一种生产3-氨基异丁酸的酶突变体的制作方法

1.本发明涉及代谢工程领域，特别是涉及构建生产3-氨基异异丁酸的菌株与其方法，以及透过基因工程菌株生产3-氨基异异丁酸的方法。


背景技术：

2.3-氨基异丁酸(3-aminoisobutyric acid)，也称为β-氨基异丁酸(β-aib)或3-氨基-2-甲基丙酸，其化学式如下：
[0003][0004]
3-氨基异丁酸为非蛋白氨基酸，一种胸腺嘧啶和缬氨酸的代谢物，其在尿液中会被排出。3-氨基异丁酸的r-构型衍生自胸腺嘧啶，而s构型衍生自缬氨酸，尿液中的r构型占比估计超过90％。目前已经发现，β-aib作为肌肉激素的第一个代表性小分子，属于白色脂肪组织生热过程的非肾上腺素能活化剂家族，具有针对ii型糖尿病和代谢疾病的良好药物潜力。此外，3-氨基异丁酸可用作化学原料和药物中间体。3-氨基异丁酸作为有机合成的原料，其具有20多种上游产物和10多种下游产物；而其在药物中间体领域的应用和研究则是非常广泛。
[0005]
目前，3-氨基异丁酸主要通过化学方法制备。虽然产物的产率高，但在合成步骤中需要昂贵的催化剂和大量的盐酸，同时也会产生高度毒性的氰化物，造成环境的巨大污染。随着环境保护的要求增加，因此有必要开发环境友善、绿色的生产方法。2018年，cn108998401a公开了一种通过大肠杆菌工程发酵产生β-aib的方法。在该专利中，从野生菌株mg1655剔除了三种基因ptsg、fumac和fumb，并且高表达了三种基因，为l-天冬氨酸α-脱羧酶基因pand、天冬氨酸酶基因aspa和甲基转移酶基因c24mtgm。基因剔除所获得的工程菌株可以在摇瓶中生产100mg/l的β-aib，这代表着β-aib作为生物制剂的可能性。然而，该工程菌株的β-aib产量仍较低，因此尚有相当大的改进空间。


