用于构建空间转录组测序文库的试剂盒及cDNA文库的构建方法与流程

用于构建空间转录组测序文库的试剂盒及cdna文库的构建方法
技术领域
1.本发明涉及空间转录组测序技术，具体地说，涉及一种用于构建空间转录组测序文库的试剂盒及cdna文库的构建方法。


背景技术：

2.在多细胞组织样本中，基因的表达按照一定的时间和空间顺序严格进行。很早前就有研究者对基因的空间表达进行了探究，包括基于微解剖基因表达技术，原位杂交技术，靶向原位测序技术以及原位捕获技术。
3.基于微解剖基因表达技术是通过从样本中分离出目标区域，然后将这些区域单独放入试管中进行rna提取和后续的基因表达谱分析。虽然解剖单个区域进行后续的测序可以完整地提取不同形式的rna种类，实现同工型存在等分析，但一般来说，覆盖较大的区域通常很麻烦，而且在整个组织中获得整体情况往往是不可行的。而原位杂交技术是通过不从组织内的各个部分(或细胞)中提取rna分子，而是直接在原始环境中对其进行可视化，这可以通过与感兴趣的目标互补的标记探针杂交来实现，但此方法成本高昂且大规模基因检测是不太好实现的。靶向原位测序技术是通过rna测序可以直接对细胞中的rna含量进行测序，而细胞仍处于其组织环境中，转录物的位置可以用亚细胞分辨率来解决，但为了达到足够的信号进行成像，需要使用微米或纳米大小的dna球来放大信号。
4.原位捕获技术是随着高通量测序技术的成熟而出现的一项技术。2016年瑞典的spatial transcriptomics公司首次利用基因芯片技术将位置信息保留在芯片上，再利用二代测序技术对组织中的rna进行测序，从而生成了组织切片上完整的基因表达图像的技术，该项技术于2018年被10x genomics公司收购并于2019年进行了商品化销售。此外还有2019和2020年分别公开的slideseq和slideseqv2技术，它们是通过微球组装芯片使用solid测序方法解码微球空间信息并进行rna捕获和表达的方法；基于微球组装芯片的方法还有2019年提出的高清空间转录组的方法(hdst)，这种方法是基于直径更小的微球和密度更大的芯片来实现的。
5.无论基于哪种芯片，后续都需要通过一定方法将捕获到的rna进行转化得到可用于构建文库的cdna样本，从rna捕获到cdna合成的整个过程被称为基因表达。如何开发一种成本低、操作性强的基因表达方法成为研发热点。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种用于构建空间转录组测序文库的试剂盒及cdna文库的构建方法。
7.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于构建空间转录组测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括组织透化液、反转录和cdna一链合成试剂、cdna二链合成试剂以及cdna扩增试剂等。
8.所述组织透化液的组成如下：0.01-1％胃蛋白酶，0.1-2mm tritonx-100，0.1-1mhcl中的一种或多种试剂混合。
9.优选地，所述组织透化液为0.1％胃蛋白酶。
10.反转录和cdna一链合成试剂包括：rt reagentⅰ、反转录酶(rt reagentⅱ)、dntps、dtt和链置换引物；其中，rt reagentⅰ(5
×
反转录缓冲液)：100-500mm tris-hcl(ph 7-9，25℃)、200-500mm kcl、10-30mm mgcl2和10-100mm dtt；
11.可以使用市面上常见的反转录酶，如thermofisher公司的superscript
tm
ii、superscript
tm
iii、superscript
tm
iv；vazyme公司的hiscript ii reverse transcriptase、hiscript iii reverse transcriptase、hiscript reverse transcriptase等反转录酶的一种或多种。
