集成式病原体核酸检测芯片及具有其的核酸检测仪的制作方法

1.本发明属于数字核酸检测芯片设计技术领域，具体涉及一种集成式病原体核酸检测芯片及具有其的核酸检测仪。


背景技术：

2.核酸检测一般分为样本前处理、核酸提取、核酸扩增三个过程，传统的核酸检测需要在中心实验室进行，一般利用化学裂解法进行核酸释放，利用磁珠法核酸提取仪进行核酸的提取、提取后取出一定量洗脱液核酸、再人工配制反应试剂和核酸混合在pcr仪中进行扩增，pcr扩增也常需1个小时。由上述的传统核酸检测过程看，目前现有的技术有以下弊端：过程繁琐耗时长容易造成核酸损失、所需设备精密且种类多、常常需要专业的受过培训的人员进行操作、检测地点常在中心实验室且需要分间操作。这就导致常规的检测方法不能及时有效快速的给出核酸检测结果。另外，传统的检测方法由于多过程、长耗时存在核酸降解的风险，尤其针对低病毒拷贝数的样本，进而会导致不能提供超高灵敏的检测结果，这就可能导致假阴性的结果出现，所以常常发生多轮检测才能检测出阳性。另外，常规的低检测灵敏导致目前的方法也不适用于一些低拷贝检测场景下的核酸检测，如针对空气气溶胶、物体表面等场景下，常规的方法并不能满足其低病毒拷贝数的检测需求。
3.微流控芯片经过近20年的发展已经开始在产业界得到了一定规模的应用推广。其是利用微管道、微泵、微阀等结构将传统实验室的生化检测过程浓缩在了一个微小的装置中，尤其针对核酸检测的样本制备、核酸提取、核酸扩增过程，微流控芯片具有得天独厚的优势，能实现全集成式的核酸检测。另外，近些年来，除了聚合酶链式反应(pcr)外，出现了多种等温扩增手段，等温扩增相较于pcr的变温扩增，能使与微流控芯片配套的检测仪器更加简便，无需使用精密的温控循环和复杂的光学探测模块，这能进一步降低配套仪器的复杂程度和成本，有利于推动微流控核酸检测设备的进一步推广和在场检测的应用。
4.然而，目前市场上虽然有现存的微流控芯片技术，但并没有能实现集成核酸样本前处理、核酸捕获、核酸扩增、核酸检测全流程，并且能提供快速和高灵敏的检测能力的设备与系统，诸多系统并无法进行远途长时间的试剂存储而无法进行实际使用。


技术实现要素：

5.因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种集成式病原体核酸检测芯片及具有其的核酸检测仪，实现全集成式、超快速、超高灵敏的病原体核酸检测。
6.为了解决上述问题，本发明提供一种集成式病原体核酸检测芯片，包括：
7.外壳，所述外壳内装设有各自密封的清洗液管、反应液管、开关阀、废液池管，所述外壳外侧装设有预置核酸裂解液的样本管；
8.流道板，连接于所述外壳的底部，其内构造有流道，所述流道板上还构造有复溶腔室以及反应腔室，所述反应腔室内具有核酸捕获滤纸；
9.所述样本管中内容物能够被控制经由所述流道进入所述反应腔室内，并在所述核
酸捕获滤纸处实现核酸捕获；
10.所述清洗液管中内容物能够被控制经由所述流道进入所述反应腔室内清洗捕获的所述核酸；
11.所述反应液管中内容物能够被控制进入所述复溶腔室并在所述开关阀的控制下经由所述流道进入所述反应腔室内；
12.所述反应腔室中内容物能够被控制存储于所述废液池管内。
13.在一些实施方式中，所述流道板上还设置有多根空心顶针，所述流道与所述清洗液管、反应液管、废液池管分别对应的位置处各设有一根所述空心顶针，所述流道与所述开关阀对应的位置处设置有两根所述空心顶针，且所述清洗液管、反应液管、废液池管、开关阀的底部皆具有下密封胶塞，所述下密封胶塞具有包裹密封所述空心顶针的封堵位置以及空心顶针穿出以使相应的管阀与所述流道或者腔室连通的连通位置。
14.在一些实施方式中，所述开关阀包括阀体，所述阀体内构造有入口腔室及出口腔室，所述入口腔室与所述出口腔室通过中间孔连通，两根与所述开关阀对应设置所述空心顶针分别为与所述入口腔室对应的入口顶针以及与所述出口腔室对应的出口顶针。
