一种O-糖肽键多肽的合成工艺的制作方法

一种o-糖肽键多肽的合成工艺
技术领域
1.本发明涉及糖肽合作技术领域，具体为一种o-糖肽键多肽的合成工艺。


背景技术：

2.多肽的人工糖基化修饰主要利用糖的半缩醛羟基与多肽n端的α-氨基，天冬酰胺的酰胺基形成n-糖基化修饰，或者利用糖的半缩醛羟基与多肽中丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点，形成-o-糖苷键型。此种方式难以实现定点修饰，造成位点紊乱或错误，为目标肽的获得增加了难度。因此需要一种能够对多肽指定位置，指定氨基酸的糖基化修饰，降低合成难度，避免多杂质的产生，提高产品的收率的合成工艺。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种o-糖肽键多肽的合成工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种o-糖肽键多肽的合成工艺：
5.①
、ser(o-glcnac)和thr(o-glcnac)的制备
6.s1、ser(o-glcnac)的制备
7.取0.5份的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3份的fmoc-ser-oh溶解于50份无水二氯甲烷与10份的无水乙腈混合溶液中，加入1-2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度；反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用hplc将产物进一步提纯得到98％的ser(o-glcnac)；
8.s2、thr(o-glcnac)的制备
9.取0.5份的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3份的fmoc-thr-oh溶解于50份无水二氯甲烷与10ml的无水乙腈混合溶液中，加入1-2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度，反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用hplc将产物进一步提纯得到98％的thr(o-glcnac)；
10.②
、cg-[ser(o-glcnac)]-gg-[thr(o-glcnac)]-gg-[ser(o-glcnac)]-gl的合成；
[0011]
s1、树脂溶涨
[0012]
将2-chlorotrityl chloride resin树脂放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡30min；
[0013]
s2、接第一个氨基酸
[0014]
取s1步骤生成物通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的fmoc-leu-oh，再加入10倍摩尔过量的diea，最后加入dmf溶解，振荡60min，并使用甲醇封头，静置30min；
[0015]
s3、脱保护
[0016]
取s2步骤生成物去掉溶剂，加20％哌啶/dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶/dmf溶液(15ml/g)，15min；
[0017]
s4、检测
[0018]
取s3步骤生成物抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入kaiser试剂，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；
[0019]
s5、洗
[0020]
取s4步骤生成物依次经过：dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；
[0021]
s6、链接
[0022]
取s5步骤生成物、3倍摩尔过量的氨基酸fmoc-gly-oh、3倍摩尔过量的hbtu，均用dmf溶解，加入反应管，立刻加入10倍摩尔过量diea，反应30min。
[0023]
s7、检测
[0024]
取s6步骤生成物，抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入kaiser试剂，105℃－110℃加热5min,无色为阴性反应，说明反应完全。
[0025]
s8、洗
[0026]
取s7步骤生成物依次经过dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；
[0027]
s9、重复s3-s8步操作，依次连接多肽中的氨基酸包括糖修饰单元，抽干树脂；
[0028]
s10、从树脂上切割片段肽
[0029]
配制切割液(10/g)tfa 95％，edt 2％，tis 2％，h2o 1％
[0030]
切割时间：120min；
[0031]
s11、将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥发干；
[0032]
s12、将多肽中间体溶于饱和甲醇钠/甲醇溶液至于烧瓶，氮气保护，室温，磁力搅拌至反应结束；
[0033]
s13、抽滤去除未反应的甲醇钠，滤液旋蒸去除甲醇得粗产品；
[0034]
s14、取粗品小样进hplc分析，设置时间为0-20min，设置梯度为5-95，进行检测；根据出峰时间，设置梯度为35-100平衡制备hplc，色谱柱固定相为烷基键合硅胶，流动相为乙腈-tfa溶液，收集目标峰的洗脱液；
[0035]
s15、冻干得到白色粉末状终产品，纯度为98％。
[0036]
更进一步的，步骤
①
中，乙酰氨基半乳糖过乙酰化：将1gglcnac溶于10ml的吡啶溶液中，然后缓慢加入10ml乙酸酐溶液，室温反应24小时，反应完成后调节ph至中性，加入50ml无水二氯甲烷和10ml超纯水，移至分液漏斗中进行分液保留二氯甲烷相，使用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，在剩余溶液中加入乙醚析出产物并冻干。
[0037]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：一种o-糖肽键多肽的合成工艺突破固有修饰方法，开发一种新型的单元构建法实现糖修饰肽的合成，探索合适糖修饰合成工艺以降低产品的合成难度，避免了多种杂质的生成，实现糖修饰的定点或多位点生成，增加产品的收率，使得糖修饰肽位点筛选成为现实。
