1.本公开涉及阿司匹林(aspirin)化合物在促进外源核酸递送和/或表达中的用途。
背景技术：
：：2.多年来，遗传病症和基因相关疾病一直是导致高死亡率和生活质量下降的原因。一些先天性异常表现得很早，并且这些儿童的生存希望很小，这给他们的家庭带来了很大的痛苦，因为治疗选择有限，而且他们几乎没有办法改变此类疾病。基因疗法是一种新型的分子医学形式，其涉及将全功能外源基因转导到个体的细胞或组织中，以替代有缺陷的基因并改变遗传性疾病。基因疗法有可能纠正如血友病、家族性高胆固醇血症、帕金森氏病(parkinson′sdisease)和阿尔茨海默氏病(alzheimer′sdisease)等遗传病症。3.基因疗法虽然有其优点，但也存在如表达水平低、表达时间短等缺点。因此，需要克服现有外源基因转导技术(尤其是病毒转导技术，更优选地aav转导技术)存在的问题，并提供一种用于促进外源基因表达的方法。技术实现要素：4.一方面，本公开提供了一种对细胞进行预备以递送外源核酸的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。5.一方面，本公开提供了一种在细胞中表达外源核酸的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述细胞已经或正在同时施用阿司匹林化合物，并且其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。6.一方面，本公开提供了一种在细胞中表达外源核酸的方法，所述方法包括：a)向所述细胞施用阿司匹林化合物；以及b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。7.一方面，本公开提供了一种增加细胞中的外源核酸的表达水平的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下，在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此增加所述外源核酸的所述表达水平，相比于未施以所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达水平而言。8.一方面，本公开提供了一种增加细胞中的外源核酸的表达水平的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述细胞已经或正在同时施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此增加所述外源核酸的所述表达水平，相比于未施以所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达水平而言。9.一方面，本公开提供了一种增加细胞中的外源核酸的表达水平的方法，所述方法包括：a)向所述细胞施用阿司匹林化合物；以及b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且其中与在不经过所述步骤a)的对照细胞中获得的对照表达水平相比，所述外源核酸的所述表达水平增加。10.一方面，本公开提供了一种延长细胞中的外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且其中与在未施用所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达持续时间相比，所述细胞中的所述外源核酸的所述表达持续时间增加。11.一方面，本公开提供了一种延长细胞中的外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述细胞已经或正在同时施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且其中与在未施用所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达持续时间相比，所述细胞中的所述外源核酸的所述表达持续时间增加。12.一方面，本公开提供了一种延长细胞中的外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：a)向所述细胞施用阿司匹林化合物；以及b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此延长所述外源核酸的所述表达持续时间，相比于未施用所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达持续时间而言。13.在一些实施例中，所述细胞在体外、离体或体内。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述细胞施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前向所述细胞施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，以足以使所述细胞或所述受试者中的所述外源核酸的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的量施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，所述表达水平基于mrna水平或蛋白质水平。在一些实施例中，所述表达水平增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％。在一些实施例中，所述表达水平是在所述外源核酸的表达持续时间内确定的。在一些实施例中，所述表达持续时间是所述外源核酸以可检测水平或以生理学上有效的水平表达的时间段。在一些实施例中，所述表达持续时间延长至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。14.在一些实施例中，所述外源核酸包含双链dna，并且其中所述双链dna包含双链dna病毒载体、双链质粒或双链人工染色体。在一些实施例中，所述外源核酸可以在递送到细胞或受试者之后转化为双链dna，并且其中所述外源核酸包含单链dna、逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施例中，所述外源核酸包含病毒载体(例如，腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体)、质粒或外泌体或包括在所述病毒载体、质粒或外泌体内。在一些实施例中，所述病毒载体包含腺相关病毒(aav)载体。在一些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒。在一些实施例中，所述aav载体包含编码衣壳蛋白的cap基因。在一些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含天然或重组衣壳蛋白。在一些实施例中，所述衣壳蛋白可以是经修饰的或嵌合的或合成的。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白源自两种或更多种aav血清型。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白可以具有特定的向性特性。15.在一些实施例中，所述外源核酸包含编码序列，所述编码序列编码感兴趣的蛋白质或其一部分，或编码功能性rna或其一部分。在一些实施例中，所述感兴趣的蛋白质包含治疗蛋白、免疫原性蛋白、报告蛋白、核酸酶或治疗靶蛋白，和/或所述功能性rna包含反义寡核苷酸、核酶、影响剪接体介导/原始剪接的rna、干扰rna(rnai)或其它非翻译功能性rna，如向导rna和单向导rna。在一些实施例中，所述外源核酸在适于表达的条件下被递送到受试者或细胞。在一些实施例中，所述编码序列与一个或多个调节序列可操作地连接。16.另一方面，本公开提供了一种对患有可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状的受试者进行预备的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或与同时向所述受试者施用有效量的阿司匹林化合物，其中本公开的所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna。17.另一方面，本公开提供了一种治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：向所述受试者递送治疗有效量的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna，并且其中所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物。18.另一方面，本公开提供了一种治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用有效量的阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送治疗有效量的所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。19.在一些实施例中，所述病状的特征在于缺乏一种或多种功能性基因或功能性蛋白。在一些实施例中，所述病状是单基因病症。在一些实施例中，所述单基因病症是常染色体显性、常染色体隐性、x连锁、y连锁或线粒体的。20.在某些实施例中，所述可治疗的病状是cns病症。在某些实施例中，所述cns病症选自由以下组成的组：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、ii型粘多糖贮积症、iiia型粘多糖贮积症、iiib型粘多糖贮积症、亨廷顿氏病(huntingtondisease)、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、巴藤病(battendisease)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、卡纳万病(canavandisease)和弗里德赖希氏共济失调(friedreich'sataxia)。21.在某些实施例中，所述外源核酸包含编码感兴趣的蛋白质或其一部分的序列，其中所述感兴趣的蛋白质选自由以下组成的组：tau、mecp2、ngf、apoe、gdnf、sumf、sgsh、aadc、cd、p53、arsa芳基硫酸酯酶a、abcd1、smn1、naglu、sod1、c9orf72、tardbp、fus、htt、lrrk2、paris、parkin、gad和α-突触核蛋白。在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体，任选地包含aav病毒颗粒。在某些实施例中，所述外源核酸包含aav9血清型的aav载体(例如，aav9血清型的aav病毒颗粒)。在一些实施例中，所述治疗有效量在106vg/kg到1014vg/kg(载体基因组/kg)的范围内。在某些实施例中，治疗有效量不超过1014vg/kg(例如，不超过1013vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1011vg/kg或甚至更低)。22.在某些实施例中，所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸通过全身施用(例如，静脉内、肌肉内、皮下施用)，或通过实质内、脑室内或鞘内途径施用。23.在一些实施例中，所述治疗有效量是亚治疗量。24.另一方面，本公开提供了一种减少受试者的副作用或提高对外源核酸的耐受性的方法，所述方法包括：向所述受试者递送亚治疗量的用于治疗或预防病状的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna，并且其中所述受试者已经或正在同时施用有效量的阿司匹林化合物。25.另一方面，本公开提供了一种减少受试者的副作用或提高对外源核酸的耐受性的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用有效量的阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送亚治疗量的用于治疗或预防病状的所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。26.在一些实施例中，所述副作用对递送到所述受试者的所述外源核酸是剂量依赖性的。27.在一些实施例中，所述亚治疗量不超过90％、不超过80％、不超过70％、不超过60％、不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的常规量的相同外源核酸，所述常规量是在不施用所述阿司匹林化合物的情况下将需要的。28.在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体，任选地包含aav病毒颗粒。在一些实施例中，所述aav载体或所述aav病毒颗粒的所述亚治疗量不超过107vg/kg(载体基因组/kg)、不超过108vg/kg、不超过109vg/kg、不超过1010vg/kg、不超过1011vg/kg、不超过1012vg/kg、不超过1013vg/kg或不超过1014vg/kg。29.在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是以不超过30mg/kg、不超过50mg/kg、不超过100mg/kg、不超过110mg/kg、不超过120mg/kg、不超过120mg/kg、不超过130mg/kg、不超过140mg/kg、不超过150mg/kg、不超过160mg/kg、不超过170mg/kg、不超过180mg/kg、不超过190mg/kg或不超过200mg/kg的量向所述受试者施用的。30.在一些实施例中，在将所述外源核酸递送到所述受试者之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述受试者施用所述阿司匹林化合物，和/或在递送所述核酸之前施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)。在一些实施例中，通过肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径向所述受试者施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸。31.在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含亚治疗量的外源核酸以及药学上可接受的载体，任选地进一步包含阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。32.在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含外源核酸、阿司匹林化合物和药学上可接受的载体，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。33.在一些实施例中，本公开的药物组合物进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述阿司匹林化合物要在施用所述药物组合物之前施用或与施用所述药物组合物同时施用。34.在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体，任选地包含aav病毒颗粒。在一些实施例中，所述药物组合物呈单位剂量，并且含有不超过1010vg、1010.5vg、1011vg、1011.5vg、1012vg、1012.5vg、1013vg、1013.5vg、1014vg、1014.5vg、1015vg、1015.5vg或1016vg的aav病毒颗粒。35.在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：a)第一组合物，所述第一组合物包含阿司匹林化合物；以及b)第二组合物，所述第二组合物包含外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。36.在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述第一组合物要在所述第二组合物之前施用或与所述第二组合物同时施用。在一些实施例中，所述第一组合物和所述第二组合物可以在使用之前容易地混合以提供组合的组合物。在一些实施例中，所述第二组合物包含亚治疗量的所述外源核酸。37.在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含阿司匹林化合物和外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。38.在又另外的方面，本公开提供了一种组合物，其包含：阿司匹林化合物和外源核酸的组合，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。39.前述概述仅是说明性的，并且并不旨在以任何方式进行限制。除了上文描述的说明性方面、实施例和特征之外，通过参考附图和以下详细说明，另外的方面、实施例和特征将变得明显。附图说明40.图1示出了aav介导的荧光素酶基因在用不同浓度的阿司匹林治疗的小鼠中的表达。41.图2示出了通过不同浓度的阿司匹林治疗，aav注射后3天的ifn-α水平。42.图3a-3c示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav8(图3a)、aav9(图3b)和aav843(图3c)之后荧光素酶的表达水平。43.图4a-4b示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav8之后的ifn-α(图4a)和ifn-β(图4b)水平。44.图5a-5b示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav9之后的ifn-α(图5a)和ifn-β(图5b)水平。45.图6a-6b示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav843之后的ifn-α(图6a)和ifn-β(图6b)水平。46.图7a-7d示出了在预先注射阿司匹林，或同时注射阿司匹林，或不注射阿司匹林的接受aav9-cb-gluc的小鼠脑组织或肝组织中gluc的mrna水平(图7a、7c)和酶活性水平(图7b、7d)。47.图8示出了在mpsii小鼠中以3×1013vg/kg或1×1014vg/kg或3×1013vg/kg的aav9-cb-ids载体治疗并结合50mg/kg的阿司匹林预治疗之后，脑中的ids酶活性。48.图9示出了本公开中公开的所有序列。具体实施方式49.在以下详细描述中，参考了附图，所述附图形成详细描述的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号通常标识类似组件。在详细说明、附图以及权利要求中所描述的说明性实施例并不旨在是限制性的。在不脱离此处呈现的主题精神或范围的情况下，可以利用其它实施例，并且可以做出其它改变。50.应理解，为清楚起见而在单独实施例的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见而在单个实施例的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。为了说明，如果本文所公开的一个具体实施例包含组分a、b和c，应当理解，本公开还旨在包含单独含有a、b或c，或a、b或c的任何组合的实施例。51.除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。52.本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入本文。53.如本文所用，“一/一个(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以意指单个细胞或多个细胞。54.如本文所用，除非另有明确说明，否则词语“或”以“和/或”的包含性意义而不是“任一/或”的排他性意义使用。55.除非另有明确说明，否则本文所描述的数字范围可以包含所述范围和每个子范围内的每个数字。56.如本文所用，术语“约”在提及如剂量、时间、温度、活性或其它生物活性等可测量值时，意在涵盖所指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。57.本发明至少部分地基于以下发现：在递送外源核酸之前或同时向细胞或受试者施用阿司匹林化合物可以显著增加外源核酸在细胞中或在受试者中的表达。58.另一方面，本公开提供了增加外源核酸在细胞或在受试者中的表达水平或延长其表达持续时间的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞或所述受试者之前或同时向所述细胞或所述受试者施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此增加或延长所述外源核酸的所述表达水平或所述表达持续时间，分别相比于在未施以所述阿司匹林化合物的情况下获得的对照表达水平或对照表达持续时间而言。59.另一方面，本公开提供了表达细胞或受试者中的外源核酸或增加外源核酸的表达水平或延长外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞或所述受试者，其中所述细胞或所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物；并且其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中或所述受试者中转化为双链dna。60.另一方面，本公开提供了表达细胞或受试者中的外源核酸或增加外源核酸的表达或延长外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：61.a)向所述细胞或所述受试者施用阿司匹林化合物；以及62.b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞或所述受试者，63.其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中或所述受试者中转化为双链dna。64.一方面，本公开提供了对细胞进行预备以递送外源核酸的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。65.另一方面，本公开提供了对患有可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状的受试者进行预备的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述受试者施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna。66.另一方面，本公开提供了治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna，并且其中所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物。67.另一方面，本公开提供了治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna。68.如本文所用，术语“阿司匹林化合物”包含阿司匹林、其类似物和衍生物。阿司匹林也被称为乙酰水杨酸，并且其化学结构如下所示：69.阿司匹林的衍生物包含但不限于阿司匹林的盐(例如，药学上可接受的盐)、酯、溶剂化物和前药，它们可以提供乙酰水杨酸或其任何活性形式，例如，在体内通过水解或代谢过程之后。阿司匹林的示例性盐包含但不限于阿司匹林-精氨酸(其是由l-精氨酸和乙酰水杨酸形成的复盐，也称为精氨酸阿司匹林)、乙酰水杨酸锂(例如，)、乙酰水杨酸钠(例如，)、乙酰水杨酸钙(例如，)、乙酰水杨酸钙(例如，)、乙酰水杨酸钙(例如，)和乙酰水杨酸镁(例如，)。阿司匹林的示例性酯包含但不限于乙酰水杨酸的乙醇酰胺、乙醇酸酯、(酰氧基)甲基酯、烷基酯和芳基酯。70.阿司匹林的类似物是作为阿司匹林的功能等效物的化合物，但没有阿司匹林的化学结构，并且不是阿司匹林的衍生物。与阿司匹林相比，阿司匹林的类似物可以具有相似(尽管不相同)的结构，并且还共享与如本文所提供的阿司匹林相同的生物活性。71.外源核酸72.如本文所用，术语“外源核酸”是要递送到细胞或受试者的核酸。外源核酸可以是线性的或环状的，并且可以呈裸核酸的形式或可以呈包装形式，如病毒颗粒。外源核酸可以包含在细胞或受试者中非天然存在的序列。外源核酸包含双链dna，或者可以在将外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。73.在某些实施例中，所述外源核酸包含双链脱氧核糖核酸(dna)。外源核酸可以由其整个长度上的双链dna构成，例如，作为双链dna(dsdna)病毒载体、dsdna病毒颗粒、双链质粒、双链人工染色体或外泌体或双链裸dna。可替代地，外源核酸可以包含部分dsdna，例如，外源核酸可以是在部分序列上具有二级双链结构的单链dna。74.在某些实施例中，所述外源核酸包含不是dsdna，但可以在递送之后在所述细胞中转化为dsdna的核酸。此类核酸的实例包含但不限于单链dna(其可以通过例如dna聚合酶转化为dsdna)和rna(其可以通过逆转录酶逆转录为dsdna)，如逆转录病毒载体、逆转录病毒颗粒、慢病毒载体和慢病毒颗粒。在某些实施例中，此类核酸可以在所述细胞的细胞质中转化为dsdna。75.在某些实施例中，所述外源核酸包含载体。术语“载体”意指用于将核酸克隆和/或转移到细胞中的任何核酸分子(无论是裸的还是包装的)。载体包含用于在体外、离体和/或体内将核酸引入到细胞中的病毒核酸分子和非病毒(例如，质粒、外泌体)核酸分子两者。在一些实施例中，载体可以是重组的，因为其含有一个或多个异源核苷酸序列，如转基因或异源调节序列。76.在某些实施例中，所述外源核酸包含质粒。如本文所用，术语“质粒”是指包括染色体外遗传物质的构建体，通常是可以独立于染色体dna复制的dna的环状双链体。质粒通常用于基因转移，作为可以将dna片段引入到宿主生物体中的媒剂。77.在某些实施例中，所述外源核酸包含病毒载体或包括在病毒载体内。如本文所用，“病毒载体”是指单链或双链的核酸载体，在感兴趣的核酸序列(例如，编码感兴趣的的蛋白质的表达构建体)的5'端和/或3'端处具有5'病毒末端重复序列和/或3'病毒末端重复序列。病毒载体可以包含一对tr或单个tr。术语“末端重复”或“tr”包含形成发夹结构并介导如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救(provirusrescue)等期望的功能的任何病毒末端重复或合成序列。例如，5'病毒末端重复序列和3'病毒末端重复序列可以含有复制原点，并且允许在一个病毒末端重复处进行dna合成启动并继续到另一个病毒末端重复。病毒末端重复的实例包含但不限于反向末端重复(itr)(例如，包含在aav中的那些)、长末端重复(ltr)(例如，包含在逆转录病毒中的那些)等。病毒载体在itr之间可以包含一个或多个与病毒基因组异源的序列。78.如本文所用，病毒载体还可以涵盖由一个或多个含有病毒核酸序列的载体产生的病毒颗粒。如本文所用，“病毒颗粒”意指包装在病毒衣壳内的病毒基因组。病毒颗粒中的病毒基因组可以是经修饰的病毒基因组，使得其可能缺少一些天然病毒序列和/或可能含有与天然病毒基因组异源的一些序列。79.本领域已知多种病毒载体适于将核酸递送到细胞或递送到如人的受试者。最常用的病毒载体包含源自腺病毒、腺相关病毒(aav)和逆转录病毒的那些病毒载体，包含慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(hiv)。逆转录病毒载体、腺病毒和aav提供了一种在哺乳动物细胞中有效引入和表达外源基因的有效且有用的方法。这些载体具有广泛的宿主和细胞类型范围，并且稳定且有效地表达基因。这些载体的安全性已经为本领域所理解。可以用于将基因转移到受试者中的其它病毒载体包含疱疹病毒乳多空病毒，如jc、sv40、多瘤病毒；爱泼斯坦巴尔病毒(epstein-barrvirus，ebv)；乳头瘤病毒，例如牛乳头瘤病毒i型(bpv)；脊髓灰质炎病毒和其它人类和动物病毒。80.在某些实施例中，所述外源核酸包含aav载体。aav是基因组大小为约4.7kb的单链人dna细小病毒。aav基因组含有两个主要基因：rep基因，其编码rep蛋白(rep76、rep68、rep52和rep40)；以及cap基因，其编码aav结构蛋白(vp-1、vp-2和vp-3)，侧接有5′反向末端重复(itr)和3′itr。如本文所用，术语“aav载体”涵盖包含一个或多个侧接至少一个或两个aav反向末端重复序列的异源序列的任何病毒载体。如本领域中被充分理解的，术语“aavitr”是存在于天然单链aav基因组的两个末端处的大约145个核苷酸的序列。itr最外层的125个核苷酸可以以两种替代性朝向中的任一种存在，从而产生不同aav基因组之间和单个aav基因组的两端之间的异质性。最外层的125个核苷酸还含有若干个较短的自互补区域，允许在itr的此部分内发生链内碱基配对。81.aavitr可以源自任何aav，包含但不限于aav血清型1(aav1)、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、禽类aav、牛类aav、犬类aav、马类aav和羊类aav以及现在已知或以后发现的任何其它aav。关于详细信息，请参见例如bernardnf等人,《病毒学(virology)》,第2卷,第69章(第4版,利平科特-雷文出版社(lippincott-ravenpublishers))，gao等人,(2004)《病毒学杂志(j.virol.)》78:6381-6388。aavitr区的核苷酸序列是已知的。参见例如kotin,r.m.(1994)《人类基因疗法(humangenetherapy)》5:793-801；berns,k.i.“细小病毒科及其复制(parvoviridaeandtheirreplication)”《基础病毒学(fundamentalvirology)》,第2版,(b.n.fields和d.m.knipe,编辑)。以下提供了aav1、aav2和aav3末端重复序列的早期描述：xiao,x.,(1996),“对腺相关病毒(aav)dna复制和整合的表征(characterizationofadeno-associatedvirus(aav)dnareplicationandintegration)”,博士论文,宾夕法尼亚州匹兹堡，匹兹堡大学(universityofpittsburgh,pittsburgh,pa)。