15.在一些实施方式中，所述阀体的顶部设有开关阀顶杆。
16.在一些实施方式中，所述清洗液管、反应液管、废液池管、开关阀内还皆具有上密封胶塞，所述上密封胶塞处于所述下密封胶塞的上部区域，且能够被控制靠近所述下密封胶塞移动。
17.在一些实施方式中，所述上密封胶塞背离所述下密封胶塞的一侧设有硬质层。
18.在一些实施方式中，所述反应腔室内还设置有压圈，所述压圈用于固定所述核酸捕获滤纸，且所述压圈为c环结构。
19.在一些实施方式中，所述外壳内容置有管架，所述清洗液管、反应液管、开关阀、废液池管置于所述管架内。
20.在一些实施方式中，所述外壳的顶部开口覆盖有盖板。
21.本发明还提供一种核酸检测仪，包括推杆，所述推杆与上述的集成式病原体核酸检测芯片配合使用，当所述集成式病原体核酸检测芯片包括上密封胶塞、空心顶针时，所述推杆能够施力于所述上密封胶塞，以使相应的管阀中的内容物流出或者使所述上密封胶塞包裹封堵相应的所述空心顶针。
22.本发明提供的一种集成式病原体核酸检测芯片及具有其的核酸检测仪，通过将清洗液管、反应液管、废液池管、样本管、复溶腔室通过流道以及开关阀依据核酸提取工序依次控制相应管腔中的内容物的流出与存储，实现了核酸样本前处理、核酸裂解、核酸捕获、核酸清洗、核酸扩增的集成化设计，这利于更加快速地对病原体核酸进行检测，同时具有更高的灵敏性；流道板中集成设置的复溶腔室能够使本发明的芯片适用于沿途长时间的试剂存储，芯片的应用场景更加丰富。
附图说明
23.图1为本发明实施例的集成式病原体核酸检测芯片的一种拆解结构示意图 (部分拆解)；
24.图2为本发明实施例的集成式病原体核酸检测芯片的另一种拆解结构示意图(部
分拆解)；
25.图3为图1中的流道板的内部结构示意图；
26.图4为图1中的样本管的拆解结构示意图；
27.图5为图2中的废液池管的拆解结构示意图；
28.图6为图2中开关阀内的结构示意图(局部)；
29.图7为图2中的反应腔室处的结构局部放大图(拆解)。
30.附图标记表示为：
31.1、外壳；101、管架；102、盖板；11、清洗液管；12、反应液管；13、开关阀；131、入口腔室；132、出口腔室；133、中间孔；134、开关阀顶杆； 14、废液池管；141、废液池盖；142、废液池管体；15、样本管；151、上端帽；152、固定盖；153、样本管体；154、铝制压盖；2、流道板；21、流道； 211、样本管流入口；212、清洗液管流入口；213、反应液管流入口；214、开关阀入口；215、开关阀出口；216、废液池管入口；22、空心顶针；221、入口顶针；222、出口顶针；23、复溶腔室；24、反应腔室；241、压圈；242、核酸捕获滤纸；300、下密封胶塞；301、上密封胶塞。
具体实施方式
32.结合参见图1至图6所示，根据本发明的实施例，提供一种集成式病原体核酸检测芯片，具体为一种集成式病原体核酸微流控检测芯片，包括：外壳1，外壳1内装设有各自密封的清洗液管11、反应液管12、开关阀13、废液池管 14，外壳1外侧装设有预置核酸裂解液的样本管15；流道板2，连接于外壳1 的底部，其内构造有流道21，流道板2上还构造有复溶腔室23以及反应腔室 24，反应腔室24内具有核酸捕获滤纸242；样本管15中内容物能够被控制经由流道21进入反应腔室24内，并在核酸捕获滤纸242处实现核酸捕获；清洗液管11中内容物能够被控制经由流道21进入反应腔室24内清洗捕获的核酸；反应液管12中内容物能够被控制进入复溶腔室23并在开关阀13的控制下经由流道21进入反应腔室24内；反应腔室24中内容物能够被控制存储于废液池管14内，需要说明的是，通过对反应腔室24内提取后的样本进行扩增(优选采用等温扩增)并采用相应的荧光检测设备进行相应的检测，即可实现采用本发明的芯片对核酸检测的样本制备、核酸提取、核酸扩增过程的全流程集成目的。
