一种促进肠道激素分泌的小肽及其制备方法和应用

1.本发明属于生物活性肽领域，尤其是涉及一种促进肠道激素分泌的小肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.机体肥胖会导致诸多慢性疾病，如ii型糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝、痛风等。这些以肥胖、高血糖、血脂异常等聚集高发、严重影响机体健康的临床症候群，统称为机体代谢综合征。目前研究认为，机体代谢综合征的共同原因就是肥胖尤其是中心性肥胖所造成的胰岛素抵抗和高胰岛素血症。因此，减轻体重和胰岛素抵抗是预防和治疗机体代谢综合征的重要措施。为了减轻体重和胰岛素抵抗，限制机体摄食量是最佳的手段。机体摄食受脑肠肽调控，其中，酪酪肽(peptide yy， pyy)是由分布于回肠及结肠粘膜的内分泌l细胞合成和分泌的由36个氨基酸组成的胃肠肽类激素。pyy由胃肠道在餐后释放,被认为是一种摄食生理调节因子, 并且和长期的能量平衡有关。动物和临床研究证实pyy有抑制食欲、减少能量摄入、减轻体质量的功能。pyy作为一种和肥胖相关的食欲因子,对改善肥胖和糖尿病都有一定的作用。因此，增加肠道pyy的分泌对于减轻体重和胰岛素抵抗，进而预防和治疗机体代谢综合征具有重要意义。
3.pyy的分泌受膳食因素调控。因此，可以通过膳食调控肠道pyy的分泌进而预防和治疗机体代谢综合征。生物活性肽是一种常见的膳食因子，具有易被人体消化吸收、食用安全性高等特点。国家高度重视生物活性肽产业的发展，明确指出，要加快发展功能性食品，支持发展生物活性肽等保健和健康食品，并开展应用示范。鉴于pyy的重要作用及生物活性肽的诸多优点，寻找一种能够促进pyy分泌的生物活性肽或提取物具有重要价值，对于预防或减缓机体代谢综合征意义重大。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种促进肠道激素分泌的小肽及其制备方法和应用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
6.本发明第一方面，提供一种促进肠道激素分泌的小肽，促进肠道激素分泌的小肽为lllpq活性肽，氨基酸序列为：leu-leu-leu-pro-gln，如seq id no.1所示，分子量为582.4da。
7.燕麦蛋白主要是球蛋白，其中燕麦12s seed storage globulin 1的氨基酸序列如 seq id no.2所示。可以发现，lllpq活性肽在燕麦蛋白存在。lllpq活性肽可以从燕麦蛋白中制备。
8.本发明提供的lllpq活性肽是燕麦来源的，lllpq小肽可显著促进肠道酪酪肽(peptide yy，pyy)的分泌，具有安全无毒副作用、耐受胃肠道消化酶酶解的特点。
9.本发明第二方面，提供编码所述促进肠道激素分泌的小肽的多核苷酸。
10.本发明第三方面，提供所述促进肠道激素分泌的小肽的制备方法，通过基因工程
的方法人工合成，或从燕麦蛋白中通过分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。
11.通过基因工程的方法人工合成所述促进肠道激素分泌的小肽是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以dna重组技术为基础，通过合适的dna 模板来控制多肽的序列合成。
12.关于从燕麦蛋白中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的促进肠道激素分泌的小肽的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、分离、纯化方法从燕麦获取促进肠道激素分泌的小肽。
13.通过化学合成制备的方法为采用传统的固相合成法合成上述小肽。
