一种提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法与流程

1.本发明涉及化合物晶体的制备技术领域，特别涉及一种能够提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法以及通过该方法制备得到的烟酰胺单核苷酸晶体。


背景技术：

2.烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide，简称nmn)是生物细胞内固有的一种生化物质，它在细胞内可被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化从而转变成生物细胞所赖以生存的重要物质—烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(简称nad，又称辅酶i，存在于所有细胞中，参与上千种生物催化反应，在生物细胞能量生成中扮演着重要角色)。nmn是nad的直接前体，其作为生物细胞内nad补救合成途径的重要中间体，在生物细胞内的水平直接影响到nad的浓度。
3.研究发现，通过体外补充nmn是提高细胞内nad浓度水平的最理想方式，除此之外，人们还发现，体外补充nmn可获得诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mrna的表达等诸多医疗保健效果，而且越来越多关于nmn的新的医药用途还在不断被报道出来。另外，随着李嘉诚投资“不老药”nmn的消息不胫而走，nmn一时间成了香饽饽，受到了众多资本的青睐，而普罗大众对nmn药品或保健品的追逐也是趋之若鹜，市场上对nmn药品或保健品的需求量与日俱增。
4.目前市面上普遍采用晶体形态的nmn作为原料来生产nmn药品或保健品，中国专利申请cn108697722a中公开的β—烟酰胺单核苷酸的晶体形式是目前最为常用的两种nmn晶体，分别为无水晶体(形式1)和二甲基亚砜溶剂化物晶体(形式2)，但是，这两种晶体的堆密度很低，仅为0.2g/ml左右，所以这两种nmn晶体的流动性较差，这就导致生产出来的nmn药品或保健品产品的装/重量差异较大、品质不一，更有甚者，装/重量差异会超过100％，从而给药品和保健品生产企业带来困扰。
5.为了解决上述技术问题，中国专利申请cn11269505a中公开了一种高密度的nmn的制备方法，包括：往nmn的水溶液中不断加入不良溶剂后，形成含水的nmn油状物层；然后用不良溶剂对油层进行多次反复打浆，稀释油状物层中的含水量，并缓慢转化成白色粉末；过滤烘干后，颗粒摇摆机粉碎并过40-80目筛，即为高堆积密度的nmn。其实施例数据显示，该方法制备得到的nmn的松堆密度为0.52g/ml，振实密度为0.71g/ml。由此可见，相较于常用的形式1和形式2这两种nmn晶体，通过该方法制备得到的nmn的堆密度确实有了很大的提高。但是，通过其所附的电子显微镜晶习图我们可以看到，其制备得到的nmn晶体的形态为棒状结构，而众所周知，堆密度的高低与晶体的形态密切相关，块状晶体的堆密度高于棒状晶体。因此，如若能将nmn晶体的形态转化成块状结构，那么将能进一步提高nmn晶体的堆密度，从而能更出色地解决烟酰胺单核苷酸晶体流动性差、导致nmn药品或保健品产品的装/重量差异较大、品质不一的技术问题。


