一种长链非编码RNA及其应用

一种长链非编码rna及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤细胞生物学领域，具体涉及一种长链非编码rna linc00376及其应用。


背景技术：

2.肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，因其早期诊断率低及晚期预后差等特性，导致肝癌相关死亡率居高不下。作为高发病率、高致死率的肿瘤之一，原发性肝癌需要及时并有效的治疗方案。原发性肝癌主要包括肝细胞癌（hcc）、肝内胆管癌（icc）和 hcc-icc 混合型 3 种不同的病理学类型，其中肝细胞癌为肝癌中最常见的病理类型，被认为是肝癌患者死亡的主要原因。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，hcc）是现今全世界最常见的恶性肿瘤之一，也是引起人类癌症患者死亡的重大原因之一，而其中有一半以上都是发生在中国。虽然目前肝移植和肝切除术是 hcc 的最主要的两大治疗手段，但患者术后 5 年生存率仍比较低，且复发率较高，远期疗效仍未得到明显改善。由于hcc早期无症状或症状不典型，且进展迅速，大多数患者被确诊时已处于癌症晚期。由于对 hcc 发病机制的认识不完全，患者难以在早期得到有效的诊断和治疗，因此，迫切的需要深入研究 hcc 发生发展的分子机制，寻求 hcc 早期诊断或精准治疗的靶标。
3.虽然现在有着大量的肿瘤相关基因已经被发现，但其潜在的分子作用机制尚未得到完全阐明。非编码 rna（noncoding rna，ncrna）已被证实在各种疾病，尤其是在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。ncrna 是不编码任何蛋白质的 rna，按长度可分为两类：长链非编码 rna（long noncoding rna，lncrna）和短链非编码 rna（microrna，mirna）。lncrna 是长度超过 200 个核苷酸的 ncrna，并在基因组转录过程中广泛存在。研究发现，mirna 可以直接靶向基因的 3
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utr 端，抑制靶基因的转录。而 lncrna 则可以通过“分子海绵”作用，结合更多的 mirna，解除 mirna 对其下游靶基因的抑制作用，从而促进靶基因发挥作用。近年来的研究发现 lncrna 在hcc 中发挥着各种不同的生物学功能，因此被认为是 hcc 生物学过程中的新型调节因子，为 hcc 的诊治提供了新的方向。
4.mirna 作为 ncrna 其中的一个种类，目前也已得到了学者们的广泛研究，并被证实在 hcc 的发生发展中也起着重要的作用。最近的研究显示，lncrna和 mirna 之间存在着相互的调节关系。lncrna 可作为竞争性内源 rna（competing endogenous rna，cerna）来调节 mirna 的表达及其生物学功能，竞争性吸附 mirna 并且调控其下游的靶基因表达。
5.到目前为止，许多致癌或者抑癌基因已被确认为hcc 相关的lncrna 的靶点。例如，lncrnas 可以通过作用于相关基因如hbx，akt1，gsk3b cdc25a，e2f1，hnrnp u、pcaf，gf、pcaf，dmr，icr，igf2 和p53 等抑制癌细胞的增殖和转移。通过调节这些相关基因，lncrnas 能够有效的发挥调节hcc 肿瘤发生发展的作用。 然而，已知的靶基因的数量增长迅速，表明lncrnas 的复杂调控网络。一般来说，lncrnas 可以通过各种机制包括调控表观遗传改变、结合并调控rna、dna 和蛋白质、调控遗传变异等作用，影响细胞内几乎所有的中
心法则的行为，从转录到翻译再到影响蛋白功能。
6.因此，寻找新的能够调控hcc细胞增殖、迁移、转移的lncrna分子，有助于对 hcc 发病机制更进一步认识，对深入研究 hcc 发生发展的分子机制以及寻求 hcc 早期诊断或精准治疗的靶标具有女重要的意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种长链非编码rna linc00376及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过降低长链非编码rna的表达能显著抑制肿瘤细胞的生长和增殖，该linc00376是多种癌症细胞潜在的抑制剂，有望用于癌症治疗。
8.在我们的前期的实验中，已经发现在肝癌细胞和癌旁组织中 存在多种长链非编码rna的差异表达。
9.本发明公开了一种长链非编码rna在制备抑制肝癌增殖、转移试剂中的应用，所述长链非编码rna为linc00376。
10.本发明公开了一种长链非编码rna在制备诊断肝癌试剂中的应用，所述长链非编码rna为linc00376。
11.优选的，所述长链非编码rna通过与mir-488-3p的结合来实现对肝癌增殖、转移。
12.本发明公开了一种长链非编码rna和mir-488-3作为组合在制备抑制肝癌增殖、转移试剂中的应用，所述长链非编码rna为linc00376。
13.本发明公开了一种组合物，所述组合物包括长链非编码rna linc00376和mir-488-3p。
