一株吡啶红球菌及其在修复重茬连作土壤的应用

1.本发明涉及农业微生物及生态修复技术领域，具体涉及一株吡啶红球菌及其应用。


背景技术：

2.连作障碍问题严重影响着作物的生产和可持续发展，植物产生的自毒物质是引起作物连作障碍的主要因素，自毒物质会通过植物体淋溶、根系分泌物和植物残渣等途径进入土壤，影响下茬作物生长。而植物根系分泌的自毒物质如对羟基苯甲酸等酚酸类物质是常见的自毒物质。有研究表明，酚酸为病原真菌提供了丰富的营养物质，极大的降低土壤的肥力以及作物的产量与质量。
3.酚酸类物质在环境中可通过非生物和生物两种途径进行降解，前者包括光解和水解，后者主要是微生物降解，大多数情况下光解降解速率远低于生物降解，因此，微生物降解是酚酸类在自然环境中的主要降解途径。
4.有研究表明，红球菌属可以降解脂肪族、芳香族、杂环、多环芳香族、脂环烃、腈以及胆固醇等多种天然有机合物，因此红球菌属是潜在的环境治理特效菌，在修复重茬连作土壤和治理环境污染中的工业废水、海洋石油污染等方面都具有良好的应用前景。
5.番茄是常见的栽培经济作物，随着种植年限的增加，连作障碍成为影响番茄产量与品质主要制约因素。酚酸类物质是番茄产生的一类自毒物质，包括香草酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸等，对番茄的生长具有显著的抑制作用。采用生物学措施促进土壤中酚酸类物质的降解，可有效减轻连作障碍。
6.近年来，微生物修复重茬连作土壤的措施引起了人们的重视。菌肥是常见的修复土壤的产品之一，它是以微生物的生长代谢活动来修复和改善土壤肥力并与植物相互作用保障植物生长的一种制剂，该菌肥在农业中被广泛的使用。