(其全部内容并入本文)。82.aavitr可以是天然aavitr，或者可替代地可以从天然aavitr改变，例如通过突变、缺失或插入，只要改变的itr仍然可以介导期望的生物学功能，如复制、病毒包装、整合等。侧接aav载体中的选定核苷酸序列的5'和3'itr不必相同或源自相同的aav血清型，只要它们按预期发挥作用，例如，允许感兴趣的序列的切除和拯救以及整合到受体细胞基因组中。83.aav的基因组序列以及aavrep基因和cap基因是本领域已知的，可以在文献和公共数据库如基因库数据库(genbankdatabase)中找到。下表1示出了aav基因组或aav衣壳序列的一些示例性序列，并且更多内容在bernardnf等人,《病毒学》,第2卷,第69章(第4版,利平科特-雷文出版社)；gao等人,(2004)《病毒学杂志》78:6381-6388；nasomf等人,《生物制药(biodrugs)》.2017；31(4):317-334中进行了综述。84.表1.[0085][0086]在一些实施例中，所述aav载体可以是重组的。重组aav载体可以包含一个或多个不同病毒来源的异源序列(例如，来自非aav病毒，或来自不同血清型的aav，或来自部分或完全合成的序列)。在某些实施例中，所述异源序列侧接至少一个aavitr。[0087]在某些实施例中，本文提供的aav载体具有适于包装到aav病毒颗粒中的大小。例如，aav载体的大小可以达到要使用的aav的基因组大小的大小限制，例如，达到5.2kb。在某些实施例中，所述aav载体的大小不超过5.2千碱基(kb)、不超过约5kb、不超过约4.5kb、不超过约4kb、不超过约3.5kb、不超过约3kb，大小不超过约2.5kb，参见例如dong,j.y.等人(1996年11月10日)。[0088]由于单个aav的包装大小限制，对于超出单个aav载体的包装能力的异源序列，可以以允许在与这些aav载体共转染的细胞中重建为完整序列或表达盒的方式构建两个或更多个aav载体。本领域已知用于构建此类aav载体，例如用于构建重叠双载体、反式剪接载体对、杂合载体系统的方法，并且更多详细信息可在chamberlaink等人,《人类基因疗法方法(humgenethermethods)》.2016年2月1日；27(1):1–12，以及美国专利第6,596,535号中获得。[0089]aav载体可以使用本领域已知的方法构建。raav载体构建的一般原理是本领域已知的。参见例如，carter,1992,《生物技术当前述评(currentopinioninbiotechnology)》,3:533-539；和muzyczka,1992,《微生物学和免疫学当前论题(curr.top.microbiol.immunol.)》,158:97-129。例如，异源序列可以直接插入aav基因组的itr之间，其中rep基因和/或cap基因已缺失。只要保留足够的itr部分以允许复制和包装功能，aav基因组的其它部分也可以是缺失的。可以使用本领域众所周知的技术来设计此类构建体。参见例如，美国专利第5,173,414号和第5,139,941号；国际公开号第wo92/01070号(1992年1月23日出版)和wo93/03769(1993年3月4日出版)；lebkowski等人(1988)《分子和细胞生物学(molec.cell.biol.)》8:3988-3996；vincent等人(1990)《疫苗(vaccines)》90(冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress))；carter,b.j.(1992)《生物技术当前述评》3:533-539；muzyczka,n.(1992)《微生物学和免疫学当前论题》158:97-129；kotin,r.m.(1994)《人类基因疗法》5:793-801；shelling和smith(1994)《基因疗法(genetherapy)》1:165-169；以及zhou等人(1994)《实验医学杂志(j.exp.med.)》179:1867-1875。[0090]可替代地，aavitr可以从病毒基因组或从含有所述病毒基因组的aav载体中切除，并且使用如在上述sambrook等人中所描述的那些标准连接技术，融合到与异源序列的5'和3'。含有aavitr的aav载体可商购获得，并且已在例如美国专利第5,139,941号中进行了描述。[0091]在某些实施例中，所述aav载体包含重组aav病毒颗粒。aav病毒颗粒可以由aav表达载体产生。aav颗粒可以通过使用已知技术，如通过转染将aav表达载体连同如编码aavcap/rep基因的质粒和由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助基因等其它必要的机制一起引入到合适的宿主细胞中来产生(参见例如，m.f.naso等人,《生物制药》,31(4):317-334(2017)，其全部内容并入本文)。aav表达载体可以在宿主细胞中表达并包装到病毒颗粒中。[0092]在一些实施例中，所述aav载体进一步包含编码衣壳蛋白的cap基因。在一些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含天然或重组衣壳蛋白。在一些实施例中，所述衣壳蛋白可以是经修饰的或嵌合的或合成的。经修饰的衣壳可以包含如插入、添加、缺失或突变等修饰。例如，经修饰的衣壳可以并入检测或纯化标签。嵌合衣壳包含两个或更多个衣壳序列的部分。合成衣壳包含合成或人工设计的序列。aav的衣壳结构也是本领域中已知的并且在上述bernardnf等人中进行了更详细的描述。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白源自两种或更多种aav血清型。如本文所用，关于aav的术语“血清型”是指衣壳蛋白与定义的抗血清的反应性。本领域已知各种aav血清型在功能上和结构上是相关的，甚至在遗传水平上也是如此(参见例如，blacklow,“细小病毒和人类疾病(parvovirusesandhumandisease)”的第165-174页j.r.pattison编辑.(1988)；以及rose,《综合病毒学(comprehensivevirology)》3:1,1974)。然而，不同血清型的aav病毒颗粒可以具有不同的组织向性(详细信息参见，nonnenmacherm等人,《基因疗法》，2012年6月；19(6):649–658)，并且可以适当地选择用于靶组织的基因疗法。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白可以具有特定的向性特性。术语“向性特性”是指一种或多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。例如，衣壳蛋白可以具有对肝脏(例如，肝细胞)、脑、眼、肌肉、肺、肾、肠、胰腺、唾液腺或滑膜或任何其它合适的细胞、组织或器官具有特异性的向性特性。[0093]在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白源自任何合适的aav衣壳基因或蛋白，例如但不限于源自以下的aav衣壳基因或蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav12、aav843、aavbb2、aavcys、aavrh10、aavrh20、aavrh39、aavrh43、aavrh64、aavhu37、aav3b、aavhu48、aavhu43、aavhu44、aavhu46、aavhu19、aavhu20、aavhu23、aavhu22、aavhu24、aavhu21、aavhu27、aavhu28、aavhu29、aavhu63、aavhu64、aavhu13、aavhu56、aavhu57、aavhu49、aavhu58、aavhu34、aavhu45、aavhu47、aavhu51、aavhu52、aavhut41、aavhus17、aavhut88、aavhut71、aavhut70、aavhut40、aavhut32、aavhut17、aavhulg15、aavhu9、aavhu10、aavhu11、aavhu53、aavhu55、aavhu54、aavhu7、aavhu18、aavhu15、aavhu16、aavhu25、aavhu60、aavch5、aavhu3、aavhu1、aavhu4、aavhu2、aavhu61、aavrh62、aavrh48、aavrh54、aavrh55、aavcy2、aavrh35、aavrh37、aavrh36、aavcy6、aavcy4、aavcy3、aavcy5、aavrh13、aavrh38、aavhu66、aavhu42、aavhu67、aavhu40、aavhu41、aavrh40、aavrh2、aavbb1、aavhu17、aavhu6、aavrh25、aavpi2、aavpi3、aavrh57、aavrh50、aavrh49、aavhu39、aavrh58、aavrh61、aavrh52、aavrh53、aavrh51、aavhu14、aavhu31、aavhu32、aavrh34、aavrh33、aavrh32、禽类aavatccvr-865、禽类aav菌株da-1或牛类aav。[0094]aav843的衣壳与wo2019241324a1(其全部内容并入本文)中公开的合成衣壳aavxl32相同，并且aav843也公开于例如xuj.等人,《国际临床与实验医学杂志(intjclinexpmed)》,2019；12(8):10253-10261中。在某些实施例中，aav843的衣壳蛋白具有seqidno:10的氨基酸序列。在某些实施例中，编码aav843的衣壳蛋白的衣壳基因具有与seqidno:6至少90％、92％、95％、97％或98％相同或者作为具有简并密码子取代的seqidno:6的变体的核酸序列。简并密码子取代，也称为同义核苷酸取代，可以通过产生一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置由混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列实现。[0095]在某些实施例中，aav8的衣壳蛋白具有seqidno:8的氨基酸序列。在某些实施例中，编码aav8的衣壳蛋白的衣壳蛋白的衣壳基因具有与seqidno:4至少90％或95％相同，或者作为具有简并密码子取代的seqidno:4的变体的核酸序列。[0096]在某些实施例中，aav9的衣壳蛋白具有seqidno:9的氨基酸序列。在某些实施例中，编码aav9的衣壳蛋白的衣壳基因具有与seqidno:5至少90％或95％相同，或者作为具有简并密码子取代的seqidno:5的变体的核酸序列。[0097]aav衣壳基因序列和蛋白质序列的更多实例可以在基因库数据库中找到，参见基因库登录号：af043303、af028705、af028704、j02275、j01901、j02275、x01457、af288061、ah009962、ay028226、ay028223、nc001358、nc001540、af513851、af513852、ay530579、ay631965、ay631966；af063497、af085716、af513852、ay530579、aas99264.1、ay243022、ay243015、ay530560、ay530600、ay530611、ay530628、ay530553、ay530606、ay530583、ay530555、ay530607、ay530580、ay530569、nc006263、nc005889、nc001862、ay530609、ay530581、ay530563、ay530591、ay530562、ay530584、ay530622、ay530601、ay530586、ay243021、ay530570、ay530589、ay530595、ay530572、ay530588、ay530575、ay530565、ay530590、ay530602、ay530566、ay530587、ay530585、ay530564、ay530592、ay530623、ay530574、ay530593、ay530560、ay530594、ay530573、af513852、ay530624、ay530561、ay242997、ay530625、ay530567、ay530556、ay530578、ay530568、ay530618、ay243020、ay530579、ay530619、ay530596、ay530612、ay243000、ay530597、ay530620、ay242998、ay530598、ay242999、ay530599、ay243016、nc001729、nc001401、ay243018、nc001863、ay530608、ay243019、nc001829、ay530610、ay243017、ay243001、ay530613、ay243013、ay243002、ay530614、ay243003、ay695378、ay530558、ay530626、ay695376、ay695375、ay530605、ay695374、ay530603、ay530627、ay695373、ay695372、ay530604、ay695371、ay530600、ay695370、ay530559、ay695377、ay243007、ay243023、ay186198、ay629583、nc004828、ay530629、ay530576、ay243015、ay388617、ay530577、ay530582、ay530615、ay530621、ay530617、ay530557、ay530616或ay530554。[0098]在某些实施例中，所述aav载体包含来自一种aav血清型的cap基因和来自第二种血清型的aavitr。在某些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含假型化(pseudotyped)aav。“假型化”aav是指含有来自一种血清型的衣壳蛋白和包含第二种血清型的5'-3'itr的病毒基因组的aav。假型化aav将预期具有衣壳蛋白来源的血清型的细胞表面结合特性，以及与itr来源的血清型一致的遗传特性。[0099]在某些实施例中，所述外源核酸包含腺病毒载体。腺病毒具有不能整合到宿主基因组中的双链线性dna基因组。腺病毒载体的说明性实例包含但不限于第一代腺载体(例如，缺失了e1a基因和e1b基因的腺载体，以及缺失了e1基因和e3基因的腺载体)、第二代腺病毒载体(例如，缺失了e1基因和e2基因的腺载体、缺失了e1基因和e4基因的腺载体)和其中缺失了所有病毒编码序列的无肠腺病毒载体(也被称为辅助依赖性腺病毒载体)。[0100]在某些实施例中，所述外源核酸包含逆转录病毒载体。逆转录病毒具有rna基因组并且可以通过逆转录酶在宿主细胞中复制，以从rna基因组产生dna。逆转录病毒载体的说明性实例包含但不限于源自以下的载体：禽白血病病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、牛白血病病毒、大眼鲈皮肤肉瘤病毒(walleyedermalsarcomavirus)、hiv-1(人类免疫缺陷病毒)、hiv-2、siv(猿猴免疫缺陷病毒)、eiav(马传染性贫血病毒)、fiv(猫免疫缺陷病毒)、caev(山羊关节炎脑炎病毒)、vmv(维斯纳/梅迪病毒(visna/maedivirus))、人类泡沫病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukaemiavirus)、劳氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)、猫白血病病毒、人类t淋巴细胞病毒和猿猴泡沫病毒。[0101]在某些实施例中，所述外源核酸包含慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有具有调节或结构功能的其它基因。慢病毒载体的说明性实例包含但不限于源自hiv-1、siv、fiv、caev、vmv和eiav的载体。[0102]在某些实施例中，所述外源核酸可以包含编码感兴趣的蛋白质或其一部分的编码序列。在一些实施例中，可以将所述感兴趣的蛋白质的所述编码序列划分或拆分为两个或更多个外源核酸序列(例如，两个或更多个质粒，或两个或更多个病毒颗粒)，其方式为允许所述划分的编码序列在递送到所述细胞之后(例如，通过同源重组或通过某些病毒包装过程)接合在一起。这将允许其长度超过载体(如aav载体或质粒)的递送能力的编码序列被递送和表达。[0103]感兴趣的蛋白质可以是其在细胞中或在受试者中的表达是感兴趣的任何蛋白质。在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是治疗蛋白(例如，用于医学用途或兽医用途)、免疫原性蛋白(例如，用于疫苗)、报告蛋白、核酸酶或治疗靶蛋白。[0104]治疗蛋白可以在体外表达以提供治疗组合物以递送到有需要的受试者，或者可以在体内表达以提供治疗益处。此类治疗蛋白的实例包含但不限于抗体(例如，单克隆或双特异性或多特异性)、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、肽激素、生长因子、促红细胞生成素(epo)、细胞因子、凝血因子、抗血友病因子、干扰素、fc融合蛋白(如ctla-4fc融合蛋白、vegfrfc融合蛋白)、治疗酶(例如，溶酶体水解酶和硫酸酯酶)。可替代地，治疗蛋白可以在有需要的受试者体内表达。此类治疗蛋白的实例包含但不限于运动神经元存活基因1(smn1，基因id：6066)、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶(naglu，基因id：4669)、n-磺基葡糖胺磺酰水解酶(sgsh，基因id：6448)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids，基因id：3423)、凝血因子viii(fviii，基因id：2157)、凝血因子ix(fix，基因id：2158)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(brutontyrosinekinase，btk，基因id：695)、atp结合盒d亚家族成员1(abcd1，基因id：215)、酰基-coa脱氢酶极长链(acadvl，基因id：37)、雄激素受体重复不稳定区(ar，基因id：109504725)、血红蛋白亚基β(hbb，基因id：3043)、钠电压门控通道α亚基1(scn1a，基因id：6323)、cf跨膜传导调节因子(cftr，基因id：1080)、集落刺激因子2受体亚基α(csf2ra，基因id：1438)、白介素2受体亚基α(il2ag，基因id：3559)、苯丙氨酸羟化酶(pha，基因id：5053)、丝氨酸/苏氨酸激酶11(stk11，基因id：6794)、磷脂酰肌醇聚糖锚生物合成a类(piga，基因id：5277)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(otc，基因id：5009)、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症(nags，基因id：162417)、dm1蛋白激酶(dmpk，基因id：1760)、cchc型锌指核酸结合蛋白(cnbp，基因id：7555)、酰基-coa脱氢酶中链(acadm，基因id：34)、gnas复合基因座(gnas，基因id：2778)、原纤维蛋白1(fbn1，基因id：2200)、脂肪酶a，溶酶体酸型(lipa，基因id：3988)、溶质载体家族7成员7(slc7a7，基因id：9056)、羟酰基-coa脱氢酶三功能多酶复合物亚基α(hadha，基因id：3030)、生长激素受体(ghr，基因id：2690)、异戊酰基-coa脱氢酶(idv，基因id：3712)、碱性磷酸酶，生物矿化相关(alpl，基因id：249)、溶质载体家族25成员15(slc25a15，基因id：10166)、亨廷顿蛋白(huntingtin，htt，基因id：3064)、羧化全酶合成酶(hcs，基因id：3141)、notch受体3(notch3，基因id：4854)、醛缩酶，果糖二磷酸b(aldob，基因id：229)、atp酶铜转运β(atp7b，基因id：540)、葡萄糖苷酶α，酸(gaa，基因id：2548)、戊二酰基-coa脱氢酶(gcdh，基因id：2639)、溶质载体家族12成员3(slc12a3，基因id：6559)、葡萄糖基神经酰胺酶β(gba，基因id：2629)、家族性地中海热(familialmediterraneanfever，mefv，基因id：4210)、半乳糖苷酶α(gla，基因id：2717)、氯电压门控通道1(clcn1，基因id：1180)、核受体亚家族0组b成员1(nr0b1，基因id：190)、精氨琥珀酸合成酶1(ass1，基因id：445)、溶质载体家族25成员13(slc25a13，基因id：10165)、溶质载体家族22成员5(slc22a5，基因id：84)、钠电压门控通道α亚基5(scn5a，基因id：6331)、生物素酶(btd，基因id：686)、乙酰基-coa乙酰转移酶1(acat1，基因id：38)、精氨酸酶(arg1，基因id：383)、细胞色素p450家族21亚家族a成员2(cyp21a2，基因id：1589)。仍在另一个实施例中，治疗蛋白可以离体表达，例如在要移植到受试者的t细胞上。此类治疗蛋白包含例如嵌合抗原受体(car)。[0105]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是免疫原性蛋白。免疫原性蛋白或免疫原可以是适于保护受试者免于疾病的任何多肽，所述疾病包含但不限于如微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和病毒疾病等传染性疾病以及癌症。例如，免疫原可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，如流感病毒血凝素(ha)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因，或马流感病毒免疫原)，或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(siv)免疫原或人类免疫缺陷病毒(hiv)免疫原，如hiv或siv包膜gp160蛋白、hiv或siv基质/衣壳蛋白，以及hiv或sivgag、pol和env基因产物)。免疫原还可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒(lassafevervirus)免疫原，如拉沙热病毒核衣壳蛋白基因和拉沙热包膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如，牛痘，如牛痘ll或l8基因)、黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒(ebolavirus)免疫原或马尔堡病毒(marburgvirus)免疫原，如np和gp基因)、布尼亚病毒免疫原(例如，rvfv、cchf和sfs病毒)或冠状病毒免疫原(例如，传染性人冠状病毒免疫原，如人冠状病毒包膜糖蛋白基因、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽传染性支气管炎病毒免疫原、或严重急性呼吸系统综合征(sars)免疫原，如s[sl或s2]、m、e或n蛋白或其免疫原性片段或covid-19免疫原)。免疫原可以进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如，cmv、ebv、hsv免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)免疫原或本领域已知的任何其它疫苗免疫原。对于另一个实例，免疫原可以是在肿瘤或癌细胞的表面上表达的肿瘤或癌症抗原。示例性肿瘤或癌症抗原包含但不限于b-连环蛋白、brca1基因产物、brca2基因产物、epcam、egfr、her2、vegfr、cd19、psma等。[0106]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是报告蛋白。报告蛋白可以在细胞中表达以提供用于生物测定的工程化细胞。报告蛋白的实例包含但不限于荧光蛋白(例如，egfp、gfp、rfp、bfp、yfp或dsred2)、产生可检测产物的酶，如荧光素酶(例如，来自高斯公司(gaussia)、海肾公司(renilla)或pho公司)、b-半乳糖苷酶、b-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶和氯霉素乙酰转移酶基因或可以直接检测到的蛋白质。几乎任何蛋白质都可以通过使用例如针对蛋白质的特异性抗体来直接检测。适于真核细胞的阳性或阴性选择的另外的标志物(和相关抗生素)公开于以下中：sambrook和russell(2001),《分子克隆(molecularcloning)》,第3版,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)以及ausubel等人(1992),《当代分子生物学实验指南(currentprotocolsinmolecularbiology)》,约翰威利父子公司(johnwiley&sons)，包含定期更新。[0107]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是核酸酶。如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。本文所提供的核酸酶可以是天然存在的或经修饰的。在本公开中有用的核酸酶的实例包含但不限于锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)或cas家族蛋白(如cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、cas11、cas12、cas13、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、其同源物或其经修饰版本)。此类核酸酶可能在例如宿主基因组中的基因工程或基因编辑中有用。[0108]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是治疗靶蛋白。治疗靶蛋白的实例包含但不限于gpcr、ctla-4、her2、粘连蛋白-4、硬化蛋白、p-选择蛋白、vegf、rsvf、vegfr2、cd79、il23p19、vwf、ifn-γ、c5、pd-1、pd-l1、cgrp、cd3、cd11a、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、ige、klk、ccr4、fgf-23、il-6r、il-5、il-23p19、il-2r、il-17r、il-17、cd4、fix/fx、il-12、il-23、il-1β、il-5r、il-6r、il-4/il-13、pdgf-α、达比加群(dabigatran)、slamf7、egfr、pcsk9、gd2、cd3、cd19、α4β7整合素、α4β1整合素、pa、blys、rank、tnf-α、epcam、ggta1、内皮抑素和血管抑素。治疗靶蛋白在重组细胞中的表达可以在例如产生用于生物测定的重组细胞系，或用于筛选或鉴定能够靶向治疗靶蛋白或与治疗靶蛋白相互作用的潜在治疗剂中有用。[0109]可替代地，在某些实施例中，所述外源核酸可以包含编码功能性rna的编码序列。功能性rna可以是作用于生物靶标核酸序列的非翻译rna并且调节靶标，例如，抑制或降低靶标的表达或活性。例如，功能性rna可以是反义寡核苷酸、核酶(例如，如美国专利第5,877,022号中所描述的)、影响剪接体介导/原始剪接的rna(参见，puttaraju等人,(1999)《自然生物技术(naturebiotech)》.17:246；美国专利第6,013,487号；美国专利第6,083,702号)、包含介导基因沉默的小干扰rna(sirna)的干扰rna(rnai)(参见，sharp等人,(2000)《科学(science)》287:2431)、microrna或其它非翻译功能性rna，如向导rna(gorman等人,(1998)《美国国家科学院院刊(proc.nat.acad.sci.usa)》95:4929；yuan等人的美国专利第5,869,248号)、用于crispr技术的单向导rna(参见例如us10,266,850、us8,697,359、us20160298134、adlim等人,《自然通讯(natcommun)》9,1911(2018))等。功能性rna的潜在生物靶标可以包含但不限于多种药物抗性(mdr)蛋白靶标、肿瘤靶标(例如，vegf、her2、egfr、pd-l1等)、如病毒表面抗原等病原体靶标(例如，乙型肝炎表面抗原基因)、缺陷基因产物(突变的肌营养不良蛋白)或如本文所公开的治疗靶标(例如，肌生长抑制素)。[0110]编码感兴趣的蛋白质或编码功能性rna的编码序列可以与外源核酸中的一个或多个调节序列可操作地连接。如本文所用，术语“可操作地连接”意指编码序列以允许从细胞中的编码序列表达感兴趣的蛋白质的方式与外源核酸中的一个或多个调节序列直接或间接连接或缔合。编码序列连同调节序列一起在本文中可以被称为表达盒。在某些实施例中，外源核酸可以呈表达载体的形式。转录调节元件的实例包含一个或多个启动子和/或增强子，以及任选地聚腺苷酸化序列和/或插入在蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。[0111]如本文所用，术语“调节序列”是指对于编码序列的表达而言必需或有利的任何核苷酸序列。调节序列可以包含但不限于一个或多个启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化序列、内部核糖体进入位点和/或插入在蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。[0112]如本文所用，术语“启动子”是指可以控制编码序列的转录的多核苷酸序列。启动子序列包含对于rna聚合酶识别、结合和转录起始来说足够的特异性序列。另外，启动子序列可以包含调节rna聚合酶的这一识别、结合和转录起始活性的序列。启动子可以影响定位于与其自身相同的核酸分子上的基因或定位于与其自身不同的核酸分子上的基因的转录。取决于调节的性质，启动子序列的功能可以是组成型的或可被刺激诱导的。“组成型”启动子是指用于持续激活宿主细胞中的基因表达的启动子。“诱导型”启动子是指在存在某种或某些刺激的情况下激活宿主细胞中的基因表达的启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子或细胞特异性启动子。如本文所用，术语“组织特异性启动子”是指用于在某种组织中优先地或排他地激活基因表达，并且在其它组织中没有活性或活性降低的启动子。