抗菌化合物的制作方法

抗菌化合物
1.本发明涉及氮杂环丁烷类化合物及其用途。特别地，本发明涉及1,2,4-取代的氮杂环丁烷化合物及其作为抗菌剂的用途。
2.结核病(tb)是一种由细菌结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)引起的传染病。在大多数健康个体中，免疫系统能够杀死该细菌。在一些情况下，免疫系统不能杀死该细菌，而是控制其在体内的传播。这被称为“潜伏性”tb，如果免疫系统变弱，则它可能发展为活动性感染。
3.tb是使用抗生素治疗的，抗生素可以在长持续时间内施用。对于之前没有患过tb的患者的典型治疗方案可以持续六个月，前两个月涉及施用一线药物诸如异烟肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinaminde)和乙胺丁醇(ethambutol)，随后在剩余的四个月内继续施用异烟肼和利福平(rifampicin)。
4.尽管自世界卫生组织(who)宣布tb为全球性紧急情况已过去了二十多年，但是结核病(tb)仍然是一个主要的全球性健康问题。在2016年，tb导致约130万人死亡，并且现在与hiv并列为全球头号死因。据估计，在2016年发生了近630万例新tb病例；这些新tb病例中有46％是同时感染hiv的个体。令人担忧的是，估计有4.1％的新tb病例和19％的先前治疗过的tb病例是由多药耐药性tb(mdr-tb)引起的感染，并且在2016年估计有190,000人死于这种形式的疾病。此外，现已有105个国家报告了广泛耐药性tb(xdr-tb)，并且在2016年导致大约30,000名tb患者。迫切需要针对新途径的药物。如果要按照who终止tb战略设定的里程碑来减小这些数字，则迫切需要靶向新途径的替代治疗剂。
5.考虑到这些问题设计了本发明。
6.根据本发明的第一个方面，提供了一种式i的化合物
[0007][0008]
其中：
[0009]-环a是任选地含有至少一个杂原子的6元环；
[0010]-各个r1独立地选自：卤素(例如氟、氯、溴或碘)；-cz3、-ocz3、取代或未取代的c
1-6
烷基、烯基或炔基；oh、no2、cn、cho和co2r5；
[0011]-各个r2独立地选自：卤素(例如氟、氯、溴或碘)；-cz3、-ocz3、取代或未取代的c
1-6
烷基、烯基或炔基；oh、no2、cn、cho和co2r5；
[0012]-x是氮、碳、硫或氧；
[0013]-各个z独立地选自氟、氯、溴和碘；
[0014]-r3和r4独立地表示氢、取代或未取代的c
1-6
烷基、烯基或炔基、环烷基或杂环、或-(ch2)
q-o-(ch2)q基团，或者x、r3和r4一起形成选自以下各项的结构：
[0015][0016]-各个r5独立地选自h、取代或未取代的c
1-6
烷基、苄基、杂芳基和芳基；
[0017]-各个r6独立地选自-cz3或ocz3，
[0018]-n、m和p独立地表示0、1、2、3、4或5；并且
[0019]-各个q独立地选自1至5的任意整数，
[0020]
或其药用盐。
[0021]
在一些实施方案中，所述化合物不是具有选自以下各项的结构的化合物：
[0022][0023]
如本文中使用的，术语“烷基”是指直链或支链烷基。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、叔戊基、己基和异己基。取代基可以附接在烷基的任意点处。
[0024]
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
[0025]
术语“环烷基”是指具有3至7个环原子的饱和碳环(即仅由碳原子形成的环)。
[0026]
如本文中使用的，术语“杂环”是指单环或者稠合双环或三环结构，其每个环结构具有3至10个环原子，所述环原子选自碳原子和至少一个(例如1、2、3或4个)选自氮、氧和硫的杂原子。杂环可以是饱和的或不饱和的。饱和杂环的实例包括氮杂环丙烷(aziridine)、氧杂环丙烷(oxirane)、硫杂环丙烷(thiirane)、氮杂环丁烷(azetidine)、氧杂环丁烷(oxetane)、硫杂环丁烷(thietane)、吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、噁唑烷、二氧戊环、二硫杂环戊烷(dithiolane)、哌啶、四氢吡喃和噻烷。不饱和杂环的实例包括氮杂环丙烯(azirine)、氧杂环丙烯(oxirene)、硫杂环丙烯(thiirene)、氮杂环丁二烯(azete)、氧杂环丁烯(oxete)、硫杂环丁烯(thiete)、吡咯、呋喃、噻吩、吡啶、吡喃、噻喃和三唑。