33.该技术方案中，通过将清洗液管11、反应液管12、废液池管14、样本管 15、复溶腔室23通过流道21以及开关阀13依据核酸提取工序依次控制相应管腔中的内容物的流出与存储，实现了核酸样本前处理、核酸裂解、核酸捕获、核酸清洗、核酸扩增的集成化设计，这利于更加快速地对病原体核酸进行检测，同时具有更高的灵敏性。同时需要特别说明的是，流道板2中集成设置的复溶腔室23以及反应液管12将冻干粉状试剂与溶液状试剂分开存储，使本发明的芯片适用于远途长时间的试剂稳定存储，芯片的应用场景更加丰富。
34.前述的流道21具体为微管道结构，微管道宽0.5mm，深0.5mm适合于微流体的操控，从而在各个试剂管阀的注射配合(也即推杆的下推)下使本发明中的芯片成为微流控芯片。
35.具体而言，样本管15用于进行待测样本采集及裂解(样本可以是一定浓度的dna/rna，或者是病原微生物样本，包括细胞、病毒、组织、细菌、真菌)；清洗液管11用以清洗捕获核酸后的滤纸(设置于反应腔室24内)，去除一定的杂质和裂解液残留；反应液管12则用于存储液体反应试剂，具体例如聚合酶链式反应pcr、重组酶聚合酶反应rpa、环介导等温扩增lamp、核酸序列依赖性扩增nasba反应试剂，其与复溶腔室23中存储的反应试剂如冻干粉复
溶或核酸扩增时添加试剂(如rpa反应时所需镁离子)配合使用；反应腔室24用于进行核酸扩增(原位扩增)，如聚合酶链式反应pcr、重组酶聚合酶反应rpa、环介导等温扩增lamp、核酸序列依赖性扩增nasba等，通过与其匹配设置的荧光检测部件即可获取其内扩增后内容物的荧光信息；废液池管14用以存储废液。
36.需要特别说明的是，开关阀13将样本液和清洗液管路与反应试剂管路中的复溶腔室23隔开，避免注射样本液与清洗液时液体往复溶腔室回流，导致复溶试剂失效。仅当开始注射反应试剂时，才打开此开关阀13，让试剂流通先进入复溶腔室进行冻干试剂复溶，再流入到反应腔室进行扩增，也即，本发明的开关阀13形成了注射样本及清洗管路(也即流道21所指代的管路)与反应试剂管路的有效隔离，仅在需要两者连通的时候才控制开关阀13打开进而使两个管路连通。
37.在一些实施方式中，流道板2上还设置有多根空心顶针22，多根空心顶针 22通过针座孔实现固定，流道21与清洗液管11、反应液管12、废液池管14 分别对应的位置处各设有一根空心顶针22，流道21与开关阀13对应的位置处设置有两根空心顶针22，且清洗液管11、反应液管12、废液池管14、开关阀 13的底部皆具有下密封胶塞300，下密封胶塞300具有包裹密封空心顶针22 的封堵位置以及空心顶针22穿出以使相应的管阀与流道21或者腔室连通的连通位置，具体通过外部推动部件(例如推杆)推动相关的管阀靠近处于下密封胶塞300顶部的空心顶针22移动，实现下密封胶塞300由封堵位置切换为连通位置，也即，当下密封胶塞300处于封堵位置时，相应的管阀中内容物被存储于该管阀内不能流出，而当下密封胶塞300处于连通位置时，相应的管阀中内容物并被迫出至流道21或者复溶腔室23或者反应腔室24内，实现相应的核酸提取工艺，例如提取、清洗、试剂复溶、扩增反应等。该技术方案中，通过空心顶针22刺破下密封胶塞300的方式实现腔阀内容物的流出与封堵，该过程与相应的腔阀的注射(也即推动下压各个腔阀)动作保持一致，结构简单、控制简便。
38.参见图6所示，在一些实施方式中，开关阀13包括阀体，阀体内构造有入口腔室131及出口腔室132，入口腔室131与出口腔室132通过中间孔133 连通，两根与开关阀13对应设置空心顶针22分别为与入口腔室131对应的入口顶针221以及与出口腔室132对应的出口顶针222，其中入口顶针221与复溶腔室23连通，出口顶针222则与反应腔室24连通，如此实现了复溶腔室23 所在的反应试剂管路与反应腔室24所在的注射样本及清洗管路的有效隔离与连通的状态切换。