一种解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌检测的试剂盒及方法

1.本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌检测的试剂盒及方法。


背景技术：

2.近年来，性传播疾病的发病率逐年升高，根据世界卫生组织的数据，每年全球估计有5亿人患有梅毒、淋病、衣原体感染或滴虫病。性传播疾病对个人、社区和国家的公共健康产生不利影响。在性病感染的非病毒原因中，解脲支原体(uu)、沙眼衣原体(ct)、淋球菌(ng)是引起性传播疾病的常见致病菌。这些致病菌导致多种临床综合征，如尿道炎、宫颈炎、前列腺炎和阴道炎，可能导致严重并发症和长期后遗症，包括盆腔炎、不孕症、慢性骨盆疼痛、异位妊娠、成人神经和心血管疾病、早产、新生儿死亡、婴儿严重残疾或失明。
3.目前沙眼衣原体、解脲支原体和淋球菌的实验室检测方法主要有分离培养法、免疫学方法、基于核酸检测的分子生物方法等。培养法的特异性和敏感性高，但其具有临床检测时间过长(至少需要24h～48h，甚至更长时间)，过程繁琐，需要使用特殊的培养介质以及易受杂菌影响等缺陷，不适用于大范围检测。免疫学方法简便快捷，但特异性差、灵敏度不高。
4.针对传统分离培养的耗时繁琐的操作，近年来，聚核酶链式反应(pcr)法渐渐显现了其在检测上的优势。荧光pcr技术是基于传统pcr技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术，其检测结果准确，重复性高，能动态反应病原体变化及与临床的关系，且整个过程中避免了传统pcr需后处理的问题，减少了污染。
5.目前已有一些基于实时荧光定量pcr技术检测沙眼衣原体、解脲支原体或淋球菌dna的试剂盒产品已面向市场，但普遍存在特异性差、灵敏度低的问题，并且大部分是针对沙眼衣原体、解脲支原体或淋球菌单一的检测试剂盒，对于多种病原体微生物混合的检测效果尤其差，并且处理过程繁琐。但是，由于性病的混合感染即同时感染两种或两种以上的性病的患者的比例较高，建立同时检测上述病原体的方法能提高临床诊断效率，具有非常重要的意义。
6.针对多种性病病原菌的混合感染，已有文献报道基于pcr扩增，再进行不同产物长度的电泳来区别各个不同的性病病原菌，但是由于经过pcr扩增后还要进行电泳，这个过程不仅耗时长还增加了因开盖操作带来的实验室污染的风险。
7.中国发明专利申请“cn202010329650.6淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用”公开了一种三联检测引物组，该引物组能够用于淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体三种病原体的同时检测。然而，该专利申请中提供的引物对淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的特异性不足，例如，其沙眼衣原体引物可以扩增肺炎衣原体基因组，导致检测结果的准确性不足。
3:1-3:1-4；
29.和/或，所述用于检测淋球菌的正向引物、反向引物和探针的用量摩尔比为1-3:1-3:1-4；
30.和/或，所述用于检测解脲支原体的探针、用于检测沙眼衣原体的探针、用于检测淋球菌的探针的用量摩尔比为1-3:1-3:1-4。
31.优选的，所述用于检测解脲支原体的正向引物、反向引物和探针的用量摩尔比为1:1:1；
32.和/或，所述用于检测沙眼衣原体的正向引物、反向引物和探针的用量摩尔比为1:1:1；
33.和/或，所述用于检测淋球菌的正向引物、反向引物和探针的用量摩尔比为1:1:1；
34.和/或，所述用于检测解脲支原体的探针、用于检测沙眼衣原体的探针、用于检测淋球菌的探针的用量摩尔比为1:1:1。
35.本发明提供一种解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌的pcr检测方法，包括如下步骤：利用上述试剂盒对待检测样品进行pcr扩增后，检测。所述检测的具体方法可选择荧光探针检测或电泳检测，优选为荧光探针检测。
36.优选的，所述pcr扩增的pcr反应体系包括如下组分：
37.pcr反应mix 10-20μl；
38.dnf buffer 2-5μl；
39.上述引物对的溶液5.4μl；
40.病原菌dna1-4μl；
41.水补足pcr反应体系总体积至30μl；
42.其中所述引物对的溶液包括如下组分：
43.用于检测解脲支原体的正向引物2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
44.用于检测解脲支原体的反向引物2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
45.用于检测沙眼衣原体的正向引物2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
46.用于检测沙眼衣原体的反向引物2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
47.用于检测淋球菌的正向引物2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
48.用于检测淋球菌的反向引物2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol。