[0027]
术语“芳基”是指芳族碳环(即仅由碳原子形成的一个环或多个环)。碳环可以是单环，或者其可以是稠合碳环。芳基可以是取代的或未取代的。芳基的实例包括苯基(c6h5)和萘基(c
10
h8)。
[0028]
术语“杂芳基”是指包含至少一个杂原子(即非碳原子)的芳环或稠环。杂原子可以选自氮、氧和硫。
[0029]
术语“苄基”是指通过亚甲基(ch2)基团附接至分子的其余部分的苯环。苄基可以
是取代的或未取代的。
[0030]
在一些实施方案中，环a是杂环。
[0031]
在一些实施方案中，环a是芳族的。在一些实施方案中，环a是苯基。
[0032]
在一些实施方案中，芳环含有一个或多个杂原子，诸如氮和/或氧。因此，该环可以是杂环芳族环。例如，环a可以是吡啶环。在其中环a是吡啶环的实施方案中，相对于将环连接到分子的其余部分的键，氮原子可以排布在间(3)位。
[0033]
不希望受理论束缚，认为吸电子和/或亲脂性基团作为r1和/或r2可能是有益的。
[0034]
在一些实施方案中，各个r1独立地选自：卤代(halo)、取代或未取代的c
1-6
烷基、-cz3和-ocz3。-cz3基团可以是cf3。-ocz3基团可以是ocf3。
[0035]
在另外的实施方案中，各个r1独立地选自：br、cl、f、och3、ocf3、oh、cf3或叔丁基。在一些实施方案中，各个r1独立地选自br、f、ocf3和cf3。
[0036]
在一些实施方案中，n是1或2。在一些实施方案中，其中n是1，取代基r1可以在邻位、间位或对位。在一些实施方案中，其中n是2，取代基可以都排布在间位。
[0037]
在一些实施方案中，各个r2独立地选自：卤代、取代或未取代的c
1-6
烷基、-cz3和-ocz3。-cz3基团可以是cf3。-ocz3基团可以是ocf3。
[0038]
在另外的实施方案中，各个r2独立地选自：br、cl、f、och3、me(即甲基、ch3)、ocf3、oh或cf3。在一些实施方案中，各个r2独立地选自br、f、och3、me、ocf3和cf3。
[0039]
在一些实施方案中，m是1或2。在一些实施方案中，其中m是1，取代基r2可以在邻位、间位或对位。在一些实施方案中，其中m是1，取代基r2在邻位。
[0040]
在一些实施方案中，x是氮。在一些实施方案中，r3和r4独立地选自氢和c
1-6
未取代或取代的烷基，诸如甲基。
[0041]
在一些实施方案中，r3和r4二者都是甲基。因此，在其中x是氮的实施方案中，x、r3和r4一起形成二甲基胺基团。
[0042]
在一些实施方案中，x、r3和r4一起形成吡咯烷环。
[0043]
在一些实施方案中，x、r3和r4一起提供选自以下的结构：
[0044][0045]
在一些实施方案中，p是0或1。在一些实施方案中，其中p是1，取代基r6在对位。
[0046]
本发明的化合物含有氮杂环丁烷环。特别地，本发明的化合物是1,2,4-取代的氮杂环丁烷。
[0047]
处在氮杂环丁烷环(氮杂环丁烷的n为1位)的2-位或4-位的取代基可以为顺式或
反式。在一些实施方案中，化合物为顺式-氮杂环丁烷。
[0048]
化合物可以是外消旋混合物，例如2,4-顺式非对映异构体的外消旋混合物。备选地，可以提供单一的对映异构体。
[0049]
在一些实施方案中，所述化合物具有根据式ii的结构，
[0050][0051]
其中
[0052]
各个r1独立地选自br、cl、f、cf3、ocf3、och3和叔丁基，
[0053]
各个r2独立地选自br、cl、f、cf3、ocf3、och3和ch3，
[0054]
n和m独立地表示1或2；
[0055]
r3和r4独立地选自氢和甲基，或者n、r3和r4一起形成以下结构：
[0056][0057]
在一些实施方案中，各个r1和r2独立地选自br、cl、cf3和ocf3。
[0058]
在一些实施方案中，根据本发明的化合物是选自表1中列出的那些的化合物。
[0059]
表1：根据本发明的化合物
[0060]
[0061]
[0062]
[0063]
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]
[0071][0072]
应当理解，可以形成本文所述化合物的不同的可能的立体异构体。在一些实施方案中，合成路线可以得到2,4-顺式非对映异构体的外消旋混合物。然后可以例如通过到烯丙基化步骤的手性辅助方法以及通过在制备型或半制备型hplc中使用手性固定相对外消旋氮杂环丁烷衍生物进行色谱分离来获得单一的对映异构体。
[0073]
在一些实施方案中，所述化合物是选自如表1所示的azet 2、azet 4、azet 5、azet 19、azet 32、azet 33、azet 34和azet 59的化合物。
