析柱上，然后ppase酶切过夜，用洗脱缓冲液将目的蛋白洗脱下来，即得到不需要再进一步纯化的高纯度突变体蛋白，命名为n-ntd w132h突变体；
21.(4)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对突变体蛋白n-ntd w132h的浓度和纯度进行鉴定；
22.(5)得到突变体蛋白n-ntd w132h后，使用荧光试剂盒thermal shift dye kit，荧光定量pcr仪quantstudio 3real-time pcr system检测rox荧光变化，得到荧光随温度升高的熔解曲线，利用软件protein thermal shift
tm
software v1.0分析熔解曲线，计算n-ntd w132h突变体蛋白的变性温度，结果显示变性温度从野生型的48.9℃降低至37℃，确定得到蛋白质变性温度降低的突变体。
23.利用本发明所述方法制得的一种或几种组合的蛋白质变性温度降低的突变体，其特征在于：突变体分别是32-34℃的n-ntd w132t或n-ntd w108l；35-36℃的n-ctd w330nl331w；37℃的n-ntd w132h；38℃的n-ntd w108h、nsp7 w29e q31f或nsp7 w29eq31w；39-40℃的n-ctd w301f；41-42℃的nsp7 w29q或nsp7 w29t；43-45℃的nsp7 w29e；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31f；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31w；组合32-34℃的n-ntd w132t、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31f；组合32-34℃的n-ntd w132t、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31w；组合32-34℃的n-ntd w108l、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31f；组合32-34℃的n-ntd w108l、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和41-42℃的nsp7 w29q；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和41-42℃的nsp7 w29t；组合37℃的n-ntd w132h、38℃的nsp7 w29e q31f和39-40℃的n-ctd w301f；组合37℃的n-ntd w132h、38℃的nsp7 w29e q31w和39-40℃的n-ctd w301f；组合38℃的n-ntd w108h和39-40℃的n-ctd w301f；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的n-ntd w108h；组合37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31f；组合37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w和37℃的n-ntd w132h；组合37℃的n-ntd w132h和39-40℃的n-ctd w301f；组合38℃的nsp7 w29e q31f和39-40℃的n-ctd w301f；组合38℃的nsp7 w29e q31w和39-40℃的n-ctd w301f。
24.上述的突变体中，进一步优选的突变体分别是：35-36℃的n-ctd w330n l331w；37
℃的n-ntd w132h；38℃的n-ntd w108h、nsp7 w29e q31f或nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31f；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的n-ntd w108h；组合37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31f；组合37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w和37℃的n-ntd w132h。
25.本发明所述的蛋白质变性温度降低的突变体在制备减毒活疫苗中的应用。
26.其中：应用方法是先通过rt-pcr扩增出待制备病毒的cdna，再拼接成全长，利用所述蛋白质变性温度降低的突变体或其组合进行基因突变，得到突变基因，体外转录获得crna，然后通过常规方法转染或电穿孔引入感受态细胞，通过病毒拯救，产生感染和高滴度的后代病毒，进而制成减毒活疫苗。