技术实现要素：

6.鉴于上述背景技术中提到的不足，本发明的目的在于开发一种提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法，以期获得块状结构的烟酰胺单核苷酸晶体，从而解决现有烟酰胺单核苷酸晶体流动性差、导致nmn药品或保健品产品的装/重量差异较大、品质不一的技术问题。
7.为实现上述目的，本发明首先提供了这样一种提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法，包括以下步骤：1)将烟酰胺单核苷酸溶解于水中得烟酰胺单核苷酸水溶液；2)将烟酰胺单核苷酸水溶液减压浓缩或者冷冻干燥至含水量≤15％的半固体；3)边搅拌边向半固体中滴加溶析剂，滴加的同时以1-15℃/h的降温速率降温至结晶终点温度5-18℃；4)待晶体析出完全，过滤晶体，干燥后即得堆密度提高的烟酰胺单核苷酸晶体。
8.烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值通常为2.0-4.0，发明人研究发现，在本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法中，改变烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值会对最终所获得的烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度产生影响，特别是当将ph值调整为4.5-6.5时，可显著提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度。因此，优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法还包括：在步骤2)之前，将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为4.5-6.5。
9.更优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法中，采用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠调节烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值。
10.本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤2)中，所谓半固体，其物理专业名称是准固体，也被称为无定形固体，其与传统的结晶固体不同，在微观尺度上是无序的。
11.优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤2)中，减压浓缩时的温度为40-50℃。一方面，该温度兼顾了浓缩效率和避免烟酰胺单核苷酸受高温降解的风险，另一方面，该温度为后续的降温析晶过程提供了前提条件，有利于晶体的充分析出。
12.更优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤2)中，减压浓缩时的真空度控制在0.07-0.10mpa范围内。
13.优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤2)中，冷冻干燥时的初始温度为-45
±
5℃，终点温度为25-30℃。
14.本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤2)中，发明人研究发现，当烟酰胺单核苷酸水溶液浓缩至含水量为5％时，再继续浓缩降低含水量时所获得的烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度提高的幅度较小，因此，综合考虑时间和经济成本，优选将烟酰胺单核苷酸水溶液减压浓缩至含水量为5-15％的半固体。
15.优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤3)中，溶析剂选自甲醇、乙醇和丙酮中的至少一种。这三种溶析剂能够使烟酰胺单核苷酸晶体快速充分析出，且价格低廉易得到。
16.优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤3)中，溶析剂滴加的体积量为半固体重量的4-6倍。
17.本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤3)中，发明人
通过对比研究发现，溶析剂的滴加速度会对晶体的堆密度产生较大的影响，因此，溶析剂滴加的速度优选控制为50-200ml/h，此范围能确保最终得到的晶体的形态呈块状结构，从而得到堆密度最够高的晶体。
18.优选地，本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法中，滴加溶析剂时的搅拌速率维持在50-500rpm范围内。
19.本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤3)中，发明人研究发现，当降温速率降低至5℃/h以下时，所获得的烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度随降温速率的继续降低而变化不大，因此，综合考虑时间和经济成本，降温速率优选为5-15℃/h。
20.本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法的步骤3)中，发明人研究发现，当结晶终点温度降低至10℃以下时，所获得的烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度随结晶终点温度的继续降低而变化不大，因此，综合考虑时间和经济成本，结晶终点温度优选为10-18℃。
21.其次，本发明还提供了这样一种烟酰胺单核苷酸晶体，该晶体的形态呈块状结构。
22.优选地，本发明提供的上述烟酰胺单核苷酸晶体通过本发明提供的上述提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法制备得到。
23.有益效果：
24.本发明提供了一种能够显著提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法以及采用该方法制备得到的烟酰胺单核苷酸晶体，与现有技术相比，采用该方法制备得到的烟酰胺单核苷酸晶体的形态呈块状结构，相较于现有的呈棒状甚至针状结构的烟酰胺单核苷酸晶体，其粒径显著增大，堆密度成倍提高，在nmn药品或保健品的生产加工中具有更大的优势，能够出色地解决烟酰胺单核苷酸晶体流动性差、导致nmn药品或保健品产品的装/重量差异较大、品质不一的技术问题。
附图说明
25.图1是参照中国专利申请cn108697722a中的实施例1公开的方法制备得到的烟酰胺单核苷酸无水晶体的电子显微镜图；
26.图2是通过本发明提供的方法制备得到的烟酰胺单核苷酸晶体的电子显微镜图。
具体实施方式
27.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，本发明并不局限于以下实施例。
28.以下实施例中所使用的试剂，如无特别说明，均为从市场购入。
29.以下所提到的堆密度均为松堆密度，其具体数值均采用如下方法测得：取待测对象过筛(1.00mm编号18)，精密称定，缓慢倾入玻璃刻度量筒，刮平顶部，记录表观体积，计算堆密度，取同一批样品3份，平行测定，记录读数，以平均值作为测定结果。
30.以下实施例中所使用的烟酰胺单核苷酸原料为参照中国专利申请cn108697722a中的实施例1公开的方法制备得到烟酰胺单核苷酸无水晶体，测得其堆密度为0.20g/ml，其电子显微镜图如图1所示。
31.实施例1
32.半固体含水量与堆密度的关系研究
33.将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，测得该水溶液的ph值为3.5，然后将该水溶液于45℃水浴中快速真空浓缩至如表1所示的不同含水量的半固体，真空度控制在0.07mp，然后边搅拌边向不同含水量的半固体中以100ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水乙醇，搅拌速率为200rpm，滴加的同时以10℃/h的降温速率降温至结晶终点温度10℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体。
34.分别对在上述不同条件下所得到的烟酰胺单核苷酸晶体测定其堆密度，测得结果如表1所示，其中含水量为15％的半固体所对应的烟酰胺单核苷酸晶体的电子显微镜图如图2所示：
35.表1