[0074]
在一些实施方案中，所述化合物的分子量小于700、小于650、小于600、小于550或小于500。
[0075]
在一些实施方案中，所述化合物的针对结核分枝杆菌(m.tuberculosis)的mic
50
和/或mic
99
为小于100μm、小于50μm、小于25μm、小于15μm、小于10μm、小于8μm或小于5μm。在一些实施方案中，结核分枝杆菌是结核分枝杆菌菌株h37rv。测定mic
99
和mic
50
的方法在本文中描述，并且对于本领域技术人员将是熟知的。
[0076]
本发明的化合物可以是结晶或无定形形式，为游离化合物或溶剂化物(例如水合物)，并且旨在所有的形式均在本发明的范围内。溶剂化的方法在本领域中通常是已知的。
[0077]
根据本发明的第二个方面，提供了一种包含如本文所定义的化合物的药物组合物。
[0078]
药物组合物可以包含治疗有效量的化合物。药物组合物还可以包含药用载体或赋形剂。
[0079]
根据本发明的又一个方面，提供了一种包含根据本发明的第二个方面的药物组合物的剂型。
[0080]
在本发明的又一个方面，提供了如本文所定义的化合物、根据本发明的药物组合物或剂型，其用作药物。
[0081]
根据本发明的另一个方面，提供了如本文所定义的化合物或其药用盐，其用于治疗感染。
[0082]
化合物可以是如本文所述的任何化合物。
[0083]
在本发明的另一个方面，提供了如本文所定义的化合物在制备用于治疗感染的药物中的用途。
[0084]
在另一个方面，本发明提供了一种治疗患有感染或处于感染风险中的患者的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的化合物或药物组合物或剂型。
[0085]
患者可以是哺乳动物，特别是人。
[0086]
本发明的药物组合物可以被配制成在将组合物施用至动物(优选人)时使得根据本发明的化合物是生物可利用的。组合物可以采用一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单个剂量单位，并且根据本发明的化合物的容器可以含有液体或气雾剂形式的化合物并且可以容纳单个或多个剂量单位。
[0087]
药用载体或媒介物可以是颗粒状的，使得组合物例如为片剂或粉剂形式。一种或多种载体可以是液体，其中组合物例如是口服糖浆或可注射液体。另外，一种或多种载体可以是气体或液体，以提供可用于例如吸入施用的气雾剂组合物。粉剂也可以用于吸入剂型。术语“载体”是指稀释剂、佐剂或赋形剂，根据本发明的化合物与其一起施用。这样的药物载体可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。载体可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素、二糖等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至动物时，根据本发明的化合物和组合物以及药用载体是无菌的。当静脉内施用根据本发明的化合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，尤其是用于注射液。合适的药物载体还包括赋形剂，诸如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或者ph缓冲剂。
[0088]
当旨在用于口服施用时，组合物优选为固体或液体形式，其中半固体、半液体、混
悬液和凝胶形式包括在本文中视为固体或液体的形式中。
[0089]
作为用于口服施用的固体组合物，组合物可以被配制成粉剂、颗粒剂、压制片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片剂(wafer)或类似形式。这样的固体组合物典型地含有一种或多种惰性稀释剂。另外，可以存在以下中的一种或多种：粘合剂，诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，诸如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，诸如海藻酸、海藻酸钠、玉米淀粉等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味料；以及着色剂。
[0090]
当组合物为胶囊(例如明胶胶囊)的形式时，除了上述类型的材料外，它还可以含有液体载体，诸如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。