技术实现要素：

[0006]
为了克服3-氨基异丁酸化学合成方法产生的污染问题和因发酵而3-氨基异丁酸的产量低问题，本发明利用了来自大豆(glycine max)的s-腺苷基-l-甲硫氨酸δ24-固醇-c-甲基转移酶(s-adenosyl-l-methionineδ24-sterol-c-methyltransferase)突变体c24mtgm-m11，构建其过表达载体psu-laciqtrc-c24mtgm-m11，并将其导入mg1655(δptsgδfuma cδfumb,pand,aspa)(见cn108998401a)，最后所获得的表达菌株可以显着提高3-氨基异丁酸发酵产量。
[0007]
具体地，本发明包括以下技术解决方案：
[0008]
一种制备生产3-氨基异丁酸菌株的方法，包括以下步骤：
[0009]
a.构建表达质粒psu-laciqtrc-c24mtgm-m11，其源自大豆的s-腺苷基-l-甲硫氨
酸δ24-固醇-c-甲基转移酶突变体；
[0010]
b.将步骤a中得到的质粒转化为mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa)，得到基因工程菌株mg1655(δptsgδfumac fumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)。
[0011]
在一实施方式中，本发明提供了一种甲基转移酶突变体c24mtgm-m11，其衍生自序列为seq id no：1的野生型酶c24mtgm，其中位置135的脯氨酸被丙氨酸取代，位置136的白氨酸被丙氨酸代替，位置213的苯丙氨酸取代丝氨酸。
[0012]
进一步地，甲基转移酶突变体c24mtgm-m11包括氨基酸序列seq id no:3。
[0013]
在其他实施方式中，本发明提供一种酶突变体c24mtgm-m11的编码多核苷酸，该多核苷酸包括核酸序列seq id no：4。
[0014]
在其他实施方式中，本发明提供一种甲基转移酶突变体的表达载体，其特征在于，包括前述多核苷酸。
[0015]
进一步地，前述载体为psu-laciqtrc-c24mtgm-m11质粒，其包括本发明的多核苷酸。
[0016]
在其他实施方式中，本发明提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括本发明的载体。
[0017]
进一步地，前述的宿主细胞，其特征在于，其为大肠杆菌mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)。
[0018]
本发明还提供了甲基转移酶突变体c24mtgm-m11、载体或宿主细胞的应用，而制备3-氨基异丁酸的方法为发酵。
[0019]
本发明的应用包括以下步骤：
[0020]
(a)获取c24mtgm-m11基因，
[0021]
(b)构建c24mtgm-m11表达载体，
[0022]
(c)构建宿主细胞，
[0023]
(d)将宿主细胞接种到培养基中，然后添加葡萄糖为基质，其通过宿主细胞转化形成3-氨基异丁酸。
[0024]
进一步地，所述发酵培养基由以下组成：硫酸铵15g/l、磷酸二氢钾5.0g/l、十二水磷酸氢二钠15g/l、七水硫酸镁1.0g/l、酵母萃取物1.0g/l、葡萄糖20g/l，ph值7.0。
[0025]
所述基因株可以直接用作发酵中间体并以发酵来生产3-氨基异丁酸，也可以用作筛选的起始菌株来获得新菌株，并进一步提高3-氨基异丁酸的产量。
[0026]
本发明使用大肠杆菌作为初始菌株，并使用分子生物学技术来修饰其基因组，重组工程菌株可以藉由发酵来获得3-氨基异丁酸。从摇瓶发酵的实验得知，即3-氨基异丁酸的最高产率可以达到870mg/l，表示本发明的方法具有工业应用的潜力。
附图说明
[0027]
图1为本发明构建的c24mtgm-m11基因表达质粒psu-laciqtrc-c24mtgm-m11的结构示意图。
具体实施方式
[0028]
虽然本发明公开能够以各种形式实施，还应理解，本发明在多项实施例中的公开
描述为依照所要求保护的主题进行举例，而非以所示和/或描述的具体实施例限制权利要求，并且不应解释为其限制了本发明的权利保护范围或广度。在本发明使用的标题仅供方便理解，不应被认为其以任何方式限制了权利要求。在任一标题下所示的实施例可以与其他标题下方所示的实施例进行组合。
[0029]
【定义】
[0030]
本发明涉及各种物质的添加量、含量和浓度，除非另有说明，其中所述的百分比为质量百分比。
[0031]
在本发明中，术语“大肠杆菌(e.coli)mg1655”、“原始菌株mg1655”具有相同的含义，指的是尚未经过基因工程修饰的原始菌株。
[0032]
在本发明中，术语“基因剔除菌株mg1655”和“mg1655(δptsgδfumacδfumb)具有相同的含义，指的是在大肠杆菌mg1655基因组中剔除ptsg、fumac、fumb基因的菌株。
[0033]
本发明中的c24mtgm-m11突变体为s-腺苷基-l-甲硫氨酸δ24-固醇-c-甲基转移酶突变体，其由s-腺苷基-l-甲硫氨酸δ24-固醇-c-甲基转移酶(c24mtgm)野生型所获得，它是一种新的蛋白质，将seq id no：1中的多种单个氨基酸进行取代修饰而获得。因此，本文中的术语“c-甲基转移酶”也可以称为“s-腺苷基-l-甲硫氨酸δ24-固醇-c-甲基转移酶突变体”，具相同的含义，于字词上可以互换使用。
[0034]
藉由合理设计出的定向演化方法来得到来源于大豆的c24mtgm-m11突变体，该突变体源自野生型c24mtgm，其中脯氨酸被丙氨酸在序列位置135处取代，白氨酸被丙氨酸在序列位置136处取代，苯丙氨酸被丝氨酸在序列位置213处取代。经过上述步骤，可获得本发明氨基酸序列为seq id no：3的突变体。
[0035]
在本发明中，以野生型c24mtgm的核酸序列seq id no:2作为模板，定点突变获得核酸序列seq id no:4。
[0036]
本发明将c24mtgm-m11的核酸序列构建到含有trc启动子的表达载体psu-laciqtrc-c24mtgm-m11中，并将表达质粒转化进mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa)，进而得到转化体(transformant)mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)。
[0037]
结果发现，与由野生型基因c24mtgm构建出的mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm)相比，转化体mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)的3-氨基异丁酸产量显着改善。
[0038]
【制备与实施例】
[0039]