14.优选的，长链非编码rna linc00376的编码序列如seq id no:1所示，具体为：acaattagactccaccaatgtcagactgctaaaatgtaaaaaatggccatcaggattttctagggcagcataattattctgcgagtaggtaaaggagttttgattgagatgaagaggtcatagaagtgagaagcactgaaagacacagaagtttgttccttccagtgggttcgtggtctcactgacttcaagaatgaagccacggaccctcgcgaaaggaccagaaccaggggcaaaatctcacagctgcagtatcatttaagactcagagacagcctatccttctgggcaaaggggctgaaaagaaggaccctgtgatccaaagagttggggaattcttcggatccgtattgaagtgattcagctagaaattgataatcttcattttaacactgctctgagttaatggctgctcttgaaaaggtattgaatccacctggaatttccttgtgtttatggttcaagctgttcgtgagtattataccacttgacgactgaggcagaatcaaagaaagtactaatgctcttcagtaaaatatacaaaactacagacaatggcagtgccttattttgtaaagtatatagctatgagcctttgctactccttgctgacatttggaatttaactgaagtgtcttgttaaaaaacatttatggaaataaaaagaatatctttcctttttagggatataaa。
15.本发明公开了一种sirna分子，所述sirna分子干扰长链非编码rna linc00376，所述sirna的序列如seq id no:7所示。
16.优选的，所述sirna的序列为5’gcuucauucu ugaagucagu3’。
17.本发明公开了所述的组合物和/或所述的sirna分子在制备抑制肝癌增殖、转移试剂中的应用。
18.优选的，所述肝癌为hepg2细胞。
19.本发明公开了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述的组合物和/或所述的sirna分子。
20.优选的，所述mir-488-3p的序列如seq id no:6所示。
21.优选的，所述mir-488-3p的序列为5
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uugaaaggcuauuuucuugguc 3’。
22.本发明公开了扩增基因linc00376的引物序列为：上游引物：5
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acaattagac tccaccaa3’， 如seq id no:2所示;下游引物：5
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tttatatccctaaaaagg 3’， 如seq id no:3所示。
23.本发明公开了内参基因gapdh的扩增引物序列为：上游引物：5
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gtcagccgcatcttcttttg-3’， 如seq id no:4所示；下游引物：5
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gcgcccaatacgaccaaatc-3’， 如seq id no:5所示。
24.本发明基于肝癌细胞与癌旁组织中存在差异表达的长链非编码rna分子，通过miｒbase 预测出miｒ-488-3p可能为linc00376 的潜在靶基因，并通过荧光素酶实验获得的证实。通过进一步向肝癌细胞中转化长链非编码rna linc00376和miｒ-488-3p，发现能够促进肝癌细胞的增殖，而相肝癌细胞中转化长链非编码rna linc00376的干扰分子和miｒ-488-3p的抑制剂，发现能够抑制肝癌细胞的增殖。因此，本发明发现了一种新的能够调控肝癌细胞增殖或转移的分子组合物，为进一步治疗肝癌并研究肝癌的发病机理提供新的证据。
附图说明
25.图1 为hepg2细胞台盼蓝染色图。
26.图2为hepg2细胞与癌旁组织中linc00376的表达rt-pcr图。
27.图3 为linc00376与miｒ-488-3p结合位点预测图。
28.图4为linc00376与miｒ-488-3p结合的荧光素酶实验。
29.图5为转化linc00376分子以及miｒ-488-3p的hepg2细胞的增殖分析。
30.图6为转化linc00376分子的干扰sirna以及miｒ-488-3p的抑制剂的hepg2细胞的增殖分析。
具体实施方式
31.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
32.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
33.实施例1 hcc细胞系hepg2的培养及计数人hcc细胞系hepg2为本科室保存。培养条件为：将细胞加入含10％胎牛血清（fbs）的rpmi1640培养基，置于5％co2、37℃恒温培养箱中培养。
34.细胞计数操作为：将安全柜的紫外灯提前打开照射30min进行消毒。观察细胞处于状态良好的对数生长期，收集细胞并加入1ml培养基，轻柔地进行吹打混匀，在新的ep管（1.5ml管）中加入10
µ
l台盼蓝染液，再向此ep管中加细胞悬液10
µ
l，吹打混匀，立即取10
µ
l混合液添加至计数板，最后使用自动化细胞计数仪检测计数。操作重复3次后取平均值。
35.其中培养的细胞系hepg2经台盼蓝染色后如图1所示。
36.实施例2 细胞系hepg2与癌旁组织中的长链非编码rna linc00376的表达
用trizol法分别提取制备细胞系hepg2与癌旁组织总rna。takara primescript试剂盒(takara，大连，中国)逆转录制备cdna。采用相对量法与内参gapdh进行目的基因linc00376相对表达量的分析。
37.其中，扩增基因linc00376的引物序列为：上游引物：5
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acaattagac tccaccaa3’， 如seq id no:2所示;下游引物：5