需要特别说明的是，在反应液管12被驱动靠近空心顶针22 移动时，空心顶针22将最终刺破下密封胶塞300，反应液管12内的反应液进入复溶腔室23与其内的冻干试剂混合相溶并经由入口顶针221(此时入口顶针 221已被控制刺破开关阀13内的下密封胶塞300)进入入口腔室131内，在其内充分混合后进一步经由中间孔133流入出口腔室132中，并最终经由出口顶针222流出至反应腔室24内与反应腔室24内容物反应，该过程中，反应试剂 (包括前述的反应液与冻干试剂)在入口腔室131、出口腔室132内能够充分相溶，保证了后续的反应效果，在反应试剂流经中间孔133时，由于中间孔133 的直径较小，能够对反应试剂形成增速效果，进一步保证两种试剂的充分相溶。
39.在一个优选的实施例中，阀体的顶部设有开关阀顶杆134，通过该开关阀顶杆134的设置能够使开关阀13的容积设计的相对更小，与试剂采用量更加匹配，该开关阀顶杆134处于开关阀13的顶部位置，还能够对开关阀13的位置进行固定，保证开关阀13的位置相对稳定。
40.在一些实施方式中，清洗液管11、反应液管12、废液池管14、开关阀13 内还皆具有上密封胶塞301，上密封胶塞301处于下密封胶塞300的上部区域，且能够被控制靠近下密封胶塞300移动，从而在相应的管阀一直靠近空心顶针 22运动时，当其内内容物完全流出时，可以将相应的管阀封堵，防止在其他的处理工序中的液体回流至该管阀内。在一种优选的实施例中，上密封胶塞301 背离下密封胶塞300的一侧设有硬质层，例如在上密封胶塞301的顶面上设置硬质塑料，从而使上密封胶塞301形成一种软硬结合胶塞，具体而言，此时外部的推杆的末端可以直接施力于上密封胶塞301的顶面，硬质层的设置能够有效防止施力过程中的胶塞不均匀变形、不倾斜，保证相应的管阀的顺畅可靠稳定地下移。
41.具体参见图4所示，图中具体示出了一实施例中的样本管15的一种分解结构，其包括样本管体153，该样本管体153为一上下贯通的筒体结构，其上下两端分别塞装有上密封胶塞301、下密封胶塞300，两个胶塞之间在初始状态下具有间隔，该间隔构成了样本管的容置空间，下密封胶塞300的外侧还包括由铝制压盖154，其与下密封胶塞300配合对样本管15的顶端形成可靠密封，上密封胶塞301的外侧还套装有固定盖152以及与固定盖152结合的上端帽 151，固定盖152具有内螺纹，其与上端帽151结合密封样本管15。
42.具体参见图5所示，图中示出了一实施例中的废液池管14的一种分解结构，其具体包括废液池管体142以及密封连接于其顶部的废液池盖141，下密封胶塞300与上密封胶塞301上下间隔布置，两者之间的间隔形成废液池管体 142的进液通道，该间隙在废液池管14下移过程中将被减小直至上密封胶塞 301完全包裹封堵其下方的空心顶针22，实现废液池管14的密封，将废液池管14与反应腔室24隔开，避免扩增产物泄露造成核酸污染。
43.核酸捕获滤纸242具体为一种壳聚糖修饰的捕获滤纸，其具有亲水性，在一些实施方式中，反应腔室24内还设置有压圈241，压圈241用于固定核酸捕获滤纸242，且压圈241为c环结构，这种c环结构会让试剂贯穿流过核酸捕获滤纸242时，先填充满压圈241内部空间，再往旁侧c环出口处流动，进而可以保证反应腔室24内无气泡，不会对后续反应造成干扰。需要说明的是，本发明中的流道21在反应腔室24处被核酸捕获滤纸242分隔为两段，其中的一段的出口处于滤纸的上方区域，另一段的入口处于滤纸的下方区域并与废液池管14连通。
44.在一些实施方式中，外壳1内容置有管架101，清洗液管11、反应液管12、开关阀13、废液池管14置于管架101内，也即，外壳1内设置的管架101居于外壳1的内壁与各个管阀的外壁之间，能够对各个管阀实现有效可靠的固定，此时的外壳1具有提升整个芯片的外观美感性的效果，外壳1的顶部开口覆盖连接有盖板102，能够防止外壳1内的各个管阀从顶部开口处脱出，防止内部各个管阀的丢失，保证内部各个管阀的位置可靠稳定。