27.进一步的，将减毒活疫苗株、冻干保护剂(脱脂乳体积百分含量为0.5％、海藻糖质量百分含量为6.0％、肌醇质量百分含量为0.5％、右旋糖酐-40质量百分含量为0.5％、甘油体积百分含量为0.5％、尿素质量百分含量为0.1％)、储藏保护剂(谷氨酸钠质量百分含量为0.5％和硫脲组质量百分含量为0.5％)、分散剂(亮氨酸质量百分含量为0.5％和泊洛沙姆体积百分含量为0.05％)和去离子水混合，得到含有病毒的混合液，真空冷冻干燥，制成冻干剂疫苗，便于保存与运输，粉剂疫苗优选鼻腔吸入使用。
28.本发明所述技术方案的有益技术效果：
29.(1)选择蛋白质结构核里的大侧链氨基酸进行突变，很容易使蛋白质的结构核出现空洞，进而影响其变性温度，得到合适的突变体。
30.(2)本发明突变的氨基酸都是由2-3个碱基突变导致的，通过几个氨基酸突变的组合，突变位点多，高毒回复突变株发生概率低，安全性高。
31.(3)本发明除呼吸道病毒外，也可用于其他病原体疫苗生产。
32.本发明提供了一种降低蛋白质变性温度的方法，利用此方法得到了一种或几种组合的蛋白质变性温度降低的突变体并且提出了所述突变体在制备减毒活疫苗中的应用。本发明方法的建立将对疫苗发展及其他生物工程类产品提供新思路，其成果具有一定的理论意义和应用价值，具有广阔的应用前景。
33.本发明通过对蛋白质结构进行分析，选择结构核的色氨酸等大侧链氨基酸，通过突变，使蛋白质的结构核出现空洞，从而改变了蛋白质的热稳定性，通过几种突变蛋白的组合，可以挑选出在鼻腔或上呼吸道存活温度的突变体，以达到构建减毒活疫苗的目的。该方法与传统减毒活疫苗相比，无需传代，开发时间缩短，并且无需注射，鼻腔吸入即可。与传统的灭活疫苗相比，在保证安全性的情况下，有效性增强，引起更全面的免疫原性。因此，本发明方法在病原减毒活疫苗领域极具应用前景和经济价值。
附图说明
34.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
35.图1是新型冠状病毒结构蛋白n蛋白ntd结构核的108位色氨酸(左)和132位色氨酸(右)的相互作用氨基酸结构图。
36.图2是新型冠状病毒结构蛋白n蛋白ctd结构核的301位色氨酸(左)和330位色氨酸(右)的相互作用氨基酸结构图。
37.图3是新型冠状病毒非结构蛋白nsp7结构核的29位色氨酸的相互作用氨基酸结构图。
38.图4是ntd野生型和突变体蛋白变性温度测定图。
39.图5是ctd野生型和突变体蛋白变性温度测定图。
40.图6是nsp7野生型和突变体蛋白变性温度测定图。
具体实施方式
41.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
42.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
43.本发明使用了基因工程和分子生物学领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。下述实施例中，所使用的实验方法，未做具体说明的，均为常规方法，例如可以参考《分子克隆实验指南》(sambrook和russell,2001)。
44.下述实施例中：
45.所述表达载体pet-15b，pet-32a，pet-28b，购自淼灵生物科技有限公司
46.所述大肠杆菌e.coli bl21(de3)购自北京全式金生物技术有限公司。
47.所述ppase购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
48.所述突变引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
49.所述2
×
primer star mix购于宝生物。
50.所述ni柱购于ge healthcare公司。
51.下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、载体等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
52.下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
53.实施例1：新型冠状病毒结构蛋白n蛋白n端结构域ntd的改造及其突变体筛选
54.1.在pdb数据库(网址是https://www1.rcsb.org/structure/7cdz)下载ntd结构，在coot软件中打开，分析其氨基酸位置，选择结构核的108位色氨酸或132位色氨酸分别进行突变。分析结果见附图1。
55.2.将所述两个位点的色氨酸(w)分别突变成与色氨酸密码子tgg三个碱基都不同的氨基酸，即：ctt(亮氨酸l)、cct(脯氨酸p)、cat(组氨酸h)、caa(谷氨酰胺q)、att(异亮氨
