人FSTL1基因的用途及相关产品的制作方法

人fstl1基因的用途及相关产品
技术领域
1.本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人fstl1基因的用途及相关产品。


背景技术：

2.卵泡抑素样蛋白1(follistatin-like protein 1，fstl1)是一种除外周淋巴细胞以外几乎所有的哺乳动物细胞均有表达的分泌性糖蛋白，它包含一个fs模块，含有10个保守半胱氨酸残基的卵泡抑素样序列，是富含半胱氨酸的分泌性酸性(sparc)家族蛋白之一，但它的功能和生物学特性与sparc家族蛋白有所不同(hambrock ho，kaufmann b，miiller s，et a1.structural characterization of tsc-36/flik：analysis of two charge isoforms[j].j biol chem，2004，279(12)：11727—35.)。
[0003]
目前关于fstl1与肿瘤的关系研究较，对fstl1在肿瘤组织中的表达情况各研究结果也不一致。有研究表明，fstl1在大多数肿瘤组织和细胞中表达下调，在少数肿瘤组织和细胞中表达上调。运用实时pcr检测技术，发现fstl1在子宫内膜癌和卵巢癌肿瘤细胞和组织样本中表达下调，fstl1 mrna表达量与肿瘤分化、恶性程度、浸润程度、淋巴结转移有关，二者可能互为因果关系(chan qk，ngan hy，ip pp，et al.tumor suppressor effect of follistatin-like 1in ovarian and endometrial carcinogenesis:a differential expression and functional analysis[j].carcinogenesis，2009，30(1):114-121.)。也有研究显示，在肾透明细胞癌中fstl1 mrna的表达量在癌的转移组织、原癌组织和正常组织中呈现逐渐上升的趋势(tan xj，zhai yj，chang wj，et al.global analysis of metastasis-associated gene expression in primary cultures from clinical specimens of clear-cell renal-cell carcinoma[j].int j cancer，2008，123(5):1 080-1 088.)。进一步免疫印迹法分析发现，fstl1蛋白表达量与肾癌患者病理分期呈负性相关，提示fstl1可能扮演着抑制肾癌发生发展的角色(liu y，han x，yu y，et al.a genetic polymorphism affects the risk and prognosis of renal cell carcinoma:association with follistatin-like protein1expression[j].sci rep，2016，6:26 689.)；在鼻咽癌细胞中，fstl1mrna表达量下调，临床病理分析发现患者性别、年龄、肿瘤分期、组织类型及淋巴转移与fstl1是否甲基化没有明显因果关系(zhou x，xiao x，huang t，et al.epigenetic inactivation of follistatin-like 1mediates tumor immune evasion in nasopharyngeal carcinoma[j].oncotarget，2016，7(13):16 433-16 444)。对鼻咽癌组织进行免疫荧光检测，结果也显示fstl1在鼻咽癌癌组织中表达下调(肖雪.分泌蛋白fstl1在鼻咽癌中的抑瘤作用及其机制的研究[d].南宁:广西医科大学，2013)。在肠癌中，免疫印迹法检测结果表明癌组织中fstl1蛋白表达量与患者的性别、肿瘤的大小、分期及分级也没有明显的相关性，免疫组化结果显示fstl1在结直肠癌上皮细胞中表达很少，而在基质中表达明显增加，且fstl1在癌组织中的表达量低于癌旁组织基质(chen sx，xu xe，wang xq，et al.identification of colonic fibroblast secretomes reveals secretory factors regulating colon cancer cell proliferation[j].j proteomics，
2014，110:155-171.)、(torres s，bartolom
é
ra，mendes m，et al.proteome profiling of cancer-associated fibroblasts identifies novel proinflammatory signatures and prognostic markers for colorectal cancer[j].clin cancer res，2013，19(21):6 006-6 019)。
[0004]
相反地，有研究发现，实时pcr检测结果显示fstl1在脑胶质细胞瘤组织中表达量上调，免疫组化显示fstl1在正常脑胶质细胞中表达为阴性，在脑胶质瘤中表达为阳性且fstl1表达量随脑胶质瘤恶性程度的降低而降低，提示fstl1的表达量越低患者预后越好(reddy sp，britto r，vinnakota ka，et al.novel glioblastoma markers with diagnostic and prognostic value identifiedthrough transcriptome analysis[j].clinical cancer research，2008，14(10):2978-2 987.)。该研究还发现单一的fstl1表达与患者生存预后没有明显相关性，而fstl1与p53共同表达与患者预后具有相关性。也发现fstl1在前列腺癌细胞中高表达且迁移力高的细胞株fstl1的表达量较高(zhou x，xiao x，huang t，et al.epigenetic inactivation of follistatin-like 1 mediates tumor immune evasion in nasopharyngeal carcinoma[j].oncotarget，2016，7(13):16433-16 444.)。以上研究结果表明fstl1在多数肿瘤组织中表达下调，在少数肿瘤组织中表达上调，其在肿瘤组织中发挥抑癌或促癌基因的作用，使其有望成为恶性肿瘤诊断或治疗的一个生物标记物。以上研究表明fstl1对肿瘤有双调控作用，既可抑制细胞增殖、迁移和迁移的作用，也可促进细胞增殖、迁移和增强细胞对化疗药的耐药能力，但具体机制仍需进一步研究，且关于fstl1在胃癌相关领域的报道很少。


技术实现要素：

[0005]
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供人fstl1基因的用途及相关产品。
[0006]
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0007]
本发明的第一方面，提供人fstl1基因作为靶标在制备胃癌治疗药物或者在制备胃癌诊断药物中的用途。
[0008]