14.本发明第四方面，提供含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物的制备方法，采用两步酶解法将燕麦蛋白进行酶解，包括以下步骤：用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解燕麦蛋白，得到燕麦蛋白酶解产物，即为含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物。
15.在本发明的一个实施方式中，所述用胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解燕麦蛋白的方法，包括如下步骤：
16.1)从燕麦中提取燕麦蛋白；
17.2)用所述胃蛋白酶酶解所述燕麦蛋白，得到第一次酶解产物；
18.3)用所述胰蛋白酶酶解所述第一次酶解产物，得到燕麦蛋白酶解产物。
19.在本发明的一个实施方式中，从燕麦中提取燕麦蛋白的方法包括以下步骤：
20.将燕麦磨粉、脱脂，然后加入蒸馏水中，将ph调到4-6，用纤维素酶预先处理0.5-2h；然后将ph调至10-12进行蛋白提取，结束后离心取上清液，将上清液 ph调至4.4-4.6，静置后离心，水洗；最后干燥得到燕麦蛋白。
21.在本发明的一个实施方式中，所述胃蛋白酶或胰蛋白酶与所述燕麦蛋白的质量比为1：10-100。
22.在本发明的一个实施方式中，所述胃蛋白酶或胰蛋白酶的酶解条件为37℃酶解1-4h。
23.在本发明的一个实施方式中，步骤3)得到燕麦蛋白酶解产物后，还包括以下步骤：
24.将所述燕麦蛋白酶解产物利用toyopearl hw-40f尺寸排阻色谱柱进行分离，以去离子水作为洗脱剂，以一定的流速进行洗脱、层析纯化，收集不同组分；然后检测不同组分对肠内分泌细胞pyy分泌的影响，选取促进pyy分泌最高活性的组分为目的组分，即为含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物。
25.本发明第五方面，提供基于上述制备方法制备的含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物。
26.本发明第六方面，提供所述促进肠道激素分泌的小肽、所述含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物在制备具有如下1)-5)中至少一种功能的产品中的应用：
27.1)促进pyy分泌；
28.2)减缓胃排空；
29.3)抑制食欲减少进食量；
30.4)预防或辅助治疗肥胖；
31.5)改善或辅助治疗糖尿病。
32.所述促进肠道激素分泌的小肽、所述含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物可显著促进肠道酪酪肽(peptide yy，pyy)的分泌，具有安全无毒副作用、耐受胃肠道消化酶酶解的特点。
33.本发明第七方面，提供一种产品，其中包含所述促进肠道激素分泌的小肽，或所述含有所述促进肠道激素分泌的小肽的酶解产物，所述产品具有如下1)-5)中至少一种功能：
34.1)促进pyy分泌；
35.2)减缓胃排空；
36.3)抑制食欲减少进食量；
37.4)预防或辅助治疗肥胖；
38.5)改善或辅助治疗糖尿病。
39.所述产品包括食品、功能食品/保健食品和药品。
40.与现有技术相比，本发明的优点及有益效果体现在以下方面：
41.本发明提供的小肽结构新颖，迄今尚未见相关，具有显著刺激肠道pyy分泌的能力；本发明所述小肽可由食品蛋白质燕麦蛋白制备得到，因而具有安全无毒副作用的优点；本发明所述lllpq序列小肽分子量为582.4da，分子量小，除了能够促进肠道pyy分泌外，还容易被机体吸收，从而具有很好的营养功能；本发明提供的含lllpq序列小肽的制备方法简单、易于操作，便于工业化大规模生产，具有重要的应用前景。
附图说明
42.图1为含有lllpq序列小肽人工合成后的液相图和质谱图；
43.图2为lllpq序列小肽对stc-1细胞活性的影响；
44.图3lllpq序列小肽对stc-1细胞分泌pyy的影响；
45.图4为不同浓度燕麦蛋白酶解物对stc-1细胞分泌pyy的影响；
46.图5为燕麦蛋白酶解物对小鼠分泌pyy的影响；
47.图6为燕麦蛋白酶解物经hw-40f尺寸排阻色谱柱分离的图谱；
48.图7为分离组分对stc-1细胞分泌pyy的影响；