[0091]
组合物可以为液体的形式，例如酏剂、糖浆、溶液、乳剂或混悬液。液体可以可用于口服施用或通过注射递送。当旨在用于口服施用时，组合物可以包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于通过注射施用的组合物中，还可以包含表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
[0092]
施用形式的实例包括但不限于口服、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、眼和鼻内。肠胃外施用包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输注技术。
[0093]
在特定病症或病况的治疗中有效的根据本发明的化合物的量将取决于该病症或病况的性质，并且可以通过标准临床技术确定。另外，可以任选地采用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。在组合物中采用的精确剂量也将取决于施用的途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。
[0094]
组合物包含有效量的本发明的化合物，使得将获得合适的剂量。化合物的正确剂量将根据特定制剂、应用模式以及其特定部位、宿主和所治疗的疾病(例如癌症并且若是如此，哪种类型的肿瘤)而变化。应考虑其他因素，如年龄、体重、性别、饮食、施用时间、排泄率、宿主状况、药物组合、反应敏感性和疾病的严重程度。施用可以在最大耐受剂量内连续或定期地进行。
[0095]
典型地，所述量是按组合物的重量计至少约0.01％的本发明的化合物，并且可以包含至少80％。当旨在用于口服施用时，这个量可以在按组合物的重量计约0.1％至约80％的范围内变化。优选的口服组合物可以包含按组合物的重量计约4％至约50％的本发明的化合物。
[0096]
制备本发明的优选组合物，使得肠胃外剂量单位含有约0.01重量％至约10重量％的本发明的化合物。更优选的肠胃外剂量单位含有约0.5重量％至约5重量％的本发明的化合物。
[0097]
对于静脉内施用，组合物适用于约0.1mg/kg动物体重至约250mg/kg动物体重，优选约0.1mg/kg动物体重至约20mg/kg动物体重，并且更优选约1mg/kg动物体重至约10mg/kg动物体重的剂量。
[0098]
本发明的组合物可以采用溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂(pill)、丸粒(pellet)、胶囊、含有液体的胶囊、粉剂、缓释制剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、混悬液或任何其他适合使用的形式。
[0099]
可以使用制药领域众所周知的方法来制备药物组合物。例如，可以通过将本发明的化合物与水或其他生理上合适的稀释剂(诸如磷酸盐缓冲盐水)合并以形成溶液来制备
旨在通过注射施用的组合物。可以添加表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。
[0100]
感染可以是由细菌、病毒、真菌、古细菌、寄生物或酵母引起的感染。在一些实施方案中，感染是细菌感染。
[0101]
在一些实施方案中，细菌感染是由分枝杆菌引起的感染。可以通过本发明的化合物处理的分枝杆菌的实例是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、非洲分枝杆菌(mycobacterium africanum)、非洲分枝杆菌(mycobacterium africanum)和卡氏分枝杆菌(mycobacterium canetti)。另外，我们还包括被本发明的化合物靶向的非结核分枝杆菌(ntm)生物体脓肿分枝杆菌(mycobacterium abscessuss)、溃疡分枝杆菌(mycobacterium ulcerans)、麻风分枝杆菌(mycobacterium leprae)、海鱼分枝杆菌(mycobacterium marinum)和鸟分枝杆菌(mycobacterium avium)。
[0102]
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的化合物、组合物或剂型，其用于治疗结核病。
[0103]
根据本发明的化合物可以与一种或多种其他活性剂(诸如抗菌剂)组合施用。因此，还提供了根据本发明的化合物与一种或多种其他抗菌剂的组合。
[0104]