[0036][0037][0038]
实施例2
[0039]
降温方式与堆密度的关系研究
[0040]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，测得该水溶液的ph值为3.5，然后将该水溶液于45℃水浴中快速真空浓缩至含水量为10％的半固体，真空度控制在0.07mp，然后边搅拌边向半固体中以100ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水乙醇，搅拌速率为200rpm，滴加的同时以如表2所示的不同的降温速率降温至如表2所示的不同的结晶终点温度，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体。
[0041]
分别对在上述不同条件下所得到的烟酰胺单核苷酸晶体测定其堆密度，测得结果如表2所示：
[0042]
表2
[0043][0044][0045]
实施例3
[0046]
烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值与堆密度的关系研究
[0047]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值分别调节为如表3所示的各种数值，然后将调节好ph值的各水溶液于45℃水浴中快速真空浓缩至含水量为10％的半固体，真空度控制在0.07mp，然后边搅拌边向半固体中以100ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水乙醇，搅拌速率为200rpm，滴加的同时以10℃/h的降温速率降温至结晶终点温度10℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体。
[0048]
分别对在上述不同条件下所得到的烟酰胺单核苷酸晶体测定其堆密度，测得结果如表3所示：
[0049]
表3
[0050]
nmn水溶液的ph值堆密度3.50.894.51.085.01.095.51.096.01.07
6.51.087.00.81
[0051]
实施例4
[0052]
采用本发明提供的提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法制备烟酰胺单核苷酸晶体
[0053]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为5.0，然后将调节好ph值的水溶液于40℃水浴中快速真空浓缩至含水量为15％的半固体，真空度控制在0.10mp，然后边搅拌边向半固体中以50ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量4倍的无水丙酮，搅拌速率为100rpm，滴加的同时以5℃/h的降温速率降温至结晶终点温度15℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为1.02g/ml。
[0054]
实施例5
[0055]
采用本发明提供的提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法制备烟酰胺单核苷酸晶体
[0056]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为5.5，然后将调节好ph值的水溶液于50℃水浴中快速真空浓缩至含水量为5％的半固体，真空度控制在0.07mp，然后边搅拌边向半固体中以200ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量6倍的无水丙酮和无水乙醇的混合液，搅拌速率为300rpm，滴加的同时以15℃/h的降温速率降温至结晶终点温度10℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为1.17g/ml。
[0057]
实施例6
[0058]
采用本发明提供的提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法制备烟酰胺单核苷酸晶体
[0059]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为4.5，然后将调节好ph值的水溶液于50℃水浴中快速真空浓缩至含水量为8％的半固体，真空度控制在0.07mp，然后边搅拌边向半固体中以150ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水甲醇、无水乙醇和无水丙酮的混合液，搅拌速率为50rpm，滴加的同时以5℃/h的降温速率降温至结晶终点温度18℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为1.21g/ml。
[0060]
实施例7
[0061]
采用本发明提供的提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法制备烟酰胺单核苷酸晶体
[0062]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为5.0，然后将调节好ph值的水溶液于冷冻干燥机中干燥至含水量为10％的半固体，干燥时的初始温度为-45℃，终点温度为25℃，然后边搅拌边向半固体中以150ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水甲醇，搅拌速率为50rpm，滴加的同时以5℃/h的降温速率降温至结晶终点温度18
℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为0.95g/ml。
[0063]
实施例8
[0064]
采用本发明提供的提高烟酰胺单核苷酸晶体的堆密度的方法制备烟酰胺单核苷酸晶体
[0065]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为5.0，然后将调节好ph值的水溶液于冷冻干燥机中干燥至含水量为5％的半固体，干燥时的初始温度为-45℃，终点温度为30℃，然后边搅拌边向半固体中以50ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水甲醇，搅拌速率为50rpm，滴加的同时以5℃/h的降温速率降温至结晶终点温度10℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为1.24g/ml。
[0066]
对比例1
[0067]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，测得该水溶液的ph值为3.5，然后边搅拌边向该水溶液中以100ml/h的速度匀速滴加110ml无水乙醇，搅拌速率为200rpm，滴加的同时以10℃/h的降温速率降温至结晶终点温度10℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为0.23g/ml。
[0068]
对比例2
[0069]
向20gβ-烟酰胺单核苷酸原料中加入2.2ml水均匀混合得含水量为10％的混合物，然后边搅拌边向该混合物中以100ml/h的速度匀速滴加110ml无水乙醇，搅拌速率为200rpm，滴加的同时以10℃/h的降温速率降温至结晶终点温度10℃，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为0.20g/ml。
[0070]
对比例3
[0071]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，测得该水溶液的ph值为3.5，然后将该水溶液于45℃水浴中快速真空浓缩至含水量为10％的半固体，真空度控制在0.07mp，放置室温后边搅拌边向半固体中以100ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水乙醇，搅拌速率为200rpm，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为0.40g/ml。
[0072]
对比例4
[0073]
将20gβ-烟酰胺单核苷酸原料溶解于60ml水中得烟酰胺单核苷酸水溶液，通过加入磷酸二氢钠和磷酸氢二钠将烟酰胺单核苷酸水溶液的ph值调节为5.0，然后将该水溶液于45℃水浴中快速真空浓缩至含水量为10％的半固体，真空度控制在0.07mp，放置室温后边搅拌边向半固体中以100ml/h的速度匀速滴加体积量为半固体重量5倍的无水乙醇，搅拌速率为200rpm，养晶3h，过滤晶体，干燥后即得烟酰胺单核苷酸晶体，测得该晶体的堆密度为0.56g/ml。