w132l、ntd w132p、ntd w132h、ntd w132q、ntd w132i、ntd w132t、ntd w132n、ntd w132k、ntd w132v、ntd w132a、ntd w132d、ntd w132e、ntd w108l、ntd w108p、ntd w108h、ntd w108q、ntd w108i、ntd w108t、ntd w108n、ntd w108k、ntd w108v、ntd w108a、ntd w108d、ntd w108e。
68.最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品的浓度和纯度进行鉴定。
69.7.于赛默飞公司购买thermal shift dye kit，其中dye是1000
×
，使用时稀释至8
×
使用，蛋白浓度稀释至1mg/ml使用，缓冲液使用25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠。按照以下体系配置：
70.成分组成用量4
×
缓冲液5μl蛋白(1mg/ml)10μldye(8
×
)2.5μl水2.5μl总20μl
71.使用荧光定量pcr仪(quantstudio 3 real-time pcr system)检测rox荧光变化，设计程序如下：
72.stepramp ratetemp(℃)time(mm:ss)1100％25.002:0021％99.002:00
73.使用软件protein thermal shift
tm
software v1.0分析熔解曲线，计算每一种突变体蛋白的变性温度。
74.结果如下：
75.其中，
“‑”
表示突变蛋白不可溶，没有得到可用蛋白。
76.[0077][0078]
结果表明，对蛋白质结构核里的色氨酸进行突变，确实能引起蛋白质稳定性的大幅度变化，其中以变性温度减小为主，少数突变体变性温度增加。
[0079]
筛选到变性温度降低至32-45℃的突变体蛋白：ntd w132t(32-34℃)、ntd w108l(32-34℃)、ntd w108l(35℃)、ntd w132h(37℃)、ntd w108h(38℃)。
[0080]
实施例2：新型冠状病毒结构蛋白n蛋白c端结构域ctd的改造及其突变体筛选
[0081]
1.在pdb数据库(网址是https://www1.rcsb.org/structure/7c22)下载ctd结构，在coot软件中打开，分析其氨基酸位置，选择结构核的301位色氨酸或330位色氨酸分别进行突变。分析结果见附图2。
[0082]
2.将所述两个位点的色氨酸(w)突变成与色氨酸密码子tgg三个碱基都不同的氨基酸：ctt(亮氨酸l)、cct(脯氨酸p)、cat(组氨酸h)、caa(谷氨酰胺q)、att(异亮氨酸i)、act(苏氨酸t)、aat(天冬酰胺n)、aaa(赖氨酸k)、gtt(缬氨酸v)、gct(丙氨酸a)、gat(天冬氨酸d)、gaa(谷氨酸e)；301位的色氨酸突变为有两个密码子碱基不同的ttt(苯丙氨酸f)。
[0083]
3.利用基因合成技术合成ctd基因(华大基因)，通过聚合酶链式反应(pcr)扩增得到编码ctd基因核苷酸序列，并将其连接入pet-15b表达载体，得到表达质粒ctd-pet-15b。
[0084]
4.设计氨基酸突变引物
[0085]
ctd w301x上游引物：tataaacatxxxccgcagattgcccagttt
[0086]
ctd w301x下游引物：aatctgcggyyyatgtttataatcggtgccctgg
[0087]
ctd w330x上游引物：agcggtaccxxxctgacctataccggtgcaattaagc
[0088]
ctd w330x下游引物：ataggtcagyyyggtaccgctcggggtaact
[0089]
其中x对应亮氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸；xxx对应ctt、cct、cat、caa、att、act、aat、aaa、gtt、gct、gat、gaa、ttt；yyy对应aag、agg、gta、ttg、aat、agt、tta、ttt、aac、agc、atc、ttc、aaa。
[0090]
5.利用quick change方法，将质粒和上述引物加入到体系，体系配制如下：
[0091]
试剂名称用量2×
primer star mix12.5μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl上述质粒(20ng/μl)1μl水9.5μl总25μl
[0092]