12.rt reagentⅲ(dntps)：1-20mm dntps。
13.reducingⅰ：1-200mm dtt。
14.ssp：10-100μm链置换引物。
15.cdna二链合成试剂包括：second strand reagentⅰ、dntps、dna聚合酶和二链反应引物；其中，second strand reagentⅰ(10
×
二链缓冲液)：100-300mm tris-hcl，50-200mm(nh4)2so4，100-1000mm kcl，10-50mm mgso4和0.5-5％tween-20，ph7-9。
16.second strand reagent ii：1-20mm dntps。
17.second strand enzyme：dna聚合酶i大片段(klenow)、dna聚合酶i(e.coli)dna聚合酶i(e.coli)等具有dna合成功能的聚合酶中的一种或多种。
18.second strand primer：1-100μm二链反应引物。
19.第二方面，本发明提供所述试剂盒在构建空间转录组测序文库中的应用。
20.第三方面，本发明提供一种cdna文库的构建方法，包括以下步骤：
21.(1)组织贴片、固定及染色；
22.(2)组织透化；
23.(3)反转录和cdna一链合成；
24.(4)cdna二链合成；
25.(5)cdna扩增；
26.(6)cdna纯化；
27.(7)cdna质控。
28.其中，步骤(2)～(5)中使用的试剂来自上述试剂盒。
29.进一步地，步骤(1)包括：将新鲜冷冻组织切片贴在透化芯片上进行固定及染色，其中所述透化芯片带有mrna捕获探针。
30.进一步地，步骤(2)包括：将步骤(1)所得芯片放入所述组织透化液中于37℃孵育2-30min(不同组织需要不同时间，没有具体范围，此时间已在组织优化实验中确定，时间可暂且定为2-30min)，去除组织透化液并向芯片的孔内加入0.1％ssc溶液。
31.进一步地，步骤(3)包括：去除孔内的ssc溶液，将所述反转录和cdna一链合成试剂加入孔内，于37-65℃孵育0.5-2小时(优选50℃孵育1.5小时)。
32.进一步地，步骤(4)包括：去除孔内的反转录和cdna一链合成试剂，加入0.08mkoh进行解链变性后，用eb缓冲液进行洗涤，然后加入所述cdna二链合成试剂，于45-70℃孵育
10-40分钟(优选65℃孵育30分钟)。
33.所述eb缓冲液为10mm tris-hcl，ph 7.5。
34.进一步地，步骤(5)包括：去除孔内的cdna二链合成试剂，加入eb缓冲液进行洗涤，再加入0.08m koh室温孵育10min，然后用tris中和koh后，加入所述cdna扩增试剂进行pcr扩增。
35.优选地，pcr扩增程序为：95℃30s；95℃15s，62℃15s，65℃8min，15个循环；65℃6min；4℃∞。
36.进一步地，步骤(6)包括：扩增产物用磁珠进行纯化，然后用80％乙醇洗涤磁珠，最后用eb缓冲液将扩增产物从磁珠上洗脱下来。
37.借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
38.(一)本发明提供一种基于北京百迈客生物科技有限公司自主研发的空间转录组芯片而建立的基因表达方法，该方法成本低(整个流程约5000元/孔)，结果稳定可靠。
39.(二)本发明的cdna文库构建方法操作简便，试剂混合液组分简单，操作性强。
附图说明
40.图1为本发明较佳实施例中空间转录组基因表达方法的流程示意图。
41.图2为本发明较佳实施例中大鼠胚胎样本cdna的2100质检图。
42.图3为本发明较佳实施例中小鼠大脑样本cdna的2100质检图。
43.图4为本发明较佳实施例中人子宫内膜样本cdna的2100质检图。
44.图5为本发明较佳实施例中小鼠肝肿瘤样本cdna的2100质检图。
具体实施方式
