一种基因递送系统在从脑部逆行递送基因到脊髓神经元中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因递送系统在从脑部逆行递送基因到脊髓神经元中的应用。


背景技术：

2.中枢神经系统(central nervous system)由脑和脊髓组成，脑和脊髓是各种反射弧的中枢部分，是神经系统的主体部分。中枢神经系统接受全身各处的传入信息，经它整合加工后成为协调的运动性传出，或者储存在中枢神经系统内成为学习、记忆的神经基础。脑器官包含大脑、小脑、脑干等，脑干(brainstem)位于大脑下方，脊髓和间脑之间，是中枢神经系统的较小部分，呈不规则的柱状形。脑干自下而上由延髓、脑桥、中脑三部分组成，延髓部分下连脊髓。旁臂核(parabrachial nucleus)是脑桥内的神经核团，位于脑桥上部，包绕于小脑上脚内侧和外侧，包含内侧臂旁核(medial parabrachial necleus，mpbn)和外侧臂旁核(lateral parabrachial nucleus，lpbn)。
3.脊髓投射神经元将躯体感觉信息传递到多个脑区，包含丘脑、导水管周围灰质、孤束核和臂旁核等(al-khater and todd,2009；gauriau and bernard,2004；todd,2010)，利用病毒示踪的方法解析相关的神经环路，对理解痛觉、痒觉、脊髓损伤修复等机制有重要的意义。然而，目前缺乏能够从脑部逆行转导脊髓神经元的工具病毒载体，且效率低。
4.基于以上问题，本发明提供了一种基因递送系统在从脑部逆行递送基因到脊髓神经元中的应用，以解决从脑部逆行转导脊髓神经元的工具病毒载体效率低的问题。