上述体系pcr结束后，得到突变体表达质粒ctd w301l-pet-15b、ctd w301p-pet-15b、ctd w301h-pet-15b、ctd w301q-pet-15b、ctd w301i-pet-15b、ctd w301t-pet-15b、ctd w301n-pet-15b、ctd w301k-pet-15b、ctd w301v-pet-15b、ctd w301a-pet-15b、ctd w301d-pet-15b、ctd w301e-pet-15b、ctd w301f-pet-15b、ctd w330l-pet-15b、ctd w330p-pet-15b、ctd w330h-pet-15b、ctd w330q-pet-15b、ctd w330i-pet-15b、ctd w330t-pet-15b、ctd w330n-pet-15b、ctd w330k-pet-15b、ctd w330v-pet-15b、ctd w330a-pet-15b、ctd w330d-pet-15b、ctd w330e-pet-15b，分别转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，得到设计的突变氨基酸的表达菌株。
[0093]
6.将表达菌株分别接种于含有氨苄青霉素的lb培养基中(每1000ml含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,氯化钠10g,氨苄青霉素100mg)，并将细胞置于37℃、200rpm培养直至od600约为0.8，降温至16℃，1小时后向培养基中添加终浓度为0.3mm的iptg进行诱导表达，200rpm培养过夜。
[0094]
第二天收集菌体(4℃,5000
×
g，离心18分钟，弃去上清)，每升菌加入30ml裂解缓冲液(25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠)悬起菌体。将重悬的菌体进行高压破碎，并将破碎后的菌液进行离心(25200
×
g，4℃，50分钟)，把含目的蛋白的上清液加到ni-nta亲和层析柱上，ni与蛋白中引入的组氨酸标签结合，将蛋白挂在层析柱上，用上述裂解缓冲液冲洗约10倍柱体积，除去非特异性吸附的杂质蛋白，然后加入1倍柱体积裂解缓冲液，堵住ni-nta亲和层析柱，加入带有his的ppase，酶切过夜，流穿就得到了纯度较高的突变体蛋白：ctd w301l、ctd w301p、ctd w301h、ctd w301q、ctd w301i、ctd w301t、ctd w301n、ctd w301k、ctd w301v、ctd w301a、ctd w301d、ctd w301e、ctd w301f、ctd w330l、ctd w330p、ctd w330h、ctd w330q、ctd w330i、ctd w330t、ctd w330n、ctd w330k、ctd w330v、ctd w330a、ctd w330d、ctd w330e。
[0095]
最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品的浓度和纯度进行鉴定。
[0096]
7.于赛默飞公司购买thermal shift dye kit，其中dye是1000
×
，使用时稀释至8
×
使用，蛋白浓度稀释至1mg/ml使用，缓冲液使用25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠。按照以下体系配置：
[0097]
成分组成用量4
×
缓冲液5μl蛋白(1mg/ml)10μldye(8
×
)2.5μl水2.5μl总20μl
[0098]
使用荧光定量pcr仪(quantstudio 3 real-time pcr system)检测rox荧光变化，
设计程序如下：
[0099]
stepramp ratetemp(℃)time(mm:ss)1100％25.002:0021％99.002:00
[0100]
使用软件protein thermal shift
tm
software v1.0分析熔解曲线，计算每一种突变体蛋白的变性温度。
[0101]
结果如下：
[0102]
其中，
“‑”
表示突变蛋白不可溶，没有得到可用蛋白。
[0103][0104][0105]
在得到上述结果后，并没有筛选到变性温度在37℃附近的突变体蛋白，本发明还建议在溶解度较好，变性温度在最接近37℃的突变体中，选择继续突变色氨酸附近的氨基酸，以达到变性温度进一步小范围变化的可能。
[0106]
在本实施例中，我们选择变性温度为48.46℃的ctd w330n突变体进一步改造。初步结构分析，可以对w330附近的疏水氨基酸331位的亮氨酸(l)进行突变。由尽可能改变更多的密码子碱基的原则，选择将l331突变为酪氨酸(y)、赖氨酸(k)和色氨酸(w)。
[0107]
结果如下：
[0108][0109]
结果表明，对蛋白质结构核里的色氨酸进行突变，确实能引起蛋白质稳定性的大幅度变化，其中以变性温度减小为主，少数突变体变性温度增加。
[0110]
筛选到变性温度降低至32-45℃的突变体蛋白：ctd w330n l331w(35-36℃)、ctd w330n l331y(35-36℃)、ctd w301f(40℃)。
[0111]
实施例3：新型冠状病毒非结构蛋白nsp7的改造及其突变体筛选
[0112]