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tttatatccctaaaaagg 3’， 如seq id no:3所示。
38.内参基因gapdh的扩增引物序列为：上游引物：5
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gtcagccgcatcttcttttg-3’， 如seq id no:4所示；下游引物：5
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gcgcccaatacgaccaaatc-3’， 如seq id no:5所示。
39.采用 sybr green realtime pcr master mix试剂盒说明书进行 real time pcr。先配制 20μl反应体系：上游特异性 pcr引物 1μl，下游特异性 pcr引物 1μl，cdna模板 2μl，sybr green real time pcr master mix 10μl rnase-freeh2o 6μl。
40.反应条件：94℃，30s变性；94℃，15s；58℃，60秒，反应35个循环。
41.细胞系hepg2和癌旁组织中的linc00376的表达的rt-pcr结果参见图2。可见，在细胞系hepg2中linc00376的表达比癌旁组织中偏高。
42.实施例3 linc00376作用靶标的预测及验证采用miｒbase 预测miｒ-488-3p 的潜在靶基因，其中，miｒ-488-3p的序列为5
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uugaaaggcuauuuucuugguc 3’，如seq id no:6所示。结果显示，linc00376的区域存在与miｒ-488-3p形成互补结合的位点( 图3) 。
43.对linc00376中的结合位点部分进行核苷酸的突变（图3），进行荧光素酶报告基因实验。pmir-rb-report
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双荧光素酶报告载体，所用载体的报告荧光为海肾萤光素酶基因（hrluc），校正荧光为萤火虫萤光素酶基因（hluc），将野生型以及突变型的linc00376基因序列克隆至 hrluc 基因下游，mirna 是通过区作用于靶基因，因此将 mirna 与构建好的报告基因载体共转，通过报告基因相对荧光值的下调来印证 mirna 与靶基因的相互作用。
44.构建pmiｒ
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linc00376-wt（表达野生型linc00376） 和pmiｒ
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linc00376-mut（表达突变型linc00376）质粒转化t24细胞，并进一步转化miｒ-488-3p 模拟物以及空载体mir-nc作为对照，转染 48h 后吸出培养基，并加入 luciferasereagent 35μl/孔，振荡 10min，转移至 lumitrac
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200 96 孔白色细胞培养板中，测定荧光值。结果发现miｒ-488-3p可明显抑制野生型的pmiｒ
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linc00376-wt细胞，而对pmiｒ
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linc00376-mut抑制荧光素酶活性无明显影响( 图4) 。表明linc00376分子作用的下游靶标分子可能是miｒ-488-3p。
45.实施例4 转化linc00376分子以及miｒ-488-3p的hepg2细胞的增殖分析分别将构建表达linc00376的质粒分子pcdna-linc00376、空载体以及miｒ-488-3p转化hepg2细胞，以及同时转化质粒分子pcdna-linc00376以及miｒ-488-3p进行细胞增殖实验，在6孔板内培养9天，每三天更换一次培养液，采台盼蓝染色后计数。其中，以原始培养的hepg2细胞计数为1，转化相应载体的细胞计数后与hepg2空白细胞进行比较。计数结果参见图5。当我们在细胞中通过过表达linc00376分子以及miｒ-488-3p后，hepg2细胞系的增殖能力受到明显提升。
46.实施例5 转化linc00376分子的干扰sirna以及miｒ-488-3p的抑制剂的hepg2细
胞的增殖分析根据linc00376分子的序列设计对应的sirna，其序列为:5
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gcuucauucu ugaagucagu3’， 如seq id no:7所示。设计miｒ-488-3p的抑制剂分子，其序列为5’gaccaagaaaauagccuuucaa 3’， 如seq id no:8所示，并对所述序列的碱基进行2
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o-甲基修饰。将linc00376分子的sirna以及miｒ-488-3p的抑制剂分子分别转化hepg2细胞，进行细胞增殖实验，在6孔板内培养9天，每三天更换一次培养液，采台盼蓝染色后计数。其中，以原始培养的hepg2细胞计数为1，转化相应载体的细胞计数后与hepg2空白细胞进行比较。计数结果参见图6。当我们在细胞中通过干扰以及抑制剂沉默linc00376分子以及miｒ-488-3p的表达后，hepg2细胞系的增殖能力受到明显下调。
47.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。