技术实现要素：

7.针对上述现有技术，本发明提供一株降解酚酸的吡啶红球菌(rhodococcus pyridinivorans)gxun1036。该吡啶红球菌gxun1036分离自红树林根际土壤，其能够降解对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸等多种酚酸类物质，能够修复重茬连作产生酚酸土壤。
8.本发明提供一种含有上述吡啶红球菌gxun1036的菌剂。
9.本发明提供上述吡啶红球菌gxun1036可用于微生物菌剂、复合微生物肥料、生物有机肥在修复酚酸类连作障碍中的应用。
10.具体的，本发明涉及以下技术方案：
11.本发明从北海红树林根际土壤中分离到一株能够降解对羟基苯甲酸的细菌菌株。该菌株可将无机盐离子培养基中2000mg/l的对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸降解。
12.本发明提供吡啶红球菌(rhodococcus pyridinivorans)gxun1036，该菌株已于2022年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号)，其生物保藏号为：cgmcc no.25002。
13.所述吡啶红球菌gxun1036菌株的菌落及菌体特征为：
14.lb平板上生长的菌苔有隆起，呈粉红色，菌落不透明，其表面较为光滑，有些许光泽，边缘较为规整，在以对羟基苯甲酸作为唯一碳源无机盐固体培养基上也能够生长；扫描电镜结果显示菌体呈棒状，凸起，无鞭毛，菌体长300～781nm，宽3～5nm。
15.所述lb培养基配方为：酵母提取物5g胰蛋白胨10g氯化钠10g琼脂20g蒸馏水1000ml，ph 7.0。
16.含有所述吡啶红球菌gxun1036的菌肥，包括微生物菌剂、复合微生物肥料、生物有机肥也属于本发明的保护范围。
17.该菌肥除包含吡啶红球菌gxun1036外还包含其他功能菌株、载体、化肥、有机肥；
18.该菌肥除包含吡啶红球菌gxun1036外，还可包括辅料，如腐植酸、生物炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、稻草、花生皮等。所述菌剂还可包括载体，所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可以选自矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可以为粘土、滑石粉、高岭土、沸石和硅藻土中的一种或多种；所述植物材料可以为玉米粉、豆粉或淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可以为聚乙烯醇。所述液体载体可以为有机溶剂、植物油或水；
19.该菌肥除包含吡啶红球菌gxun1036外，还可包括化肥，如氮肥、磷肥、钾肥等单质肥料和复合肥料；
20.该菌肥除包含吡啶红球菌gxun1036外，还可包括各种动物、植物残体、代谢物组成的有机肥，如人畜粪便、秸秆、动物残体、屠宰场废弃物；
21.所述菌肥中，吡啶红球菌gxun1036可以是被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。
22.所述菌肥的状态可以为液剂、乳剂、悬浮剂、颗粒剂、粉剂、可湿性粉剂或水分散剂。
23.进一步的，本发明还提供一种吡啶红球菌gxun1036活菌菌剂的制备方法，包括以下步骤：
24.将吡啶红球菌gxun1036接种至发酵培养基中，30～37℃培养72h，得到吡啶红球菌gxun1036发酵液；
25.将吡啶红球菌发酵液用无菌水稀释至5～10％获得活菌菌剂；
26.优选的，吡啶红球菌菌株gxun1036活菌菌剂的活菌数为2～3
×
109cfu/ml。
27.优选的，发酵培养基的配方为酵母提取物5g胰蛋白胨10g氯化钠10g蒸馏水1000ml，ph 7.0。
28.上述制备的吡啶红球菌gxun1036菌株活菌制剂的使用方法为：
29.将吡啶红球菌gxun1036菌株活菌菌剂加无菌水稀释至5～10％，移苗时蘸根或浇灌于植物根际。
30.上述吡啶红球菌gxun1036或含有吡啶红球菌gxun1036的菌剂在下述1-4中的任一应用也属于本发明的保护范围：
31.1.促进植物在酚酸类环境下生长的应用；
32.2.在制备用于酚酸土壤修复的菌肥中的应用；
33.3.在降解土壤中的酚酸类物质的应用；
34.4.在降解农作物产生的自毒物质、减轻连作障碍应用。
35.上述应用中，所述酚酸类物质包括：对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸。
36.上述应用中，农作物产生的自毒物质包括：对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸。
37.本发明的有益效果：
38.本发明吡啶红球菌gxun1036能降解对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸等植物自毒物质，培养3d后，对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸的降解率分别为99.7％、98.8％、90.1％、15.4％，其活菌制剂可用于降解酚酸类土壤番茄产生的自毒物质，减轻连作障碍，促进番茄生长，提高番茄产量。
附图说明
39.图1为实例1中吡啶红球菌在lb(a)和对羟基苯甲酸为唯一碳源培养基上生长情况(b)，扫描电镜图(c)；
40.图2为实例1中基于16s rrna基因序列构建的菌株的临近相接树；
41.图3为实例2中吡啶红球菌的生长和降解对羟基苯甲酸情况；
42.图4为实例2中吡啶红球菌降解香草酸、没食子酸、阿魏酸情况；
43.图5为实例3中番茄盆栽实验番茄生长的茎高和茎粗的值；
44.图6为实例3中番茄盆栽实验番茄生长的鲜重和干重的值。
具体实施方式
45.以下结合附图及具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
46.本发明使用的无机盐培养基如下：k2hpo40.05g、mgso40.02g、cacl20.01g、fecl30.001g、mnso
4 0.001g、nh4no30.1g、kh2no30.05g、nacl 0.02g，调节ph为7.0，添加2g对羟基苯甲酸，蒸馏水 1000ml。
47.营养培养基如下：酵母提取物5g胰蛋白胨10g氯化钠10g蒸馏水1000ml，ph 7.0。
48.平板固体培养基为相应的培养基中加入1.5％的琼脂。
49.实施例1吡啶红球菌gxun1036的分离和鉴定
50.1、利用对羟基苯甲酸菌株的筛选和分离
51.称取2g红树林沉积物置于10ml离心管中，加入2ml无菌水和玻璃株(灭菌)震荡仪震动10min，制备成混悬液。采用十倍稀释法将混悬液分别稀释成10-3