技术实现要素：

5.为了解决从脑部逆行转导脊髓神经元的工具病毒载体效率低的问题，本发明提供了一种基因递送系统在从脑部逆行递送基因到脊髓神经元中的应用。
6.该基因递送系统将基因从脑部递送到脊髓的应用，或者在制备将基因从脑部递送到脊髓的试剂中的应用，其中，所述基因递送系统包含腺相关病毒载体raav11，所述腺相关病毒载体raav11中包含编码标记蛋白的基因和启动子。
7.进一步地，所述编码标记蛋白的基因中的标记蛋白选自荧光蛋白和/或酶反应显色蛋白，所述荧光蛋白选自bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、cerulean、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、dtomato、tdtomato、mcherry、mkate、mapple、mbanana、mcitrine、morange、mplum、tagrfp和tagbfp中的一种或多种，所述酶反应显色蛋白选自hrp、firefly luciferase和renilla luciferase中的一种或多种；
8.所述启动子选自cag、cmv、hubc、ef1α、nef、hsyn、camkiiα、vgat、thy1、tre、uas、gfap、gfaabc1d、th、rpe65、tre、cba、pgk、e-sare、c-fos、ram、sst、pv、mdlx、npy、cr、tcap、sfrp2、chat、tph2、mth、gad67、gfap104、cd68、nestin、mbp、trpv1、l7/pcp2、moxt、rk、hgrk1、car、grm6、roh、nrl、mck、dmck和tmck中一种或多种。
9.本发明的一个目的是提供一种脊髓神经网络的标记方法。该脊髓神经网络的标记方法包含以下步骤：
10.s1：将腺相关病毒载体注射至小鼠脑桥的外侧臂旁核中；
11.s2：观察脊髓中标记蛋白的分布情况，
12.其中，所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码标记蛋白的基因和启动子。
13.进一步地，所述编码标记蛋白的基因中的标记蛋白选自荧光蛋白和/或酶反应显色蛋白，所述荧光蛋白选自bfp、cfp、gfp、yfp、rfp、irfp、cerulean、venus、egfp、ecfp、eyfp、ebfp、dsred、dtomato、tdtomato、mcherry、mkate、mapple、mbanana、mcitrine、morange、mplum、tagrfp和tagbfp中的一种或多种，所述酶反应显色蛋白选自hrp、firefly luciferase和renilla luciferase中的一种或多种；
14.所述启动子选自cag、cmv、hubc、ef1α、nef、hsyn、camkiiα、vgat、thy1、tre、uas、gfap、gfaabc1d、th、rpe65、tre、cba、pgk、e-sare、c-fos、ram、sst、pv、mdlx、npy、cr、tcap、sfrp2、chat、tph2、mth、gad67、gfap104、cd68、nestin、mbp、trpv1、l7/pcp2、moxt、rk、hgrk1、car、grm6、roh、nrl、mck、dmck和tmck中一种或多种。
15.本发明的一个目的是提供一种腺相关病毒载体的在脊髓神经元中表达目的蛋白或功能性rna的应用，或者在制备在脊髓神经元中表达目的蛋白或功能性rna的试剂中的应用，其中，所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码目的蛋白或功能性rna的基因和启动子。
16.进一步地，所述目的蛋白选自标记蛋白和/活性蛋白，所述活性蛋白选自激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、钙离子信号探针蛋白、小分子信号探针蛋白、介导凋亡蛋白、疾病相关突变蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子、病毒感染辅助受体、重组酶和工具蛋白中的一种或多种，所述功能性rna选自小rna、小干扰rna、小发卡rna、小向导rna、细胞器定位rna和用于rna测序或原位杂交分析的barcode rna中的一种或多种。
17.本发明的一个目的是提供一种在脊髓神经元中表达目的蛋白或功能性rna的方法。该方法包含以下步骤：
18.将腺相关病毒载体注射至小鼠脑桥的外侧臂旁核中，
19.其中，所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码目的蛋白或功能性rna的基因和启动子。
20.进一步地，所述目的蛋白选自标记蛋白和/或活性蛋白，所述活性蛋白选自激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、钙离子信号探针蛋白、小分子信号探针蛋白、介导凋亡蛋白、疾病相关突变蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子、病毒感染辅助受体、重组酶和基因编辑工具蛋白中的一种或多种，所述功能性rna选自小rna、小干扰rna、小发卡rna、小向导rna、细胞器定位rna和用于rna测序或原位杂交分析的barcode rna中的一种或多种。
21.本发明的一个目的是提供一种腺相关病毒载体在制备治疗脊髓神经元异常导致的疾病的药物中的应用。
22.该应用中所述腺相关病毒载体为raav11，所述腺相关病毒载体中还包含编码治疗用蛋白或功能性rna的基因和启动子。
23.进一步地，所述目的蛋白选自标记蛋白和/或活性蛋白，所述活性蛋白选自激活神经元蛋白、抑制神经元蛋白、生理条件下的正常蛋白、细胞因子、抗病毒因子和基因编辑工具蛋白中的一种或多种，所述功能性rna选自小rna、小干扰rna、小发卡rna和小向导rna中的一种或多种。
24.本发明发现了腺相关病毒raav11载体的新用途，raav11载体能够从脑部逆行递送将目的基因表达在脊髓的神经元中，基于此raav11载体可以携带目的基因用于标记、操控脊髓神经系统，也可以作为基因治疗的载体。
25.相比于其他载体，raav11载体可以高效将基因从脑部逆行递送到脊髓神经元。
附图说明
26.图1为c57bl/6j小鼠在外侧旁臂核注射raav11-cag-egfp-wpre-hgh polya病毒载体后，脊髓纵切面成像结果。
27.图2为c57bl/6j小鼠在外侧旁臂核注射raav11-cag-egfp-wpre-hgh polya病毒载体后，脊髓横切面成像结果。
具体实施方式
28.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
29.一、重组腺相关病毒的制备
30.病毒包装方法参考aav11 permits efficient retrograde targeting of projection neurons，han et al.biorxiv 2022.01.13.476170；doi:https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476170，采用三质粒包装系统包装腺相关病毒方法，即利用装载核心元件的质粒paav-cag-egfp-wpre-hgh polya与paav-rc2/11血清型aav衣壳质粒、腺病毒元件辅助质粒pad-helper按质粒分子数1：1：1共转染hek-293t细胞，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀，用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用sybr green qpcr法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得raav11-cag-egfp-wpre-hgh polya病毒的滴度为5.0
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vg/ml。
31.二、重组腺相关病毒的活体应用
32.将制备的raav11-cag-egfp-wpre-hgh polya(200nl/只)病毒通过脑立体定位方式注射于8-10周龄c57bl/6小鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)的脑桥的外侧臂旁核(lateral parabrachial nucleus，lpbn)脑区，3周后灌流取脑，小鼠脑组织经depc(焦碳酸二乙酯)处理过的pfa(多聚甲醛)溶液固定4小时后再用depc处理过的30％蔗糖-pbs溶液脱水48小时，将脱水后的脑组织用组织包埋剂充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的脑片。贴片并使用玻片扫描仪显微镜对其进行成像。活体检测结果可以看出，在脊髓神经元胞体可见raav11-cag-egfp-wpre-hgh polya病毒标记的绿色荧光信号，表明raav11-cag-egfp-wpre-hgh polya重组腺相关病毒可以从脑部高效逆行转导脊髓神经元，将目的基因递送到脊髓神经元。