[0038]
本技术具体通过单元构建法实现糖修饰肽的合成，即先将乙酰化保护的糖，与丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基事先反应好形成一个构建单元，氨基酸的α-氨基用fmoc保护，在多肽合成的过程中，在需要的位置将这些氨基酸引入，然后通过去乙酰酯，脱除糖保护乙酰基，即可实现多肽指定位置，指定氨基酸的糖基化修饰。
附图说明
[0039]
图1为本发明thr(o-glcnac)的分析图谱；
[0040]
图2为本发明o-糖肽键多肽的分析图谱。
具体实施方式
[0041]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0042]
请参阅图，本发明提供一种技术方案：一种o-糖肽键多肽的合成工艺：
[0043]
①
、ser(o-glcnac)和thr(o-glcnac)的制备
[0044]
乙酰氨基半乳糖过乙酰化：将1gglcnac溶于10ml的吡啶溶液中，然后缓慢加入10ml乙酸酐溶液，室温反应24小时，反应完成后调节ph至中性，加入50ml无水二氯甲烷和10ml超纯水，移至分液漏斗中进行分液保留二氯甲烷相，使用旋转蒸发仪去除二氯甲烷，在剩余溶液中加入乙醚析出产物并冻干。
[0045]
s1、ser(o-glcnac)的制备
[0046]
取0.5mmol的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3mmol的fmoc-ser-oh溶解于50ml无水二氯甲烷与10ml的无水乙腈混合溶液中，加入1-2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度；反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用hplc将产物进一步提纯得到98％的ser(o-glcnac)；
[0047]
s2、thr(o-glcnac)的制备
[0048]
取0.5mmol的过乙酰化的乙酰氨基半乳糖与0.3mmol的fmoc-thr-oh溶解于50ml无水二氯甲烷与10ml的无水乙腈混合溶液中，加入1-2eq的三氟化硼乙醚进行催化，放置于微波反应仪中反应5min，反应温度为100摄氏度，反应结束后使用旋转蒸发仪将产物旋干，再使用hplc将产物进一步提纯得到98％的thr(o-glcnac)；
[0049]
②
、cg-[ser(o-glcnac)]-gg-[thr(o-glcnac)]-gg-[ser(o-glcnac)]-gl的合成；
[0050]
s1、树脂溶涨
[0051]
将2-chlorotrityl chloride resin树脂放入反应管中，加dcm(15ml/g)，振荡30min；
[0052]
s2、接第一个氨基酸
[0053]
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的fmoc-leu-oh，再加入10倍摩尔过量的diea，最后加入dmf溶解，振荡60min，并使用甲醇封头，静置30min；
[0054]
s3、脱保护
[0055]
去掉溶剂，加20％哌啶/dmf溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶/dmf溶液(15ml/g)，15min；
[0056]
s4、检测
[0057]
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入kaiser试剂，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应；
[0058]
s5、洗
[0059]
dmf(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；
[0060]
s6、链接
[0061]
氨基酸fmoc-gly-oh三倍过量,hbtu三倍过量，均用尽量少dmf溶解，加入反应管，立刻加入diea十倍过量，反应30min。
[0062]
s7、检测
[0063]
抽掉溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入kaiser试剂，105℃－110℃加热5min,无色为阴性反应，说明反应完全。
[0064]
s8、洗
[0065]
dmf(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，dmf(10ml/g)两次；
[0066]
s9、重复s3-s8步操作，依次连接多肽中的氨基酸包括糖修饰单元，抽干树脂；
[0067]
s10、从树脂上切割片段肽
[0068]
配制切割液(10/g)tfa 95％，edt 2％，tis 2％，h2o 1％
[0069]
切割时间：120min；
[0070]
s11、将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥发干；
[0071]
s12、将多肽中间体溶于饱和甲醇钠/甲醇溶液至于250ml烧瓶，氮气保护，室温，磁力搅拌至反应结束；
[0072]
s13、抽滤去除未反应的甲醇钠，滤液旋蒸去除甲醇得粗产品；
[0073]
s14、取粗品小样进hplc分析，设置时间为0-20min，设置梯度为5-95，进行检测；根据出峰时间，设置梯度为35-100平衡制备hplc，色谱柱固定相为烷基键合硅胶，流动相为乙腈-tfa溶液，收集目标峰的洗脱液；
[0074]
s15、冻干得到白色粉末状终产品，纯度为98％。
[0075]
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“同轴”、“底部”、“一端”、“顶部”、“中部”、“另一端”、“上”、“一侧”、“顶部”、“内”、“前部”、“中央”、“两端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
[0076]
此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
[0077]
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0078]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。