在一个实施例中，所述启动子是cns特异性启动子。cns特异性启动子的实例包含从髓鞘碱性蛋白(mbp)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)和神经元特异性烯醇化酶(nse)、突触蛋白(syn)的基因中分离的启动子。肝脏特异性启动子包含但不限于甲状腺素结合球蛋白(tbg)、载脂蛋白e(apoe)、白蛋白(alb)、α-1抗胰蛋白酶(haat)。肌肉特异性启动子包含但不限于unc-45肌球蛋白分子伴侣b(unc45b)、rieg/pitx同源盒3(pitx3)。[0113]合适的启动子的实例包含但不限于polii启动子，如cmv(例如，cmv即刻早期启动子(cmv启动子))、鸡β-肌动蛋白启动子、poliii启动子、腺病毒主要晚期启动子(admlp)；单纯疱疹病毒(hsv)启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)启动子、人类免疫缺陷病毒(hiv)启动子(例如，hiv长末端重复(ltr)启动子)、莫洛尼病毒启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子、劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子、sv40早期启动子、来自人基因的启动子，如人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人突触蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子、人金属硫蛋白β-肌动蛋白启动子、人泛素c启动子(ubc)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(pgk)、人胸苷激酶启动子(tk)、人延伸因子1α启动子(ef1a)、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、e2f-1启动子(e2f1转录因子1的启动子)、甲胎蛋白启动子、胆囊收缩素启动子、癌胚抗原启动子、c-erbb2/neu癌基因启动子、环氧合酶启动子、cxc-趋化因子受体4(cxcr4)的启动子、人附睾蛋白4(he4)启动子、己糖激酶ii型启动子、l-网素启动子、粘蛋白样糖蛋白(muc1)启动子、前列腺特异性抗原(psa)启动子、存活素启动子、酪氨酸酶相关蛋白(trp1)启动子和酪氨酸酶启动子、合成启动子、杂合启动子等。此类启动子序列可商购自例如stratagene公司(加利福尼亚州圣地亚哥)。[0114]如本文所用，术语“增强子”是指增加编码序列的转录和/或翻译的核苷酸序列。增强子可以与编码序列的5'末端或3'末端可操作地连接。在真核细胞中起作用的任何增强子都可以用于本公开。增强子的说明性实例包含但不限于猿猴病毒40(sv40)早期基因增强子、源自劳氏肉瘤病毒的长末端重复(ltr)的增强子和源自人巨细胞病毒(cmv)的增强子。[0115]如本文所用，术语“转录终止子”是指被真核细胞rna聚合酶识别以终止转录的核苷酸序列。终止子序列可以与编码序列的3'末端可操作地连接。在某些实施例中，终止子可以包含用于切割rna的信号，使得可以暴露rna上的聚腺苷酸化位点。在真核细胞中起作用的任何终止子序列都可以用于本公开。终止子序列的说明性实例包含但不限于源自病毒的终止序列，如sv40终止子，以及源自已知基因的终止序列，如牛生长激素终止子序列。[0116]如本文所用，术语“聚腺苷酸化序列”是指在转录时被真核细胞识别为用于将聚腺苷残基添加到经转录的mrna的信号的核苷酸序列。聚腺苷酸化序列可以与编码序列的3'末端可操作地连接。在真核细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以用于本公开。聚腺苷酸化序列的说明性实例包含但不限于aauaaa和sv40聚腺苷酸化信号。[0117]在某些实施例中，外源核酸可以包含编码两种感兴趣的蛋白质的两个序列。在此类实施例中，两个编码序列可以通过内部核糖体进入位点(ires)分开，这允许从mrna序列的中间开始翻译，并且因此将两个或更多个编码产物的翻译分开。ires可以在第一编码序列的3′末端之后和第二编码序列的5'末端之前的位置处可操作地连接。在真核细胞中起作用的任何ires序列都可以用于本公开。ires的说明性实例可以包含但不限于小核糖核酸病毒ires、瘟病毒ires、口蹄疫病毒ires、甲型肝炎ires和丙型肝炎ires。[0118]外源核酸的递送[0119]要与外源核酸一起递送的细胞可以是体外的、离体的或体内的。在某些实施例中，所述细胞是体外的，例如，适应或工程化以适于体外培养的细胞，如已确立的细胞系的细胞。在某些实施例中，所述细胞是离体的，例如，从受试者分离或源自受试者的原代细胞，如t细胞。在某些实施例中，所述细胞是活受试者中的体内细胞。[0120]要用外源核酸递送的受试者可以是非人动物或人。在一些实施例中，所述受试者是温血哺乳动物，例如，灵长类动物、狗、猫、牛、马、绵羊、山羊、兔、大鼠和小鼠。在一些实施例中，所述受试者是灵长类动物，例如，人。[0121]可以使用多种可用于此类递送的技术将外源核酸递送到细胞或受试者。为了在体外或离体递送到细胞，可以通过以下将外源核酸转染到细胞中：氯化钙-、氯化锂-、乙酸锂/聚乙二醇-、磷酸钙-、deae-葡聚糖-、脂质体介导的转染(graham等人(1973)《病毒学》.52:456-467；mannino等人(1988)《生物技术(biotechniques)》6:682-690；felgner等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:7413-7417)、电穿孔(shigekawa等人(1988)《生物技术》6:742-751)、直接显微注射(capecchi,m.r.(1980)《细胞(cell)》22:479-488)，或通过使用高速钨微粒(klein等人(1987)《自然(nature)》327:70-73)。当外源核酸呈病毒载体的形式时，其可以通过病毒感染转染到细胞中。转染技术在本领域中通常是已知的。参见例如，graham等人(1973)《病毒学》,52:456，sambrook等人(1989)《分子克隆，实验室手册(molecularcloning,alaboratorymanual)》,纽约冷泉港实验室，davis等人(1986)；《分子生物学基本方法(basicmethodsinmolecularbiology)》，elsevier和chu等人(1981)《基因(gene)》13:197。[0122]为了将外源核酸递送到体内细胞或递送到受试者，可以将外源核酸全身或在局部治疗区域施用于受试者。在某些实施例中，所述外源核酸通过肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径递送到所述受试者。在某些实施例中，所述外源核酸口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、脑室内(icv)或直肠内递送到所述受试者。[0123]阿司匹林化合物的施用[0124]在将外源核酸递送到细胞或受试者之前或同时，可以向所述细胞或所述受试者施用阿司匹林化合物。[0125]在某些实施例中，将所述外源核酸递送到已经或正在同时施用阿司匹林化合物的细胞或受试者。[0126]在某些实施例中，在递送所述外源核酸之前以使所述细胞或所述受试者对此类递送预备的方式施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在递送所述外源核酸之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述细胞或所述受试者施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前向所述细胞或所述受试者施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)所述阿司匹林化合物。[0127]在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物与所述外源核酸同时施用于所述细胞或所述受试者。如本文所用，术语“同时”是指将产生外源核酸和阿司匹林化合物共同递送到细胞或受试者(在受试者体外、离体或体内)的安排。此类共同递送可以通过以下来实现：例如将外源核酸和阿司匹林化合物两者在组合的组合物中，或在单独的组合物中但通过相同或不同的施用途径在基本上同时的时间递送，或以受控时间在单独的组合物中递送使得外源核酸和阿司匹林化合物预期在细胞或受试者中基本上同时起作用。[0128]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物以足以有效增加所述外源核酸在所述细胞或所述受试者中的表达的量施用。在某些实施例中，以使所述细胞或所述受试者中的所述外源核酸的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的有效量施用所述阿司匹林化合物。[0129]在某些实施例中，可以在体外或离体将阿司匹林化合物添加或引入到细胞的培养基中。在某些实施例中，阿司匹林化合物通过肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径递送到受试者。在某些实施例中，阿司匹林化合物可以通过任何合适的途径施用于受试者，例如但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、脑室内(icv)或直肠内。在某些实施例中，通过静脉内施用将阿司匹林化合物递送到受试者。[0130]预备方法[0131]一方面，本公开提供了一种对细胞或受试者进行预备以递送外源核酸的方法。[0132]如本文所用，术语“预备”是指在递送外源核酸之前对细胞或受试者进行的任何预处理，以使细胞或受试者准备好处于易于接受和表达外源核酸的状态。在某些实施例中，与未预备的细胞或受试者相比，预备的细胞或预备的受试者可以处于接收和表达外源核酸所期望的状态，例如对外源核酸的免疫应答性较低。[0133]表达或增加表达水平或延长表达持续时间的方法[0134]另一方面，本公开提供了一种在细胞中表达外源核酸的方法。另一方面，本公开还提供了一种增加细胞中或受试者中的外源核酸表达水平的方法。在又另一方面，本公开提供了一种延长细胞中或受试者中的外源核酸的表达持续时间的方法。[0135]如本文所用，术语“表达”(“expression”或“expressing”)是指将编码dna序列转录成mrna和/或将编码dna序列翻译成肽或蛋白质。如本文所用，短语“对外源核酸的表达”是指对包括在外源核酸中的编码序列(例如，编码感兴趣的蛋白质的序列)的表达。在一些实施例中，外源核酸的表达水平基于mrna水平或蛋白质水平确定。在一些实施例中，相对于对照表达水平，所述表达水平增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％。对照表达水平可以是在不存在使用阿司匹林化合物治疗的情况下在可比较条件下确定的表达水平。[0136]在某些实施例中，在将外源核酸递送到细胞或受试者之后的第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天或第15天确定所述外源核酸的表达水平。[0137]在某些实施例中，在表达持续时间期间共同确定外源核酸的表达水平。[0138]如本文所用，“表达持续时间”是外源核酸在细胞中或受试者中以可检测水平或以生理学上或治疗上有效的水平表达的时间段。在某些实施例中，所述表达持续时间是从外源核酸表达的感兴趣的蛋白质在细胞中或受试者中处于或高于可检测水平或处于生理学上或治疗上有效的水平的时间段。[0139]在本文所提供的方法的一些实施例中，相对于对照持续时间，所述表达持续时间延长至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。对照持续时间可以是在不存在使用阿司匹林化合物治疗的情况下在可比较条件下确定的表达持续时间。[0140]治疗或预防方法[0141]另一方面，本公开提供了一种治疗可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状的方法。[0142]在一些实施例中，所述受试者患有可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状。在一些实施例中，所述受试者需要治疗(例如，所述受试者将从治疗中在生物学或医学上受益)。[0143]如本文所用，“可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状”是指对使用外源核酸或其表达产物治疗敏感的任何疾病或病状。[0144]在一些实施例中，此类病状的特征在于缺乏一种或多种功能性基因或功能性蛋白。在一些实施例中，此类病状适于基因疗法。递送到受试者的外源核酸可以对替代或修复受试者的活细胞的dna中的缺失或功能失调的分子元件(例如，基因)有用，或者可替代地通过在细胞中引入和表达功能基因来提供或增强细胞中的缺失或功能失调的基因的功能。[0145]在一些实施例中，所述病状是单基因病症。单基因病症是由基因组中的影响单个基因的一个或两个拷贝的一种或多种异常引起的病症。基因组异常会破坏基因并导致由被破坏基因编码的内源性蛋白的活性缺失或不足。单基因病症的症状是由于内源性蛋白的活性缺失或不足所导致。[0146]在一些实施例中，所述单基因病症是常染色体显性、常染色体隐性、x连锁、y连锁或线粒体的。[0147]常染色体显性单基因病症的实例包含但不限于布鲁格达综合征(brugadasyndrome)、1型强直性肌营养不良、2型强直性肌营养不良、遗传性多发性梗塞性痴呆、亨廷顿氏病、1型神经纤维瘤病、2型神经纤维瘤病、马凡综合征(marfansyndrom)、家族性高胆固醇血症(fh)、多囊性肾病、遗传性球形红细胞增多症、遗传性非息肉病性结直肠癌、遗传性多发性外生骨疣、结节性硬化症、冯维勒布兰德氏病(vonwillebranddisease)和急性间歇性卟啉症、德拉韦综合征(dravetsyndrome)、珀茨-杰格斯综合征(peutz-jegherssyndrome)、软骨发育不全、原发性联合免疫缺陷病、家族性腺瘤性息肉病(fap)、脊髓小脑性共济失调、多发性内分泌肿瘤。[0148]常染色体隐性遗传单基因病症的实例包含但不限于β-酮硫解酶缺乏症、生物素酶缺乏症、肝豆状核变性、脊髓性肌萎缩症、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、赖氨酸尿蛋白不耐受症、长链3-羟酰基-coa脱氢酶缺乏症、莱伦氏综合症(laronsyndrome)、异戊酸血症、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症综合征、羧化全酶合成酶缺乏症、遗传性果糖不耐受症、ii型糖原贮积病、i型戊二酸血症、吉特曼综合征(gitelmansyndrome)、戈谢氏病(gaucherdisease)、家族性地中海热、先天性肌强直症、瓜氨酸血症i、瓜氨酸血症ii、原发性肉碱缺乏症、精氨酸酶缺乏症、中链酰基-coa脱氢酶缺乏症、镰状细胞性贫血、囊性纤维化、戴萨克斯症(tay–sachsdisease)、苯丙酮尿症、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、糖原贮积病、半乳糖血症、尼曼-皮克病(niemann-pickdisease)、脊髓性肌萎缩(sma)、罗伯茨综合征(robertssyndrome)、极长链酰基-coa脱氢酶缺乏症、肺囊性纤维化、戈谢氏病、沃纳综合征(wernersyndrome)、范可尼贫血(fanconianemia)、粘多糖贮积症(i、iiia、iiib、iva、ivb、vi、vii、ix)。[0149]x连锁单基因病症的实例包含但不限于脆性x综合征、先天性肾上腺发育不全、杜氏肌营养不良(duchennemusculardystrophy)和a型血友病、b型血友病、法布里病(fabrydisease)、x连锁无丙种球蛋白血症、x连锁肾上腺脑白质营养不良、脊髓和延髓肌萎缩、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症和粘多糖贮积症ii、肾上腺脑白质营养不良(ald)、慢性肉芽肿病。[0150]单基因病症的其它实例包含麦-奥二氏综合症(mccune-albrightsyndrome)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、ada免疫缺陷、肌萎缩性侧索硬化症(als)、葡萄糖-半乳糖、肌营养不良、无精子症、埃勒斯-当洛斯综合征(ehlers-danlossyndrome)、色素性视网膜炎、血色素沉着症、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、强直性肌营养不良、巨轴索神经病、α-1抗胰蛋白酶、帕金森氏病、严重联合免疫缺陷(ada-scid/x-scid)。[0151]多基因病症的实例包含如心脏病、癌症(例如，白血病，具体地是急性淋巴细胞白血病)、糖尿病、精神分裂症和阿尔茨海默氏病。[0152]如本文所用，如本文所用的术语“治疗”(“treating”或“treatment”)病状包含缓解病状、减缓病病状的发作或发展速率、减轻、缓解或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。[0153]另一方面，本公开提供了一种预防可通过外源核酸或其表达产物预防的病状的方法。[0154]如本文所用，术语“预防”(“prevent”、“prevents”或“prevention”)、“可预防(preventable)”是指延迟疾病或病症的发作、降低病状发展的风险、延迟与病状相关症状的发展或其某种组合。所述术语并不意味着完全消除疾病，而是涵盖任何类型的降低病状的发生率或延迟病状的发作和/或进展的预防性治疗。[0155]在一些实施例中，可预防病状的特征在于可以受益于可以由外源核酸或其表达产物诱导的保护性作用(例如，免疫应答)的病状。在一些实施例中，递送到受试者的外源核酸可以用于表达诱导针对病原体或癌细胞的保护性免疫应答的免疫原。[0156]在某些实施例中，所述治疗或预防方法包括：向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物。[0157]在某些实施例中，所述治疗或预防方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述受试者施用阿司匹林化合物。[0158]在某些实施例中，所述治疗或预防方法包括：a)向所述受试者施用阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行。[0159]外源核酸以治疗有效量递送到受试者。如本文所用，关于外源核酸的术语“治疗有效量”意指递送到受试者的外源核酸的量足以在受试者中产生治疗或预防益处，例如，对受试者的至少一种临床症状提供一些缓解、减轻或减少(用于治疗目的)，或延迟疾病或病症的发作或在疾病或病症发作时减轻症状(用于预防目的)。例如，治疗有效量的外源核酸可以允许递送到足够数量的细胞中并在受试者中表达外源核酸(例如，从外源核酸表达感兴趣的蛋白质)以产生治疗益处或预防益处。[0160]在一些实施例中，所述外源核酸包含或包括在病毒载体(例如，aav载体或aav病毒颗粒)中，并且所述病毒载体的治疗有效量可以在106vg/kg到1014vg/kg(载体基因组/kg)，例如，107vg/kg到1014vg/kg、108vg/kg到1014vg/kg、109vg/kg到1014vg/kg、1010vg/kg到1013vg/kg、1010vg/kg到1012.5vg/kg、1010vg/kg到1012vg/kg、1010vg/kg到1011.5vg/kg或1010vg/kg到1011vg/kg的范围内。在一些实施例中，aav载体的治疗有效量为约或不超过106vg/kg、107vg/kg、108vg/kg、109vg/kg、1010vg/kg、1011vg/kg、1011.5vg/kg、1012vg/kg、1012.5vg/kg或1013vg/kg。病毒载体的治疗有效量可以根据如病毒载体的类型、要转染的细胞、要治疗的病状、接受治疗的受试者(例如，疾病状态、年龄、性别和体重)、病毒载体在个体中引发期望的应答的能力等许多因素而变化。治疗有效量可以通过从低但安全的剂量开始并逐渐增加到更高剂量来确定，同时监测治疗效果(例如，癌细胞生长的减少)以及任何有害副作用的存在。[0161]在某些实施例中，本文所提供的治疗方法中的治疗有效量是亚治疗量。如本文所用，术语“亚治疗量”是指低于在常规治疗方法中产生治疗益处所需的常规量的外源核酸量，其中在递送外源核酸之前或同时未向受试者施用阿司匹林化合物(“常规治疗方法”)。[0162]在某些实施例中，亚治疗量的外源核酸在常规治疗方法(其中不施用阿司匹林化合物)中产生不足的治疗效果或不产生任何治疗效果。[0163]在一些实施例中，所述亚治疗量不超过90％、不超过80％、不超过70％、不超过60％、不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的常规量的相同外源核酸，所述常规量是在不施用所述阿司匹林化合物的情况下需要的。[0164]在某些实施例中，本文所提供的治疗方法中的治疗有效量与常规量相当或相同，但提供比常规治疗方法更高的治疗效果。在某些实施例中，本文所提供的方法可以实现比所述常规治疗方法可以实现的治疗效果高至少10％、高20％、高30％、高40％、高50％、高60％、高70％、高80％、高90％、高100％、高150％、高200％、高250％、高300％、高350％、高400％、高450％或高500％的治疗效果。[0165]在一些实施例中，可以在施用外源核酸之前或同时向受试者施用阿司匹林化合物。[0166]在一些实施例中，在将所述外源核酸递送到所述受试者之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述受试者施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前向所述受试者施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物与所述外源核酸同时施用于所述受试者。[0167]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物以足以有效增加所述外源核酸在所述细胞或所述受试者中的表达的量施用。在某些实施例中，以使所述受试者中的所述外源核酸的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的有效量施用所述阿司匹林化合物。[0168]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是以不超过30mg/kg、不超过50mg/kg、不超过60mg/kg、不超过70mg/kg、不超过80mg/kg、不超过90mg/kg、不超过100mg/kg、不超过110mg/kg、不超过120mg/kg、不超过120mg/kg、不超过130mg/kg、不超过140mg/kg、不超过150mg/kg、不超过160mg/kg、不超过170mg/kg、不超过180mg/kg、不超过190mg/kg或不超过200mg/kg的量向所述受试者施用的。在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是以30mg/kg到200mg/kg、30mg/kg到150mg/kg、30mg/kg到120mg/kg、30mg/kg到100mg/kg的、30mg/kg到90mg/kg、30mg/kg到80mg/kg、30mg/kg到70mg/kg、30mg/kg到60mg/kg、30mg/kg到50mg/kg、30mg/kg到40mg/kg的量向所述受试者施用的。在某些实施例中，所述阿司匹林化合物是以30mg/kg到50mg/kg的量例如以约35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg向所述受试者施用的。在某些实施例中，所述阿司匹林化合物是以50mg/kg到100mg/kg的量例如以约55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg向所述受试者施用的。[0169]在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物与所述外源核酸同时施用于所述受试者。在某些实施例中，所述阿司匹林化合物和所述外源核酸可以在时间上足够接近地施用(例如，同时，或在彼此之前或之后的短时间段内)，使得预期它们在所述受试者中基本上同时起作用。阿司匹林化合物和外源核酸可以被视为是同时施用的，只要两种药剂在彼此之前、之后的短时间段内或同时进入到细胞中。在一些实施例中，所述阿司匹林化合物与所述外源核酸以一种单一组合物的形式同时施用。在一些其它实施例中，所述阿司匹林化合物与所述外源核酸以不同组合物同时施用。[0170]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物和所述外源核酸在同时施用于所述受试者之前混合。在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物和所述外源核酸静脉内共同施用于所述受试者。在一些实施例中，通过不同的施用途径将所述阿司匹林化合物和所述外源核酸施用于所述受试者。在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、脑室内(icv)或直肠内施用于所述受试者。[0171]在一些实施例中，施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸以治疗中枢神经系统(cns)病症。在一些实施例中，通过全身施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸来治疗所述cns病症。在某些实施例中，适于全身施用以治疗cns病症的所述外源核酸包含aav载体(例如，aav病毒颗粒)，例如，aav9载体(例如，aav9颗粒)。在某些实施例中，所述全身施用包含静脉内、皮下或肌肉内施用。在一些实施例中，通过脑室内或鞘内施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸来治疗所述cns病症。cns病症可以是可通过将治疗核酸递送到脑或脊髓来治疗的任何病状。cns病症的实例包含例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、ii型粘多糖贮积症、iiia型粘多糖贮积症、iiib型粘多糖贮积症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、巴藤病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、卡纳万病和弗里德赖希氏共济失调。[0172]在不希望受到任何理论束缚的情况下，据信本发明在治疗cns病症方面特别有利，并且这至少部分地归因于外源核酸在脑的靶位点中的表达增加。发明人惊奇地发现，通过全身施用aav与本文所提供的阿司匹林化合物的组合，可以使用低得多的aav剂量，但仍能实现与较高剂量相同或甚至更高的功效。本领域已知，如果通过全身途径施用aav9，则必须达到1014vg/kg的阈值剂量才能够在脑中进行转基因表达，然而，此类剂量既在技术上具有挑战性又制造成本很高，并且这显著限制了aav9在治疗cns病症中的使用(详细信息参见perezba等人,《脑科学(brainsci)》.2020年2月22日；10(2).pii:e119；duques等人,《分子疗法(molther)》.2009年7月；17(7):1187-96；foustkd等人,《自然生物技术》.2009年1月；27(1):59-65)。如在本技术中所公开的，通过全身途径以低于1014vg/kg的量(例如，以1013vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1011vg/kg或甚至更低)与阿司匹林化合物组合递送的aav9可以实现在脑中进行转基因表达，并且如与以或高于1014vg/kg但没有阿司匹林化合物施用的aav9相比同样有效或甚至更有效。这可以减少治疗cns病症所需的aav的剂量，并且由此降低制造过程的复杂性，从而可以使用例如较低剂量aav制剂来治疗脑部病症。[0173]另一方面，本公开提供了一种减少受试者的副作用或提高对外源核酸的耐受性的方法。如本文所用，由外源核酸的递送引起的“副作用”可以是本领域已知的关于药物递送的任何种类的副作用，包含但不限于恶心、呕吐、头晕、嗜睡/镇静、过敏、瘙痒、胃肠动力降低(包含便秘)、排尿困难、外周血管扩张(包含导致直立低血压)、头痛、口干、出汗、乏力、依赖性、情绪变化(例如，烦躁、欣快)、头晕或甚至呼吸抑制、呼吸暂停、呼吸停止、循环抑制、低血压或休克。[0174]在本公开的一些实施例中，所述外源核酸以亚治疗量递送到所述受试者。在某些实施例中，所述亚治疗量在本文所提供的治疗方法中是治疗有效的，但与常规量相比引起显著降低的副作用。[0175]在一些实施例中，所述副作用对递送到所述受试者的所述外源核酸是剂量依赖性的。据信，通过以亚治疗水平施用所述外源核酸，与外源核酸相关的副作用可以因暴露较少而减少。[0176]组合物[0177]在又另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含阿司匹林化合物和外源核酸的组合，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。[0178]在一些实施例中，所述组合物中的所述外源核酸包含编码序列，所述编码序列编码感兴趣的蛋白质或其一部分或编码功能性rna或其一部分。[0179]在一些实施例中，所述治疗蛋白选自由以下组成的组：smn1、naglu、sgsh、ids、fviii、fix、btk、abcd1、acadvl、ar、hbb、scn1a、cftr、csf2ra、il2ag、pha、stk11、piga、otc、nags、dmpk、cnbp、acadm、gnas、fbn1、lipa、slc7a7、hadha、ghr、idv、alpl、slc25a15、htt、hcs、notch3、aldob、atp7b、gaa、gcdh、slc12a3、gba、mefv、gla、clcn1nr0b1、ass1、slc25a13、slc22a5、scn5a、btd、acat1、arg1、cyp21a2、嵌合抗原受体(car)、抗体(例如，单克隆或双特异性或多特异性)、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、肽激素、生长因子、促红细胞生成素(epo)、细胞因子、凝血因子、抗血友病因子、干扰素、fc融合蛋白(如ctla-4fc融合、vegfrfc融合)和治疗酶(例如，溶酶体水解酶和硫酸酯酶)。