49.优选的，所述检测的方法为荧光检测法；
50.所述引物对的溶液还包括如下组分：
51.用于检测解脲支原体的探针2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
52.用于检测沙眼衣原体的探针2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol；
53.用于检测淋球菌的探针2
×
10-12-6
×
10-12
mol，优选为6
×
10-12
mol。
54.优选的，所述pcr扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性5s、56℃退火15s、72℃延伸30s。
55.本发明中所用“pcr反应mix”是指现有技术中的pcr反应液，包含有dntp、反应所需的聚合酶等，已经被商品化。例如，2xtaqman fast qpcr master mix包含25mm mgcl2、25mm dntps、100mm dutp、taq酶和udg酶。所用“dnf buffer”是缓冲溶液，已经被商品化。例如，在其中一个实施例中dnf buffer的组成为25mm mgcl2、25mm dntps、100mm dutp、taq酶和udg
酶。
56.本发明提供的试剂盒能够实现同时检测解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌三种性病病原体的目的。且相比于现有技术，本发明重新设计的扩增引物和探针具有更好的特异性、灵敏度和精密度。在优选的条件下，本发明的试剂盒及检测方法对其他病原体检测为阴性，对解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌三种性病病原菌的检出限低至500copies/ml，且批内精密度ct值的变异系数(cv,％)≤5％，重复性好。这说明本发明提供的试剂盒及检测方法非常适用于临床检测。
57.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
58.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
59.图1为检测方法流程示意图；
60.图2为实施例1的多重荧光pcr检测结果；
61.图3为实验例1对退火温度优化的结果；
62.图4为实验例2对引物添加量优化的结果；
63.图5本技术中及对比文件中检测解脲支原体所用的引物对的特异性比对结果；
64.图6本技术中及对比文件中检测沙眼衣原体所用的引物对的特异性比对结果；
65.图7本技术中及对比文件中检测淋球菌所用的引物对的特异性比对结果；
66.图8为实验例4的特异性评估结果；
67.图9为实验例5的检测限评估结果；
68.图10为实验例6的灵敏度和特异性评估结果；
69.图11为实验例7的精密度评估结果。
具体实施方式
70.以下实施例和实验例所用的试剂及材料包括：
71.试剂盒中包含的扩增引物及检测探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
72.解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌三种性病病原体的dna模板(病原菌dna)，提取自患者；
73.2xtaqman fast qpcr master mix，购自sangon上海；
74.dnf buffer，购自sangon上海；
75.水，sterilized ddh2o。
76.实施例1对解脲支原体(uu)、沙眼衣原体(ct)和淋球菌(ng)三种性病病原体的同时检测
77.本实施例的检测过程如图1所示，具体如下：
78.1、扩增引物及检测探针设计
79.本实施例的引物对和探针如表1所示：
80.表1引物对和探针序列
[0081][0082]
2、检测样品采集(核酸提取)
[0083]
按照现有技术的方法收集用于检测解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌的生殖道分泌物标本，收集到的标本等用无菌生理盐水洗脱，参照细菌基因组提取说明书进行提取细菌核酸，经过核酸提取后用于后续检测。
[0084]
3、反应液配制
[0085]
按照下表配制pcr反应液：
[0086]
表2 pcr反应液
[0087][0088][0089]
按照下表配制阴性对照品反应液：
[0090]
表3阴性对照品反应液
[0091]
成分体积(μl)2
×
taqman fast qpcr mix15正向引物(10μmol/l)三种各0.6反向引物(10μmol/l)三种各0.6探针(10μmol/l)三种各0.6
dnf buffer3水6
[0092]
4、多重荧光pcr检测
[0093]
将检测样品与反应液混合后进行pcr扩增，pcr扩增的程序为：94℃预变性3min；94℃变性5s、56℃退火15s、72℃延伸30s。同时在hex，rox和cy5通道下收集荧光信号，进行50个循环。根据三个通道检测到的荧光强度判断检测样本对三种性病病原体为阴性还是阳性。
[0094]
对于包含三种性病病原体的阳性检测样本，多重荧光pcr结果如图2所示，uu的检测探针用-fam荧光报告基团修饰，扩增曲线呈绿色；ct的检测探针用-rox荧光报告基团修饰，扩增曲线呈橙色；ng的检测探针用-cy5荧光报告基团修饰，扩增曲线呈紫色，扩增结果表明三种病原菌核酸的扩增过程中并未出现相互的干扰或者抑制，均有良好的扩增，说明本发明引物和探针的特异性非常好。