1.在pdb数据库(网址是https://www1.rcsb.org/structure/7dcd)下载nsp7结构，在coot软件中打开，分析其氨基酸位置，选择结构核的29位色氨酸进行突变。分析结果见附图3。
[0113]
2.将色氨酸(w)突变成与色氨酸密码子tgg三个碱基都不同的氨基酸：ctt(亮氨酸l)、cct(脯氨酸p)、cat(组氨酸h)、caa(谷氨酰胺q)、att(异亮氨酸i)、act(苏氨酸t)、aat(天冬酰胺n)、aaa(赖氨酸k)、gtt(缬氨酸v)、gct(丙氨酸a)、gat(天冬氨酸d)、gaa(谷氨酸e)。
[0114]
3.利用基因合成技术合成nsp7基因(华大基因)，通过聚合酶链式反应(pcr)扩增得到编码nsp7基因核苷酸序列，并将其连接入pet-21b表达载体，得到表达质粒nsp7-pet-21b。
[0115]
4.设计氨基酸突变引物
[0116]
nsp7 w29x上游引物：agcaaactgxxxgcccagtgcgttcagctg
[0117]
nsp7 w29x下游引物：ctgggcyyycagtttgctgctactttcaac
[0118]
其中x对应亮氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸；xxx对应ctt、cct、cat、caa、att、act、aat、aaa、gtt、gct、gat、gaa；yyy对应aag、agg、gta、ttg、aat、agt、tta、ttt、aac、agc、atc、ttc。
[0119]
5.利用quick change方法，将质粒和上述引物加入到体系，体系配制如下：
[0120]
试剂名称用量2
×
primer star mix12.5μl上游引物(10μm)1μl下游引物(10μm)1μl上述质粒(20ng/μl)1μl水9.5μl总25μl
[0121]
上述体系pcr结束后，得到突变体表达质粒nsp7 w29l-pet-21b、nsp7 w29p-pet-21b、nsp7 w29h-pet-21b、nsp7 w29q-pet-21b、nsp7 w29i-pet-21b、nsp7 w29t-pet-21b、
nsp7w29n-pet-21b、nsp7 w29k-pet-21b、nsp7 w29v-pet-21b、nsp7 w29a-pet-21b、nsp7w29d-pet-21b、nsp7 w29e-pet-21b，分别转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，得到设计的突变氨基酸的表达菌株。
[0122]
6.将表达菌株分别接种于含有氨苄青霉素的lb培养基中(每1000ml含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,氯化钠10g,氨苄青霉素100mg)，并将细胞置于37℃、200rpm培养直至od600约为0.8，降温至16℃，1小时后向培养基中添加终浓度为0.3mm的iptg进行诱导表达，200rpm培养过夜。
[0123]
第二天收集菌体(4℃,5000
×
g，离心18分钟，弃去上清)，每升菌加入30ml裂解缓冲液(25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠)悬起菌体。将重悬的菌体进行高压破碎，并将破碎后的菌液进行离心(25200
×
g，4℃，50分钟)，把含目的蛋白的上清液加到ni-nta亲和层析柱上，ni与蛋白中引入的组氨酸标签结合，将蛋白挂在层析柱上，用上述裂解缓冲液冲洗约10倍柱体积，除去非特异性吸附的杂质蛋白，用洗脱缓冲液(25mm tris ph 8.0,100mm氯化钠,250mm咪唑)，缓冲液中的咪唑与ni有更强的亲和力，将目的蛋白竞争洗脱下来，就得到了纯度较高的突变体蛋白：nsp7 w29l、nsp7 w29p、nsp7 w29h、nsp7 w29q、nsp7w29i、nsp7 w29t、nsp7 w29n、nsp7 w29k、nsp7 w29v、nsp7 w29a、nsp7 w29d、nsp7w29e。
[0124]
最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品的浓度和纯度进行鉴定。
[0125]
7.于赛默飞公司购买thermal shift dye kit，其中dye是1000
×
，使用时稀释至8
×
使用，蛋白浓度稀释至1mg/ml使用，缓冲液使用25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠。按照以下体系配置：
[0126]
成分组成用量4
×
缓冲液5μl蛋白(1mg/ml)10μldye(8
×
)2.5μl水2.5μl总20μl
[0127]
使用荧光定量pcr仪(quantstudio 3 real-time pcr system)检测rox荧光变化，设计程序如下：
[0128]
stepramp ratetemp(℃)time(mm:ss)1100％25.002:0021％99.002:00