[0180]在一些实施例中，所述免疫原性蛋白选自由以下组成的组：来自正粘病毒(例如，流感病毒)、慢病毒(例如，hiv、siv)、沙粒病毒(拉沙热病毒)、痘病毒(例如，牛痘)、黄病毒(例如，黄热病病毒)、丝状病毒(埃博拉病毒)、布尼亚病毒(rvfv、cchf或sfs病毒)、冠状病毒(例如，sars、mers或covid-19)、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒(cmv、ebv、hsv)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、白喉毒素、百日咳和肝炎病毒(例如，hav、hbv或hcv)的免疫原性蛋白。[0181]在一些实施例中，所述核酸酶包含锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)或cas家族蛋白(如cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、cas11、cas12、cas13、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、其同源物或其经修饰版本)。[0182]在一些实施例中，所述报告蛋白选自由以下组成的组：荧光蛋白(例如，egfp、gfp、rfp、bfp、yfp或dsred2)，产生可检测产物的酶，如荧光素酶(例如，来自高斯公司、海肾公司或pho公司)、b-半乳糖苷酶、b-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶基因和可以直接检测到的蛋白质。[0183]在一些实施例中，所述治疗靶蛋白(例如，ctla-4、her2、粘连蛋白-4、硬化蛋白、p-选择蛋白、vegf、rsvf、vegfr2、cd79、il23p19、vwf、ifn-γ、c5、pd-1、pd-l1、cgrp、cd3、cd11a、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、ige、klk、ccr4、fgf-23、il-6r、il-5、il-23p19、il-2r、il-17r、il-17、cd4、fix/fx、il-12、il-23、il-1β、il-5r、il-6r、il-4/il-13、pdgf-α、达比加群、slamf7、egfr、pcsk9、gd2、cd3、cd19、α4β7整合素、α4β1整合素、pa、blys、rank、tnf-α、epcam、ggta1、内皮抑素、血管抑素)。[0184]在一些实施例中，所述功能性rna调节生物靶标，所述生物靶标选自由以下组成的组：多种药物抗性(mdr)蛋白靶标、肿瘤靶标(例如，vegf、her2、egfr、pd-l1等)、如病毒表面抗原等病原体靶标(例如，乙型肝炎表面抗原基因)、缺陷基因产物(突变的肌营养不良蛋白)或治疗靶标(例如，肌生长抑制素)。[0185]药物组合物[0186]在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含亚治疗量的本文所提供的外源核酸以及药学上可接受的载体。在某些实施例中，所述药物组合物进一步包含本文所提供的阿司匹林化合物。[0187]在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所提供的外源核酸、本文所提供的阿司匹林化合物以及药学上可接受的载体。[0188]如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可以促进本公开的核酸、表达载体的储存和向受试者和/或向宿主细胞施用的任何和所有药学载体，如溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在某些实施例中，已经施用所述药物组合物的所述宿主细胞适于施用于受试者。药学上可接受的载体可以包含任何合适的组分，例如但不限于盐水、脂质体、聚合物赋形剂、胶体或载体颗粒。[0189]在某些实施例中，所述药学上可接受的载体是可以溶解或分散本公开的核酸、表达载体和/或宿主细胞的盐水。盐水的说明性实例包含但不限于缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液和聚山梨醇酯溶液。[0190]在某些实施例中，所述药学上可接受的载体是脂质体。脂质体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性材料形成的膜以及内部水性部分。本公开的核酸、表达载体和/或宿主细胞可以包封在脂质体的水性部分中。脂质体的说明性实例包含但不限于基于3[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(dc-chlo)的脂质体、基于n-(2,3-二油酰氧基)丙基-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)的脂质体和基于1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷(dotap)的脂质体。制备脂质体和将表达载体包封在脂质体中的方法是本领域众所周知的(参见例如，d.d.lasic等人,《基因递送中的脂质体(liposomesingenedelivery)》,由crc出版社(crcpress)出版,1997)。[0191]在某些实施例中，所述药学上可接受的载体是聚合物赋形剂，如但不限于微球、微胶囊、聚合物胶束和树状物。本公开的核酸、表达载体和/或宿主细胞可以通过本领域已知的方法包封、粘附或包被在基于聚合物的组分上(参见例如，w.heiser,《非病毒基因转移技术(nonviralgenetransfertechnologies)》,由胡玛纳出版社(humanapress)出版,2004；美国专利6025337；《先进药物递送评论(advanceddrugdeliveryreviews)》,57(15):2177-2202(2005))。[0192]在某些实施例中，药学上可接受的载体是胶体或载体颗粒，如金胶体、金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和多段纳米棒。核酸、表达载体或细胞可以以本领域已知的任何合适的方式在载体上包被、粘附到载体或与载体缔合(参见例如，m.sullivan等人,《基因疗法》,10:1882–1890(2003)，c.mclntosh等人,《美国化学学会杂志(j.am.chem.soc.)》,123(31):7626–7629(2001)，d.luo等人,《自然生物技术》,18:893-895(2000)，以及a.salem等人,《自然材料(naturematerials)》,2:668-671(2003))。[0193]在某些实施例中，药物组合物可以进一步包含添加剂，例如但不限于稳定剂、防腐剂和有助于药物的细胞摄取的转染促进剂。合适的稳定剂可以包含但不限于谷氨酸一钠、甘氨酸、edta和白蛋白(例如，人血清白蛋白)。合适的防腐剂可以包含但不限于2-苯氧乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟基苯甲酸甲酯、酚类、硫柳汞和抗生素。合适的转染促进剂可以包含但不限于钙离子。[0194]药物组合物可以适于通过本领域已知的任何合适的途径施用，包含但不限于肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径。[0195]药物组合物可以以适于每种施用途径的调配物或制剂的形式向受试者施用。适于施用药物组合物的调配物可以包含但不限于溶液、分散体、乳剂、粉剂、悬浮剂、气溶胶、喷雾剂、滴鼻剂、基于脂质体的调配物、贴片、植入物和栓剂。[0196]所述调配物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药业领域熟知的任何方法来制备。制备这些调配物或组合物的方法包含将本公开的外源核酸提供给一种或多种药学上可接受的载体和任选地一种或多种佐剂的步骤。可以在以下中找到用于制备此类调配物的方法：例如《雷明顿氏药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》(《雷明顿：药学科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》,第19版,a.r.gennaro(编辑),新泽西州马克出版公司(mackpublishingco.,n.j.),1995；r.stribling等人,《美国国家科学院院刊》,89:11277-11281(1992)；t.w.kim等人,《基因医学杂志(thejournalofgenemedicine)》,7(6):749-758(2005)；s.f.jia等人,《临床癌症研究(clinicalcancerresearch)》,9:3462(2003)；a.shahiwala等人,《最近药物递送和调配专利(recentpatentsondrugdeliveryandformulation)》,1:1-9(2007)；a.barnes等人,《分子治疗学的当前观点(currentopinioninmoleculartherapeutics)》20002:87-93(2000)，所述参考文献通过引用整体并入本文)。[0197]在某些实施例中，本公开的含有外源核酸(例如，aav载体或aav病毒颗粒)的药物组合物适于通过局部递送到患病位点处的靶组织或器官中而施用于需要治疗的受试者。在某些实施例中，所述药物组合物适于使用注射器直接注射到通过皮肤可触知的患病位点。在某些实施例中，所述药物组合物适于使用连接到导管线或其它医疗接入装置的可植入给药装置进行注射，并且可以与引导到患病位点的成像系统结合使用。在某些实施例中，所述药物组合物适于以有效剂量直接注射到暴露的外科手术区域中可见的患病位点。在某些实施例中，所述药物组合物(例如，载体包被的金颗粒)适于使用基因枪轰击到患病位点，所述基因枪将所述颗粒直接射入所述患病位点(参见例如，r.muangmoonchai等人,《分子生物学(molecularbiology)》,20(2):145-151(2002))。在某些实施例中，所述药物组合物适于通过静脉内注射向受试者施用。在某些实施例中，所述药物组合物适合口服或经粘膜向受试者施用。有关将治疗核酸引入到细胞或动物中的方法的参考文献，参见例如，yang,n-s.,《生物技术关键评论(crit.rev.biotechnol.)》12:335-356(1992)；anderson,w.f.,《科学》256:808-813(1992)；miller,a.s.,《自然》357:455-460(1992)；crystal,r.g.,《美国医学杂志(amer.j.med.)》92(增刊6a):44s-52s(1992)；zwiebel,j.a.等人,《纽约科学院年报(ann.n.y.acad.sci.)》618:394-404(1991)；mclachlin,j.r.等人,《核酸研究与分子生物学进展(prog.nucl.acidres.molec.biol.)》38:91-135(1990)；kohn,d.b.等人,《癌症调查(cancerinvest)》.7:179-192(1989)。这些参考文献通过引用整体并入本文。[0198]在一些实施例中，所述药物组合物中的所述外源核酸包含编码序列，所述编码序列编码感兴趣的蛋白质或其一部分或编码功能性rna或其一部分。在一些实施例中，所述药物组合物中的所述外源核酸包含编码治疗蛋白的感兴趣的核酸。在一些实施例中，所述药物组合物中的所述外源核酸包含编码适于治疗cns病症或脑部疾病的治疗蛋白的感兴趣的核酸。在一些实施例中，用于治疗cns病症或脑部疾病的功能性rna的治疗蛋白或治疗靶标包含例如但不限于tau、mecp2、ngf、apoe、gdnf、sumf、sgsh、aadc、cd、p53、arsa芳基硫酸酯酶a、abcd1、smn1、naglu、sod1、c9orf72、tardbp、fus、htt、lrrk2、paris、parkin、gad和α-突触核蛋白。这些基因在本领域中是已知的，并且已经在以下中进行了描述：例如maguireca等人,《神经治疗学(neurotherapeutics)》.2014年10月；11(4):817-39；bowerswj等人,《人类分子遗传学(hummolgenet)》.2011年4月15日；20(r1):r28-41)。[0199]在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体(例如，aav病毒颗粒)。在一些实施例中，所述药物组合物中的aav病毒颗粒适于提供量不超过1014vg/kg(例如，不超过1013vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1011.5vg/kg、1011vg/kg、1010.5vg/kg、1010vg/kg或109vg/kg)的剂量。在一些实施例中，所述药物组合物中的aav病毒颗粒适于提供亚治疗剂量。[0200]在一些实施例中，所述药物组合物呈单位剂量，并且含有不超过1010vg、1010.5vg、1011vg、1011.5vg、1012vg、1012.5vg、1013vg、1013.5vg、1014vg、1014.5vg、1015vg、1015.5vg或1016vg的aav病毒颗粒。如本文所用，“单位剂量”是足以提供一种治疗的剂量。在一些实施例中，所述单位剂量针对人类使用，例如，针对人类成人(例如，平均体重为60kg)、人类青少年、人类儿童或人类婴儿。在一些实施例中，所述药物组合物呈适于全身施用，如适于静脉内注射、静脉内输注和肌肉内注射的调配物。[0201]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物与aav颗粒包装在一起，例如以混合物或一种组合物的形式。在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是独立包装的，与aav病毒颗粒分开，例如，所述阿司匹林化合物可以以任何可商购获得的形式在单独的容器中提供。[0202]在一些实施例中，本公开的药物组合物进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述阿司匹林化合物要在施用所述药物组合物之前施用或与施用所述药物组合物同时施用。在一些实施例中，所述使用说明书表明为了治疗脑部疾病，所述aav病毒通过全身施用施用，优选地以低于1014vg/kg的剂量施用。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，或存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或分包装相关)。在一些实施例中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，cd-rom、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在一些实施例中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于从远程源，例如通过互联网获得说明书的手段。此实施例的实例是包含网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。[0203]试剂盒[0204]在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：a)第一组合物，所述第一组合物包含所述阿司匹林化合物；以及b)第二组合物，所述第二组合物包含本文所提供的所述外源核酸。在一些实施例中，试剂盒进一步包含用于使用所述试剂盒的组分来实践本公开的方法的说明书。[0205]在某些实施例中，所述第一组合物和所述第二组合物处于单独的容器中。所述第一组合物和所述第二组合物可以在使用之前组合，或者可以单独使用，例如在不同的时间或通过不同的施用途径。[0206]在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含本文所提供的所述阿司匹林化合物和所述外源核酸。在一些实施例中，试剂盒进一步包含用于使用所述试剂盒的组分来实践本公开的方法的说明书。[0207]在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述第二组合物要在所述第二组合物之前施用或与所述第二组合物同时施用。在一些实施例中，所述第一组合物和所述第二组合物可以在使用之前容易地混合以提供组合的组合物。在一些实施例中，所述第二组合物包含亚治疗量的所述外源核酸。[0208]在又另外的方面，本公开提供了一种组合物，其包含：阿司匹林化合物和亚治疗量的本文所提供的所述外源核酸。[0209]呈现了以下实例以说明本发明并帮助普通技术人员制备和使用本发明。所述实例不旨在以任何方式在其它方面限制本发明的范围。[0210]实例[0211]实例1.[0212]除非另外指明，否则本文所描述的某些实例的实践可以采用分子生物学、细胞培养、重组核酸(例如，dna)技术、免疫学和/或核酸和多肽合成、检测、操作和定量等的常规技术，所述技术都处于本领域的普通技术范围内。参见例如，ausubel,f.等人,(编辑),《当代分子生物学实验指南》、《当代免疫学实验指南(currentprotocolsinimmunology)》、《当代蛋白质科学实验指南(currentprotocolsinproteinscience)》和《当代细胞生物学实验指南(currentprotocolsincellbiology)》,均为纽约约翰威利父子公司例如截至2010年1月或以后的版本；sambrook、russell和sambrook,《分子克隆：实验室手册》,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,2001或第4版,2012。[0213]材料[0214]基于美国专利公开us20160229904中公开的方法制备载体质粒aav-lxp3.3-gluc。简而言之，合成启动子lxp3.3是基于如us20160229904中所公开的核苷酸序列(本文还提供为seqidno:1)合成的，并且lxp3.3启动子在其3'端处与报告基因高斯荧光素酶(gluc)编码基因连接(其序列可以在基因库登录号：lc006266.1中找到，还参见seqidno:2)，以获得lxp3.3-gluc表达盒。lxp3.3-gluc表达盒插入aav表达质粒中的aav2itr之间，并且与表达rep基因的第二质粒和编码aav8、aav9或aav843的cap基因的第三质粒共转染到hek293细胞中，以分别包装到aav8-lxp3.3-gluc病毒、aav9-lxp3.3-gluc病毒或aav843-lxp3.3-gluc病毒中。aav8的cap基因在seqidno：4中(从基因库登录号：af513852获得)示出，并且编码的cap蛋白序列在seqidno:8(还参见基因库登录号aan03857.1)中示出。aav9的cap基因来自基因库登录号：ay530579(还参见seqidno:5)，并且编码的cap蛋白序列在seqidno:9中示出。aav843的cap基因来自如wo2019241324a1中公开的aavxl32的合成衣壳基因序列(还参见seqidno:6)，并且编码的cap蛋白序列在seqidno:10中示出。[0215]使用可商购获得的试剂盒并基于制造商的说明书，通过实时pcr和斑点印迹对病毒滴度进行定量。其中产生aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc，显示滴度分别为2.67×1013(载体基因组/ml)vg/ml和2.99×1013vg/ml。aav843-lxp3.3-gluc在内部产生，其中滴度为4×1012vg/ml。[0216]cas编号：50-78-2的乙酰水杨酸(阿司匹林)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(shanghaialaddinbiochemicaltechnologyco.,ltd.)。[0217]实例2[0218]1.1阿司匹林治疗和病毒载体递送[0219]将平均重量为20g的雄性c57bl/6j小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司(shanghaijiesijieexperimentalanimalsco.,ltd.))(n＝4)分为六组。连续7天(第-7天到第-1天)将阿司匹林用于腹膜内注射到五组小鼠中，剂量分别为1mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。第六组注射5％蓖麻油(于pbs缓冲液中(目录号：02-024-1acs，bi))作为对照。在第0天，向每组中的每只小鼠静脉内注射aav9-lxp3.3-gluc病毒(5×1012vg/kg)，并且从第1天开始检测荧光素酶的表达。[0220]1.2样品收集[0221]通过眶后出血收集小鼠的血液样品。将一半体积的血液样品以1:9的比率添加柠檬酸钠进行抗凝，混合，在30分钟内离心(6000rpm，5分钟)，并且收集上清液作为小鼠血浆，用于检测gluc的表达。剩余的血液样品在室温下放置2小时以分离血清，在6000rpm下离心15分钟，并且收集上清液作为小鼠血清样品。ifn-α和ifn-β的含量通过使用小鼠ifn-βelisa试剂盒(720131-2，上海酶联生物科技有限公司(shanghaimlbioco.,ltd.))、legendmaxtm小鼠ifn-βelisa试剂盒(439407，百进生物公司(biolegend))和小鼠ifn-αelisa试剂盒(706291-2，上海酶联生物科技有限公司)确定。[0222]1.3对gluc的检测[0223]先制备腔肠素h(40906es02，翌圣生物科技(上海)股份有限公司(shanghaiyeasenbiotechco.,ltd.))缓冲液：向500ml的超纯水中添加29.72g的抗坏血酸钠，并且然后添加50ml的tris-hcl(1mol/l，ph7.4)。腔肠素h的储备溶液的浓度为200μm。腔肠素h的工作溶液以1:1的比率制备，并且以新鲜制备的形式使用。将10μl的上述工作溶液添加到10μl血浆样品中，并且用synergyh1多功能酶标仪检测相对光单位(rlu)。[0224]1.4结果[0225]结果显示，所有组中的荧光素酶的表达水平随时间推移逐渐增加，但一些组中的表达水平从第11天开始有一定程度的下降。经阿司匹林预处理的组中的荧光素酶的表达水平随阿司匹林浓度显示出剂量依赖性增加，如通过施用不同浓度的阿司匹林的组间的比较所揭示的，其中在100mg/kg的阿司匹林下荧光素酶的表达水平达到最高(图1)。发现以50mg/kg和100mg/kg进行阿司匹林治疗的组在第3天的ifn-α水平显著低于对照组(图2)。[0226]实例3.[0227]注射剂量为50mg/kg的阿司匹林用于进一步研究由三种不同aav血清型进行的aav介导的外源基因的表达。研究设计与实例2相似。简而言之，对于每种aav血清型(即，aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc或aav843-lxp3.3-gluc)，将平均重量为20g的雄性c57bl/6j小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)(n＝4)分成两组。一组连续7天注射50mg/kg的阿司匹林，并且另一组注射5％蓖麻油(于pbs缓冲液(目录号：02-024-1acs，bi)中)作为对照。在第8天，将5×1012vg/kg的aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc或aav843-lxp3.3-gluc病毒(在150-200μlpbs中稀释)通过尾静脉注射递送到每只小鼠。收集血液样品并按照与实例2所描述的相同的方法检测荧光素酶的表达水平。[0228]结果表明，阿司匹林可以显著促进所有测试的病毒血清型，即体内的aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc和aav843-lxp3.3-gluc病毒的转导。如与对照组相比，三种aav血清型中含有的荧光素酶基因的表达从aav注射之后第1天开始就显示出显著差异。随时间推移，荧光素酶的表达迅速增加，在aav注射之后第15天达到峰值，并且然后降低，在整个时间段，阿司匹林治疗组与其对应的对照组显示出显著差异(图3a、3b、3c)。对照组中的荧光素酶的表达也在第15天达到峰值。[0229]已经对aav和阿司匹林以一种制剂或单独的制剂但在同时共同施用进行了研究。初步结果表明，aav和阿司匹林的共同施用也可以增加转基因的表达水平。[0230]总之，结果表明，在aav注射之前或同时施用阿司匹林对小鼠进行适当治疗可以显著促进aav转导，增加转基因的表达水平，并且转基因表达的增加不具有血清型依赖性。[0231]实例4.[0232]在实例3中描述的研究中，ifn-α和ifn-β的水平通过使用小鼠ifn-βelisa试剂盒(720131-2，上海酶联生物科技有限公司)、legendmaxtm小鼠ifn-βelisa试剂盒(439407，百进生物公司)和小鼠ifn-αelisa试剂盒(706291-2，上海酶联生物科技有限公司)测定，遵循用户手册。对ifn-α和ifn-β水平的分析表明，在注射aav8、aav9和aav843之后，阿司匹林显著抑制了i型干扰素在小鼠中的表达。用于aav8注射的对照组的ifn-α水平从第2天起显著增加，并且从第15天起逐渐降低，而用阿司匹林治疗的小鼠的中的ifn-α维持在相对较低的水平，尽管从注射aav8之后的第3天到第11天以及第23天到第31天有所升高(图4a)。除第31天外，对照组中的ifn-α水平显著高于阿司匹林治疗组中的水平。用于aav8注射的对照组中的ifn-β水平显著高于阿司匹林治疗组中的水平。对照组中的ifn-β水平随时间推移逐渐降低，但始终显著高于阿司匹林治疗组中的水平(图4b)。[0233]注射aav9之后，阿司匹林治疗组中的ifn-α水平从第11天到第18天增加，但显著低于对照组中的水平(图5a)。在对照组中，ifn-α从第23天开始逐渐降低(图5a)。与对照组中的ifn-α水平的趋势相似，对照组中的ifn-β水平在第23天之后也显著降低，而在阿司匹林治疗组中，ifn-β从第1天到第31天维持在低水平，并且从第1天到第23天与对照组的水平显示出统计学显著差异(图5b)。[0234]注射aav843之后测量ifn-α和ifn-β水平显示，阿司匹林治疗组中的两种i型干扰素均随时间推移逐渐增加，但其水平显著低于对照组中的水平(图6a和图6b)。对照组中的i型干扰素的水平显示出逐渐下降。在注射病毒之后第31天，阿司匹林治疗组与对照组之间的i型干扰素的水平无显著差异(图6a和图6b)。[0235]总之，结果表明，阿司匹林可以显著抑制转导不同血清型aav之后i型干扰素的激活，表明此类作用不具有血清型依赖性。[0236]实例5.[0237]为确认转基因在脑中的表达，将平均重量为20g的雄性c57bl/6j小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)(每组n＝6-8只小鼠)分为五组。四组先连续7天注射50mg/kg的阿司匹林，并且在第8天通过尾静脉注射将1010vg/kg、1011vg/kg、1012vg/kg和1013vg/kg的aav病毒分别递送到相应组中的小鼠。第五组为对照组，所述对照组连续7天注射5％蓖麻油(于pbs缓冲液中(目录号：02-024-1acs，bi))，并且在第8天仅将1014vg/kg的aav递送到组中的每只小鼠。注射后15天到25天将动物麻醉并经心脏灌注，固定每只小鼠的脑，并且然后切片。在脑的不同区域分析转基因表达。预期阿司匹林和aav的静脉内施用有效地产生脑中的转基因表达，其中显著增加cns治疗效果。有趣的是，初步研究中使用的aav的剂量远低于被认为能够在脑中表达的剂量(1014vg/kg)。初步研究表明，尽管aav的剂量相对较低且阿司匹林的剂量低，但脑中的转基因表达显著增加。[0238]进一步研究正在设计和进行中，以进一步验证cns作用。[0239]实例6.[0240]在用阿司匹林预处理或用阿司匹林共同施用的小鼠中检测到外源基因的表达。根据实例1中提供的方法制备aav9-cb-gluc，除了使用cb启动子的核酸序列(参见seqidno:3)。简而言之，一组小鼠通过腹膜内注射预先施用阿司匹林50mg/kg，持续7天，然后在第8天施用aav9-cb-gluc(5×1013vg/kg)。相比之下，一组未预先施用阿司匹林的小鼠同时用50mg/kg的阿司匹林与aav9-cb-gluc组合施用。在aav9-cb-gluc施用之后15天处死小鼠，并且收集脑和肝脏用于确定gluc的表达。[0241]在脑中，与非治疗组(即在没有进行任何阿司匹林治疗的情况下施用aav9-cb-gluc的小鼠)相比，接受阿司匹林预先注射的小鼠的gluc的mrna水平(图7a，p《0.01)和酶活性水平(图7b，p《0.01)分别上调了5.5倍和7.13倍。另外，相对于非治疗组，在同时治疗组中，gluc水平的mrna水平(图7a，p《0.01)和酶活性水平(图7b，p《0.01)也上调了2.95倍(p《0.05)和3.55倍(p《0.01)。[0242]在肝脏中，与非治疗组相比，接受阿司匹林预先注射的小鼠的mrna水平和酶活性分别上调1.43倍(图7c，p《0.05)和1.95倍(图7d，p《0.01)。然而，相对于非治疗组，同时治疗组并未增加肝脏中的mrna水平或酶活性水平(图7c、7d，p《0.05)。mrna水平甚至低于非治疗组的(图7c)，而酶活性水平没有显著差异(图7d)。[0243]总之，阿司匹林已显示出可显著改善aav9的转导并增加脑中外源基因的表达。阿司匹林预处理组也观察到肝脏中外源基因的表达的增加。[0244]实例7.[0245]确定了阿司匹林对改善脑中的治疗转基因的表达的作用。aav9-cb-ids载体使用实例1中描述的方法产生，除了艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids)基因表达盒插入aavitr之间。编码ids的基因在seqidno:7中提供并且ids的蛋白质序列在seqidno:11中提供。为了确定转基因的治疗效果，使用了b6n.cg-idstm1muen/j小鼠(n＝5，从jax小鼠获得，目录号：024744)，其是一种粘多糖贮积症ii(mpsii)模型，因突变而具有非活性的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)。使用一组野生型对照小鼠作为对照。用于治疗mpsii的aav9-cb-ids载体如实例1中所描述的以3×1013vg/kg(即3e13组)或1×1014vg/kg(即1e14组)的剂量向用阿司匹林注射预处理的小鼠施用。aav9-cb-ids注射之后一个月，在脑中检测到ids酶活性(图8)。