常规方法
[0040]
材料与方法:
[0041]
在本发明中，全基因合成、引物合成和测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。分子生物学实验包括质粒结构、限制酶消化、连接、制备感受态细胞(competent cell)、转化、制备培养基等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。
[0042]
举例来说，感受态细胞的转化方法和制备均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进。若有需要可以通过简单的测试确定具体的实验条件。
[0043]
实施例中用于pcr的酶kod fx购自toyobo co.，ltd，限制核酸内切酶购自
thermofisher，而gibson assembly kit购自neb，axygen的dna纯化和质粒提取试剂盒购自康宁公司。实验操作依据产品说明书进行。
[0044]
培养基和缓冲液:
[0045]
lb培养基：10g/l胰蛋白胨、10g/l氯化钠、5.0g/l酵母萃取物(固体培养基添加20g/l洋菜粉，ph值＝7.0)
[0046]
发酵培养基：硫酸铵15g/l、磷酸二氢钾5.0g/l、十二水磷酸氢二钠15g/l、七水硫酸镁1.0g/l、酵母萃取物1.0g/l、葡萄糖20g/l，ph值7.0。
[0047]
在以下实施例，当使用含抗生素的培养基时，抗生素的最终浓度为氨苄西林(ampicillin)100μg/ml和氯霉素(chloramphenicol)40μg/ml。根据转化质粒的特性加入其相应的抗生素。
[0048]
20x电穿孔原液：80g/l甘氨酸、2％吐温-80。
[0049]
培养条件:
[0050]
固体培养基在37℃下静态培养，而液体培养基在37℃、230rpm摇动培养。
[0051]
分析3-氨基异丁酸的方法:
[0052]
以邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde)作为衍生剂，对样品进行柱前衍生，色谱柱为安捷伦sb-c18，流动相为乙酸钠(浓度2.871g/l)的30％甲醇水溶液，管柱温度为30℃，检测波长为334nm，检测时间10分钟，保留时间为5.1分钟。
[0053]
实施例1：取得c24mtgm-m11基因
[0054]
专利cn108998401a中公开了用质粒psu-laciqtrc-c24mtgm作为模板，分别使用24mtgm-f/135a136a-r、135a136a-f/213s-r、213s-f/c24mtgm-r作为引物进行kod-fx pcr扩增，分别获得片段c24mtgm-p1、c24mtgm-p2、c24mtgm-p3。
[0055]
接着使用c24mtgm-p1、c24mtgm-p2、c24mtgm-p3三个片段作为模板，c24mtgm-f/c24mtgm-r作为引物进行重叠pcr(overlapping pcr)，最后获得c24mtgm-m11基因。上述所用的引物序列如下：
[0056]
c24mtgm-f：
[0057]5’‑
ccatggatccaggaggtaaaaaaacatgcagaagaaaaagaaaaatcgcaacgag-3’，
[0058]
c24mtgm-r：
[0059]5’‑
ctagaaagcttttaattacgatccagatccggtttacgg-3’。
[0060]
135a136a-f：
[0061]5’‑
gatgtgggttgtggcattggtggcgcagcacgtgaaatcagccgctttagcag-3’[0062]
135a136a-r：
[0063]5’‑
ctgctaaagcggctgatttcacgtgctgcgccaccaatgccacaacccacatc-3’[0064]
213s-f：
[0065]5’‑
ctgctacaaagagatcagccgcgtgctgaaaccgggccag-3’[0066]
213s-r：
[0067]5’‑
ctggcccggtttcagcacgcggctgatctctttgtagcag-3’[0068]
实施例2：构建c24mtgm-m11表达载体
[0069]
psu-laciqtrc-c24mtgm质粒经bamhi/hindiii双酶切回收4351bp大小片段，将实施例1构建的c24mtgm-m11基因片段经bamhi/hindiii双酶切后克隆到重组质粒片段中，得
到表达载体c24mtgm-m11。表达质粒psu-laciqtrc-c24mtgm-m11结构如图1所示。
[0070]
实施例3：构建生产3-氨基异丁酸的菌株
[0071]
将实施例2中构建的psu-laciqtrc-c24mtgm-m11表达质粒透过电穿孔转化进大肠杆菌菌株mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa)(该菌株来自专利cn108998401a)，并得到工程菌株mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)。
[0072]
实施例4：菌株发酵
[0073]
本发明的发酵使用葡萄糖作为碳源，例如，发酵培养基由以下成分组成：硫酸铵15g/l、磷酸二氢钾5.0g/l、十二水磷酸氢二钠15g/l、七水硫酸镁1.0g/l、酵母萃取物1.0g/l、葡萄糖20g/l，ph值7.0。
[0074]
将原始菌株mg1655、菌株mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm)和菌株mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)分别培养并发酵。发酵培养基的量添载至30/250ml，37℃，230rpm，发酵24-32小时，然后测量3-氨基异丁酸的含量。
[0075]
3-氨基异丁酸的分析方法：以邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde)作为衍生剂，对样品进行柱前衍生，色谱柱为安捷伦sb-c18，流动相为乙酸钠(浓度2.871g/l)的30％甲醇水溶液，管柱温度为30℃，检测波长为334nm，检测时间10分钟，滞留时间为5.1分钟。
[0076]
结果表明，菌株mg1655不能产生3-氨基异丁酸；菌株mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm)可以产生82mg/l的3-氨基异丁酸；而菌株mg1655(δptsgδfumacδfumb,pand,aspa,c24mtgm-m11)可以产生480mg/l的3-氨基异丁酸。与野生型菌株c24mtgm相比，含有突变体c24mtgm-m11的菌株显着提高5.8倍的3-氨基丁酸产量。