[0095]
实验例1退火温度优化
[0096]
退火温度是影响pcr反应特异性的重要因素。退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低pcr扩增效率。多重荧光pcr中由于引物不止一对，退火温度的正确把握更是重要。
[0097]
本实验例按照实施例1的方法对相同阳性样本进行检测，区别在于将多重荧光pcr的退火温度依次设为55.0、56.0、58.0、60.9、64.5、67.5、69.2、70.0℃，结果如图3所示。选出最佳退火温度为56.0℃。
[0098]
实验例2扩增引物添加量优化
[0099]
本实验例按照实施例1的方法对相同阳性样本进行检测，以等量添加各个引物对为原则，设置的引物添加量梯度为各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μl(10μmol/l)，结果如图4所示。选出的最佳添加量为各个引物各添加0.6μl。
[0100]
实验例3引物及探针的特异性考查
[0101]
本实验例对实施例1以及中国发明专利申请“cn202010329650.6淋球菌、沙眼衣原体和解脲支原体的三联检引物组、产品及应用”中公开的引物的特异性进行考查，考查的方法为在ncbi数据库中进行对比，了解其扩增产物和tm值。
[0102]
图5给出了实施例1及对比文件中检测解脲支原体所用的引物对的特异性比对结果，从结果可以看出，本技术中所用引物所得到的扩增产物都是解脲支原体基因，不存在其他非目的的物种。而对比文件中所用引物除了能扩增部分解脲支原体还能扩增出其他产物，如ureaplasma parvum微小脲原体等。
[0103]
图6给出了实施例1及对比文件中检测沙眼衣原体所用的引物对的特异性比对结果，从结果可以看出，本技术中所用引物所得到的扩增产物都是沙眼衣原体基因，不存在其他非目的的物种。而对比文件中所用引物除了能扩增部分沙眼衣原体还能扩增其他产物，如chlamydia pneumoniae肺炎衣原体等。
[0104]
图7给出了实施例1及对比文件中检测淋球菌所用的引物对的特异性比对结果，从结果可以看出，本技术中所用引物所得到的扩增产物都是淋球菌基因，不存在其他非目的的物种。而对比文件中所用引物除了能扩增部分淋球菌还能扩增出其他产物，如neisseria meningitidis脑膜炎奈瑟菌等。
[0105]
以上结果表明本技术所用三种引物对的特异性都高于对比文件。此外，实施例1所用引物tm值接近60℃，高于对比文件中所用引物的tm值，这也说明实施例1的引物特异性的高于对比文件。
[0106]
实验例4反应特异性评估
[0107]
为确定所建立多重荧光pcr方法的特异性，按照实施例1的方法进行检测，结果显示：以解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌三种混合病原菌基因组为模板的检测均出现目的扩增曲线，而其他非目的病原体(单纯疱疹病毒2型、人乳头瘤病毒6型、人乳头瘤病毒16型)检测结果均为阴性，表明该方法具有良好的特异性(图8)。
[0108]
实验例5检出限的评估
[0109]
对解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌三种病原菌的阳性质控品进行稀释，稀释至浓度为50copies/ml，500copies/ml，5000copies/ml，然后按照实施例1的条件进行检测。结果如图9所示，uu、ct、ng三种病原菌的核酸浓度在5
×
102～5
×
104copies/ml区间均可出现目的扩增曲，最低检出限为5
×
102copies/ml，这说明多重荧光pcr方法灵敏度非常高，达到了临床检测标准。
[0110]
实验例6诊断灵敏度与特异性评估
[0111]
本实验例对诊断灵敏度和特异性进行评估，收集30份阴性临床标本，30份阳性标本，阳性标本中有23份是单一感染标本，有7份混合感染标本。将上述样本分别用实施例1的方法和临床现用的pcr试剂盒进行检测。其中，用于对比的pcr试剂盒分别为解脲支原体(uu)核酸测定试剂盒(荧光pcr法)(之江生物)、沙眼衣原体(ct)核酸测定试剂盒(荧光pcr法)(之江生物)、淋球菌(ng)核酸测定试剂盒(荧光pcr法)(之江生物)。
[0112]
检测结果表明实施例1的方法与临床现用的pcr试剂盒检测结果接近一致(图10)，以临床检测结果为金标准，对诊断灵敏度与特异度进行初步评估，诊断灵敏性sen＝94.87％，诊断特异性sep＝96.67％。
[0113]
实验例7诊断精密度评估
[0114]
本实验例为了证明方法的稳定性，对批内精密度进行了评估，对一组阳性标本重复检测了5次，得到了每次结果的ct值(图11)，通过公式计算得出三种病原菌检测结果的变异系数，cv
uu
＝4.21％，cv
ct
＝3.20％，cv
ng
＝0.76％
[0115]
变异系数cv均小于5％，由此可见，本发明方法不仅灵敏、快速，而且可重复性强，适用于目前的临床检测情况。
[0116]
综上所述，本发明提供了一种基于多重荧光pcr技术对解脲支原体、沙眼衣原体和淋球菌三种性病病原体的同时检测的方法。本发明的方法对引物和探针序列进行了设计，并优化了退火条件和引物添加量等检测条件，进而提高了检测方法的特异性、灵敏度和精密度。在临床应用中具有良好的前景。