结果表明，在3e13组中，阿司匹林预处理显著增加了mpsii小鼠中的ids酶活性，其水平甚至高于野生型小鼠组的水平，并且此类水平显著高于不接受阿司匹林而仅接受相同剂量(3×1013vg/kg)(p《0.05)或甚至更高剂量(1014vg/kg)的aav9-cb-ids的组。这些结果证实，阿司匹林可以显著降低在没有阿司匹林治疗的情况下治疗疾病所需要的aav剂量。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：2.多年来，遗传病症和基因相关疾病一直是导致高死亡率和生活质量下降的原因。一些先天性异常表现得很早，并且这些儿童的生存希望很小，这给他们的家庭带来了很大的痛苦，因为治疗选择有限，而且他们几乎没有办法改变此类疾病。基因疗法是一种新型的分子医学形式，其涉及将全功能外源基因转导到个体的细胞或组织中，以替代有缺陷的基因并改变遗传性疾病。基因疗法有可能纠正如血友病、家族性高胆固醇血症、帕金森氏病(parkinson′sdisease)和阿尔茨海默氏病(alzheimer′sdisease)等遗传病症。3.基因疗法虽然有其优点，但也存在如表达水平低、表达时间短等缺点。因此，需要克服现有外源基因转导技术(尤其是病毒转导技术，更优选地aav转导技术)存在的问题，并提供一种用于促进外源基因表达的方法。技术实现要素：4.一方面，本公开提供了一种对细胞进行预备以递送外源核酸的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。5.一方面，本公开提供了一种在细胞中表达外源核酸的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述细胞已经或正在同时施用阿司匹林化合物，并且其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。6.一方面，本公开提供了一种在细胞中表达外源核酸的方法，所述方法包括：a)向所述细胞施用阿司匹林化合物；以及b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。7.一方面，本公开提供了一种增加细胞中的外源核酸的表达水平的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下，在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此增加所述外源核酸的所述表达水平，相比于未施以所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达水平而言。8.一方面，本公开提供了一种增加细胞中的外源核酸的表达水平的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述细胞已经或正在同时施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此增加所述外源核酸的所述表达水平，相比于未施以所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达水平而言。9.一方面，本公开提供了一种增加细胞中的外源核酸的表达水平的方法，所述方法包括：a)向所述细胞施用阿司匹林化合物；以及b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且其中与在不经过所述步骤a)的对照细胞中获得的对照表达水平相比，所述外源核酸的所述表达水平增加。10.一方面，本公开提供了一种延长细胞中的外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且其中与在未施用所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达持续时间相比，所述细胞中的所述外源核酸的所述表达持续时间增加。11.一方面，本公开提供了一种延长细胞中的外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述细胞已经或正在同时施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且其中与在未施用所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达持续时间相比，所述细胞中的所述外源核酸的所述表达持续时间增加。12.一方面，本公开提供了一种延长细胞中的外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：a)向所述细胞施用阿司匹林化合物；以及b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此延长所述外源核酸的所述表达持续时间，相比于未施用所述阿司匹林化合物的对照细胞中获得的对照表达持续时间而言。13.在一些实施例中，所述细胞在体外、离体或体内。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述细胞施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前向所述细胞施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，以足以使所述细胞或所述受试者中的所述外源核酸的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的量施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，所述表达水平基于mrna水平或蛋白质水平。在一些实施例中，所述表达水平增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％。在一些实施例中，所述表达水平是在所述外源核酸的表达持续时间内确定的。在一些实施例中，所述表达持续时间是所述外源核酸以可检测水平或以生理学上有效的水平表达的时间段。在一些实施例中，所述表达持续时间延长至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。14.在一些实施例中，所述外源核酸包含双链dna，并且其中所述双链dna包含双链dna病毒载体、双链质粒或双链人工染色体。在一些实施例中，所述外源核酸可以在递送到细胞或受试者之后转化为双链dna，并且其中所述外源核酸包含单链dna、逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施例中，所述外源核酸包含病毒载体(例如，腺相关病毒(aav)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体)、质粒或外泌体或包括在所述病毒载体、质粒或外泌体内。在一些实施例中，所述病毒载体包含腺相关病毒(aav)载体。在一些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒。在一些实施例中，所述aav载体包含编码衣壳蛋白的cap基因。在一些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含天然或重组衣壳蛋白。在一些实施例中，所述衣壳蛋白可以是经修饰的或嵌合的或合成的。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白源自两种或更多种aav血清型。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白可以具有特定的向性特性。15.在一些实施例中，所述外源核酸包含编码序列，所述编码序列编码感兴趣的蛋白质或其一部分，或编码功能性rna或其一部分。在一些实施例中，所述感兴趣的蛋白质包含治疗蛋白、免疫原性蛋白、报告蛋白、核酸酶或治疗靶蛋白，和/或所述功能性rna包含反义寡核苷酸、核酶、影响剪接体介导/原始剪接的rna、干扰rna(rnai)或其它非翻译功能性rna，如向导rna和单向导rna。在一些实施例中，所述外源核酸在适于表达的条件下被递送到受试者或细胞。在一些实施例中，所述编码序列与一个或多个调节序列可操作地连接。16.另一方面，本公开提供了一种对患有可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状的受试者进行预备的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或与同时向所述受试者施用有效量的阿司匹林化合物，其中本公开的所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna。17.另一方面，本公开提供了一种治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：向所述受试者递送治疗有效量的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna，并且其中所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物。18.另一方面，本公开提供了一种治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用有效量的阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送治疗有效量的所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。19.在一些实施例中，所述病状的特征在于缺乏一种或多种功能性基因或功能性蛋白。在一些实施例中，所述病状是单基因病症。在一些实施例中，所述单基因病症是常染色体显性、常染色体隐性、x连锁、y连锁或线粒体的。20.在某些实施例中，所述可治疗的病状是cns病症。在某些实施例中，所述cns病症选自由以下组成的组：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、ii型粘多糖贮积症、iiia型粘多糖贮积症、iiib型粘多糖贮积症、亨廷顿氏病(huntingtondisease)、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、巴藤病(battendisease)、脊髓小脑性共济失调、脊髓性肌萎缩、卡纳万病(canavandisease)和弗里德赖希氏共济失调(friedreich'sataxia)。21.在某些实施例中，所述外源核酸包含编码感兴趣的蛋白质或其一部分的序列，其中所述感兴趣的蛋白质选自由以下组成的组：tau、mecp2、ngf、apoe、gdnf、sumf、sgsh、aadc、cd、p53、arsa芳基硫酸酯酶a、abcd1、smn1、naglu、sod1、c9orf72、tardbp、fus、htt、lrrk2、paris、parkin、gad和α-突触核蛋白。在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体，任选地包含aav病毒颗粒。在某些实施例中，所述外源核酸包含aav9血清型的aav载体(例如，aav9血清型的aav病毒颗粒)。在一些实施例中，所述治疗有效量在106vg/kg到1014vg/kg(载体基因组/kg)的范围内。在某些实施例中，治疗有效量不超过1014vg/kg(例如，不超过1013vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1011vg/kg或甚至更低)。22.在某些实施例中，所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸通过全身施用(例如，静脉内、肌肉内、皮下施用)，或通过实质内、脑室内或鞘内途径施用。23.在一些实施例中，所述治疗有效量是亚治疗量。24.另一方面，本公开提供了一种减少受试者的副作用或提高对外源核酸的耐受性的方法，所述方法包括：向所述受试者递送亚治疗量的用于治疗或预防病状的所述外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna，并且其中所述受试者已经或正在同时施用有效量的阿司匹林化合物。25.另一方面，本公开提供了一种减少受试者的副作用或提高对外源核酸的耐受性的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用有效量的阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送亚治疗量的用于治疗或预防病状的所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。26.在一些实施例中，所述副作用对递送到所述受试者的所述外源核酸是剂量依赖性的。27.在一些实施例中，所述亚治疗量不超过90％、不超过80％、不超过70％、不超过60％、不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的常规量的相同外源核酸，所述常规量是在不施用所述阿司匹林化合物的情况下将需要的。28.在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体，任选地包含aav病毒颗粒。在一些实施例中，所述aav载体或所述aav病毒颗粒的所述亚治疗量不超过107vg/kg(载体基因组/kg)、不超过108vg/kg、不超过109vg/kg、不超过1010vg/kg、不超过1011vg/kg、不超过1012vg/kg、不超过1013vg/kg或不超过1014vg/kg。29.在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是以不超过30mg/kg、不超过50mg/kg、不超过100mg/kg、不超过110mg/kg、不超过120mg/kg、不超过120mg/kg、不超过130mg/kg、不超过140mg/kg、不超过150mg/kg、不超过160mg/kg、不超过170mg/kg、不超过180mg/kg、不超过190mg/kg或不超过200mg/kg的量向所述受试者施用的。30.在一些实施例中，在将所述外源核酸递送到所述受试者之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述受试者施用所述阿司匹林化合物，和/或在递送所述核酸之前施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)。在一些实施例中，通过肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径向所述受试者施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸。31.在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含亚治疗量的外源核酸以及药学上可接受的载体，任选地进一步包含阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。32.在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含外源核酸、阿司匹林化合物和药学上可接受的载体，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。33.在一些实施例中，本公开的药物组合物进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述阿司匹林化合物要在施用所述药物组合物之前施用或与施用所述药物组合物同时施用。34.在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体，任选地包含aav病毒颗粒。在一些实施例中，所述药物组合物呈单位剂量，并且含有不超过1010vg、1010.5vg、1011vg、1011.5vg、1012vg、1012.5vg、1013vg、1013.5vg、1014vg、1014.5vg、1015vg、1015.5vg或1016vg的aav病毒颗粒。35.在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：a)第一组合物，所述第一组合物包含阿司匹林化合物；以及b)第二组合物，所述第二组合物包含外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。36.在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述第一组合物要在所述第二组合物之前施用或与所述第二组合物同时施用。在一些实施例中，所述第一组合物和所述第二组合物可以在使用之前容易地混合以提供组合的组合物。在一些实施例中，所述第二组合物包含亚治疗量的所述外源核酸。37.在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含阿司匹林化合物和外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。38.在又另外的方面，本公开提供了一种组合物，其包含：阿司匹林化合物和外源核酸的组合，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。39.前述概述仅是说明性的，并且并不旨在以任何方式进行限制。除了上文描述的说明性方面、实施例和特征之外，通过参考附图和以下详细说明，另外的方面、实施例和特征将变得明显。附图说明40.图1示出了aav介导的荧光素酶基因在用不同浓度的阿司匹林治疗的小鼠中的表达。41.图2示出了通过不同浓度的阿司匹林治疗，aav注射后3天的ifn-α水平。42.图3a-3c示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav8(图3a)、aav9(图3b)和aav843(图3c)之后荧光素酶的表达水平。43.图4a-4b示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav8之后的ifn-α(图4a)和ifn-β(图4b)水平。44.图5a-5b示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav9之后的ifn-α(图5a)和ifn-β(图5b)水平。45.图6a-6b示出了在用阿司匹林治疗的小鼠和对照组中注射aav843之后的ifn-α(图6a)和ifn-β(图6b)水平。46.图7a-7d示出了在预先注射阿司匹林，或同时注射阿司匹林，或不注射阿司匹林的接受aav9-cb-gluc的小鼠脑组织或肝组织中gluc的mrna水平(图7a、7c)和酶活性水平(图7b、7d)。47.图8示出了在mpsii小鼠中以3×1013vg/kg或1×1014vg/kg或3×1013vg/kg的aav9-cb-ids载体治疗并结合50mg/kg的阿司匹林预治疗之后，脑中的ids酶活性。48.图9示出了本公开中公开的所有序列。具体实施方式49.在以下详细描述中，参考了附图，所述附图形成详细描述的一部分。在附图中，除非上下文另有说明，否则类似符号通常标识类似组件。在详细说明、附图以及权利要求中所描述的说明性实施例并不旨在是限制性的。在不脱离此处呈现的主题精神或范围的情况下，可以利用其它实施例，并且可以做出其它改变。50.应理解，为清楚起见而在单独实施例的上下文中描述的本公开的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见而在单个实施例的上下文中描述的本公开的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。为了说明，如果本文所公开的一个具体实施例包含组分a、b和c，应当理解，本公开还旨在包含单独含有a、b或c，或a、b或c的任何组合的实施例。51.除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。52.本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过引用整体并入本文。53.如本文所用，“一/一个(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以意指单个细胞或多个细胞。54.如本文所用，除非另有明确说明，否则词语“或”以“和/或”的包含性意义而不是“任一/或”的排他性意义使用。55.除非另有明确说明，否则本文所描述的数字范围可以包含所述范围和每个子范围内的每个数字。56.如本文所用，术语“约”在提及如剂量、时间、温度、活性或其它生物活性等可测量值时，意在涵盖所指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。57.本发明至少部分地基于以下发现：在递送外源核酸之前或同时向细胞或受试者施用阿司匹林化合物可以显著增加外源核酸在细胞中或在受试者中的表达。58.另一方面，本公开提供了增加外源核酸在细胞或在受试者中的表达水平或延长其表达持续时间的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞或所述受试者之前或同时向所述细胞或所述受试者施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna，并且由此增加或延长所述外源核酸的所述表达水平或所述表达持续时间，分别相比于在未施以所述阿司匹林化合物的情况下获得的对照表达水平或对照表达持续时间而言。59.另一方面，本公开提供了表达细胞或受试者中的外源核酸或增加外源核酸的表达水平或延长外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞或所述受试者，其中所述细胞或所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物；并且其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中或所述受试者中转化为双链dna。60.另一方面，本公开提供了表达细胞或受试者中的外源核酸或增加外源核酸的表达或延长外源核酸的表达持续时间的方法，所述方法包括：61.a)向所述细胞或所述受试者施用阿司匹林化合物；以及62.b)在适于表达的条件下将所述外源核酸递送到所述细胞或所述受试者，63.其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中或所述受试者中转化为双链dna。64.一方面，本公开提供了对细胞进行预备以递送外源核酸的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述细胞施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述细胞中转化为双链dna。65.另一方面，本公开提供了对患有可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状的受试者进行预备的方法，所述方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述受试者施用阿司匹林化合物，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna。66.另一方面，本公开提供了治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna，并且其中所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物。67.另一方面，本公开提供了治疗或预防可通过外源核酸或其表达产物治疗或预防的病状的方法，所述方法包括：a)向所述受试者施用阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在递送之后在所述受试者中转化为双链dna。68.如本文所用，术语“阿司匹林化合物”包含阿司匹林、其类似物和衍生物。阿司匹林也被称为乙酰水杨酸，并且其化学结构如下所示：69.阿司匹林的衍生物包含但不限于阿司匹林的盐(例如，药学上可接受的盐)、酯、溶剂化物和前药，它们可以提供乙酰水杨酸或其任何活性形式，例如，在体内通过水解或代谢过程之后。阿司匹林的示例性盐包含但不限于阿司匹林-精氨酸(其是由l-精氨酸和乙酰水杨酸形成的复盐，也称为精氨酸阿司匹林)、乙酰水杨酸锂(例如，)、乙酰水杨酸钠(例如，)、乙酰水杨酸钙(例如，)、乙酰水杨酸钙(例如，)、乙酰水杨酸钙(例如，)和乙酰水杨酸镁(例如，)。阿司匹林的示例性酯包含但不限于乙酰水杨酸的乙醇酰胺、乙醇酸酯、(酰氧基)甲基酯、烷基酯和芳基酯。70.阿司匹林的类似物是作为阿司匹林的功能等效物的化合物，但没有阿司匹林的化学结构，并且不是阿司匹林的衍生物。与阿司匹林相比，阿司匹林的类似物可以具有相似(尽管不相同)的结构，并且还共享与如本文所提供的阿司匹林相同的生物活性。71.外源核酸72.如本文所用，术语“外源核酸”是要递送到细胞或受试者的核酸。外源核酸可以是线性的或环状的，并且可以呈裸核酸的形式或可以呈包装形式，如病毒颗粒。外源核酸可以包含在细胞或受试者中非天然存在的序列。外源核酸包含双链dna，或者可以在将外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。73.在某些实施例中，所述外源核酸包含双链脱氧核糖核酸(dna)。外源核酸可以由其整个长度上的双链dna构成，例如，作为双链dna(dsdna)病毒载体、dsdna病毒颗粒、双链质粒、双链人工染色体或外泌体或双链裸dna。可替代地，外源核酸可以包含部分dsdna，例如，外源核酸可以是在部分序列上具有二级双链结构的单链dna。74.在某些实施例中，所述外源核酸包含不是dsdna，但可以在递送之后在所述细胞中转化为dsdna的核酸。此类核酸的实例包含但不限于单链dna(其可以通过例如dna聚合酶转化为dsdna)和rna(其可以通过逆转录酶逆转录为dsdna)，如逆转录病毒载体、逆转录病毒颗粒、慢病毒载体和慢病毒颗粒。在某些实施例中，此类核酸可以在所述细胞的细胞质中转化为dsdna。75.在某些实施例中，所述外源核酸包含载体。术语“载体”意指用于将核酸克隆和/或转移到细胞中的任何核酸分子(无论是裸的还是包装的)。载体包含用于在体外、离体和/或体内将核酸引入到细胞中的病毒核酸分子和非病毒(例如，质粒、外泌体)核酸分子两者。在一些实施例中，载体可以是重组的，因为其含有一个或多个异源核苷酸序列，如转基因或异源调节序列。76.在某些实施例中，所述外源核酸包含质粒。如本文所用，术语“质粒”是指包括染色体外遗传物质的构建体，通常是可以独立于染色体dna复制的dna的环状双链体。质粒通常用于基因转移，作为可以将dna片段引入到宿主生物体中的媒剂。77.在某些实施例中，所述外源核酸包含病毒载体或包括在病毒载体内。如本文所用，“病毒载体”是指单链或双链的核酸载体，在感兴趣的核酸序列(例如，编码感兴趣的的蛋白质的表达构建体)的5'端和/或3'端处具有5'病毒末端重复序列和/或3'病毒末端重复序列。病毒载体可以包含一对tr或单个tr。术语“末端重复”或“tr”包含形成发夹结构并介导如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救(provirusrescue)等期望的功能的任何病毒末端重复或合成序列。例如，5'病毒末端重复序列和3'病毒末端重复序列可以含有复制原点，并且允许在一个病毒末端重复处进行dna合成启动并继续到另一个病毒末端重复。病毒末端重复的实例包含但不限于反向末端重复(itr)(例如，包含在aav中的那些)、长末端重复(ltr)(例如，包含在逆转录病毒中的那些)等。病毒载体在itr之间可以包含一个或多个与病毒基因组异源的序列。78.如本文所用，病毒载体还可以涵盖由一个或多个含有病毒核酸序列的载体产生的病毒颗粒。如本文所用，“病毒颗粒”意指包装在病毒衣壳内的病毒基因组。病毒颗粒中的病毒基因组可以是经修饰的病毒基因组，使得其可能缺少一些天然病毒序列和/或可能含有与天然病毒基因组异源的一些序列。79.本领域已知多种病毒载体适于将核酸递送到细胞或递送到如人的受试者。最常用的病毒载体包含源自腺病毒、腺相关病毒(aav)和逆转录病毒的那些病毒载体，包含慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(hiv)。逆转录病毒载体、腺病毒和aav提供了一种在哺乳动物细胞中有效引入和表达外源基因的有效且有用的方法。这些载体具有广泛的宿主和细胞类型范围，并且稳定且有效地表达基因。这些载体的安全性已经为本领域所理解。可以用于将基因转移到受试者中的其它病毒载体包含疱疹病毒乳多空病毒，如jc、sv40、多瘤病毒；爱泼斯坦巴尔病毒(epstein-barrvirus，ebv)；乳头瘤病毒，例如牛乳头瘤病毒i型(bpv)；脊髓灰质炎病毒和其它人类和动物病毒。80.在某些实施例中，所述外源核酸包含aav载体。aav是基因组大小为约4.7kb的单链人dna细小病毒。aav基因组含有两个主要基因：rep基因，其编码rep蛋白(rep76、rep68、rep52和rep40)；以及cap基因，其编码aav结构蛋白(vp-1、vp-2和vp-3)，侧接有5′反向末端重复(itr)和3′itr。如本文所用，术语“aav载体”涵盖包含一个或多个侧接至少一个或两个aav反向末端重复序列的异源序列的任何病毒载体。如本领域中被充分理解的，术语“aavitr”是存在于天然单链aav基因组的两个末端处的大约145个核苷酸的序列。itr最外层的125个核苷酸可以以两种替代性朝向中的任一种存在，从而产生不同aav基因组之间和单个aav基因组的两端之间的异质性。最外层的125个核苷酸还含有若干个较短的自互补区域，允许在itr的此部分内发生链内碱基配对。81.aavitr可以源自任何aav，包含但不限于aav血清型1(aav1)、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、禽类aav、牛类aav、犬类aav、马类aav和羊类aav以及现在已知或以后发现的任何其它aav。关于详细信息，请参见例如bernardnf等人,《病毒学(virology)》,第2卷,第69章(第4版,利平科特-雷文出版社(lippincott-ravenpublishers))，gao等人,(2004)《病毒学杂志(j.virol.)》78:6381-6388。aavitr区的核苷酸序列是已知的。参见例如kotin,r.m.(1994)《人类基因疗法(humangenetherapy)》5:793-801；berns,k.i.“细小病毒科及其复制(parvoviridaeandtheirreplication)”《基础病毒学(fundamentalvirology)》,第2版,(b.n.fields和d.m.knipe,编辑)。