49.图8为分离组分f1中lllpq序列小肽的ms/ms图谱。
具体实施方式
50.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
51.实施例1lllpq序列小肽的人工合成与活性评价
52.一、lllpq序列小肽的合成
53.合成leu-leu-leu-pro-gln(lllpq)小肽，该肽由“浙江鸿拓科技有限公司”采用肽固相合成法合成，通过高效液相方法和质谱技术验证了合成肽的纯度大于 95％，该肽的液相图和质谱图1所示。
54.二、含lllpq序列小肽对sct-1细胞pyy分泌的影响
55.(1)stc-1细胞的培养
56.stc-1细胞培养在含有10％胎牛血清(fbs)，1％非必需氨基酸(neaa)，100 u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的dmem培养基中。将细胞在37℃，含有5％ co2的细胞培养箱中孵
育，并在达到80-90％密度时，通过胰蛋白酶消化进行传代培养。
57.(2)细胞活性测定
58.通过3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物[3-(4， 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl]-2h-tetrazoliumbromide，mtt)细胞增殖及细胞毒性测试和评估lllpq序列小肽对stc-1细胞活力的影响。在96孔板处理后的stc-1细胞中加入mtt，代谢活跃的细胞将黄色四唑盐mtt裂解成紫色的甲瓒晶体。将形成的甲瓒溶解，用酶标仪在检测波长为570nm处测量吸光度，结果以对照组的百分比表示。结果如2所示，在不同肽测试浓度下(0,1,2,4mmol/l)，相比对照物stc-1细胞活力没有现在变化，说明lllpq序列小肽对细胞无毒性。
[0059]
(3)stc-1细胞分泌pyy的测定
[0060]
将小肽用hank’s缓冲液配成摩尔浓度分别为0,0.5,1，2mm的肽溶液。在24 孔培养板中将stc-1细胞以1.25
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105个细胞的密度接种。待细胞达到80％-90％汇合时，将细胞用hank’s缓冲液洗涤两次，以除去培养基。小肽溶液加入stc-1细胞中，在培养箱中37℃孵育细胞2h。孵育结束后，1000g离心20min，取上清液。采用武汉云克隆科技股份有限公司的商用pyy试剂盒测定pyy含量。
[0061]
小肽对stc-1细胞分泌pyy的影响见图3，可以看到小肽均能够剂量依赖的显著促进stc-1细胞分泌pyy，lllpq序列小肽促进pyy分泌的量是空白对照组的4.15倍。当前大量研究已证实促进肠道pyy的分泌有助于抑制食欲,减少能量摄入和体重。pyy作为一种和肥胖相关的食欲因子，对改善肥胖和糖尿病都有一定的作用。本专利所述小肽能够显著促进肠道内分泌细胞stc-1分泌pyy，因此这些小肽对于减轻体重和胰岛素抵抗，进而预防和治疗机体代谢综合征具有重要意义和应用价值。
[0062]
实施例2制备燕麦蛋白酶解物与活性评价
[0063]
(1)燕麦蛋白酶解物制备
[0064]
将燕麦磨粉过80筛，然后用己烷将燕麦粉脱脂。将脱脂燕麦粉用蒸馏水以质量比为12:1于烧杯中浸泡，用1mol/l hcl将ph值调至5.0，在50℃下用纤维素酶处理1h。然后将ph值用1mol/l naoh调至11.0，在磁力搅拌器作用2h后离心取上清液。用1mol/l hcl将上清液ph值调至其等电点(ph 4.5)静置1h后离心，水洗沉淀至中性，用少量蒸馏水复溶后冷冻干燥得到燕麦蛋白，4℃储藏备用。
[0065]
将冻干的1g蛋白粉末溶于20ml含25mg新鲜制备的胃蛋白酶的 k2hpo
4-kh2po4磷酸盐缓冲液(0.1mol/l)中，将溶液ph值用hcl(1mol/l)调节至2.0，在37℃下孵育2h。孵育结束，将溶液ph值用naoh(1mol/l)调至 6.8后，加入50mg胰蛋白酶继续酶解2h。结束后沸水浴灭酶8min，离心取上清液冷冻干燥，得到燕麦蛋白酶解物。