[0129]
使用软件protein thermal shift
tm
software v1.0分析熔解曲线，计算每一种突变体蛋白的变性温度。
[0130]
结果如下：
[0131]
其中，
“‑”
表示突变蛋白不可溶，没有得到可用蛋白。
[0132][0133][0134]
在得到上述结果后，并没有得到变性温度在37℃附近的突变体蛋白，本发明还建议在溶解度较好，变性温度在最接近37℃的突变体中，选择继续突变色氨酸附近的氨基酸，以达到变性温度进一步小范围变化的可能。
[0135]
在本实施例中，我们选择变性温度为44.59℃的nsp7 w29e突变体进一步改造。初步结构分析，可以对w29附近的疏水氨基酸31位的谷氨酰胺(e)进行突变。由尽可能改变更多的密码子碱基的原则，选择将q31突变为苯丙氨酸(f)和色氨酸(w)。
[0136]
结果如下：
[0137][0138]
结果表明，对蛋白质结构核里的色氨酸进行突变，确实能引起蛋白质稳定性的大幅度变化，其中以变性温度减小为主，少数突变体变性温度增加。
[0139]
筛选到变性温度降低至32-45℃的突变体蛋白：nsp7 w29e q31f(38-39℃)、nsp7 w29e q31w(38-39℃)、w29q(41-42℃)、w29t(41-42℃)、w29e(43-45℃)。
[0140]
以上实施例的蛋白变性温度测定见图4(实施例1)、图5(实施例2)、图6(实施例3)。
[0141]
实施例4：新型冠状病毒非结构蛋白ntd w132h突变体构建与变性温度测定
[0142]
1.在pdb数据库(网址是https://www1.rcsb.org/structure/7cdz)下载ntd结构，在coot软件中打开，分析其氨基酸位置，发现132位的色氨酸位于结构核，132位色氨酸与周围氨基酸相互作用紧密，所以对其进行突变。分析结果见附图1右图。
[0143]
2.色氨酸(w)密码子为tgg，与tgg三个密码子碱基皆不同的氨基酸有12种，在本实施例中，优选将132位色氨酸突变成密码子为cat的组氨酸(h)。
[0144]
3.利用基因合成技术合成ntd基因(华大基因)，通过聚合酶链式反应(pcr)扩增得
到编码ntd基因核苷酸序列，并通过无缝克隆将其连接入pet-15b表达载体，得到表达质粒ntd-pet-15b。
[0145]
4.设计氨基酸突变引物
[0146]
ntd w132h上游引物：ggtattattcatgtggcaaccgaaggtgca
[0147]
ntd w132h下游引物：ggttgccacatgaataataccatccttatttgcaccata
[0148]
5.利用quick change方法，将质粒和上述引物加入到体系，体系配制如下：
[0149]
试剂名称用量2
×
primer star mix12.5μlntd w132h上游引物(10μm)1μlntd w132h下游引物(10μm)1μl上述质粒(20ng/μl)1μl水9.5μl总25μl
[0150]
上述体系pcr结束后，得到突变体表达质粒：ntd w132h，转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，得到色氨酸(w)突变成组氨酸(h)的突变氨基酸的表达菌株。
[0151]
6.将表达菌株接种于含有氨苄青霉素的lb培养基中(每1000ml含胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,氯化钠10g,氨苄青霉素100mg)，并将细胞置于37℃、200rpm培养直至od
600
约为0.8，降温至16℃，1小时后向培养基中添加终浓度为0.3mm的iptg进行诱导表达，200rpm培养过夜。
[0152]
第二天收集菌体(4℃,5000
×
g，离心18分钟，弃去上清)，每升菌加入30ml裂解缓冲液(25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠)悬起菌体。将重悬的菌体进行高压破碎，并将破碎后的菌液进行离心(25200
×
g，4℃，50分钟)，把含目的蛋白的上清液加到ni-nta亲和层析柱上，ni与蛋白中引入的组氨酸标签结合，将蛋白挂在层析柱上，用上述裂解缓冲液冲洗约10倍柱体积，除去非特异性吸附的杂质蛋白，然后加入1倍柱体积裂解缓冲液，堵住ni-nta亲和层析柱，加入带有his的ppase，酶切过夜，流穿就得到了纯度较高的突变体蛋白ntd w132h。
[0153]
最后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白样品的浓度和纯度进行鉴定。
[0154]
7.于赛默飞公司购买thermal shift dye kit，其中dye是1000
×
，使用时稀释至8
×
使用，蛋白浓度稀释至1mg/ml使用，缓冲液使用25mm tris ph 8.0,200mm氯化钠。按照以下体系配置：
[0155]
成分组成用量4
×