以下提供了aav1、aav2和aav3末端重复序列的早期描述：xiao,x.,(1996),“对腺相关病毒(aav)dna复制和整合的表征(characterizationofadeno-associatedvirus(aav)dnareplicationandintegration)”,博士论文,宾夕法尼亚州匹兹堡，匹兹堡大学(universityofpittsburgh,pittsburgh,pa)。(其全部内容并入本文)。82.aavitr可以是天然aavitr，或者可替代地可以从天然aavitr改变，例如通过突变、缺失或插入，只要改变的itr仍然可以介导期望的生物学功能，如复制、病毒包装、整合等。侧接aav载体中的选定核苷酸序列的5'和3'itr不必相同或源自相同的aav血清型，只要它们按预期发挥作用，例如，允许感兴趣的序列的切除和拯救以及整合到受体细胞基因组中。83.aav的基因组序列以及aavrep基因和cap基因是本领域已知的，可以在文献和公共数据库如基因库数据库(genbankdatabase)中找到。下表1示出了aav基因组或aav衣壳序列的一些示例性序列，并且更多内容在bernardnf等人,《病毒学》,第2卷,第69章(第4版,利平科特-雷文出版社)；gao等人,(2004)《病毒学杂志》78:6381-6388；nasomf等人,《生物制药(biodrugs)》.2017；31(4):317-334中进行了综述。84.表1.[0085][0086]在一些实施例中，所述aav载体可以是重组的。重组aav载体可以包含一个或多个不同病毒来源的异源序列(例如，来自非aav病毒，或来自不同血清型的aav，或来自部分或完全合成的序列)。在某些实施例中，所述异源序列侧接至少一个aavitr。[0087]在某些实施例中，本文提供的aav载体具有适于包装到aav病毒颗粒中的大小。例如，aav载体的大小可以达到要使用的aav的基因组大小的大小限制，例如，达到5.2kb。在某些实施例中，所述aav载体的大小不超过5.2千碱基(kb)、不超过约5kb、不超过约4.5kb、不超过约4kb、不超过约3.5kb、不超过约3kb，大小不超过约2.5kb，参见例如dong,j.y.等人(1996年11月10日)。[0088]由于单个aav的包装大小限制，对于超出单个aav载体的包装能力的异源序列，可以以允许在与这些aav载体共转染的细胞中重建为完整序列或表达盒的方式构建两个或更多个aav载体。本领域已知用于构建此类aav载体，例如用于构建重叠双载体、反式剪接载体对、杂合载体系统的方法，并且更多详细信息可在chamberlaink等人,《人类基因疗法方法(humgenethermethods)》.2016年2月1日；27(1):1–12，以及美国专利第6,596,535号中获得。[0089]aav载体可以使用本领域已知的方法构建。raav载体构建的一般原理是本领域已知的。参见例如，carter,1992,《生物技术当前述评(currentopinioninbiotechnology)》,3:533-539；和muzyczka,1992,《微生物学和免疫学当前论题(curr.top.microbiol.immunol.)》,158:97-129。例如，异源序列可以直接插入aav基因组的itr之间，其中rep基因和/或cap基因已缺失。只要保留足够的itr部分以允许复制和包装功能，aav基因组的其它部分也可以是缺失的。可以使用本领域众所周知的技术来设计此类构建体。参见例如，美国专利第5,173,414号和第5,139,941号；国际公开号第wo92/01070号(1992年1月23日出版)和wo93/03769(1993年3月4日出版)；lebkowski等人(1988)《分子和细胞生物学(molec.cell.biol.)》8:3988-3996；vincent等人(1990)《疫苗(vaccines)》90(冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress))；carter,b.j.(1992)《生物技术当前述评》3:533-539；muzyczka,n.(1992)《微生物学和免疫学当前论题》158:97-129；kotin,r.m.(1994)《人类基因疗法》5:793-801；shelling和smith(1994)《基因疗法(genetherapy)》1:165-169；以及zhou等人(1994)《实验医学杂志(j.exp.med.)》179:1867-1875。[0090]可替代地，aavitr可以从病毒基因组或从含有所述病毒基因组的aav载体中切除，并且使用如在上述sambrook等人中所描述的那些标准连接技术，融合到与异源序列的5'和3'。含有aavitr的aav载体可商购获得，并且已在例如美国专利第5,139,941号中进行了描述。[0091]在某些实施例中，所述aav载体包含重组aav病毒颗粒。aav病毒颗粒可以由aav表达载体产生。aav颗粒可以通过使用已知技术，如通过转染将aav表达载体连同如编码aavcap/rep基因的质粒和由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助基因等其它必要的机制一起引入到合适的宿主细胞中来产生(参见例如，m.f.naso等人,《生物制药》,31(4):317-334(2017)，其全部内容并入本文)。aav表达载体可以在宿主细胞中表达并包装到病毒颗粒中。[0092]在一些实施例中，所述aav载体进一步包含编码衣壳蛋白的cap基因。在一些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含天然或重组衣壳蛋白。在一些实施例中，所述衣壳蛋白可以是经修饰的或嵌合的或合成的。经修饰的衣壳可以包含如插入、添加、缺失或突变等修饰。例如，经修饰的衣壳可以并入检测或纯化标签。嵌合衣壳包含两个或更多个衣壳序列的部分。合成衣壳包含合成或人工设计的序列。aav的衣壳结构也是本领域中已知的并且在上述bernardnf等人中进行了更详细的描述。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白源自两种或更多种aav血清型。如本文所用，关于aav的术语“血清型”是指衣壳蛋白与定义的抗血清的反应性。本领域已知各种aav血清型在功能上和结构上是相关的，甚至在遗传水平上也是如此(参见例如，blacklow,“细小病毒和人类疾病(parvovirusesandhumandisease)”的第165-174页j.r.pattison编辑.(1988)；以及rose,《综合病毒学(comprehensivevirology)》3:1,1974)。然而，不同血清型的aav病毒颗粒可以具有不同的组织向性(详细信息参见，nonnenmacherm等人,《基因疗法》，2012年6月；19(6):649–658)，并且可以适当地选择用于靶组织的基因疗法。在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白可以具有特定的向性特性。术语“向性特性”是指一种或多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。例如，衣壳蛋白可以具有对肝脏(例如，肝细胞)、脑、眼、肌肉、肺、肾、肠、胰腺、唾液腺或滑膜或任何其它合适的细胞、组织或器官具有特异性的向性特性。[0093]在一些实施例中，所述cap基因或所述衣壳蛋白源自任何合适的aav衣壳基因或蛋白，例如但不限于源自以下的aav衣壳基因或蛋白：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav12、aav843、aavbb2、aavcys、aavrh10、aavrh20、aavrh39、aavrh43、aavrh64、aavhu37、aav3b、aavhu48、aavhu43、aavhu44、aavhu46、aavhu19、aavhu20、aavhu23、aavhu22、aavhu24、aavhu21、aavhu27、aavhu28、aavhu29、aavhu63、aavhu64、aavhu13、aavhu56、aavhu57、aavhu49、aavhu58、aavhu34、aavhu45、aavhu47、aavhu51、aavhu52、aavhut41、aavhus17、aavhut88、aavhut71、aavhut70、aavhut40、aavhut32、aavhut17、aavhulg15、aavhu9、aavhu10、aavhu11、aavhu53、aavhu55、aavhu54、aavhu7、aavhu18、aavhu15、aavhu16、aavhu25、aavhu60、aavch5、aavhu3、aavhu1、aavhu4、aavhu2、aavhu61、aavrh62、aavrh48、aavrh54、aavrh55、aavcy2、aavrh35、aavrh37、aavrh36、aavcy6、aavcy4、aavcy3、aavcy5、aavrh13、aavrh38、aavhu66、aavhu42、aavhu67、aavhu40、aavhu41、aavrh40、aavrh2、aavbb1、aavhu17、aavhu6、aavrh25、aavpi2、aavpi3、aavrh57、aavrh50、aavrh49、aavhu39、aavrh58、aavrh61、aavrh52、aavrh53、aavrh51、aavhu14、aavhu31、aavhu32、aavrh34、aavrh33、aavrh32、禽类aavatccvr-865、禽类aav菌株da-1或牛类aav。[0094]aav843的衣壳与wo2019241324a1(其全部内容并入本文)中公开的合成衣壳aavxl32相同，并且aav843也公开于例如xuj.等人,《国际临床与实验医学杂志(intjclinexpmed)》,2019；12(8):10253-10261中。在某些实施例中，aav843的衣壳蛋白具有seqidno:10的氨基酸序列。在某些实施例中，编码aav843的衣壳蛋白的衣壳基因具有与seqidno:6至少90％、92％、95％、97％或98％相同或者作为具有简并密码子取代的seqidno:6的变体的核酸序列。简并密码子取代，也称为同义核苷酸取代，可以通过产生一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置由混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列实现。[0095]在某些实施例中，aav8的衣壳蛋白具有seqidno:8的氨基酸序列。在某些实施例中，编码aav8的衣壳蛋白的衣壳蛋白的衣壳基因具有与seqidno:4至少90％或95％相同，或者作为具有简并密码子取代的seqidno:4的变体的核酸序列。[0096]在某些实施例中，aav9的衣壳蛋白具有seqidno:9的氨基酸序列。在某些实施例中，编码aav9的衣壳蛋白的衣壳基因具有与seqidno:5至少90％或95％相同，或者作为具有简并密码子取代的seqidno:5的变体的核酸序列。[0097]aav衣壳基因序列和蛋白质序列的更多实例可以在基因库数据库中找到，参见基因库登录号：af043303、af028705、af028704、j02275、j01901、j02275、x01457、af288061、ah009962、ay028226、ay028223、nc001358、nc001540、af513851、af513852、ay530579、ay631965、ay631966；af063497、af085716、af513852、ay530579、aas99264.1、ay243022、ay243015、ay530560、ay530600、ay530611、ay530628、ay530553、ay530606、ay530583、ay530555、ay530607、ay530580、ay530569、nc006263、nc005889、nc001862、ay530609、ay530581、ay530563、ay530591、ay530562、ay530584、ay530622、ay530601、ay530586、ay243021、ay530570、ay530589、ay530595、ay530572、ay530588、ay530575、ay530565、ay530590、ay530602、ay530566、ay530587、ay530585、ay530564、ay530592、ay530623、ay530574、ay530593、ay530560、ay530594、ay530573、af513852、ay530624、ay530561、ay242997、ay530625、ay530567、ay530556、ay530578、ay530568、ay530618、ay243020、ay530579、ay530619、ay530596、ay530612、ay243000、ay530597、ay530620、ay242998、ay530598、ay242999、ay530599、ay243016、nc001729、nc001401、ay243018、nc001863、ay530608、ay243019、nc001829、ay530610、ay243017、ay243001、ay530613、ay243013、ay243002、ay530614、ay243003、ay695378、ay530558、ay530626、ay695376、ay695375、ay530605、ay695374、ay530603、ay530627、ay695373、ay695372、ay530604、ay695371、ay530600、ay695370、ay530559、ay695377、ay243007、ay243023、ay186198、ay629583、nc004828、ay530629、ay530576、ay243015、ay388617、ay530577、ay530582、ay530615、ay530621、ay530617、ay530557、ay530616或ay530554。[0098]在某些实施例中，所述aav载体包含来自一种aav血清型的cap基因和来自第二种血清型的aavitr。在某些实施例中，所述aav载体包含aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含假型化(pseudotyped)aav。“假型化”aav是指含有来自一种血清型的衣壳蛋白和包含第二种血清型的5'-3'itr的病毒基因组的aav。假型化aav将预期具有衣壳蛋白来源的血清型的细胞表面结合特性，以及与itr来源的血清型一致的遗传特性。[0099]在某些实施例中，所述外源核酸包含腺病毒载体。腺病毒具有不能整合到宿主基因组中的双链线性dna基因组。腺病毒载体的说明性实例包含但不限于第一代腺载体(例如，缺失了e1a基因和e1b基因的腺载体，以及缺失了e1基因和e3基因的腺载体)、第二代腺病毒载体(例如，缺失了e1基因和e2基因的腺载体、缺失了e1基因和e4基因的腺载体)和其中缺失了所有病毒编码序列的无肠腺病毒载体(也被称为辅助依赖性腺病毒载体)。[0100]在某些实施例中，所述外源核酸包含逆转录病毒载体。逆转录病毒具有rna基因组并且可以通过逆转录酶在宿主细胞中复制，以从rna基因组产生dna。逆转录病毒载体的说明性实例包含但不限于源自以下的载体：禽白血病病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、牛白血病病毒、大眼鲈皮肤肉瘤病毒(walleyedermalsarcomavirus)、hiv-1(人类免疫缺陷病毒)、hiv-2、siv(猿猴免疫缺陷病毒)、eiav(马传染性贫血病毒)、fiv(猫免疫缺陷病毒)、caev(山羊关节炎脑炎病毒)、vmv(维斯纳/梅迪病毒(visna/maedivirus))、人类泡沫病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukaemiavirus)、劳氏肉瘤病毒(roussarcomavirus)、猫白血病病毒、人类t淋巴细胞病毒和猿猴泡沫病毒。[0101]在某些实施例中，所述外源核酸包含慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有具有调节或结构功能的其它基因。慢病毒载体的说明性实例包含但不限于源自hiv-1、siv、fiv、caev、vmv和eiav的载体。[0102]在某些实施例中，所述外源核酸可以包含编码感兴趣的蛋白质或其一部分的编码序列。在一些实施例中，可以将所述感兴趣的蛋白质的所述编码序列划分或拆分为两个或更多个外源核酸序列(例如，两个或更多个质粒，或两个或更多个病毒颗粒)，其方式为允许所述划分的编码序列在递送到所述细胞之后(例如，通过同源重组或通过某些病毒包装过程)接合在一起。这将允许其长度超过载体(如aav载体或质粒)的递送能力的编码序列被递送和表达。[0103]感兴趣的蛋白质可以是其在细胞中或在受试者中的表达是感兴趣的任何蛋白质。在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是治疗蛋白(例如，用于医学用途或兽医用途)、免疫原性蛋白(例如，用于疫苗)、报告蛋白、核酸酶或治疗靶蛋白。[0104]治疗蛋白可以在体外表达以提供治疗组合物以递送到有需要的受试者，或者可以在体内表达以提供治疗益处。此类治疗蛋白的实例包含但不限于抗体(例如，单克隆或双特异性或多特异性)、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、肽激素、生长因子、促红细胞生成素(epo)、细胞因子、凝血因子、抗血友病因子、干扰素、fc融合蛋白(如ctla-4fc融合蛋白、vegfrfc融合蛋白)、治疗酶(例如，溶酶体水解酶和硫酸酯酶)。可替代地，治疗蛋白可以在有需要的受试者体内表达。此类治疗蛋白的实例包含但不限于运动神经元存活基因1(smn1，基因id：6066)、α-n-乙酰葡糖胺糖苷酶(naglu，基因id：4669)、n-磺基葡糖胺磺酰水解酶(sgsh，基因id：6448)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids，基因id：3423)、凝血因子viii(fviii，基因id：2157)、凝血因子ix(fix，基因id：2158)、布鲁顿氏酪氨酸激酶(brutontyrosinekinase，btk，基因id：695)、atp结合盒d亚家族成员1(abcd1，基因id：215)、酰基-coa脱氢酶极长链(acadvl，基因id：37)、雄激素受体重复不稳定区(ar，基因id：109504725)、血红蛋白亚基β(hbb，基因id：3043)、钠电压门控通道α亚基1(scn1a，基因id：6323)、cf跨膜传导调节因子(cftr，基因id：1080)、集落刺激因子2受体亚基α(csf2ra，基因id：1438)、白介素2受体亚基α(il2ag，基因id：3559)、苯丙氨酸羟化酶(pha，基因id：5053)、丝氨酸/苏氨酸激酶11(stk11，基因id：6794)、磷脂酰肌醇聚糖锚生物合成a类(piga，基因id：5277)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(otc，基因id：5009)、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症(nags，基因id：162417)、dm1蛋白激酶(dmpk，基因id：1760)、cchc型锌指核酸结合蛋白(cnbp，基因id：7555)、酰基-coa脱氢酶中链(acadm，基因id：34)、gnas复合基因座(gnas，基因id：2778)、原纤维蛋白1(fbn1，基因id：2200)、脂肪酶a，溶酶体酸型(lipa，基因id：3988)、溶质载体家族7成员7(slc7a7，基因id：9056)、羟酰基-coa脱氢酶三功能多酶复合物亚基α(hadha，基因id：3030)、生长激素受体(ghr，基因id：2690)、异戊酰基-coa脱氢酶(idv，基因id：3712)、碱性磷酸酶，生物矿化相关(alpl，基因id：249)、溶质载体家族25成员15(slc25a15，基因id：10166)、亨廷顿蛋白(huntingtin，htt，基因id：3064)、羧化全酶合成酶(hcs，基因id：3141)、notch受体3(notch3，基因id：4854)、醛缩酶，果糖二磷酸b(aldob，基因id：229)、atp酶铜转运β(atp7b，基因id：540)、葡萄糖苷酶α，酸(gaa，基因id：2548)、戊二酰基-coa脱氢酶(gcdh，基因id：2639)、溶质载体家族12成员3(slc12a3，基因id：6559)、葡萄糖基神经酰胺酶β(gba，基因id：2629)、家族性地中海热(familialmediterraneanfever，mefv，基因id：4210)、半乳糖苷酶α(gla，基因id：2717)、氯电压门控通道1(clcn1，基因id：1180)、核受体亚家族0组b成员1(nr0b1，基因id：190)、精氨琥珀酸合成酶1(ass1，基因id：445)、溶质载体家族25成员13(slc25a13，基因id：10165)、溶质载体家族22成员5(slc22a5，基因id：84)、钠电压门控通道α亚基5(scn5a，基因id：6331)、生物素酶(btd，基因id：686)、乙酰基-coa乙酰转移酶1(acat1，基因id：38)、精氨酸酶(arg1，基因id：383)、细胞色素p450家族21亚家族a成员2(cyp21a2，基因id：1589)。仍在另一个实施例中，治疗蛋白可以离体表达，例如在要移植到受试者的t细胞上。此类治疗蛋白包含例如嵌合抗原受体(car)。[0105]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是免疫原性蛋白。免疫原性蛋白或免疫原可以是适于保护受试者免于疾病的任何多肽，所述疾病包含但不限于如微生物、细菌、原生动物、寄生虫、真菌和病毒疾病等传染性疾病以及癌症。例如，免疫原可以是正粘病毒免疫原(例如，流感病毒免疫原，如流感病毒血凝素(ha)表面蛋白或流感病毒核蛋白基因，或马流感病毒免疫原)，或慢病毒免疫原(例如，马传染性贫血病毒免疫原、猿猴免疫缺陷病毒(siv)免疫原或人类免疫缺陷病毒(hiv)免疫原，如hiv或siv包膜gp160蛋白、hiv或siv基质/衣壳蛋白，以及hiv或sivgag、pol和env基因产物)。免疫原还可以是沙粒病毒免疫原(例如，拉沙热病毒(lassafevervirus)免疫原，如拉沙热病毒核衣壳蛋白基因和拉沙热包膜糖蛋白基因)、痘病毒免疫原(例如，牛痘，如牛痘ll或l8基因)、黄病毒免疫原(例如，黄热病病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原)、丝状病毒免疫原(例如，埃博拉病毒(ebolavirus)免疫原或马尔堡病毒(marburgvirus)免疫原，如np和gp基因)、布尼亚病毒免疫原(例如，rvfv、cchf和sfs病毒)或冠状病毒免疫原(例如，传染性人冠状病毒免疫原，如人冠状病毒包膜糖蛋白基因、或猪传染性胃肠炎病毒免疫原、或禽传染性支气管炎病毒免疫原、或严重急性呼吸系统综合征(sars)免疫原，如s[sl或s2]、m、e或n蛋白或其免疫原性片段或covid-19免疫原)。免疫原可以进一步是脊髓灰质炎免疫原、疱疹免疫原(例如，cmv、ebv、hsv免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、风疹免疫原、白喉毒素或其它白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如，甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)免疫原或本领域已知的任何其它疫苗免疫原。对于另一个实例，免疫原可以是在肿瘤或癌细胞的表面上表达的肿瘤或癌症抗原。示例性肿瘤或癌症抗原包含但不限于b-连环蛋白、brca1基因产物、brca2基因产物、epcam、egfr、her2、vegfr、cd19、psma等。[0106]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是报告蛋白。报告蛋白可以在细胞中表达以提供用于生物测定的工程化细胞。报告蛋白的实例包含但不限于荧光蛋白(例如，egfp、gfp、rfp、bfp、yfp或dsred2)、产生可检测产物的酶，如荧光素酶(例如，来自高斯公司(gaussia)、海肾公司(renilla)或pho公司)、b-半乳糖苷酶、b-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶和氯霉素乙酰转移酶基因或可以直接检测到的蛋白质。几乎任何蛋白质都可以通过使用例如针对蛋白质的特异性抗体来直接检测。适于真核细胞的阳性或阴性选择的另外的标志物(和相关抗生素)公开于以下中：sambrook和russell(2001),《分子克隆(molecularcloning)》,第3版,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)以及ausubel等人(1992),《当代分子生物学实验指南(currentprotocolsinmolecularbiology)》,约翰威利父子公司(johnwiley&sons)，包含定期更新。[0107]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是核酸酶。如本文所用，术语“核酸酶”是指能够切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶。本文所提供的核酸酶可以是天然存在的或经修饰的。在本公开中有用的核酸酶的实例包含但不限于锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)或cas家族蛋白(如cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、cas11、cas12、cas13、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、其同源物或其经修饰版本)。此类核酸酶可能在例如宿主基因组中的基因工程或基因编辑中有用。[0108]在某些实施例中，感兴趣的蛋白质可以是治疗靶蛋白。治疗靶蛋白的实例包含但不限于gpcr、ctla-4、her2、粘连蛋白-4、硬化蛋白、p-选择蛋白、vegf、rsvf、vegfr2、cd79、il23p19、vwf、ifn-γ、c5、pd-1、pd-l1、cgrp、cd3、cd11a、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、ige、klk、ccr4、fgf-23、il-6r、il-5、il-23p19、il-2r、il-17r、il-17、cd4、fix/fx、il-12、il-23、il-1β、il-5r、il-6r、il-4/il-13、pdgf-α、达比加群(dabigatran)、slamf7、egfr、pcsk9、gd2、cd3、cd19、α4β7整合素、α4β1整合素、pa、blys、rank、tnf-α、epcam、ggta1、内皮抑素和血管抑素。治疗靶蛋白在重组细胞中的表达可以在例如产生用于生物测定的重组细胞系，或用于筛选或鉴定能够靶向治疗靶蛋白或与治疗靶蛋白相互作用的潜在治疗剂中有用。[0109]可替代地，在某些实施例中，所述外源核酸可以包含编码功能性rna的编码序列。功能性rna可以是作用于生物靶标核酸序列的非翻译rna并且调节靶标，例如，抑制或降低靶标的表达或活性。例如，功能性rna可以是反义寡核苷酸、核酶(例如，如美国专利第5,877,022号中所描述的)、影响剪接体介导/原始剪接的rna(参见，puttaraju等人,(1999)《自然生物技术(naturebiotech)》.17:246；美国专利第6,013,487号；美国专利第6,083,702号)、包含介导基因沉默的小干扰rna(sirna)的干扰rna(rnai)(参见，sharp等人,(2000)《科学(science)》287:2431)、microrna或其它非翻译功能性rna，如向导rna(gorman等人,(1998)《美国国家科学院院刊(proc.nat.acad.sci.usa)》95:4929；yuan等人的美国专利第5,869,248号)、用于crispr技术的单向导rna(参见例如us10,266,850、us8,697,359、us20160298134、adlim等人,《自然通讯(natcommun)》9,1911(2018))等。功能性rna的潜在生物靶标可以包含但不限于多种药物抗性(mdr)蛋白靶标、肿瘤靶标(例如，vegf、her2、egfr、pd-l1等)、如病毒表面抗原等病原体靶标(例如，乙型肝炎表面抗原基因)、缺陷基因产物(突变的肌营养不良蛋白)或如本文所公开的治疗靶标(例如，肌生长抑制素)。[0110]编码感兴趣的蛋白质或编码功能性rna的编码序列可以与外源核酸中的一个或多个调节序列可操作地连接。如本文所用，术语“可操作地连接”意指编码序列以允许从细胞中的编码序列表达感兴趣的蛋白质的方式与外源核酸中的一个或多个调节序列直接或间接连接或缔合。编码序列连同调节序列一起在本文中可以被称为表达盒。在某些实施例中，外源核酸可以呈表达载体的形式。转录调节元件的实例包含一个或多个启动子和/或增强子，以及任选地聚腺苷酸化序列和/或插入在蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。[0111]如本文所用，术语“调节序列”是指对于编码序列的表达而言必需或有利的任何核苷酸序列。调节序列可以包含但不限于一个或多个启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化序列、内部核糖体进入位点和/或插入在蛋白质编码序列的外显子之间的一个或多个内含子。[0112]如本文所用，术语“启动子”是指可以控制编码序列的转录的多核苷酸序列。启动子序列包含对于rna聚合酶识别、结合和转录起始来说足够的特异性序列。另外，启动子序列可以包含调节rna聚合酶的这一识别、结合和转录起始活性的序列。启动子可以影响定位于与其自身相同的核酸分子上的基因或定位于与其自身不同的核酸分子上的基因的转录。取决于调节的性质，启动子序列的功能可以是组成型的或可被刺激诱导的。“组成型”启动子是指用于持续激活宿主细胞中的基因表达的启动子。“诱导型”启动子是指在存在某种或某些刺激的情况下激活宿主细胞中的基因表达的启动子。在一些实施例中，所述启动子是组织特异性启动子或细胞特异性启动子。如本文所用，术语“组织特异性启动子”是指用于在某种组织中优先地或排他地激活基因表达，并且在其它组织中没有活性或活性降低的启动子。在一个实施例中，所述启动子是cns特异性启动子。cns特异性启动子的实例包含从髓鞘碱性蛋白(mbp)、胶质原纤维酸性蛋白(gfap)和神经元特异性烯醇化酶(nse)、突触蛋白(syn)的基因中分离的启动子。肝脏特异性启动子包含但不限于甲状腺素结合球蛋白(tbg)、载脂蛋白e(apoe)、白蛋白(alb)、α-1抗胰蛋白酶(haat)。