45.本发明旨在提供一种成本低、操作性强的基因表达方法。本方法通过将新鲜冷冻组织切片贴在透化芯片上进行固定及染色后置入卡夹，使用配置好的透化酶进行组织透化，然后去除组织透化液，投入一链cdna合成混合液，进行逆转录，完成后将rna解链再接着进行cdna二链的合成，最后通过cdna变性解链获取到cdna样本进行扩增得到可用于构建二代文库的样品。
46.本发明采用如下技术方案：
47.(1)组织透化：将带有已固定好并染色的组织的芯片置入配套卡夹内，配置组织透化试剂按照组织优化已确定的透化时间进行孵育，透化后去除组织透化试剂并向孔内加0.1％ssc溶液。
48.(2)cdna一链合成：去除孔内0.1％ssc溶液，将配置好的一链合成试剂加入孔内，在50℃孵育1.5小时。
49.(3)cdna二链合成：去除一链合成试剂，加0.08m koh进行解链变性后，eb缓冲液进行洗涤后，加入二链合成试剂，于65℃孵育30分钟。
50.(4)cdna解链与扩增：去除二链合成试剂，加入eb缓冲液先进行洗涤，再加入0.08m koh室温孵育10min，将带有cdna的koh与一定比例的tris进行中和后，取1ul样品进行qpcr检测确定循环数，再使用扩增酶对剩余样品进行cdna扩增。
51.(5)cdna纯化：使用spriselect磁珠对扩增后产物进行纯化，80％的乙醇进行洗
涤，eb缓冲液进行洗脱。
52.(6)cdna定量与质检：使用qubit对纯化后的cdna进行浓度检测，取1ul稀释到2ng/ul后使用高灵敏安捷伦2100检测芯片对最终的cdna进行长度分布检测。
53.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
54.实施例1空间转录组测序文库的构建方法
55.本实施例提供一种基于基因表达芯片进行组织样本基因表达的测试方法，利用高灵敏agilent2100对结果进行判读的方法及其应用。利用该方法可对组织样本进行rna捕获，cdna一链合成，cdna二链合成以及cdna扩增，得到最终带组织样本空间信息的cdna样品，下游可接二、三代测序。该方法与传统方法相比优点在于兼容范围广，操作性强，重复性好，成本低等，主要用于空间转录组的基因表达。
56.空间转录组基因表达的方法包括如下步骤：
57.1、组织贴片、固定及染色：将新鲜冷冻组织(分别为大鼠胚胎样本、小鼠大脑样本、人子宫内膜样本和小鼠肝肿瘤样本)切片贴在透化芯片上进行固定及染色，其中所述透化芯片带有mrna捕获探针。
58.组织染色及成像：
59.1.1组织固定
60.40ml甲醇置50ml离心管中预冷至-20℃；
61.将pcr仪设定为37℃，热盖温度为37℃或50℃，放置适配器平衡温度；
62.从-80℃中取出贴好组织的芯片(干冰运输)，组织面朝上置于37℃适配器上孵育1min(勿盖热盖)；若是刚于冷冻切片机中贴好组织，也执行此操作；
63.将芯片置于预冷好的甲醇中，于-20℃孵育30min；
64.在此期间可准备组织染色所需试剂。
65.1.2组织染色
66.1.2.1提前准备好三个1l烧杯，均加入不少于800ml的超纯水；
67.1.2.2按照下表准备伊红mix：
68.伊红mix体积/芯片(ul)eosin100tris-acetic acid buffer(0.45m，ph6.0)900total1000
69.苏木精染液用前需使用0.2um滤膜过滤；
70.1.2.3将固定好的芯片擦拭掉多余甲醇液体，放置于平台洁净的台面上；
71.1.2.4将异丙醇添加到组织面上并均匀覆盖，室温孵育1min；
72.1.2.5倾斜芯片去除异丙醇，擦拭多余液体，可轻轻挥动芯片使组织上多余异丙醇挥发，此过程不超过5min，避免过度干燥；
73.1.2.6向组织面添加滤后的苏木精染液并均匀覆盖，室温孵育1-7min(因组织而异)；
74.1.2.7倾斜芯片去除苏木精染液，将芯片置于第一杯超纯水中轻轻涮洗15次左右，再置于第二杯超纯水中轻轻涮洗15次左右，擦拭掉多余液体；