在一些实施方案中，其他抗菌剂是抗结核剂。
[0105]
根据本发明的化合物和其他抗菌剂可以同时、分开或依次施用。
[0106]
应当理解，除非另有说明，否则本文描述的与本发明的第一个方面相关的任何实施方案都可以与本发明的任何其他方面组合。
[0107]
现在将通过实施例的方式来描述本发明的实施方案。
[0108]
实施例1：合成方法
[0109]
一般合成方案含有四个步骤，如下面的方案1所示。第一个步骤是取代的苯甲醛和取代的苄胺之间的亚胺化反应。高烯丙基胺基序可容易地通过亚胺的烯丙基化获得，这是第二个步骤。在第三个步骤中，碘介导的高烯丙基胺在室温下的环化通过4-exo trig(4-外型-三角形体系)环化得到顺式-2,4-氮杂环丁烷。(在完全的立体控制下，碘代-氮杂环丁烷异构化为顺式-吡咯烷可以通过加热实现)。进一步的官能化(胺化反应)通过碘的亲核置换以得到取代的氮杂环丁烷(氨基氮杂环丁烷)来实现。
[0110]
[0111]
方案1
[0112]
亚胺形成：例如，(i)etoh，回流(1至10小时)；或(ii)ch2cl2和干燥剂(例如ms 3a)；或(iii)甲苯，δ，迪安斯塔克设备(dean stark apparatus)。
[0113]
烯丙基化：例如，(i)与原位制备的烯丙基锌(allyl since)反应；或(ii)与预先形成的烯丙基-镁(格氏)试剂(典型地rmgx，r＝烯丙基，x＝卤素)反应。
[0114]
环化：典型地与分子碘(i2)、无机碱(nahco3)，在合适的溶剂(乙腈)中，在不超过25℃(典型地《18℃)的温度下，较低的温度使得更清洁地转化为所需的含有氮杂环丁烷的产物，但是导致反应时间延长(可能需要18至36小时)。
[0115]
胺化：在极性非质子溶剂(例如dmf或dmso)中，添加纯(用于液体胺)或作为溶液(固体胺所需)的伯胺或仲胺(或其他亲核试剂-例如叠氮化物)，置换碘化物并且得到所需的1,2,3-氮杂环丁烷衍生物。
[0116]
使用方案1中绘示的一般方案来制备所有的氮杂环丁烷。
[0117]
通过完善且常规的程序，将醛和胺在溶剂(etoh)中合并，并且在回流下加热如通过tlc分析(中和二氧化硅-etoac/己烷)判断而确定为合适的时间。典型地1至10小时以确保醛的完全消耗。将溶剂蒸发，并且由此获得的剩余物可以使用etoac作为洗脱剂经由通过二氧化硅塞的快速过滤(除去任何残留的胺)来纯化(如果需要，如通过由此获得的剩余物的质子nmr光谱的检查来进行判断)。通过完善且常规的程序，经由通过在合适的无水溶剂(例如thf(优先)、二噁烷或二乙醚)中加入优先预形成的原位制备的烯丙基锌试剂(活化的锌加上烯丙基溴)的反应来进行烯丙基化(烯丙基格氏试剂或烯丙基锡烷试剂也产生所需的产物，锌试剂提供更清洁的产物、更少的不希望的废渣和更顺畅的反应)。通过急骤色谱法(例如二氧化硅-etoac/己烷)纯化由此获得的高烯丙基产物典型地将纯度提高到》98％(通过质子nmr光谱分析)，从而允许在下一个步骤中获得最大收率。通过在共同发明人团队内建立的程序，接下来进行碘介导的环化。重要的是，为了避免形成不希望的(在这种情况下)吡咯烷产物，将反应和随后的产物保持在《25℃，最佳条件是17℃反应，室温操作并且储存在-4℃，此外由此获得的含有碘化物的产物典型地立即使用，以避免由异构化造成的污染。分子碘(i2)、无机碱(nahco3)，在合适的溶剂(乙腈)中，在不超过25℃(典型地《18℃)的温度下，较低的温度使得更清洁地转化为所需的含有氮杂环丁烷的产物，但是导致反应时间延长(可能需要18至36小时)。在使用硫代硫酸钠溶液的水性后处理(以去除多余的碘)、萃取、干燥(用mgso
4-或类似物)、过滤和溶剂蒸发(在《20℃)后，通过质子nmr光谱分析由此获得的剩余物以确认存在氮杂环丁烷衍生物(以及不存在吡咯烷衍生物，通过与标准代表性光谱相比)，并且在不进行进一步纯化的情况下用于下一个步骤。根据需要，向由此获得的碘代-氮杂环丁烷衍生物中添加过量的纯胺(如果是液体)或溶解在合适的溶剂(例如dmso或dmf)中的胺。在室温或控制在《18℃的温度下搅拌一段时间后，根据环境实验室条件，温度稳定在15℃可能是有益的。挥发物的蒸发和通过急骤色谱法(根据需要，在一些情况下，接着是制备型hplc(c18反相))的小心纯化，得到分析纯的产物1,2,3-取代的氮杂环丁烷。
[0118]
实施例2：抗菌研究
[0119]
方法
[0120]
菌株
[0121]
通过比例肉汤微量稀释法来测试结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)h37rv标准菌株。细菌在补充有油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶(oadc)增菌物的middlebrook培养基(7h9)上新鲜生长。