肌肉特异性启动子包含但不限于unc-45肌球蛋白分子伴侣b(unc45b)、rieg/pitx同源盒3(pitx3)。[0113]合适的启动子的实例包含但不限于polii启动子，如cmv(例如，cmv即刻早期启动子(cmv启动子))、鸡β-肌动蛋白启动子、poliii启动子、腺病毒主要晚期启动子(admlp)；单纯疱疹病毒(hsv)启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)启动子、人类免疫缺陷病毒(hiv)启动子(例如，hiv长末端重复(ltr)启动子)、莫洛尼病毒启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒ltr启动子、劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子、sv40早期启动子、来自人基因的启动子，如人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、人突触蛋白启动子、人肌肉肌酸启动子、人金属硫蛋白β-肌动蛋白启动子、人泛素c启动子(ubc)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(pgk)、人胸苷激酶启动子(tk)、人延伸因子1α启动子(ef1a)、花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、e2f-1启动子(e2f1转录因子1的启动子)、甲胎蛋白启动子、胆囊收缩素启动子、癌胚抗原启动子、c-erbb2/neu癌基因启动子、环氧合酶启动子、cxc-趋化因子受体4(cxcr4)的启动子、人附睾蛋白4(he4)启动子、己糖激酶ii型启动子、l-网素启动子、粘蛋白样糖蛋白(muc1)启动子、前列腺特异性抗原(psa)启动子、存活素启动子、酪氨酸酶相关蛋白(trp1)启动子和酪氨酸酶启动子、合成启动子、杂合启动子等。此类启动子序列可商购自例如stratagene公司(加利福尼亚州圣地亚哥)。[0114]如本文所用，术语“增强子”是指增加编码序列的转录和/或翻译的核苷酸序列。增强子可以与编码序列的5'末端或3'末端可操作地连接。在真核细胞中起作用的任何增强子都可以用于本公开。增强子的说明性实例包含但不限于猿猴病毒40(sv40)早期基因增强子、源自劳氏肉瘤病毒的长末端重复(ltr)的增强子和源自人巨细胞病毒(cmv)的增强子。[0115]如本文所用，术语“转录终止子”是指被真核细胞rna聚合酶识别以终止转录的核苷酸序列。终止子序列可以与编码序列的3'末端可操作地连接。在某些实施例中，终止子可以包含用于切割rna的信号，使得可以暴露rna上的聚腺苷酸化位点。在真核细胞中起作用的任何终止子序列都可以用于本公开。终止子序列的说明性实例包含但不限于源自病毒的终止序列，如sv40终止子，以及源自已知基因的终止序列，如牛生长激素终止子序列。[0116]如本文所用，术语“聚腺苷酸化序列”是指在转录时被真核细胞识别为用于将聚腺苷残基添加到经转录的mrna的信号的核苷酸序列。聚腺苷酸化序列可以与编码序列的3'末端可操作地连接。在真核细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以用于本公开。聚腺苷酸化序列的说明性实例包含但不限于aauaaa和sv40聚腺苷酸化信号。[0117]在某些实施例中，外源核酸可以包含编码两种感兴趣的蛋白质的两个序列。在此类实施例中，两个编码序列可以通过内部核糖体进入位点(ires)分开，这允许从mrna序列的中间开始翻译，并且因此将两个或更多个编码产物的翻译分开。ires可以在第一编码序列的3′末端之后和第二编码序列的5'末端之前的位置处可操作地连接。在真核细胞中起作用的任何ires序列都可以用于本公开。ires的说明性实例可以包含但不限于小核糖核酸病毒ires、瘟病毒ires、口蹄疫病毒ires、甲型肝炎ires和丙型肝炎ires。[0118]外源核酸的递送[0119]要与外源核酸一起递送的细胞可以是体外的、离体的或体内的。在某些实施例中，所述细胞是体外的，例如，适应或工程化以适于体外培养的细胞，如已确立的细胞系的细胞。在某些实施例中，所述细胞是离体的，例如，从受试者分离或源自受试者的原代细胞，如t细胞。在某些实施例中，所述细胞是活受试者中的体内细胞。[0120]要用外源核酸递送的受试者可以是非人动物或人。在一些实施例中，所述受试者是温血哺乳动物，例如，灵长类动物、狗、猫、牛、马、绵羊、山羊、兔、大鼠和小鼠。在一些实施例中，所述受试者是灵长类动物，例如，人。[0121]可以使用多种可用于此类递送的技术将外源核酸递送到细胞或受试者。为了在体外或离体递送到细胞，可以通过以下将外源核酸转染到细胞中：氯化钙-、氯化锂-、乙酸锂/聚乙二醇-、磷酸钙-、deae-葡聚糖-、脂质体介导的转染(graham等人(1973)《病毒学》.52:456-467；mannino等人(1988)《生物技术(biotechniques)》6:682-690；felgner等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:7413-7417)、电穿孔(shigekawa等人(1988)《生物技术》6:742-751)、直接显微注射(capecchi,m.r.(1980)《细胞(cell)》22:479-488)，或通过使用高速钨微粒(klein等人(1987)《自然(nature)》327:70-73)。当外源核酸呈病毒载体的形式时，其可以通过病毒感染转染到细胞中。转染技术在本领域中通常是已知的。参见例如，graham等人(1973)《病毒学》,52:456，sambrook等人(1989)《分子克隆，实验室手册(molecularcloning,alaboratorymanual)》,纽约冷泉港实验室，davis等人(1986)；《分子生物学基本方法(basicmethodsinmolecularbiology)》，elsevier和chu等人(1981)《基因(gene)》13:197。[0122]为了将外源核酸递送到体内细胞或递送到受试者，可以将外源核酸全身或在局部治疗区域施用于受试者。在某些实施例中，所述外源核酸通过肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径递送到所述受试者。在某些实施例中，所述外源核酸口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、脑室内(icv)或直肠内递送到所述受试者。[0123]阿司匹林化合物的施用[0124]在将外源核酸递送到细胞或受试者之前或同时，可以向所述细胞或所述受试者施用阿司匹林化合物。[0125]在某些实施例中，将所述外源核酸递送到已经或正在同时施用阿司匹林化合物的细胞或受试者。[0126]在某些实施例中，在递送所述外源核酸之前以使所述细胞或所述受试者对此类递送预备的方式施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在递送所述外源核酸之前至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时、1.5天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述细胞或所述受试者施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前向所述细胞或所述受试者施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)所述阿司匹林化合物。[0127]在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物与所述外源核酸同时施用于所述细胞或所述受试者。如本文所用，术语“同时”是指将产生外源核酸和阿司匹林化合物共同递送到细胞或受试者(在受试者体外、离体或体内)的安排。此类共同递送可以通过以下来实现：例如将外源核酸和阿司匹林化合物两者在组合的组合物中，或在单独的组合物中但通过相同或不同的施用途径在基本上同时的时间递送，或以受控时间在单独的组合物中递送使得外源核酸和阿司匹林化合物预期在细胞或受试者中基本上同时起作用。[0128]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物以足以有效增加所述外源核酸在所述细胞或所述受试者中的表达的量施用。在某些实施例中，以使所述细胞或所述受试者中的所述外源核酸的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的有效量施用所述阿司匹林化合物。[0129]在某些实施例中，可以在体外或离体将阿司匹林化合物添加或引入到细胞的培养基中。在某些实施例中，阿司匹林化合物通过肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径递送到受试者。在某些实施例中，阿司匹林化合物可以通过任何合适的途径施用于受试者，例如但不限于口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、脑室内(icv)或直肠内。在某些实施例中，通过静脉内施用将阿司匹林化合物递送到受试者。[0130]预备方法[0131]一方面，本公开提供了一种对细胞或受试者进行预备以递送外源核酸的方法。[0132]如本文所用，术语“预备”是指在递送外源核酸之前对细胞或受试者进行的任何预处理，以使细胞或受试者准备好处于易于接受和表达外源核酸的状态。在某些实施例中，与未预备的细胞或受试者相比，预备的细胞或预备的受试者可以处于接收和表达外源核酸所期望的状态，例如对外源核酸的免疫应答性较低。[0133]表达或增加表达水平或延长表达持续时间的方法[0134]另一方面，本公开提供了一种在细胞中表达外源核酸的方法。另一方面，本公开还提供了一种增加细胞中或受试者中的外源核酸表达水平的方法。在又另一方面，本公开提供了一种延长细胞中或受试者中的外源核酸的表达持续时间的方法。[0135]如本文所用，术语“表达”(“expression”或“expressing”)是指将编码dna序列转录成mrna和/或将编码dna序列翻译成肽或蛋白质。如本文所用，短语“对外源核酸的表达”是指对包括在外源核酸中的编码序列(例如，编码感兴趣的蛋白质的序列)的表达。在一些实施例中，外源核酸的表达水平基于mrna水平或蛋白质水平确定。在一些实施例中，相对于对照表达水平，所述表达水平增加至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、150％、180％、200％、220％、250％、280％、300％、400％、500％、600％、700％、800％或900％。对照表达水平可以是在不存在使用阿司匹林化合物治疗的情况下在可比较条件下确定的表达水平。[0136]在某些实施例中，在将外源核酸递送到细胞或受试者之后的第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天或第15天确定所述外源核酸的表达水平。[0137]在某些实施例中，在表达持续时间期间共同确定外源核酸的表达水平。[0138]如本文所用，“表达持续时间”是外源核酸在细胞中或受试者中以可检测水平或以生理学上或治疗上有效的水平表达的时间段。在某些实施例中，所述表达持续时间是从外源核酸表达的感兴趣的蛋白质在细胞中或受试者中处于或高于可检测水平或处于生理学上或治疗上有效的水平的时间段。[0139]在本文所提供的方法的一些实施例中，相对于对照持续时间，所述表达持续时间延长至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。对照持续时间可以是在不存在使用阿司匹林化合物治疗的情况下在可比较条件下确定的表达持续时间。[0140]治疗或预防方法[0141]另一方面，本公开提供了一种治疗可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状的方法。[0142]在一些实施例中，所述受试者患有可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状。在一些实施例中，所述受试者需要治疗(例如，所述受试者将从治疗中在生物学或医学上受益)。[0143]如本文所用，“可通过外源核酸或其表达产物治疗的病状”是指对使用外源核酸或其表达产物治疗敏感的任何疾病或病状。[0144]在一些实施例中，此类病状的特征在于缺乏一种或多种功能性基因或功能性蛋白。在一些实施例中，此类病状适于基因疗法。递送到受试者的外源核酸可以对替代或修复受试者的活细胞的dna中的缺失或功能失调的分子元件(例如，基因)有用，或者可替代地通过在细胞中引入和表达功能基因来提供或增强细胞中的缺失或功能失调的基因的功能。[0145]在一些实施例中，所述病状是单基因病症。单基因病症是由基因组中的影响单个基因的一个或两个拷贝的一种或多种异常引起的病症。基因组异常会破坏基因并导致由被破坏基因编码的内源性蛋白的活性缺失或不足。单基因病症的症状是由于内源性蛋白的活性缺失或不足所导致。[0146]在一些实施例中，所述单基因病症是常染色体显性、常染色体隐性、x连锁、y连锁或线粒体的。[0147]常染色体显性单基因病症的实例包含但不限于布鲁格达综合征(brugadasyndrome)、1型强直性肌营养不良、2型强直性肌营养不良、遗传性多发性梗塞性痴呆、亨廷顿氏病、1型神经纤维瘤病、2型神经纤维瘤病、马凡综合征(marfansyndrom)、家族性高胆固醇血症(fh)、多囊性肾病、遗传性球形红细胞增多症、遗传性非息肉病性结直肠癌、遗传性多发性外生骨疣、结节性硬化症、冯维勒布兰德氏病(vonwillebranddisease)和急性间歇性卟啉症、德拉韦综合征(dravetsyndrome)、珀茨-杰格斯综合征(peutz-jegherssyndrome)、软骨发育不全、原发性联合免疫缺陷病、家族性腺瘤性息肉病(fap)、脊髓小脑性共济失调、多发性内分泌肿瘤。[0148]常染色体隐性遗传单基因病症的实例包含但不限于β-酮硫解酶缺乏症、生物素酶缺乏症、肝豆状核变性、脊髓性肌萎缩症、n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、赖氨酸尿蛋白不耐受症、长链3-羟酰基-coa脱氢酶缺乏症、莱伦氏综合症(laronsyndrome)、异戊酸血症、高鸟氨酸血症-高氨血症-高瓜氨酸尿症综合征、羧化全酶合成酶缺乏症、遗传性果糖不耐受症、ii型糖原贮积病、i型戊二酸血症、吉特曼综合征(gitelmansyndrome)、戈谢氏病(gaucherdisease)、家族性地中海热、先天性肌强直症、瓜氨酸血症i、瓜氨酸血症ii、原发性肉碱缺乏症、精氨酸酶缺乏症、中链酰基-coa脱氢酶缺乏症、镰状细胞性贫血、囊性纤维化、戴萨克斯症(tay–sachsdisease)、苯丙酮尿症、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、糖原贮积病、半乳糖血症、尼曼-皮克病(niemann-pickdisease)、脊髓性肌萎缩(sma)、罗伯茨综合征(robertssyndrome)、极长链酰基-coa脱氢酶缺乏症、肺囊性纤维化、戈谢氏病、沃纳综合征(wernersyndrome)、范可尼贫血(fanconianemia)、粘多糖贮积症(i、iiia、iiib、iva、ivb、vi、vii、ix)。[0149]x连锁单基因病症的实例包含但不限于脆性x综合征、先天性肾上腺发育不全、杜氏肌营养不良(duchennemusculardystrophy)和a型血友病、b型血友病、法布里病(fabrydisease)、x连锁无丙种球蛋白血症、x连锁肾上腺脑白质营养不良、脊髓和延髓肌萎缩、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症和粘多糖贮积症ii、肾上腺脑白质营养不良(ald)、慢性肉芽肿病。[0150]单基因病症的其它实例包含麦-奥二氏综合症(mccune-albrightsyndrome)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、ada免疫缺陷、肌萎缩性侧索硬化症(als)、葡萄糖-半乳糖、肌营养不良、无精子症、埃勒斯-当洛斯综合征(ehlers-danlossyndrome)、色素性视网膜炎、血色素沉着症、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、强直性肌营养不良、巨轴索神经病、α-1抗胰蛋白酶、帕金森氏病、严重联合免疫缺陷(ada-scid/x-scid)。[0151]多基因病症的实例包含如心脏病、癌症(例如，白血病，具体地是急性淋巴细胞白血病)、糖尿病、精神分裂症和阿尔茨海默氏病。[0152]如本文所用，如本文所用的术语“治疗”(“treating”或“treatment”)病状包含缓解病状、减缓病病状的发作或发展速率、减轻、缓解或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。[0153]另一方面，本公开提供了一种预防可通过外源核酸或其表达产物预防的病状的方法。[0154]如本文所用，术语“预防”(“prevent”、“prevents”或“prevention”)、“可预防(preventable)”是指延迟疾病或病症的发作、降低病状发展的风险、延迟与病状相关症状的发展或其某种组合。所述术语并不意味着完全消除疾病，而是涵盖任何类型的降低病状的发生率或延迟病状的发作和/或进展的预防性治疗。[0155]在一些实施例中，可预防病状的特征在于可以受益于可以由外源核酸或其表达产物诱导的保护性作用(例如，免疫应答)的病状。在一些实施例中，递送到受试者的外源核酸可以用于表达诱导针对病原体或癌细胞的保护性免疫应答的免疫原。[0156]在某些实施例中，所述治疗或预防方法包括：向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述受试者已经或正在同时施用阿司匹林化合物。[0157]在某些实施例中，所述治疗或预防方法包括：在将所述外源核酸递送到所述细胞之前或同时向所述受试者施用阿司匹林化合物。[0158]在某些实施例中，所述治疗或预防方法包括：a)向所述受试者施用阿司匹林化合物；以及b)向所述受试者递送所述外源核酸，其中所述步骤a)在所述步骤b)之前或与所述步骤b)同时进行。[0159]外源核酸以治疗有效量递送到受试者。如本文所用，关于外源核酸的术语“治疗有效量”意指递送到受试者的外源核酸的量足以在受试者中产生治疗或预防益处，例如，对受试者的至少一种临床症状提供一些缓解、减轻或减少(用于治疗目的)，或延迟疾病或病症的发作或在疾病或病症发作时减轻症状(用于预防目的)。例如，治疗有效量的外源核酸可以允许递送到足够数量的细胞中并在受试者中表达外源核酸(例如，从外源核酸表达感兴趣的蛋白质)以产生治疗益处或预防益处。[0160]在一些实施例中，所述外源核酸包含或包括在病毒载体(例如，aav载体或aav病毒颗粒)中，并且所述病毒载体的治疗有效量可以在106vg/kg到1014vg/kg(载体基因组/kg)，例如，107vg/kg到1014vg/kg、108vg/kg到1014vg/kg、109vg/kg到1014vg/kg、1010vg/kg到1013vg/kg、1010vg/kg到1012.5vg/kg、1010vg/kg到1012vg/kg、1010vg/kg到1011.5vg/kg或1010vg/kg到1011vg/kg的范围内。在一些实施例中，aav载体的治疗有效量为约或不超过106vg/kg、107vg/kg、108vg/kg、109vg/kg、1010vg/kg、1011vg/kg、1011.5vg/kg、1012vg/kg、1012.5vg/kg或1013vg/kg。病毒载体的治疗有效量可以根据如病毒载体的类型、要转染的细胞、要治疗的病状、接受治疗的受试者(例如，疾病状态、年龄、性别和体重)、病毒载体在个体中引发期望的应答的能力等许多因素而变化。治疗有效量可以通过从低但安全的剂量开始并逐渐增加到更高剂量来确定，同时监测治疗效果(例如，癌细胞生长的减少)以及任何有害副作用的存在。[0161]在某些实施例中，本文所提供的治疗方法中的治疗有效量是亚治疗量。如本文所用，术语“亚治疗量”是指低于在常规治疗方法中产生治疗益处所需的常规量的外源核酸量，其中在递送外源核酸之前或同时未向受试者施用阿司匹林化合物(“常规治疗方法”)。[0162]在某些实施例中，亚治疗量的外源核酸在常规治疗方法(其中不施用阿司匹林化合物)中产生不足的治疗效果或不产生任何治疗效果。[0163]在一些实施例中，所述亚治疗量不超过90％、不超过80％、不超过70％、不超过60％、不超过50％、不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的常规量的相同外源核酸，所述常规量是在不施用所述阿司匹林化合物的情况下需要的。[0164]在某些实施例中，本文所提供的治疗方法中的治疗有效量与常规量相当或相同，但提供比常规治疗方法更高的治疗效果。在某些实施例中，本文所提供的方法可以实现比所述常规治疗方法可以实现的治疗效果高至少10％、高20％、高30％、高40％、高50％、高60％、高70％、高80％、高90％、高100％、高150％、高200％、高250％、高300％、高350％、高400％、高450％或高500％的治疗效果。[0165]在一些实施例中，可以在施用外源核酸之前或同时向受试者施用阿司匹林化合物。[0166]在一些实施例中，在将所述外源核酸递送到所述受试者之前至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天向所述受试者施用所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，在所述递送所述核酸之前向所述受试者施用一次或重复施用(例如，两次、三次、四次等)所述阿司匹林化合物。在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物与所述外源核酸同时施用于所述受试者。[0167]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物以足以有效增加所述外源核酸在所述细胞或所述受试者中的表达的量施用。在某些实施例中，以使所述受试者中的所述外源核酸的表达增加至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或更多的有效量施用所述阿司匹林化合物。[0168]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是以不超过30mg/kg、不超过50mg/kg、不超过60mg/kg、不超过70mg/kg、不超过80mg/kg、不超过90mg/kg、不超过100mg/kg、不超过110mg/kg、不超过120mg/kg、不超过120mg/kg、不超过130mg/kg、不超过140mg/kg、不超过150mg/kg、不超过160mg/kg、不超过170mg/kg、不超过180mg/kg、不超过190mg/kg或不超过200mg/kg的量向所述受试者施用的。在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是以30mg/kg到200mg/kg、30mg/kg到150mg/kg、30mg/kg到120mg/kg、30mg/kg到100mg/kg的、30mg/kg到90mg/kg、30mg/kg到80mg/kg、30mg/kg到70mg/kg、30mg/kg到60mg/kg、30mg/kg到50mg/kg、30mg/kg到40mg/kg的量向所述受试者施用的。在某些实施例中，所述阿司匹林化合物是以30mg/kg到50mg/kg的量例如以约35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg向所述受试者施用的。在某些实施例中，所述阿司匹林化合物是以50mg/kg到100mg/kg的量例如以约55mg/kg、60mg/kg、65mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、85mg/kg、90mg/kg、95mg/kg或100mg/kg向所述受试者施用的。[0169]在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物与所述外源核酸同时施用于所述受试者。在某些实施例中，所述阿司匹林化合物和所述外源核酸可以在时间上足够接近地施用(例如，同时，或在彼此之前或之后的短时间段内)，使得预期它们在所述受试者中基本上同时起作用。阿司匹林化合物和外源核酸可以被视为是同时施用的，只要两种药剂在彼此之前、之后的短时间段内或同时进入到细胞中。在一些实施例中，所述阿司匹林化合物与所述外源核酸以一种单一组合物的形式同时施用。在一些其它实施例中，所述阿司匹林化合物与所述外源核酸以不同组合物同时施用。[0170]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物和所述外源核酸在同时施用于所述受试者之前混合。在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物和所述外源核酸静脉内共同施用于所述受试者。在一些实施例中，通过不同的施用途径将所述阿司匹林化合物和所述外源核酸施用于所述受试者。在一些实施例中，将所述阿司匹林化合物口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、脑室内(icv)或直肠内施用于所述受试者。[0171]在一些实施例中，施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸以治疗中枢神经系统(cns)病症。在一些实施例中，通过全身施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸来治疗所述cns病症。在某些实施例中，适于全身施用以治疗cns病症的所述外源核酸包含aav载体(例如，aav病毒颗粒)，例如，aav9载体(例如，aav9颗粒)。在某些实施例中，所述全身施用包含静脉内、皮下或肌肉内施用。在一些实施例中，通过脑室内或鞘内施用所述阿司匹林化合物和/或所述外源核酸来治疗所述cns病症。cns病症可以是可通过将治疗核酸递送到脑或脊髓来治疗的任何病状。cns病症的实例包含例如帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、ii型粘多糖贮积症、iiia型粘多糖贮积症、iiib型粘多糖贮积症、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫、巴藤病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩、卡纳万病和弗里德赖希氏共济失调。[0172]在不希望受到任何理论束缚的情况下，据信本发明在治疗cns病症方面特别有利，并且这至少部分地归因于外源核酸在脑的靶位点中的表达增加。发明人惊奇地发现，通过全身施用aav与本文所提供的阿司匹林化合物的组合，可以使用低得多的aav剂量，但仍能实现与较高剂量相同或甚至更高的功效。本领域已知，如果通过全身途径施用aav9，则必须达到1014vg/kg的阈值剂量才能够在脑中进行转基因表达，然而，此类剂量既在技术上具有挑战性又制造成本很高，并且这显著限制了aav9在治疗cns病症中的使用(详细信息参见perezba等人,《脑科学(brainsci)》.2020年2月22日；10(2).pii:e119；duques等人,《分子疗法(molther)》.2009年7月；17(7):1187-96；foustkd等人,《自然生物技术》.2009年1月；27(1):59-65)。如在本技术中所公开的，通过全身途径以低于1014vg/kg的量(例如，以1013vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1011vg/kg或甚至更低)与阿司匹林化合物组合递送的aav9可以实现在脑中进行转基因表达，并且如与以或高于1014vg/kg但没有阿司匹林化合物施用的aav9相比同样有效或甚至更有效。这可以减少治疗cns病症所需的aav的剂量，并且由此降低制造过程的复杂性，从而可以使用例如较低剂量aav制剂来治疗脑部病症。[0173]另一方面，本公开提供了一种减少受试者的副作用或提高对外源核酸的耐受性的方法。如本文所用，由外源核酸的递送引起的“副作用”可以是本领域已知的关于药物递送的任何种类的副作用，包含但不限于恶心、呕吐、头晕、嗜睡/镇静、过敏、瘙痒、胃肠动力降低(包含便秘)、排尿困难、外周血管扩张(包含导致直立低血压)、头痛、口干、出汗、乏力、依赖性、情绪变化(例如，烦躁、欣快)、头晕或甚至呼吸抑制、呼吸暂停、呼吸停止、循环抑制、低血压或休克。[0174]在本公开的一些实施例中，所述外源核酸以亚治疗量递送到所述受试者。在某些实施例中，所述亚治疗量在本文所提供的治疗方法中是治疗有效的，但与常规量相比引起显著降低的副作用。[0175]在一些实施例中，所述副作用对递送到所述受试者的所述外源核酸是剂量依赖性的。据信，通过以亚治疗水平施用所述外源核酸，与外源核酸相关的副作用可以因暴露较少而减少。[0176]组合物[0177]在又另一方面，本公开提供了一种组合物，其包含阿司匹林化合物和外源核酸的组合，其中所述外源核酸包含双链dna，或者可以在将所述外源核酸递送到细胞之后在所述细胞中转化为双链dna。[0178]在一些实施例中，所述组合物中的所述外源核酸包含编码序列，所述编码序列编码感兴趣的蛋白质或其一部分或编码功能性rna或其一部分。[0179]在一些实施例中，所述治疗蛋白选自由以下组成的组：smn1、naglu、sgsh、ids、fviii、fix、btk、abcd1、acadvl、ar、hbb、scn1a、cftr、csf2ra、il2ag、pha、stk11、piga、otc、nags、dmpk、cnbp、acadm、gnas、fbn1、lipa、slc7a7、hadha、ghr、idv、alpl、slc25a15、htt、hcs、notch3、aldob、atp7b、gaa、gcdh、slc12a3、gba、mefv、gla、clcn1nr0b1、ass1、slc25a13、slc22a5、scn5a、btd、acat1、arg1、cyp21a2、嵌合抗原受体(car)、抗体(例如，单克隆或双特异性或多特异性)、胰岛素、胰高血糖素样肽-1、肽激素、生长因子、促红细胞生成素(epo)、细胞因子、凝血因子、抗血友病因子、干扰素、fc融合蛋白(如ctla-4fc融合、vegfrfc融合)和治疗酶(例如，溶酶体水解酶和硫酸酯酶)。