一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法与流程

1.本技术属于生物技术领域，具体涉及一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法。


背景技术：

2.外泌体是由活细胞分泌的纳米级双层膜囊泡，是细胞信号传导的重要介质，并且具有促进肿瘤血管生成和转移的各种生物学效应。外泌体不仅含有蛋白质、dna和mrna，也含有非编码rna，包括microrna、lncrna和circular rna。lncrna(linc00152)在胃癌患者血浆外泌体中表达显著升高，而且外泌体能保护linc00152，使其能在血液中稳定存在，因此外泌体linc00152有可能作为胃癌诊断新的生物标志物。而且前列腺癌患者尿液中外泌体lncrna-p21表达显著增加，表明外泌体lncrna-p21可用来鉴别前列腺癌和前列腺良性疾病。外泌体介导的生物分子转运具有调节受体细胞生物学功能的重要作用。研究也表明外泌体相关的lncrna能调节细胞功能，在肿瘤发生发展中具有重要作用。
3.目前，均通过免疫磁珠捕获外泌体，获得外泌体-磁珠复合物，然后将该复合物进行表征检测。然而并不能充分的证明磁珠所捕获的是外泌体而不是其他囊泡。目前并没有一种合适的方法在保证外泌体完整性的前提下将外泌体从免疫磁珠上分离下来，并进行纯化的试剂盒。
4.因此，国内亟需一种既可以简便快速，又可以保证外泌体完整性的试剂盒及检测分析方法将外泌体吸附、分离、并进行纯化。