缓冲液5μlntd w132h蛋白(1mg/ml)10μldye(8
×
)2.5μl水2.5μl总20μl
[0156]
使用荧光定量pcr仪(quantstudio 3 real-time pcr system)检测rox荧光变化，设计程序如下：
[0157]
stepramp ratetemp(℃)time(mm:ss)1100％25.002:0021％99.002:00
[0158]
使用软件protein thermal shift
tm
software v1.0分析熔解曲线，计算ntd w132h突变体蛋白的变性温度。
[0159]
结果如下：
[0160][0161]
结果表明，将蛋白质结构核里的132位的色氨酸突变为组氨酸，确实能降低蛋白质热稳定性，变性温度从原先的48.9℃降低至37℃。
[0162]
实施例5：变性温度降低的突变体蛋白组合
[0163]
为了增加病毒改造后被拯救的几率，提供多种减毒活疫苗的可能性，我们对实施例1-4中筛选得到的变性温度降低的蛋白质突变体，进行了组合，优选列出了一种或多种变性温度为32-45℃的突变体蛋白组合。
[0164]
变性温度为32-34℃的突变体蛋白：n-ntd w132t、n-ntd w108l。
[0165]
变性温度为35-36℃的突变体蛋白：n-ctd w330n l331w。
[0166]
变性温度为37℃的突变体蛋白：n-ntd w132h。
[0167]
变性温度为38℃的突变体蛋白：n-ntd w108h、nsp7 w29e q31f、nsp7 w29e q31w。
[0168]
变性温度为39-40℃的突变体蛋白：n-ctd w301f。
[0169]
变性温度为41-42℃的突变体蛋白：nsp7 w29q、nsp7 w29t。
[0170]
变性温度为43-45℃的突变体蛋白：nsp7 w29e。
[0171]
每一种蛋白结构域，不同的变性温度，进行组合，包括但不限于以下组合：
[0172]
(1)n-ctd w330n l331w(35-36℃)、n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29e q31f(38℃)；
[0173]
(2)n-ctd w330n l331w(35-36℃)、n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29e q31w(38℃)；
[0174]
(3)n-ntd w132t(32-34℃)、n-ctd w330n l331w(35-36℃)、nsp7 w29e q31f(38℃)；
[0175]
(4)n-ntd w132t(32-34℃)、n-ctd w330n l331w(35-36℃)、nsp7 w29e q31w(38℃)；
[0176]
(5)n-ntd w108l(32-34℃)、n-ctd w330n l331w(35-36℃)、nsp7 w29e q31f(38℃)；
[0177]
(6)n-ntd w108l(32-34℃)、n-ctd w330n l331w(35-36℃)、nsp7 w29e q31w(38℃)；
[0178]
(7)n-ctd w330n l331w(35-36℃)、n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29q(41-42℃)；
[0179]
(8)n-ctd w330n l331w(35-36℃)、n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29t(41-42℃)；
[0180]
(9)n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29e q31f(38℃)、n-ctd w301f(39-40℃)；
[0181]
(10)n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29e q31w(38℃)、n-ctd w301f(39-40℃)；
[0182]
(11)n-ntd w108h(38℃)、n-ctd w301f(39-40℃)；
[0183]
(12)n-ctd w330n l331w(35-36℃)、n-ntd w108h(38℃)；
[0184]
(13)n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29e q31f(38℃)；
[0185]
(14)n-ntd w132h(37℃)、nsp7 w29e q31w(38℃)；
[0186]
(15)n-ctd w330n l331w(35-36℃)、n-ntd w132h(37℃)；
[0187]
(16)n-ntd w132h(37℃)、n-ctd w301f(39-40℃)；
[0188]
(17)nsp7 w29e q31f(38℃)、n-ctd w301f(39-40℃)；
[0189]