[0066]
(2)活性评价
[0067]
将燕麦蛋白酶解物用hank’s缓冲液配成质量浓度分别为3,4,5mg/ml的溶液, 用上述方法测定酶解物对stc-1细胞分泌pyy的影响，结果见图4。由结果可以看到燕麦蛋白酶解物能够显著的刺激stc-1细胞分泌pyy。
[0068]
另外，在动物水平上评价燕麦蛋白酶解物对小鼠肠内分泌细胞分泌激素的影响。经过1周的适应期后，将icr小鼠随机分为2组(每组28只)。对照组：灌胃生理盐水；燕麦蛋白酶解物组：灌胃燕麦蛋白酶解物(1.0g/kg体重)。灌胃后，分别在0，15min，30min，60min，
90min，120min，150min摘眼球取血，放入含有edta(最终浓度为1mg/ml)、抑肽酶(最终浓度为0.6tiu/ml)的离心管中，离心取上清液，用elisa方法血清中pyy激素含量。灌胃生理盐水组血清中的 pyy在这个期间水平维持在30pg/ml左右。灌胃燕麦蛋白酶解物组结果如图5所示，可以发现燕麦蛋白酶解物增加小鼠体内pyy水平，在30-120min内，对小鼠肠内分泌细胞分泌pyy的影响最大，可达到130pg/ml左右，是灌胃生理盐水组的4.3倍。
[0069]
实施例3制备燕麦蛋白促pyy分泌的小肽
[0070]
取toyopearl hw-40f填料常规溶胀与装柱(装填缓冲溶液为0.1m nacl溶于 50mm磷酸盐)，柱高10cm，内径2.6cm，任何时刻柱顶需留水层1.5-2cm，柱平衡约3-4个柱体积后即可使用。保留液面2-3mm时开始加样燕麦蛋白酶解物。称取燕麦蛋白酶解物粉末约20mg溶于2ml蒸馏水中，0.45μm微孔滤膜过滤后加入层析柱，洗脱液为蒸馏水，洗脱速度为2ml/min，收集洗脱峰。燕麦蛋白酶解物分离图谱见图6，可以看到hw-40f色谱柱将蛋白酶解物分为4个肽组分。
[0071]
将4个肽组分用上述方法进行活性评价，结果如图7所示。可以发现在4个肽组分中，f1组分具有最好的刺激stc-1细胞分泌pyy的能力。因此，f1组分为高活性的促pyy分泌的小肽。
[0072]
实施例4燕麦蛋白含lllpq序列小肽的鉴定
[0073]
将f1组分中的肽序列采用质谱技术进行鉴定。将样品溶于蒸馏水，制成1mg/ml样品。使用反相色谱柱(150μm i.d.
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150mm,packed with acclaim pepmaprplc c18,1.9μm,)进行分离，流动相a为0.1％甲酸水溶液，流动相b为 0.1％甲酸/80％乙腈溶液，在600nl/min流速下梯度洗脱，分离梯度：0-2min，4-8％ b；2-45min，8-40％b；45-55min，40-60％b；55-56min，60-95％b；56-66min， 95％b。质谱离子源类型为电喷雾电离源(esi)，正离子扫描模式，喷雾电压2200 v，毛细管温度270℃。一级质谱参数设置：扫描范围100-2000m/z，最大分辨率 70000，自动增益参数3000000。二级质谱参数设置：扫描范围50-2000m/z，最大分辨率17500，自动增益参数100000。
[0074]
经质谱检测，f1组分中出现的离子峰包括m/z＝583.38。将这个分子离子峰进一步进行二级质谱分析，此分子离子峰的二级质谱图见图8。经数据库匹配和手动计算，此分子离子峰对应的肽序列为leu-leu-leu-pro-gln(lllpq)。
[0075]
燕麦蛋白主要是球蛋白，其中燕麦12s seed storage globulin 1的氨基酸序列如 seq id no.2所示。可以发现，lllpq序列小肽在燕麦蛋白中存在。lllpq序列小肽可以利用上述方法从燕麦蛋白中制备。
[0076]
燕麦12s seed storage globulin 1的氨基酸序列具体如下所示：
[0077]
[0078]
[0079][0080]
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。