所述人fstl1基因作为靶标在制备胃癌治疗药物具体是指：将fstl1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人fstl1基因表达的药物作为胃癌治疗备选药物。如本发明所述的fstl1基因小分子干扰rna(sirna)即是以人fstl1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制胃癌细胞迁移的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将fstl1基因作为作用对象。
[0009]
所述将人fstl1基因作为靶标用于制备胃癌诊断药物具体是指：将fstl1基因表达产物作为一项胃癌诊断指标应用于胃癌诊断药物的制备。
[0010]
所述胃癌治疗药物为能够特异性抑制fstl1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制fstl1蛋白的表达或活性的分子，从而降低胃癌细胞中fstl1基因的表达水平，达到抑制胃癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0011]
所述通过fstl1基因制备获得的胃癌治疗药物或者胃癌诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0012]
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链rna(dsrna)、核酶、核糖核酸内切酶
iii制备的小干扰rna或者短发夹rna(shrna)。
[0013]
所述胃癌治疗药物的施用量为足够降低人fstl1基因的转录或翻译，或者足够降低人fstl1蛋白的表达或活性的剂量。以使人fstl1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
[0014]
采用前述胃癌治疗药物治疗胃癌的方法，主要是通过降低人fstl1基因的表达水平抑制胃癌细胞的迁移来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人fstl1基因表达水平的物质给药于患者。
[0015]
在一种实施方式中，所述fstl1基因的靶标序列如seq id no：1所示。具体为：5
’-
gccatcaatattacaacgtat-3’。
[0016]
本发明的第二方面，提供fstl1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
[0017]
治疗胃癌；
[0018]
抑制胃癌细胞迁移。
[0019]
所述产品必然包括fstl1抑制剂，并以fstl1抑制剂作为前述功效的有效成分。
[0020]
所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为fstl1抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。
[0021]
亦即，fstl1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
[0022]
所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
[0023]
所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
[0024]
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
[0025]
所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
[0026]
所述fstl1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。
[0027]
如本发明实施例列举的，所述fstl1抑制剂可以为降低胃癌细胞中fstl1基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链rna或shrna。
[0028]
本发明的第三方面，提供了一种治疗胃癌的方法，为向对象施用fstl1抑制剂。
[0029]
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的胃癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述胃癌细胞可以为离体胃癌细胞。
[0030]
所述对象可以是罹患胃癌的患者或者期待治疗的胃癌的个体。或者所述对象为胃癌患者或者期待治疗胃癌的个体的离体胃癌细胞。
[0031]
所述fstl1抑制剂可以在接受胃癌治疗前、中、后向对象施用。
[0032]
本发明第四方面公开了一种降低胃癌细胞中fstl1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链rna或shrna。
[0033]
其中，所述双链rna中含有能够与fstl1基因杂交的核苷酸序列；
[0034]
所述shrna中含有能够与fstl1基因杂交的核苷酸序列。
[0035]
进一步的，所述双链rna包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成rna二聚体，并且所述第一链的序列与fstl1基因中的靶序列基本相同。
[0036]
所述fstl1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默fstl1基因表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mrna片段所对应的fstl1基因中的片段。
[0037]
进一步的，所述双链rna的靶序列如seq id no：1所示。具体为：5
’-
gccatcaatattacaacgtat-3’。更进一步的，所述双链rna第一链的序列如seq idno：2所示。具体为5
’-
gccaucaauauuacaacguau-3’。
[0038]
进一步的，所述双链rna为小干扰rna(sirna)。
[0039]
seq id no：2为以seq id no:1所示的序列为rna干扰靶序列设计的、针对人fstl1基因的小干扰rna的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该sirna可以起到特异性沉默胃癌细胞中内源fstl1基因表达的作用。
[0040]
所述shrna包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与fstl1基因中的靶序列基本相同。
[0041]
进一步的，所述sh rna的靶序列如seq id no：1所示。
[0042]
所述shrna经酶切加工后可成为小干扰rna(sirna)进而起到特异性沉默胃癌细胞中内源fstl1基因表达的作用。
[0043]
进一步的，所述shrna的茎环结构的序列可选自以下任一：uucaagaga、aug、ccc、uucg、ccacc、ctcgag、aagcuu和ccacacc。
[0044]
更进一步的，所述shrna的序列如seq id no：3所示。具体为5