75.1.2.8向组织面添加靛蓝染色液并均匀覆盖，室温孵育30s-2min(因组织而异)；
76.1.2.9倾斜芯片去除靛蓝染色，置于第二杯超纯水中轻轻涮洗5次左右，擦拭掉多余液体；
77.1.2.10向组织面添加配置好的伊红mix并均匀覆盖，室温孵育30s-1min(因组织而异)；
78.1.2.11倾斜芯片去除伊红mix，置于第三杯超纯水中轻轻涮洗20次左右,擦拭掉多余液体；
79.1.2.12将芯片放置于洁净的50ml离心管中，配平离心，250g，30s；
80.1.2.13取出芯片于37℃适配器上孵育1min。
81.1.3明场组织成像
82.1.3.1将芯片置于载物架上并加载进入仪器中；
83.1.3.2待系统预采集成像后，将光标点置于组织图像上进行自动对焦；
84.1.3.3将对焦好的数值
±
50，选好图像保存的文件夹并命名；
85.1.3.4框出组织位置，点击扫描即可。
86.2.组织透化
87.2.1permeabilization enzyme(组织透化酶，即0.1％的胃蛋白酶)置于37℃金属浴中预热10min；
88.2.2将适配器置于pcr仪中，pcr仪设置如下程序：
89.热盖反应体积37℃(或50℃)100ul温度时间37℃hold
90.2.3将芯片安装到芯片卡夹中，沿孔侧加入70ul预热好的permeabilization enzyme，使酶均匀覆盖整个矩阵(切勿引入气泡)；
91.2.4使用封口膜密封，置于pcr仪中的适配器上，盖好热盖，于37℃孵育置已确定好的时间，使用计时器计时；
92.2.5将20
×
ssc稀释至0.1
×
ssc，涡旋混匀，瞬时离心；
93.2.6透化时间根据不同组织而异，通过组织透化实验确定。结束，取出卡夹，撕开密封，沿矩阵边缘吸出permeabilization enzyme，向孔内加入100ul上述配置好的0.1
×
ssc缓冲液并均匀覆盖矩阵(避免引入气泡)，再次密封。
94.3.cdna一链合成
95.3.1在冰上配制如下cdna一链合成mix：
[0096][0097]
涡旋混匀，瞬时离心；
[0098]
3.2将适配器置于pcr仪中，pcr仪设置以下程序：
[0099]
热盖反应体积 50℃100ul 步骤温度时间预热42℃hold一链合成42℃90min/4℃hold
[0100]
3.3撕开密封，沿孔侧吸出缓冲液，加入一链合成mix(均匀覆盖，避免气泡)，再次密封，将卡夹置于适配器上，盖上热盖，跳过预热步骤，开始一链合成。
[0101]
4.cdna二链合成与变性
[0102]
4.1从适配器上取出卡夹，撕开密封，沿孔侧吸出一链合成mix；
[0103]
4.2向孔内加入100ul 0.08m koh，室温孵育5min；
[0104]
4.3移液器沿孔侧缓慢匀速吹吸5次后(切勿剧烈)弃掉0.08m koh；
[0105]
4.4向孔内加入100ul eb缓冲液，室温孵育2min；
[0106]
4.5在冰上配制如下cdna二链合成mix：
[0107][0108]
second strand primer引物序列：5
′‑
tttctgttggtgctgatattgc-3
′
。
[0109]
涡旋混匀，瞬时离心；
[0110]
4.6将适配器置于pcr仪中，pcr仪设置以下程序：
[0111]
热盖反应体积 50℃100ul 步骤温度时间预热65℃hold二链合成65℃30min/4℃hold
[0112]
4.7移液器沿孔侧缓慢匀速吹吸5次后(切勿剧烈)弃掉eb缓冲液；
[0113]
4.8向孔内加入cdna二链合成mix(避免气泡)，置于适配器上，跳过预热，开始cdna二链合成。
[0114]
4.9cdna二链合成结束后，从孔内移除二链合成mix；
[0115]
4.10孔内加入100ul eb缓冲液，室温孵育2min；
[0116]
4.11移液器沿孔侧缓慢匀速吹吸5次后(切勿剧烈)弃掉eb缓冲液；