(18)nsp7 w29e q31w(38℃)、n-ctd w301f(39-40℃)。
[0190]
以上组合了18种在37℃附近的不同变性温度突变体，但不限于以上的组合。
[0191]
实施例6：对病毒进行理性靶向诱变(反向遗传学)
[0192]
利用实施例5给出的一种或几种组合的蛋白质变性温度降低的突变体，对其按呼吸道病毒性质进行反向遗传学操作(具体方法可参照专利一种麻疹病毒活载体新冠疫苗，申请公布号为cn 113293145 a)，基因组突变，得到特定的减毒活疫苗。
[0193]
先通过rt-pcr扩增出新冠病毒cdna，再拼接成全长，利用实施例5提供的变性温度降低的蛋白质突变体或其组合：32-34℃的n-ntd w132t或n-ntd w108l；35-36℃的n-ctd w330n l331w；37℃的n-ntd w132h；38℃的n-ntd w108h、nsp7 w29e q31f或nsp7 w29e q31w；39-40℃的n-ctd w301f；41-42℃的nsp7 w29q或nsp7 w29t；43-45℃的nsp7 w29e；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31f；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31w；组合32-34℃的n-ntd w132t、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31f；组合32-34℃的n-ntd w132t、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31w；组合32-34℃的n-ntd w108l、35-36℃的n-ctd w330nl331w和38℃的nsp7 w29e q31f；组合32-34℃的n-ntd w108l、35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和41-42℃的nsp7 w29q；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w、37℃的n-ntd w132h和41-42℃的nsp7 w29t；组合37℃的n-ntd w132h、38℃的nsp7 w29eq31f和39-40℃的n-ctd w301f；组合37℃的n-ntd w132h、38℃的nsp7 w29e q31w和39-40℃的n-ctd w301f；组合38℃的n-ntd w108h和39-40℃的n-ctd w301f；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w和38℃的n-ntd w108h；组合37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31f；组合37℃的n-ntd w132h和38℃的nsp7 w29e q31w；组合35-36℃的n-ctd w330n l331w和37℃的n-ntd w132h；组合37℃的n-ntd w132h和39-40℃的n-ctd w301f；组合38℃的nsp7 w29e q31f和39-40℃的n-ctd w301f；组合38℃的nsp7 w29e q31w和39-40℃的n-ctd w301f，进行相应的基因突变，得到突变基因，常规方式体外转录获得crna，然后通过转染或电穿孔引入感受态细胞，通过病毒拯救，产生感染和高滴度的后代病毒，进而制成减毒活疫苗。
[0194]
应用上述变性温度降低的蛋白质突变体或其组合(病毒)，对其进行反向遗传学改造，基因组突变，使其在人体正常温度37℃下稳定性下降、活力降低，造成该毒株无法在人体内生存，只可能在温度较低的鼻腔及上呼吸道存活，从而成为减毒活疫苗。
[0195]
实施例7：减毒活疫苗冻干制品
[0196]
将实施例6提供的减毒疫苗株、冻干保护剂(脱脂乳体积百分含量为0.5％、海藻糖
质量百分含量为6.0％、肌醇质量百分含量为0.5％、右旋糖酐-40质量百分含量为0.5％、甘油体积百分含量为0.5％、尿素质量百分含量为0.1％)、储藏保护剂(谷氨酸钠质量百分含量为0.5％和硫脲组质量百分含量为0.5％)、分散剂(亮氨酸质量百分含量为0.5％和泊洛沙姆体积百分含量为0.05％)和去离子水混合，得到含有病毒的混合液；真空冷冻干燥，制成疫苗冻干制品。
[0197]
结论：本发明通过对蛋白质结构分析，对结构核的色氨酸等大侧链氨基酸进行突变，突变体蛋白提取与变性温度的测定实验，发现了降低变性温度的几个突变体。并通过几种不同变性温度的突变体蛋白质组合，通过反向遗传学手段对病毒进行遗传改造，使其只能在37℃以下生存，从而制备了病毒减毒活疫苗，并将疫苗制成冻干制品便于储存和运输。
[0198]
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。