一种生物活性次级代谢产物的制备方法和应用

1.本发明属于从微生物分离活性物质的技术领域，具体涉及raffaelea lauricola中生物活性次级代谢产物（a'-neogammacer-17-en-15α-ol）制备及应用。


背景技术：

2.a'-neogammacer-17(21)-en-15α-ol是一种由五元环构成的藿烷型三萜类物质，是一种微生物代谢中常见的萜类化合物，自1986年荷兰学者van eijk等在虫生真菌中分离得到两个三萜物质开始（van eijk g w, roeijmans h j, seykens d. hopanoins from the entomogenous fungus aschersonia aleyrodis. tetrahedron letters, 1986, 27(22): 2533-2534.），藿烷型三萜便受到越来越多的关注，萜类物质在天然产物中具有重要地位，其不仅有良好的稳定性，抗菌、抗炎、抗肿瘤等效果也很显著。而在raffaelea lauricola（食菌小蠹共生真菌）中尚属首次分离到a'-neogammacer-17-en-15α-ol。这不仅丰富了天然产物来源也为萜类物质的开发利用拓宽了道路。


技术实现要素：

3.本发明的目的是公开一种raffaelea lauricola中生物活性次级代谢产物（a'-neogammacer-17-en-15α-ol）制备及应用，以促进其进一步在医药领域的研究和开发。
4.为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：raffaelea lauricola中生物活性次级代谢产物（a'-neogammacer-17-en-15α-ol）的制备方法，包括以下步骤：1)将raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到pdb 培养基中，在，在140～180 r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天即初级培养，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天即次级培养。
5.2）将步骤1）得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
6.3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶c
18
进行拌样，干法装柱，以甲醇：水自体积比1:9
→
9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部位洗脱液，旋蒸浓缩得组分a。
7.4）用1倍体积的氯仿溶解组分a，上200-300 目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1 开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1 部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比8:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状a'-neogammacer-17-en-15α-ol，其结构式如下：
。
8.进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基的组成为：大米100 g，木屑10 g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌，20 min。
9.进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5 cm，接种量为4块。
10.进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
11.进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶c
18
粒径40-60 μm，孔径120
ꢀå
。
12.所述步骤3）中梯度洗脱比例为甲醇：水体积比1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1。
13.进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1, 20:1, 10:1, 8:1，石油醚：氯仿体积比依次为8:1, 6:1, 4:1。
14.本发明的显著优点：本发明分离纯化简单，成本低，易操作；制得的化合物纯度高，且重复性好。
附图说明
15.图1为a'-neogammacer-17-en-15α-ol的1h nmr谱（cdcl3）；图2为a'-neogammacer-17-en-15α-ol的
13
c nmr谱（cdcl3）；图3为a'-neogammacer-17-en-15α-ol的dept135谱（cdcl3）；图4为a'-neogammacer-17-en-15α-ol的cosy谱（cdcl3）；图5为a'-neogammacer-17-en-15α-ol的hmbc谱（cdcl3）；图6为a'-neogammacer-17-en-15α-ol的hsqc谱（cdcl3）。
具体实施方式
16.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
17.本发明所使用的raffaelea lauricola菌株编号为hulcr7161。
18.实施例1raffaelea lauricola中生物活性次级代谢产物（a'-neogammacer-17-en-15α-ol）制备步骤如下：1)取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5 cm的菌块4块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9 g，纯水100 ml，装入250 ml锥形瓶，在121℃高压下灭菌20 min）中，在160 r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100 g，木屑10 g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌，20 min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
19.2) 收集培养35天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
20.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60 μm粒径反相c
18
硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1），收集甲醇：水体积比9:1部分旋蒸得粗品。
21.4)用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比30:1 开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1 部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1），收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比20:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为20:1, 10:1, 8:1, 6:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比8:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状a'-neogammacer-17-en-15α-ol。
22.本实施例中，步骤3）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
23.经计算其提取率为1.020%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
24.实施例2化合物a'-neogammacer-17-en-15α-ol抗肿瘤活性实验方法如下：1）细胞培养：于37℃、5%co2饱和湿度培养箱中培养人肺癌细胞a549、人肝癌细胞hepg2和人乳腺癌细胞mcf-7，a549和hepg2细胞采用dmem培养基,mcf-7细胞采用rpmi 1640培养液,上述2种培养基中均含有胎牛血清(体积分数为10%)、青霉素(1
×
10
5 iu/l)和链霉素(100 mg/l),取对数生长期细胞用于实验。
25.2) mtt法测定药物的半数抑制浓度(ic
50
)：在96孔板中每孔180 μl种5
×
103个细胞,设置化合物a'-neogammacer-17(21)-en-15α-ol不同给药浓度,另设阳性对照组顺铂，于37℃培养箱培养48 h后加20 μl的mtt,再培养4 h,加 dmso溶解甲瓒,在570 nm波长下测a值,按公式计算细胞生长抑制率。
26.3) 细胞生长抑制率=(a对照-a实验)/(a对照-a空白)
×
100%。
27.4) 统计学处理：采用spss 22.0软件做统计学分析，每组重复3次结果用(mean
±
s)表示，各组间比较采用duncan多重比较法检测差异显著性，p《0.05为差异有统计学意义。抗肿瘤活性如表1所示：5) 表1 化合物a'-neogammacer-17-en-15α-ol抗肿瘤活性6）如表1所示，所分离得到的a'-neogammacer-17-en-15α-ol对三种癌细胞（人肺
癌细胞a549、人肝癌细胞hepg2和人乳腺癌细胞mcf-7）均有不同程度的抑制作用，其中对人乳腺癌细胞mcf-7表现出中等抑制活性，具有开发抗癌药物的潜力。
28.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。