[0117]
4.12孔内加入45ul 0.08m koh，注意使其覆盖整个矩阵，室温孵育10min，期间每隔两分钟使用移液器吹吸两次；
[0118]
4.13吸出42ul 0.08m koh与6ul tris(1m，ph7.0)于0.2ml低吸附tube管中混匀，瞬时离心后置于冰上。
[0119]
5.cdna扩增
[0120]
5.1 qpcr循环数测定
[0121]
5.1.1在冰上配制如下qpcr mix：
[0122][0123]
涡旋混匀，瞬时离心；
[0124]
5.1.2在qpcr孔板中，每孔加入9ul qpcr mix(包含2个样品重复，1个阴性对照，也可设置阳性对照，可按比例增大qpcr mix体系)；
[0125]
5.1.3吸取步骤4.13中的样品，每个样品重复孔内加1ul，阴性对照内加1ul水，如加阳性对照可在孔内加入1ul已质控过的cdna样本；
[0126]
5.1.4按照如下程序进行qpcr反应：
[0127][0128]
5.1.5记录所得cq值。
[0129]
5.2 cdna扩增
[0130]
5.2.1冰上配制如下cdna扩增mix：
[0131][0132][0133]
amp mix为kapa hifi hotstar dna聚合酶。
[0134]
cdna primer引物序列如下：
[0135]
引物f：5
′‑
ctacacgacgctcttccgatct-3
′
[0136]
引物r：5
′‑
tttctgttggtgctgatattgc-3
′
[0137]
涡旋混匀，瞬时离心；
[0138]
5.2.2向4.13样品中加入51ul cdna扩增mix，吹打混匀，瞬时离心，避免气泡；
[0139]
5.2.3在pcr仪上设置以下程序进行cdna扩增：
[0140][0141]
5.2.4质控节点，可使用qubit对pcr后产物进行浓度测定。
[0142]
6.cdna纯化
[0143]
6.1涡旋spriselect磁珠使其充分混匀，向样品(100ul)中加入60ul的spriselect磁珠(0.6x)，移液器混合15次；
[0144]
6.2室温孵育5min；
[0145]
65.3放置到磁力架上，直到溶液澄清；
[0146]
6.4除去上清；
[0147]
6.5向管中加入200ul 80％的乙醇，静待30s；
[0148]
6.6除去乙醇；
[0149]
6.7重复步骤6.5和6.6，共洗涤2次；
[0150]
6.8瞬时离心并转移至磁力架上；
[0151]
6.9去除残余的酒精，室温干燥2min(不要超过2min，否则会降低洗脱效率)；
[0152]
6.10试管从磁力架上移开，加入40.5ul eb缓冲液，移液器混匀15次；
[0153]
6.11室温孵育2min；
[0154]
6.12将试管放置于磁力架上，直至溶液澄清；
[0155]
6.13吸取40ul液体于至新试管中；
[0156]
6.14可在4℃保存72h，或在-20℃保存4周，或直接进行下一步反应。
[0157]
7.cdna定量及质控
[0158]
7.1使用qubit测定纯化后cdna产物浓度，稀释至2ng/ul；
[0159]
7.2使用high sensitivity agilent technologies 2100bioanalyzerd对cdna产物峰型进行测定。
[0160]
空间转录组基因表达方法的流程示意图见图1；
[0161]
大鼠胚胎样本cdna的2100质检图见图2；
[0162]
小鼠大脑样本cdna的2100质检图见图3；
[0163]
人子宫内膜样本cdna的2100质检图见图4；
[0164]
小鼠肝肿瘤样本cdna的2100质检图见图5。
[0165]
从图2～图5可以看出，本发明提供的基因表达操作流程获得高质量的cdna文库且兼容广泛的样本类型。
[0166]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。