[0180]在一些实施例中，所述免疫原性蛋白选自由以下组成的组：来自正粘病毒(例如，流感病毒)、慢病毒(例如，hiv、siv)、沙粒病毒(拉沙热病毒)、痘病毒(例如，牛痘)、黄病毒(例如，黄热病病毒)、丝状病毒(埃博拉病毒)、布尼亚病毒(rvfv、cchf或sfs病毒)、冠状病毒(例如，sars、mers或covid-19)、脊髓灰质炎病毒、疱疹病毒(cmv、ebv、hsv)、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、白喉毒素、百日咳和肝炎病毒(例如，hav、hbv或hcv)的免疫原性蛋白。[0181]在一些实施例中，所述核酸酶包含锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)或cas家族蛋白(如cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、cas11、cas12、cas13、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx15、csf1、csf2、csf3、csf4、cpf1、其同源物或其经修饰版本)。[0182]在一些实施例中，所述报告蛋白选自由以下组成的组：荧光蛋白(例如，egfp、gfp、rfp、bfp、yfp或dsred2)，产生可检测产物的酶，如荧光素酶(例如，来自高斯公司、海肾公司或pho公司)、b-半乳糖苷酶、b-葡萄糖醛酸酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶基因和可以直接检测到的蛋白质。[0183]在一些实施例中，所述治疗靶蛋白(例如，ctla-4、her2、粘连蛋白-4、硬化蛋白、p-选择蛋白、vegf、rsvf、vegfr2、cd79、il23p19、vwf、ifn-γ、c5、pd-1、pd-l1、cgrp、cd3、cd11a、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd40、cd52、ige、klk、ccr4、fgf-23、il-6r、il-5、il-23p19、il-2r、il-17r、il-17、cd4、fix/fx、il-12、il-23、il-1β、il-5r、il-6r、il-4/il-13、pdgf-α、达比加群、slamf7、egfr、pcsk9、gd2、cd3、cd19、α4β7整合素、α4β1整合素、pa、blys、rank、tnf-α、epcam、ggta1、内皮抑素、血管抑素)。[0184]在一些实施例中，所述功能性rna调节生物靶标，所述生物靶标选自由以下组成的组：多种药物抗性(mdr)蛋白靶标、肿瘤靶标(例如，vegf、her2、egfr、pd-l1等)、如病毒表面抗原等病原体靶标(例如，乙型肝炎表面抗原基因)、缺陷基因产物(突变的肌营养不良蛋白)或治疗靶标(例如，肌生长抑制素)。[0185]药物组合物[0186]在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含亚治疗量的本文所提供的外源核酸以及药学上可接受的载体。在某些实施例中，所述药物组合物进一步包含本文所提供的阿司匹林化合物。[0187]在又另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文所提供的外源核酸、本文所提供的阿司匹林化合物以及药学上可接受的载体。[0188]如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指可以促进本公开的核酸、表达载体的储存和向受试者和/或向宿主细胞施用的任何和所有药学载体，如溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在某些实施例中，已经施用所述药物组合物的所述宿主细胞适于施用于受试者。药学上可接受的载体可以包含任何合适的组分，例如但不限于盐水、脂质体、聚合物赋形剂、胶体或载体颗粒。[0189]在某些实施例中，所述药学上可接受的载体是可以溶解或分散本公开的核酸、表达载体和/或宿主细胞的盐水。盐水的说明性实例包含但不限于缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液和聚山梨醇酯溶液。[0190]在某些实施例中，所述药学上可接受的载体是脂质体。脂质体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性材料形成的膜以及内部水性部分。本公开的核酸、表达载体和/或宿主细胞可以包封在脂质体的水性部分中。脂质体的说明性实例包含但不限于基于3[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(dc-chlo)的脂质体、基于n-(2,3-二油酰氧基)丙基-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)的脂质体和基于1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷(dotap)的脂质体。制备脂质体和将表达载体包封在脂质体中的方法是本领域众所周知的(参见例如，d.d.lasic等人,《基因递送中的脂质体(liposomesingenedelivery)》,由crc出版社(crcpress)出版,1997)。[0191]在某些实施例中，所述药学上可接受的载体是聚合物赋形剂，如但不限于微球、微胶囊、聚合物胶束和树状物。本公开的核酸、表达载体和/或宿主细胞可以通过本领域已知的方法包封、粘附或包被在基于聚合物的组分上(参见例如，w.heiser,《非病毒基因转移技术(nonviralgenetransfertechnologies)》,由胡玛纳出版社(humanapress)出版,2004；美国专利6025337；《先进药物递送评论(advanceddrugdeliveryreviews)》,57(15):2177-2202(2005))。[0192]在某些实施例中，药学上可接受的载体是胶体或载体颗粒，如金胶体、金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和多段纳米棒。核酸、表达载体或细胞可以以本领域已知的任何合适的方式在载体上包被、粘附到载体或与载体缔合(参见例如，m.sullivan等人,《基因疗法》,10:1882–1890(2003)，c.mclntosh等人,《美国化学学会杂志(j.am.chem.soc.)》,123(31):7626–7629(2001)，d.luo等人,《自然生物技术》,18:893-895(2000)，以及a.salem等人,《自然材料(naturematerials)》,2:668-671(2003))。[0193]在某些实施例中，药物组合物可以进一步包含添加剂，例如但不限于稳定剂、防腐剂和有助于药物的细胞摄取的转染促进剂。合适的稳定剂可以包含但不限于谷氨酸一钠、甘氨酸、edta和白蛋白(例如，人血清白蛋白)。合适的防腐剂可以包含但不限于2-苯氧乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟基苯甲酸甲酯、酚类、硫柳汞和抗生素。合适的转染促进剂可以包含但不限于钙离子。[0194]药物组合物可以适于通过本领域已知的任何合适的途径施用，包含但不限于肠胃外、口服、肠内、口腔内、鼻腔、局部、直肠、阴道、经粘膜、表皮、透皮、真皮、眼部、肺、心脏、皮下、实质内、脑室内或鞘内施用途径。[0195]药物组合物可以以适于每种施用途径的调配物或制剂的形式向受试者施用。适于施用药物组合物的调配物可以包含但不限于溶液、分散体、乳剂、粉剂、悬浮剂、气溶胶、喷雾剂、滴鼻剂、基于脂质体的调配物、贴片、植入物和栓剂。[0196]所述调配物可以方便地以单位剂型呈现并且可以通过制药业领域熟知的任何方法来制备。制备这些调配物或组合物的方法包含将本公开的外源核酸提供给一种或多种药学上可接受的载体和任选地一种或多种佐剂的步骤。可以在以下中找到用于制备此类调配物的方法：例如《雷明顿氏药物科学(remington'spharmaceuticalsciences)》(《雷明顿：药学科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》,第19版,a.r.gennaro(编辑),新泽西州马克出版公司(mackpublishingco.,n.j.),1995；r.stribling等人,《美国国家科学院院刊》,89:11277-11281(1992)；t.w.kim等人,《基因医学杂志(thejournalofgenemedicine)》,7(6):749-758(2005)；s.f.jia等人,《临床癌症研究(clinicalcancerresearch)》,9:3462(2003)；a.shahiwala等人,《最近药物递送和调配专利(recentpatentsondrugdeliveryandformulation)》,1:1-9(2007)；a.barnes等人,《分子治疗学的当前观点(currentopinioninmoleculartherapeutics)》20002:87-93(2000)，所述参考文献通过引用整体并入本文)。[0197]在某些实施例中，本公开的含有外源核酸(例如，aav载体或aav病毒颗粒)的药物组合物适于通过局部递送到患病位点处的靶组织或器官中而施用于需要治疗的受试者。在某些实施例中，所述药物组合物适于使用注射器直接注射到通过皮肤可触知的患病位点。在某些实施例中，所述药物组合物适于使用连接到导管线或其它医疗接入装置的可植入给药装置进行注射，并且可以与引导到患病位点的成像系统结合使用。在某些实施例中，所述药物组合物适于以有效剂量直接注射到暴露的外科手术区域中可见的患病位点。在某些实施例中，所述药物组合物(例如，载体包被的金颗粒)适于使用基因枪轰击到患病位点，所述基因枪将所述颗粒直接射入所述患病位点(参见例如，r.muangmoonchai等人,《分子生物学(molecularbiology)》,20(2):145-151(2002))。在某些实施例中，所述药物组合物适于通过静脉内注射向受试者施用。在某些实施例中，所述药物组合物适合口服或经粘膜向受试者施用。有关将治疗核酸引入到细胞或动物中的方法的参考文献，参见例如，yang,n-s.,《生物技术关键评论(crit.rev.biotechnol.)》12:335-356(1992)；anderson,w.f.,《科学》256:808-813(1992)；miller,a.s.,《自然》357:455-460(1992)；crystal,r.g.,《美国医学杂志(amer.j.med.)》92(增刊6a):44s-52s(1992)；zwiebel,j.a.等人,《纽约科学院年报(ann.n.y.acad.sci.)》618:394-404(1991)；mclachlin,j.r.等人,《核酸研究与分子生物学进展(prog.nucl.acidres.molec.biol.)》38:91-135(1990)；kohn,d.b.等人,《癌症调查(cancerinvest)》.7:179-192(1989)。这些参考文献通过引用整体并入本文。[0198]在一些实施例中，所述药物组合物中的所述外源核酸包含编码序列，所述编码序列编码感兴趣的蛋白质或其一部分或编码功能性rna或其一部分。在一些实施例中，所述药物组合物中的所述外源核酸包含编码治疗蛋白的感兴趣的核酸。在一些实施例中，所述药物组合物中的所述外源核酸包含编码适于治疗cns病症或脑部疾病的治疗蛋白的感兴趣的核酸。在一些实施例中，用于治疗cns病症或脑部疾病的功能性rna的治疗蛋白或治疗靶标包含例如但不限于tau、mecp2、ngf、apoe、gdnf、sumf、sgsh、aadc、cd、p53、arsa芳基硫酸酯酶a、abcd1、smn1、naglu、sod1、c9orf72、tardbp、fus、htt、lrrk2、paris、parkin、gad和α-突触核蛋白。这些基因在本领域中是已知的，并且已经在以下中进行了描述：例如maguireca等人,《神经治疗学(neurotherapeutics)》.2014年10月；11(4):817-39；bowerswj等人,《人类分子遗传学(hummolgenet)》.2011年4月15日；20(r1):r28-41)。[0199]在一些实施例中，所述外源核酸包含aav载体(例如，aav病毒颗粒)。在一些实施例中，所述药物组合物中的aav病毒颗粒适于提供量不超过1014vg/kg(例如，不超过1013vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1012.5vg/kg、1012vg/kg、1011.5vg/kg、1011vg/kg、1010.5vg/kg、1010vg/kg或109vg/kg)的剂量。在一些实施例中，所述药物组合物中的aav病毒颗粒适于提供亚治疗剂量。[0200]在一些实施例中，所述药物组合物呈单位剂量，并且含有不超过1010vg、1010.5vg、1011vg、1011.5vg、1012vg、1012.5vg、1013vg、1013.5vg、1014vg、1014.5vg、1015vg、1015.5vg或1016vg的aav病毒颗粒。如本文所用，“单位剂量”是足以提供一种治疗的剂量。在一些实施例中，所述单位剂量针对人类使用，例如，针对人类成人(例如，平均体重为60kg)、人类青少年、人类儿童或人类婴儿。在一些实施例中，所述药物组合物呈适于全身施用，如适于静脉内注射、静脉内输注和肌肉内注射的调配物。[0201]在一些实施例中，所述阿司匹林化合物与aav颗粒包装在一起，例如以混合物或一种组合物的形式。在一些实施例中，所述阿司匹林化合物是独立包装的，与aav病毒颗粒分开，例如，所述阿司匹林化合物可以以任何可商购获得的形式在单独的容器中提供。[0202]在一些实施例中，本公开的药物组合物进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述阿司匹林化合物要在施用所述药物组合物之前施用或与施用所述药物组合物同时施用。在一些实施例中，所述使用说明书表明为了治疗脑部疾病，所述aav病毒通过全身施用施用，优选地以低于1014vg/kg的剂量施用。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，或存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或分包装相关)。在一些实施例中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，cd-rom、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在一些实施例中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于从远程源，例如通过互联网获得说明书的手段。此实施例的实例是包含网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。[0203]试剂盒[0204]在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：a)第一组合物，所述第一组合物包含所述阿司匹林化合物；以及b)第二组合物，所述第二组合物包含本文所提供的所述外源核酸。在一些实施例中，试剂盒进一步包含用于使用所述试剂盒的组分来实践本公开的方法的说明书。[0205]在某些实施例中，所述第一组合物和所述第二组合物处于单独的容器中。所述第一组合物和所述第二组合物可以在使用之前组合，或者可以单独使用，例如在不同的时间或通过不同的施用途径。[0206]在另外的方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含组合物，所述组合物包含本文所提供的所述阿司匹林化合物和所述外源核酸。在一些实施例中，试剂盒进一步包含用于使用所述试剂盒的组分来实践本公开的方法的说明书。[0207]在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含使用说明书，所述使用说明书指示所述第二组合物要在所述第二组合物之前施用或与所述第二组合物同时施用。在一些实施例中，所述第一组合物和所述第二组合物可以在使用之前容易地混合以提供组合的组合物。在一些实施例中，所述第二组合物包含亚治疗量的所述外源核酸。[0208]在又另外的方面，本公开提供了一种组合物，其包含：阿司匹林化合物和亚治疗量的本文所提供的所述外源核酸。[0209]呈现了以下实例以说明本发明并帮助普通技术人员制备和使用本发明。所述实例不旨在以任何方式在其它方面限制本发明的范围。[0210]实例[0211]实例1.[0212]除非另外指明，否则本文所描述的某些实例的实践可以采用分子生物学、细胞培养、重组核酸(例如，dna)技术、免疫学和/或核酸和多肽合成、检测、操作和定量等的常规技术，所述技术都处于本领域的普通技术范围内。参见例如，ausubel,f.等人,(编辑),《当代分子生物学实验指南》、《当代免疫学实验指南(currentprotocolsinimmunology)》、《当代蛋白质科学实验指南(currentprotocolsinproteinscience)》和《当代细胞生物学实验指南(currentprotocolsincellbiology)》,均为纽约约翰威利父子公司例如截至2010年1月或以后的版本；sambrook、russell和sambrook,《分子克隆：实验室手册》,第3版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,2001或第4版,2012。[0213]材料[0214]基于美国专利公开us20160229904中公开的方法制备载体质粒aav-lxp3.3-gluc。简而言之，合成启动子lxp3.3是基于如us20160229904中所公开的核苷酸序列(本文还提供为seqidno:1)合成的，并且lxp3.3启动子在其3'端处与报告基因高斯荧光素酶(gluc)编码基因连接(其序列可以在基因库登录号：lc006266.1中找到，还参见seqidno:2)，以获得lxp3.3-gluc表达盒。lxp3.3-gluc表达盒插入aav表达质粒中的aav2itr之间，并且与表达rep基因的第二质粒和编码aav8、aav9或aav843的cap基因的第三质粒共转染到hek293细胞中，以分别包装到aav8-lxp3.3-gluc病毒、aav9-lxp3.3-gluc病毒或aav843-lxp3.3-gluc病毒中。aav8的cap基因在seqidno：4中(从基因库登录号：af513852获得)示出，并且编码的cap蛋白序列在seqidno:8(还参见基因库登录号aan03857.1)中示出。aav9的cap基因来自基因库登录号：ay530579(还参见seqidno:5)，并且编码的cap蛋白序列在seqidno:9中示出。aav843的cap基因来自如wo2019241324a1中公开的aavxl32的合成衣壳基因序列(还参见seqidno:6)，并且编码的cap蛋白序列在seqidno:10中示出。[0215]使用可商购获得的试剂盒并基于制造商的说明书，通过实时pcr和斑点印迹对病毒滴度进行定量。其中产生aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc，显示滴度分别为2.67×1013(载体基因组/ml)vg/ml和2.99×1013vg/ml。aav843-lxp3.3-gluc在内部产生，其中滴度为4×1012vg/ml。[0216]cas编号：50-78-2的乙酰水杨酸(阿司匹林)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(shanghaialaddinbiochemicaltechnologyco.,ltd.)。[0217]实例2[0218]1.1阿司匹林治疗和病毒载体递送[0219]将平均重量为20g的雄性c57bl/6j小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司(shanghaijiesijieexperimentalanimalsco.,ltd.))(n＝4)分为六组。连续7天(第-7天到第-1天)将阿司匹林用于腹膜内注射到五组小鼠中，剂量分别为1mg/kg、15mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、100mg/kg。第六组注射5％蓖麻油(于pbs缓冲液中(目录号：02-024-1acs，bi))作为对照。在第0天，向每组中的每只小鼠静脉内注射aav9-lxp3.3-gluc病毒(5×1012vg/kg)，并且从第1天开始检测荧光素酶的表达。[0220]1.2样品收集[0221]通过眶后出血收集小鼠的血液样品。将一半体积的血液样品以1:9的比率添加柠檬酸钠进行抗凝，混合，在30分钟内离心(6000rpm，5分钟)，并且收集上清液作为小鼠血浆，用于检测gluc的表达。剩余的血液样品在室温下放置2小时以分离血清，在6000rpm下离心15分钟，并且收集上清液作为小鼠血清样品。ifn-α和ifn-β的含量通过使用小鼠ifn-βelisa试剂盒(720131-2，上海酶联生物科技有限公司(shanghaimlbioco.,ltd.))、legendmaxtm小鼠ifn-βelisa试剂盒(439407，百进生物公司(biolegend))和小鼠ifn-αelisa试剂盒(706291-2，上海酶联生物科技有限公司)确定。[0222]1.3对gluc的检测[0223]先制备腔肠素h(40906es02，翌圣生物科技(上海)股份有限公司(shanghaiyeasenbiotechco.,ltd.))缓冲液：向500ml的超纯水中添加29.72g的抗坏血酸钠，并且然后添加50ml的tris-hcl(1mol/l，ph7.4)。腔肠素h的储备溶液的浓度为200μm。腔肠素h的工作溶液以1:1的比率制备，并且以新鲜制备的形式使用。将10μl的上述工作溶液添加到10μl血浆样品中，并且用synergyh1多功能酶标仪检测相对光单位(rlu)。[0224]1.4结果[0225]结果显示，所有组中的荧光素酶的表达水平随时间推移逐渐增加，但一些组中的表达水平从第11天开始有一定程度的下降。经阿司匹林预处理的组中的荧光素酶的表达水平随阿司匹林浓度显示出剂量依赖性增加，如通过施用不同浓度的阿司匹林的组间的比较所揭示的，其中在100mg/kg的阿司匹林下荧光素酶的表达水平达到最高(图1)。发现以50mg/kg和100mg/kg进行阿司匹林治疗的组在第3天的ifn-α水平显著低于对照组(图2)。[0226]实例3.[0227]注射剂量为50mg/kg的阿司匹林用于进一步研究由三种不同aav血清型进行的aav介导的外源基因的表达。研究设计与实例2相似。简而言之，对于每种aav血清型(即，aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc或aav843-lxp3.3-gluc)，将平均重量为20g的雄性c57bl/6j小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)(n＝4)分成两组。一组连续7天注射50mg/kg的阿司匹林，并且另一组注射5％蓖麻油(于pbs缓冲液(目录号：02-024-1acs，bi)中)作为对照。在第8天，将5×1012vg/kg的aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc或aav843-lxp3.3-gluc病毒(在150-200μlpbs中稀释)通过尾静脉注射递送到每只小鼠。收集血液样品并按照与实例2所描述的相同的方法检测荧光素酶的表达水平。[0228]结果表明，阿司匹林可以显著促进所有测试的病毒血清型，即体内的aav8-lxp3.3-gluc、aav9-lxp3.3-gluc和aav843-lxp3.3-gluc病毒的转导。如与对照组相比，三种aav血清型中含有的荧光素酶基因的表达从aav注射之后第1天开始就显示出显著差异。随时间推移，荧光素酶的表达迅速增加，在aav注射之后第15天达到峰值，并且然后降低，在整个时间段，阿司匹林治疗组与其对应的对照组显示出显著差异(图3a、3b、3c)。对照组中的荧光素酶的表达也在第15天达到峰值。[0229]已经对aav和阿司匹林以一种制剂或单独的制剂但在同时共同施用进行了研究。初步结果表明，aav和阿司匹林的共同施用也可以增加转基因的表达水平。[0230]总之，结果表明，在aav注射之前或同时施用阿司匹林对小鼠进行适当治疗可以显著促进aav转导，增加转基因的表达水平，并且转基因表达的增加不具有血清型依赖性。[0231]实例4.[0232]在实例3中描述的研究中，ifn-α和ifn-β的水平通过使用小鼠ifn-βelisa试剂盒(720131-2，上海酶联生物科技有限公司)、legendmaxtm小鼠ifn-βelisa试剂盒(439407，百进生物公司)和小鼠ifn-αelisa试剂盒(706291-2，上海酶联生物科技有限公司)测定，遵循用户手册。对ifn-α和ifn-β水平的分析表明，在注射aav8、aav9和aav843之后，阿司匹林显著抑制了i型干扰素在小鼠中的表达。用于aav8注射的对照组的ifn-α水平从第2天起显著增加，并且从第15天起逐渐降低，而用阿司匹林治疗的小鼠的中的ifn-α维持在相对较低的水平，尽管从注射aav8之后的第3天到第11天以及第23天到第31天有所升高(图4a)。除第31天外，对照组中的ifn-α水平显著高于阿司匹林治疗组中的水平。用于aav8注射的对照组中的ifn-β水平显著高于阿司匹林治疗组中的水平。对照组中的ifn-β水平随时间推移逐渐降低，但始终显著高于阿司匹林治疗组中的水平(图4b)。[0233]注射aav9之后，阿司匹林治疗组中的ifn-α水平从第11天到第18天增加，但显著低于对照组中的水平(图5a)。在对照组中，ifn-α从第23天开始逐渐降低(图5a)。与对照组中的ifn-α水平的趋势相似，对照组中的ifn-β水平在第23天之后也显著降低，而在阿司匹林治疗组中，ifn-β从第1天到第31天维持在低水平，并且从第1天到第23天与对照组的水平显示出统计学显著差异(图5b)。[0234]注射aav843之后测量ifn-α和ifn-β水平显示，阿司匹林治疗组中的两种i型干扰素均随时间推移逐渐增加，但其水平显著低于对照组中的水平(图6a和图6b)。对照组中的i型干扰素的水平显示出逐渐下降。在注射病毒之后第31天，阿司匹林治疗组与对照组之间的i型干扰素的水平无显著差异(图6a和图6b)。[0235]总之，结果表明，阿司匹林可以显著抑制转导不同血清型aav之后i型干扰素的激活，表明此类作用不具有血清型依赖性。[0236]实例5.[0237]为确认转基因在脑中的表达，将平均重量为20g的雄性c57bl/6j小鼠(购自上海杰思捷实验动物有限公司)(每组n＝6-8只小鼠)分为五组。四组先连续7天注射50mg/kg的阿司匹林，并且在第8天通过尾静脉注射将1010vg/kg、1011vg/kg、1012vg/kg和1013vg/kg的aav病毒分别递送到相应组中的小鼠。第五组为对照组，所述对照组连续7天注射5％蓖麻油(于pbs缓冲液中(目录号：02-024-1acs，bi))，并且在第8天仅将1014vg/kg的aav递送到组中的每只小鼠。注射后15天到25天将动物麻醉并经心脏灌注，固定每只小鼠的脑，并且然后切片。在脑的不同区域分析转基因表达。预期阿司匹林和aav的静脉内施用有效地产生脑中的转基因表达，其中显著增加cns治疗效果。有趣的是，初步研究中使用的aav的剂量远低于被认为能够在脑中表达的剂量(1014vg/kg)。初步研究表明，尽管aav的剂量相对较低且阿司匹林的剂量低，但脑中的转基因表达显著增加。[0238]进一步研究正在设计和进行中，以进一步验证cns作用。[0239]实例6.[0240]在用阿司匹林预处理或用阿司匹林共同施用的小鼠中检测到外源基因的表达。根据实例1中提供的方法制备aav9-cb-gluc，除了使用cb启动子的核酸序列(参见seqidno:3)。简而言之，一组小鼠通过腹膜内注射预先施用阿司匹林50mg/kg，持续7天，然后在第8天施用aav9-cb-gluc(5×1013vg/kg)。相比之下，一组未预先施用阿司匹林的小鼠同时用50mg/kg的阿司匹林与aav9-cb-gluc组合施用。在aav9-cb-gluc施用之后15天处死小鼠，并且收集脑和肝脏用于确定gluc的表达。[0241]在脑中，与非治疗组(即在没有进行任何阿司匹林治疗的情况下施用aav9-cb-gluc的小鼠)相比，接受阿司匹林预先注射的小鼠的gluc的mrna水平(图7a，p《0.01)和酶活性水平(图7b，p《0.01)分别上调了5.5倍和7.13倍。另外，相对于非治疗组，在同时治疗组中，gluc水平的mrna水平(图7a，p《0.01)和酶活性水平(图7b，p《0.01)也上调了2.95倍(p《0.05)和3.55倍(p《0.01)。[0242]在肝脏中，与非治疗组相比，接受阿司匹林预先注射的小鼠的mrna水平和酶活性分别上调1.43倍(图7c，p《0.05)和1.95倍(图7d，p《0.01)。然而，相对于非治疗组，同时治疗组并未增加肝脏中的mrna水平或酶活性水平(图7c、7d，p《0.05)。mrna水平甚至低于非治疗组的(图7c)，而酶活性水平没有显著差异(图7d)。[0243]总之，阿司匹林已显示出可显著改善aav9的转导并增加脑中外源基因的表达。阿司匹林预处理组也观察到肝脏中外源基因的表达的增加。[0244]实例7.[0245]确定了阿司匹林对改善脑中的治疗转基因的表达的作用。aav9-cb-ids载体使用实例1中描述的方法产生，除了艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(ids)基因表达盒插入aavitr之间。编码ids的基因在seqidno:7中提供并且ids的蛋白质序列在seqidno:11中提供。为了确定转基因的治疗效果，使用了b6n.cg-idstm1muen/j小鼠(n＝5，从jax小鼠获得，目录号：024744)，其是一种粘多糖贮积症ii(mpsii)模型，因突变而具有非活性的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)。使用一组野生型对照小鼠作为对照。用于治疗mpsii的aav9-cb-ids载体如实例1中所描述的以3×1013vg/kg(即3e13组)或1×1014vg/kg(即1e14组)的剂量向用阿司匹林注射预处理的小鼠施用。aav9-cb-ids注射之后一个月，在脑中检测到ids酶活性(图8)。结果表明，在3e13组中，阿司匹林预处理显著增加了mpsii小鼠中的ids酶活性，其水平甚至高于野生型小鼠组的水平，并且此类水平显著高于不接受阿司匹林而仅接受相同剂量(3×1013vg/kg)(p《0.05)或甚至更高剂量(1014vg/kg)的aav9-cb-ids的组。这些结果证实，阿司匹林可以显著降低在没有阿司匹林治疗的情况下治疗疾病所需要的aav剂量。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于创业者技术爱好者查询，仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
