一种用于冠状病毒核酸检测的微电极及其制备方法与应用

技术特征：
1.一种用于冠状病毒核酸检测的微电极，其特征在于，该微电极包括绝缘衬底、制备于绝缘衬底上的微电极及导线，所述微电极包含工作电极，对电极和参比电极，在所述工作电极表面完全覆盖石墨烯，所述工作电极表面的石墨烯修饰固定dna探针；所述dna探针能够直接与待测冠状病毒核酸序列或能够和待测冠状病毒核酸特征序列逆转录后的dna通过碱基互补配对结合在一起，结合引起的排斥效应使dna探针上的电化学标签接触到所述微电极表面的石墨烯，发生氧化还原反应，产生电化学信号。2.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸检测的微电极，其特征在于，所述dna探针是在dna单链或三维核酸纳米结构上添加一条或多条用于与冠状病毒核酸序列互补配对的检测链以及位于检测链顶端的电化学标签，其中，三维核酸纳米结构通过寡核苷酸链互补配对自组装而成。3.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸检测的微电极，其特征在于，所述冠状病毒核酸特征序列为编码非结构蛋白基因、编码刺蛋白基因、编码核壳蛋白基因或编码包膜蛋白基因中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸检测的微电极，其特征在于，在检测链与三维核酸纳米结构之间增加一段不与冠状病毒核酸序列或冠状病毒核酸序列逆转录后的dna配对的核酸单链，用以保证检测链可以多个自由度转动。5.根据权利要求1所述的一种用于冠状病毒核酸检测的微电极，其特征在于，工作电极图案为中心对称图形；所述绝缘衬底采用二氧化硅材质；所述石墨烯为单层石墨烯。6.权利要求1-5中任一项所述用于冠状病毒核酸检测的微电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：在绝缘衬底表面制备工作电极、参比电极、对电极和导线；步骤2：将石墨烯转移到微电极表面，并利用光刻技术将石墨烯进行图案化，使石墨烯完全覆盖工作电极，将覆盖在对电极和参比电极表面的石墨烯去除，得到待修饰器件；步骤3：将待修饰器件上加入连接分子溶液中0.5～2小时，使连接分子吸附到石墨烯表面，同时合成dna探针；步骤4：在微电极上制造微量液体容器；步骤5：在液体容器中加入dna探针溶液，使dna探针通过共价键与连接分子连接，静置反应2-10小时使dna探针修饰在石墨烯表面；步骤6：修饰完成后，取出dna探针溶液，加入含镁离子的缓冲液，在常温下保存器件，得到所述用于冠状病毒核酸检测的微电极。7.权利要求1-5中任一项所述用于冠状病毒核酸检测的微电极非疾病诊断治疗目的的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：在测试前，微电极分别与电化学测试装置的接口进行电气连接，通过在工作电极上施加负电压，检测时，在微量液体容器里面加入待测样本，使其能够接触并覆盖工作电极表面的石墨烯，通过检测电化学电流变化实现冠状病毒核酸的高灵敏度检测。8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，根据dna探针电化学标签的氧化还原电位设置相应的电化学检测参数，包括电压扫描起始电压，终止电压，步进电压，脉冲电压；起始电压和终止电压根据电化学标签的氧化还原电位分别加减0.3伏特到0.5伏特，步进电压为0.005伏特到0.01伏特，脉冲电压为0.01伏特到0.1伏特；在测试前，通过在工作电极上
施加-0.9伏特到-0.1伏特的负电压，使所述dna探针上的检测链以及电化学标签远离石墨烯，降低噪声。9.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，检测时，在电化学微电极的微量液体容器中，加入待测溶液，使得修饰在电化学微电极上的dna探针与待测溶液中的冠状病毒核酸序列或冠状病毒核酸逆转录后得到的dna互补配对结合；在加入检测样本并孵育5到30分钟后，通过控制负电压的大小，调整施加排斥电场的强弱，将已与冠状毒核酸结合的检测链和未与冠状病毒核酸结合的检测链进行区分，使未与冠状病毒核酸结合的检测链顶端远离石墨烯，同时使与冠状病毒核酸结合的检测链顶端靠近石墨烯，提升检测灵敏度和精度；检测过程中的电化学响应作为核酸检测的信号，即在电化学标签氧化还原电位附近出现氧化还原电流峰就可以判定为核酸阳性，在电化学标签氧化还原电位附近未出现氧化还原电流峰就可以判定为核酸阴性；最后通过实时检测氧化还原电流的变化，通过浓度公式计算出冠状病毒核酸的浓度。10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于，出现氧化还原电流峰的标志为电化学标签氧化还原电位
±
0.2伏特所对应电流平均值的120％以上，包括120％；未出现氧化还原电流峰的标志为电化学标签氧化还原电位
±
0.2伏特所对应电流平均值的120％以下，不包括120％。

技术总结
本发明涉及一种用于冠状病毒核酸检测的微电极及其制备方法与应用。该微电极包括绝缘衬底、制备于绝缘衬底上的微电极及导线，所述微电极包含工作电极，对电极和参比电极，在所述工作电极表面完全覆盖石墨烯，所述工作电极表面的石墨烯修饰固定特殊设计的DNA探针；所述DNA探针能够直接与待测冠状病毒核酸序列或能够和待测冠状病毒核酸特征序列逆转录后的DNA通过碱基互补配对结合在一起，由于排斥效应，使DNA探针顶端的电化学标签接触到所述微电极表面的石墨烯，发生氧化还原反应，产生电化学信号。本发明实现了准确定量检测冠状病毒核酸的目的，检测时间短，灵敏度高，特异性好，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：魏大程 纪岱宗
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.07.08
技术公布日：2022/11/15