’-
ccgggccaucaauauuacaacguaucucgagauacguuguaauauugauggcuuuuug-3’。
[0045]
进一步的，所述fstl1基因来源于人。
[0046]
本发明第五方面，公开了一种fstl1基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的shrna的基因片段，能表达所述shrna。
[0047]
所述的fstl1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人fstl1基因shrna的基因片段克隆入已知载体获得。
[0048]
进一步的，所述fstl1基因干扰核酸构建体为fstl1基因干扰慢病毒载体。
[0049]
本发明公开的fstl1基因干扰慢病毒载体是将编码前述fstl1基因shrna的dna片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述fstl1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染胃癌细胞，进而转录出本发明所述shrna，通过酶切加工等步骤，最终获得所述sirna，用于特异性沉默fstl1基因的表达。
[0050]
进一步的，所述fstl1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码胃癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(gfp)。
[0051]
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：plko.1-puro、plko.1-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tgfp、plko.1-cmv-neo、plko.1-neo、plko.1-neo-cmv-tgfp、plko.1-puro-cmv-tagcfp、plko.1-puro-cmv-tagyfp、plko.1-puro-cmv-tagrfp、plko.1-puro-cmv-tagfp635、plko.1-puro-ubc-turbogfp、plko.1-puro-ubc-tagfp635、plko-puro-iptg-1xlaco、plko-puro-iptg-3xlaco、plp1、plp2、plp/vsv-g、pentr/u6、plenti6/block-it-dest、plenti6-gw/u6-laminshrna、pcdna1.2/v5-gw/lacz、plenti6.2/n-lumio/v5-dest、pgcsil-gfp或plenti6.2/n-lumio/v5-gw/lacz中的任一。
[0052]
本发明实施例具体列举了以pgcsil-gfp为载体构建的人fstl1基因干扰慢病毒载体，命名为pgcsil-004-fstl1-sirna。
[0053]
本发明的fstl1基因sirna可用于抑制胃癌细胞的增殖，进一步地可以用作治疗胃癌的药物或制剂。fstl1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述fstl1基因sirna。当用作治疗胃癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0054]
本发明第六方面，公开了一种fstl1基因干扰慢病毒，由前述fstl1基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染胃癌细胞并产生针对fstl1基因的小分子干扰rna，从而抑制胃癌细胞的增殖。该fstl1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗胃癌的药物。
[0055]
本发明的第七方面，提供前述核酸分子，或前述fstl1基因干扰核酸构建体，或前述fstl1基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗胃癌的药物，或用于制备降低胃癌细胞中fstl1基因表达的试剂盒。
[0056]
所述预防或治疗胃癌的药物的应用为胃癌的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内胃癌的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
[0057]
进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内胃癌时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
[0058]
所述方法的对象可以为人。
[0059]
本发明的第八方面，提供一种用于预防或治疗胃癌的组合物，其有效物质含有：
[0060]
前述的核酸分子；和/或，前述fstl1基因干扰核酸构建体；和/或，前述fstl1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0061]
所述组合物可以为药物组合物。
[0062]
当所述组合物用于预防或治疗对象体内胃癌时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述胃癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
[0063]
所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
[0064]
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
[0065]
综上所述，本发明设计了针对人fstl1基因的rnai靶点序列，构建相应的fstl1 rnai载体，其中rnai载体pgcsil-004-fstl1-sirna能够显著下调fstl1基因在mrna水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为lv)作为基因操作工具携带rnai载体pgcsil-004-fstl1-sirna能够靶向地将针对fstl1基因的rnai序列高效导入胃癌ags细胞，降低fstl1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的fstl1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
[0066]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0067]
本发明经过广泛而深入的研究发现，采用rnai方法下调人fstl1基因的表达后可有效地抑制胃癌细胞的迁移，可以有效地控制胃癌的生长进程。本发明提供的sirna或者包含该sirna序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制抑制胃癌细胞迁移，从而治疗胃癌，为胃癌治疗开辟新的方向。
附图说明
[0068]
图1：rt-pcr检测ags细胞mrna水平靶基因消减效率。
[0069]