、10-4
、10-5
的稀释液，
分别取稀释的混悬液各100μl 涂布于含有对羟基苯甲酸的无机盐培养基上，于30℃恒温箱避光培养7d，观察并挑取能够在以对羟基苯甲酸为唯一碳源的固体培养基上生长的菌株，通过三区划线分离的方法进行多次纯化，直至培养基中分离出单个菌落，分离出一株降解对羟基苯甲酸的菌株，命名为gxun1036。
52.2、菌株gxun1036的形态观察和鉴定
53.(1)方法：将活化的菌株在lb平板，含2000mg/l对羟基苯甲酸的固体无机盐平板上，30℃恒温避光培养3d，观察菌株的生长情况，利用扫描电子显微镜对细菌的细胞形态进行观察。采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株gxun1036的基因组dna，pcr扩增菌株gxun1036的16s rrna基因，扩增的上游引物序列为：27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’)，下游引物序列为：1492r(5
’‑
ggttaccttgtt acgactt-3’)，总的反应体系为25μl，pcr预混液(2
×
taq master mix)12.5μl，超纯水(ddh2o)10.5μ l，上下游引物各1μl，扩增模板1μl。设置的反应程序为：94℃预变性5min，95℃变性10s，55℃退火 20s，72℃延伸1.5min，共32循环，72℃再延伸10min。以琼脂糖(1％)凝胶电泳检测pcr产物，通过m arker条带挑选出符合预期的目标条带大小的扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。在 ezbiocloud(http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net)网站上将gxun1036的16s rrna基因序列与其它标准菌株进行比对分析，获取与gxun1036相似菌株的16s rrna，在mega6软件中使用邻近法(neighbor-joinin g)构建系统发育树，用自展法(bootstrap)进行1000次重复验证。
54.(2)结果：
55.如图1所示，吡啶红球菌在lb(a)和对羟基苯甲酸为唯一碳源培养基上生长情况(b)，扫描电镜图(c)；
56.如图2所示，基于16s rrna基因序列构建的菌株的临近相接树；
57.如上图所示，菌株gxun1036与rhodococcus pyridinivorans有100％的同一性。
58.实施例2吡啶红球菌gxun1036菌株的降解性能试验
59.(1)方法：选取对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸这4种酚酸作为降解目标产物，测定 gxnu1036降解酚酸的能力。向20ml无机盐液体培养基中分别加入上述4种酚酸，使培养基中酚酸的终浓度为2g/l，取200μl od600的值为0.6的菌悬液接种到上述培养基中，30℃，200rmp恒温摇床培养72h。将发酵液置于-80℃冰箱冷冻3h，冷冻干燥机冷冻干燥处理72h。称量冻干产物，加入十倍量的甲醇，超声10min，使用0.45μm的有机滤膜过滤提取产物，在紫外分光光度计254nm、290nm、311nm、 270nm处分别测量对羟基苯甲酸、香草酸、没食子酸、阿魏酸的残留浓度。利用各酚酸的标准曲线计算降解率。每个实验组设置3个重复，以未接种的菌液的样品作为空白对照。
60.(2)结果：
61.如图3所示，吡啶红球菌的生长和降解对羟基苯甲酸情况；
62.如上图所示，吡啶红球菌降解对羟基的平均降解率大于99％。
63.如图4所示，吡啶红球菌降解香草酸、没食子酸、阿魏酸情况；
64.如上图所示对香草酸、没食子酸、阿魏酸降解率分别为98.8％、90.1％、15.4％。
65.实例3吡啶红球菌gxun1036菌株活菌菌剂的制备
66.(1)菌种活化：将吡啶红球菌gxun1036转接入lb培养基平板，于30℃培养72h进行
活化。
67.(2)发酵液的制备：用接种环刮取活化后的吡啶红球菌gxun1036菌苔，接种于200ml lb液体培养基中，30℃培养72h。
68.(3)菌株活菌菌剂的制备：将发酵液稀释5～10％，吡啶红球菌gxun1036活菌菌剂活菌数为2～3
×
10
9 cfu/ml。
69.实例4吡啶红球菌gxun1036菌剂对对羟基苯甲酸土壤番茄生长的修复作用
70.(1)方法：对照组将营养土装入花盆中，实验组在营养土中添加对羟基苯甲酸，使对羟基苯甲酸的终浓度为10g/kg再装入花盆中。该试验采用的是灌根的处理方法，把育苗盘中生长的幼苗转移到装有营养土的花盆中。试验有以下5种处理：t1，70g正常营养土浇灌10％无菌水；t2，70g 10g/kg对羟基苯甲酸营养土浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂；t3，70g 10g/kg对羟基苯甲酸营养土浇灌5％吡啶红球菌 gxun1036菌剂；t4，70g正常营养土浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂。t5，70g正常营养土浇灌 10％无菌水。试验在温室中进行，温度为24～28℃，rh为75-90％，光周期为12h。每个处理为3株，试验重复3次。接种后28d测量番茄的鲜重、干重、株高以及茎粗。
71.(2)结果
72.如图5所示，10g/kg对羟基苯甲酸土壤浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂、10g/kg对羟基苯甲酸土壤浇灌5％吡啶红球菌gxun1036菌剂、正常土壤浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂、正常土壤浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂与10g/kg对羟基苯甲酸土壤浇灌10％在株高和茎粗上有显著差异，表明吡啶红球菌gxun1036菌剂可以恢复被对羟基苯甲酸土壤胁迫的番茄。
73.如图6所示，10g/kg对羟基苯甲酸土壤浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂、10g/kg对羟基苯甲酸土壤浇灌5％吡啶红球菌gxun1036菌剂、正常土壤浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂、正常土壤浇灌10％吡啶红球菌gxun1036菌剂与10g/kg对羟基苯甲酸土壤浇灌10％在鲜重和干重上有显著差异，表明吡啶红球菌gxun1036菌剂可以恢复被对羟基苯甲酸土壤胁迫的番茄。
74.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。