技术实现要素：

5.本技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本技术的实施例提出了一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法。
6.为实现上述目的，本技术所提供的技术方案为：一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，所述试剂盒包括：
7.免疫磁球，用于从体液中捕获外泌体，形成特异性结合体；
8.洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；
9.洗涤液，用于对经过分离的所述外泌体进行洗涤。
10.更进一步的技术方案是，所述免疫磁球的制备过程如下：
11.s1：将1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和fe3o4纳米颗粒共溶解在氯仿中，获得第一组合物；
12.s2：在步骤s1中的所述第一组合物中加入蒸馏水，得到第二组合物，使用探头式超声仪对所述第二组合物进行超声振荡，然后蒸发得到免疫磁珠溶液；
13.s3：将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵溶解在无水乙醇中，同时加入溶酶体相关膜蛋白3抗体，共孵育得到第三组合物；
14.s4：在步骤s3中的所述第三组合物中加入步骤s2中的所述免疫磁珠溶液，反应后
获得免疫磁球溶液；
15.s5：用磁分离架将步骤s4中的所述免疫磁球分开并清洗，以去除多余的游离抗体，然后将所述免疫磁球放置在磷酸缓冲盐溶液中，并在0～4℃储存。
16.更进一步的技术方案是，步骤s1中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和fe3o4的体积比为2:2:1:2。
17.更进一步的技术方案是，步骤s2中探头式超声仪每次超声振荡为1s，间隔为2s，总时间振荡为6分钟；步骤s2中二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与溶酶体相关膜蛋白3的质量比为500:3。
18.更进一步的技术方案是，步骤s4中反应时间为22～26h；步骤s4中加入所述免疫磁珠溶液后，按照原始物质的体积质量比：胆固醇：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵为1:1。
19.更进一步的技术方案是，步骤s5中所述磁分离架为磁场强度大于2500gs的永久磁体。
20.更进一步的技术方案是，所述免疫磁珠的粒径为10nm～10μm；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：cd9、cd63、cd81、cd44、cd31、rab5b、epcam、tsg101、hsp90、hsp70、anxa5、flot1、icam1、alix、gm130、icam-1、snap、mhci/ii、hla-g、integrins、claudins、tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
21.更进一步的技术方案是，一种完整外泌体分离、纯化试剂盒在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。
22.更进一步的技术方案是，一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，包括以下步骤：
23.(1)向免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中加入洗脱液混匀，得到消化组合物；其中免疫磁珠-外泌体复合物与洗脱液的配比为50:1～10～1；
24.(2)将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃进行消化反应，持续时间1～10分钟，得到第一分离组合物；
25.(3)向所述第一分离组合物内添加等量于洗脱液加入量的洗脱液抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；
26.(4)对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。
27.更进一步的技术方案是，所述洗脱液有效成分为胰蛋白酶，所述洗脱液中还包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液；所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶和基因工程表达的胰蛋白酶中的一种或多种。
28.本技术在采用了上述方案后，其有益效果在于：
29.(1)采用本技术制备的完整外泌体分离、纯化试剂盒能够快速捕获、分离和纯化外泌体，既可以简便快速使用，又可以保证外泌体完整性，且分离得到的外泌体具有较高的纯度，分离过程中添加的各种试剂不会影响后续检测分析，是一种快速、高效的完整外泌体分离、纯化试剂盒。
30.(2)采用本技术制备的试剂盒中的检测分析方法：通过使用特定浓度的洗脱液使免疫磁珠表面抗体与抗原之间的化学键断裂分开，从而将外泌体从免疫磁珠上分离，同时保持外泌体的完整性以及生物活性，其所包含的内容物如蛋白、核酸等不受破坏，可以进一步用于外泌体形态、生物活性等研究以及tem、nta等表征检测方法。
附图说明
31.为了使本技术所述的内容更加便于理解，下面结合附图与具体实施方式对本技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本技术不仅限于此。
32.图1为本技术中免疫磁球的粒径测试结果统计图；
33.图2为本技术中免疫磁球的原子力显微镜观察图；
34.图3为本技术实施例1捕获、分离、纯化的外泌体western blot结果；
35.图4为本技术实施例1捕获、分离、纯化的外泌体电镜测试结果。
具体实施方式
36.为了使本技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本技术一种用于捕获循环肿瘤细胞的免疫磁球组合及检测分析方法作具体阐述。
37.一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，所述试剂盒包括：
38.免疫磁球，用于从体液中捕获外泌体，形成特异性结合体；
39.洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；
40.洗涤液，用于对经过分离的所述外泌体进行洗涤。
41.更进一步的技术方案是，所述免疫磁球的制备过程如下：
42.s1：将1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和fe3o4纳米颗粒共溶解在氯仿中，获得第一组合物；
43.s2：在步骤s1中的所述第一组合物中加入蒸馏水，得到第二组合物，使用探头式超声仪对所述第二组合物进行超声振荡，然后蒸发得到免疫磁珠溶液；
44.s3：将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵溶解在无水乙醇中，同时加入溶酶体相关膜蛋白3抗体，共孵育得到第三组合物；
45.s4：在步骤s3中的所述第三组合物中加入步骤s2中的所述免疫磁珠溶液，反应后获得免疫磁球溶液；
46.s5：用磁铁将步骤s4中的所述免疫磁球分开并清洗，以去除多余的游离抗体，然后将所述免疫磁球放置在磷酸缓冲盐溶液中，并在0～4℃储存。
47.在一些实施例中，步骤s1中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和fe3o4的体积比为2:2:1:2。
48.在一些实施例中，步骤s2中探头式超声仪每次超声振荡为1s，间隔为2s，总时间振荡为6分钟；步骤s2中二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与溶酶体相关膜蛋白3的质量比为500:3。
49.在一些实施例中，步骤s4中反应时间为22～26h；步骤s4中加入所述免疫磁珠溶液后，按照原始物质的体积质量比：胆固醇：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵为1:1。
50.在一些实施例中，步骤s5中所述磁分离架为磁场强度大于2500gs的永久磁体。
51.在一些实施例中，所述免疫磁珠的粒径为10nm～10μm；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：cd9、cd63、cd81、cd44、cd31、rab5b、epcam、tsg101、hsp90、hsp70、anxa5、flot1、icam1、alix、gm130、icam-1、snap、mhci/ii、hla-g、integrins、claudins、tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。
52.在一些实施例中，一种完整外泌体分离、纯化试剂盒在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。
53.一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，包括以下步骤：
54.(1)向免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中加入洗脱液混匀，得到消化组合物；其中免疫磁珠-外泌体复合物与洗脱液的配比为50:1～10～1；
55.(2)将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃进行消化反应，持续时间1～10分钟，得到第一分离组合物；
56.(3)向所述第一分离组合物内添加等量于洗脱液加入量的洗脱液抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；
57.(4)对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。
58.在一些实施例中，所述洗脱液有效成分为胰蛋白酶，所述洗脱液中还包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液；所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶和基因工程表达的胰蛋白酶中的一种或多种。
59.将本技术制备的免疫磁球进行表征，具体方法如下：
60.取20μl免疫磁球溶液，用纯水稀释至2ml，通过zetasizer nano zs检测粒径；取10μl免疫磁球在云母片上制样，待干后通过原子力显微镜观察形态。
61.免疫磁球的粒径测试结果统计图与免疫磁球的原子力显微镜观察图参见附图1与附图2所示。
62.实施例1
63.以下以一个具体实施例及附图3和附图4进一步说明本技术的工作原理：
64.从gc患者收集抗凝血样(7.5ml)，然后以1000rpm/min离心10分钟。小心地将上清液置于ep管中。将免疫磁球(30μl)加入管中，然后在室温下孵育30分钟(每10分钟混合一次)。将ep管置于磁分离架上分离5min，除去上清液，得到免疫磁球捕获的外泌体溶液。在ep管中加入洗脱液(2ml)，37℃消化10分钟后加入洗脱液抑制剂(2ml)，涡旋5min后立即置于磁分离架上10min，收集上清液，从而获得外泌体悬浮液。全部过程只需数分钟即可完成外泌体-免疫磁球的分离，而且分离条件非常温和，不会破坏外泌体的完整性和生物活性。
65.将捕获、分离、纯化的外泌体，通过蛋白质印迹法(western blot)裂解，结果如附图3所示，本技术捕获、分离、纯化的外泌体的电镜测试结果如附图4所示。
66.实施例2
67.以下以一个具体实施例进一步说明本技术的工作原理：
68.收集肺癌患者外周血7.5ml，然后以1000rpm/min离心10min。随后，取出血清并放入ep管中。加入20μl免疫磁球，室温孵育30分钟，每5分钟混合一次。孵育后，将ep管置于磁分离架上进行分离5分钟。然后，吸出上清液，产生富含免疫磁球的外泌体。再在ep管中加入洗脱液2ml，37℃消化10min后加入洗脱液抑制剂2ml，涡旋5min后立即置于磁选架上静置10min分离后，收集上清液，从而获得外泌体悬浮液。全部过程只需数分钟即可完成外泌体-免疫磁球的分离，而且分离条件非常温和，不会破坏外泌体的完整性和生物活性。
69.以上所述仅为本技术的较佳实施例而已，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改和改进等，均应包括在本技术的保护范围之内。