图2：侵染慢病毒的ags肿瘤细胞迁移水平检测。
[0070]
附图中，
[0071]
柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差(sd)。
[0072]
**，shctrl与目的基因shrna慢病毒处理组相比，p《0.01。
具体实施方式
[0073]
本发明从细胞功能学角度出发证实fstl1基因在胃癌发生中的作用。通过构建目的基因shrna慢病毒后转染胃癌细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组胃癌细胞系内mrna及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验检测，结果显示shrna组与对照组对比，shrna组胃癌细胞迁移水平明显降低。
[0074]
依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的诊断治疗新方法，能给胃癌患者的诊断治疗提供更多选择。
[0075]
fstl1抑制剂
[0076]
指对于fstl1具有抑制效果的分子。对于fstl1具有抑制效果包括但不限于：抑制fstl1的表达或活性。
[0077]
抑制fstl1活性是指使fstl1活力下降。优选地，相比抑制前，fstl1活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
[0078]
抑制fstl1表达具体的可以是抑制fstl1基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使fstl1的基因不转录，或降低fstl1的基因的转录活性，或者使fstl1的基因不翻译，或降低fstl1的基因的翻译水平。
[0079]
本领域技术人员可以使用常规方法对fstl1的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰rna等。
[0080]
fstl1的基因表达的抑制可以通过pcr检测表达量验证。
[0081]
优选地，与野生型相比，fstl1基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地fstl1基因完全没有表达。
[0082]
小分子化合物
[0083]
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
[0084]
制备预防或治疗胃癌的药物
[0085]
可以利用降低胃癌细胞中fstl1基因表达的核酸分子；和/或，fstl1基因干扰核酸构建体；和/或，fstl1基因干扰慢病毒，作为有效成分，制备预防或治疗胃癌的药物。通常，
所述药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
[0086]“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
[0087]“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
[0088]
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
[0089]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
[0090]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0091]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
[0092]
实施例1针对人fstl1基因rnai慢病毒的制备
[0093]
1.筛选针对人fstl1基因的有效的sirna靶点
[0094]
从genbank调取fstl1(nm_007085)基因信息；设计针对fstl1基因的有效的sirna靶点。表1-1列出了筛选出的针对fstl1基因的有效sirna靶点序列。
[0095]
表1-1靶向于人fstl1基因的sirna靶点序列
[0096]
seq id notargetseq(5
’-3’
)1gccatcaatattacaacgtat
[0097]
2.慢病毒载体的制备
[0098]
针对sirna靶点(以seq id no：1为例)合成两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo序列(表1-2)；以age i和ecor i限制性内切酶作用于pgcsil-004载体(上海
吉凯基因化学技术有限公司提供)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
[0099]
表1-2两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo
[0100][0101]
通过t4 dna连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-4所示，37℃，反应1h)的载体dna和纯化好的双链dna oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表1-5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl lb培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中rnai序列的上下游，设计通用pcr引物，上游引物序列：5
’-
tcaacccatctttcaaccctc-3’(seqid no：6)；下游引物序列：5
’-
cccttctgattctttccgtca-3’(seq id no：7)，进行pcr鉴定实验(pcr反应体系如表1-6，反应条件如表1-7)。对pcr鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对seq id no：1的表达rnai的载体，命名为pgcsil-004-fstl1-sirna。
[0102]
构建pgcsil-004-scr-sirna阴性对照质粒，阴性对照sirna靶序列为5
’-
ttctccgaacgtgtcacgt-3’(seq id no：8)。构建pgcsil-0004-scr-sirna阴性对照质粒时，针对scr sirna靶点合成两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo序列(表1-3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pgcsil-004-fstl1-sirna。
[0103]
表1-3两端含age i和ecor i酶切位点粘端的双链dna oligo
[0104][0105]
表1-4 pgcsil-gfp质粒酶切反应体系
[0106]
试剂体积(μl)pgcsil-gfp质粒(1μg/μl)2.010
×
buffer5.0100
×
bsa0.5age i(10u/μl)1.0ecor i(10u/μl)1.0dd h2o40.5total50.0
[0107]
表1-5载体dna和双链dna oligo连接反应体系