45.本发明还提供一种核酸检测仪，包括推杆，推杆与上述的集成式病原体核酸检测芯片配合使用，当集成式病原体核酸检测芯片包括上密封胶塞301、空心顶针22时，推杆能够施力于上密封胶塞301，以使相应的管阀中的内容物流出或者使上密封胶塞301包裹封堵相应的空心顶针22。
46.以下结合一具体实施例对本发明的技术方案进一步阐述。
47.以通过重组酶聚合酶扩增反应rpa检测空气生物气溶胶中新冠病毒为例，该芯片具体实施方式如下：
48.存储试剂：每个独立的试剂管配合上胶塞(也即前述的上密封胶塞301，下同)与下
胶塞(也即前述的下密封胶塞300，下同)即可进行试剂预存，以备后续实验，样本管(也即前述的样本管15，下同)内存储试剂可为1ml的病毒裂解液、清洗液腔室(也即前述的清洗液管11，下同)试剂可为1mldepc 水(dnase、rnase free)(货号：r0022，生产商：碧云天)，反应试剂套管(也即前述的反应液管12，下同)存储试剂可为重组酶聚合酶扩增反应对应的rna 恒温快速扩增试剂，复溶腔室23表面有烘干后固态状2.5μl280nm醋酸镁。
49.样品采集：使用样本管进行样本采集，并在样本管内进行核酸释放；样本可以是利用生物气溶胶采样器(规格：便携式生物气溶胶采样器，生产商：北京工匠生物科技有限公司)对环境中的病原体进行采集，也可以是鼻/咽拭子进行涮洗，也可以是其余待检测液态或固态试剂。此实验中选用新型冠状病毒 (2019-ncov)假病毒核糖核酸标准物质代替(货号：nim-rm5203，生产商：中国计量科学研究院)。
50.核酸释放：样本管中存储液是裂解液，一旦样本进去后，便可进行病原体裂解，释放核酸。
51.核酸捕获：配合仪器推杆推动样本管中的软硬结合胶塞(也即前述的上密封胶塞301)进行柱塞式压力驱动，注射时，会先让试剂管(对应为样本管) 往下移动一定距离的行程，使得下件管道层(也即前述的流道层2，下同)上固定的顶针(也即空心顶针22，下同)刺破试剂管下胶塞(也即前述的下密封胶塞300，下同)，进而可让流体流过样本液出口，进入到下件管道层，再流过滤纸进行核酸捕获。
52.核酸清洗：配合仪器推杆推动清洗液管11内的软硬结合胶塞进行柱塞式压力驱动，注射时，会先让试剂管(对应为清洗液管11)往下移动一定距离的行程，使得下件管道层上固定的顶针刺破试剂管下胶塞，进而可让清洗液流过清洗液出口，进入到下件管道层，再流过滤纸进行清洗，洗去滤纸上的杂质。
53.试剂复溶：配合仪器推杆推动试剂管(对应前述的反应液管12)内的软硬结合胶塞进行柱塞式压力驱动，注射时，会先让试剂管往下移动一定距离的行程，使得下件管道层上固定的顶针刺破试剂管下胶塞，进而可让液体试剂流过液体试剂出口，流到复溶腔室内进行固体试剂的复溶。
54.打开开关阀(也即前述的开关阀13，下同)：开关阀一开始处于封闭状态，即顶针扎进在开关阀下端胶塞上，针孔处于堵塞状态，无法进行流体流通；当开关阀配合仪器下压一定行程时，顶针即扎过下端胶塞，扎进开关阀腔室内，即可让流体进行流体，开关阀开启。
55.核酸扩增：配合仪器推杆继续推动试剂管内软硬结合胶塞进行柱塞式压力驱动，将复溶腔室内的流体打入扩增腔室(也即前述的反应腔室24)，再配合仪器进行温度控制即可进行核酸扩增。
56.输出检测结果：配合全集成仪器荧光信号读取模块进行实时荧光检测，给出荧光曲线，最终判读阴阳性结果。
57.经验证，本发明可采用等温扩增的方式，进行超快速核酸扩增，可在半小时内给出检测结果，尤其适合独特场景的在场检测，实现超快速检测。传统检测方式检测灵敏度仅能达到200copies/ml，该检测芯片配合全集成仪器，可将检测灵敏度进一步提高到20copies/ml，高灵敏的核酸检测尤其适合在一些低病原体载量的样本。
58.本领域的技术人员容易理解的是，在不冲突的前提下，上述各有利方式可以自由地组合、叠加。
59.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。