[0122]
接种物制备
[0123]
将来自middlebrook琼脂的结核分枝杆菌的新鲜生长的菌落转移到含有3-4ml磷酸盐缓冲盐水和6至9个无菌玻璃珠的管中。将这些管在涡旋混合器上剧烈搅动并且使团块沉降30分钟。将上清液转移到无菌管中。然后将上清液用磷酸盐缓冲盐水调整至等于0.5mcfarland标准的密度以用作在bmm中的标准接种物，并且调整至等于1.0mcfarland的密度以用作用于比例法(nccls 2002)的标准接种物。
[0124]
化合物制备
[0125]
所有化合物均在greiner 96孔v型底聚丙烯微量滴定板(化合物中间板)中制备。将化合物以25μm(100％dmso)的浓度载入第2列中，并且使用hamilton star机器人平台从第2列至第11列在100％dmso中连续2倍稀释。在微量滴定板中包括未处理的对照样品(第1列，100％dmso)和对照化合物(第2列，10mm利福平)。
[0126]
使用针对结核分枝杆菌h37ra的无选择标记的自发光测定的体外抗结核活性
[0127]
将ualra(mtb h37ra::ptyok)在含有5ml middlebook 7h9培养基加上0.05％吐温(tween)80、10％v/v油酸白蛋白葡萄糖过氧化氢酶(oadc)补充物(7h9-oadc-tw)的50ml管中用无菌玻璃珠均化。当od600达到0.3-0.5时，通过将200μl培养物放在光度计的检测孔上来测定相对光单位(rlu)计数。当rlu达到200万时，在具有吐温80的7h9肉汤中生长的25μl ualra肉汤培养物(rlu稀释至2000-4000)中制备的从0.000001μg/ml至10μg/ml的3倍增加的范围内，评估化合物5a-v的效应浓度。在处理组中，dmso用作阴性对照，并且q203(10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/l)、异烟肼(inh，10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml)和利福平(rif，10μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml)用作阳性对照。每天测定rlu 16计数，持续4天。分析数据，miclux值是在处理后能够获得比率(rlu药物/rludmso)小于10％的最低药物浓度。
[0128]
针对结核分枝杆菌h37rv的药敏试验
[0129]
greiner f型底、黑壁、透明底部的96孔微量滴定板(测定板)用补充有油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶(oadc)增菌物的100μl middlebrook7h9培养基填充。使用hamilton star机器人平台的96头，将1μl的化合物从化合物中间板转移到测定板(包括对照)中。将100μl的在补充有oadc的middlebrook 7h9中的结核分枝杆菌h37rv添加到测定板的所有96孔中，这相当于每孔大约5000cfu的结核分枝杆菌h37rv(每孔)。将测定板在37℃在具有5％co2的加湿温育箱中温育7天。在温育的第6天，将20μl 0.02％刃天青(resazurin)添加到所有96孔中，并且将板在37℃温育另外24小时。在第7天，使用带有光学模块exc-560nm、emm-585nm的bmg pherastar fs对测定板进行荧光测量。根据标准方法，计算每种化合物的生长抑制百分比。mic数据针对高和低对照进行归一化，并且使用graphpad prism软件进行处理。将数据拟合到gomperz方程以确定mic
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值。
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结果
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化合物根据上述方案进行合成并测试。化合物针对结核分枝杆菌h37rv的抗菌活性在表2中示出。结果表明，根据本发明的氮杂环丁烷化合物对结核分枝杆菌是有效的。
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表2：本发明的化合物的抗菌活性
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