[0108]
试剂阳性对照(μl)自连对照(μl)连接组(μl)
线性化的载体dna (100ng/μl)1.01.01.0退火的双链dna oligo(100ng/μl)1.0-1.010
×
t4噬菌体dna连接酶缓冲液1.01.01.0t4噬菌体dna连接酶1.01.01.0dd h2o16.017.016.0total20.020.020.0
[0109]
表1-6 pcr反应体系
[0110]
试剂体积(μl)10
×
buffer2.0dntps(2.5mm)0.8上游引物0.4下游引物0.4taq聚合酶0.2模板1.0ddh2o15.2total20.0
[0111]
表1-7 pcr反应体系程序设定
[0112][0113]
3.包装fstl1-shrna慢病毒
[0114]
以qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取rnai质粒pgcsil-004-fstl1-sirna的dna，配制成100ng/μl储存液。
[0115]
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293t细胞，以含10％胎牛血清的dmem完全培养基调整细胞密度为1.5
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105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％co2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照sigma-aldrich公司的mission lentiviral packaging mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入packing mix(pvm)20μl，pei 12μl，无血清dmem培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒dna，加至上述pvm/pei/dmem混合液。
[0116]
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293t细胞的培养基中，37℃，5％co2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，pbs溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，centricon plus-20离心超滤装置(millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的sirna的第一链的序列如seq id no:2所示。对照慢病毒的包装过程同fstl1-shrna慢病毒，仅以pgcsil-004-nc载体代替
pgcsil-004-fstl1-sirna载体。
[0117]
实施例2实时荧光定量rt-pcr法检测基因的沉默效率
[0118]
处于对数生长期的人胃癌ags细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5
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104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数值(moi，ags：10)，加入适宜量的实施例1制备的慢病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据invitrogen公司的trizol操作说明书，抽提总rna。根据promega公司的m-mlv操作说明书，将rna逆转录获得cdna(逆转录反应体系见表2-1，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
[0119]
采用tp800型real time pcr仪(takara)进行实时定量检测。fstl1基因的引物如下：上游引物5
’-
tcaacccatctttcaaccctc-3’(seq id no：11)和下游引物5
’-
cccttctgattctttccgtca-3’(seq id no：12)。以管家基因gapdh为内参，引物序列如下：上游引物5
’-
tgacttcaacagcgacaccca-3’(seq id no：13)和下游引物5
’-
caccctgttgctgtagccaaa-3’(seq id no：14)。按表2-2中的比例配置反应体系。
[0120]
表2-1逆转录反应体系
[0121]
试剂体积(μl)5
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rt buffer4.010mm dntps2.0rnasin0.5m-mlv-rtase1.0depc h2o3.5total11.0
[0122]
表2-2 real-time pcr反应体系
[0123]
试剂体积(μl)sybr premix ex taq6.0上游引物(2.5μm)：0.15下游引物(2.5μm)：0.15cdna1.5ddh2o4.2total12.0
[0124]
设定程序为两步法real-time pcr：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。pcr结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使dna双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-δδct
分析法计算侵染了慢病毒的细胞fstl1 mrna的表达丰度。侵染对照病毒的细胞作为对照。实验结果如图1所示，表明人胃癌ags细胞中fstl1 mrna的表达水平下调了66.1％。
[0125]
实施例3侵染fstl1-shrna慢病毒的肿瘤细胞迁移水平检测
[0126]
迁移室放到培养箱中使其达到室温；用70％乙醇消毒镊子，用镊子处理transwell小室；加300μl温无血清培养基到小室内，室温放置1～2h使ecm层(extracellular matrix)再水化；准备1.0
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106/ml(用无血清培养基)细胞悬液；在步骤3再水化后，从小室内小心移
去培养基；加500μl含10％fbs的培养基于下室中；加300μl步骤4准备好的细胞悬液到每个小室中；在组织培养箱中培养48h；用棉拭子轻轻移去非-迁移细胞；加500μl染色液到板的空孔中；将小室浸泡在染色液中20min，在膜的下表面染色侵入细胞；浸泡小室在一个大的水杯中，冲洗数次。空气中晾干小室；显微镜拍照膜；醋酸溶解膜进行od值检测。
[0127]
结果如图2所示，肿瘤细胞fstl1 mrna的表达水平下调(shtarget gene组)后，其24小时的迁移率为16.2％，32小时的迁移率为21.4％，均明显低于对照组的迁移率。
[0128]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。