针对含有G12V突变的RAS的HLAII类限制性T细胞受体的制作方法

针对含有g12v突变的ras的hla ii类限制性t细胞受体
相关申请的交叉引用
1.本专利申请要求2020年2月26日提交的美国临时专利申请第62/981,856号的权益，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。关于联邦资助的研究或开发的声明
2.本发明是由国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号为ziabc010984的政府支持下完成的。政府享有本技术的某些权利。以电子方式提交的材料的引用并入
3.通过引用整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“751507_st25.txt”，日期为2021年2月18日的一份266,276字节ascii(文本)文件。发明背景
4.一些癌症可具有极有限的治疗选择，尤其在癌症变得转移及不可切除时。尽管在诸如例如手术、化学疗法及辐射疗法的治疗中取得一定进展，但许多癌症(诸如例如胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌及前列腺癌)的预后可能较差。因此，存在对于其他癌症治疗的未满足需求。发明概述
5.本发明的实施方案提供了分离的或纯化的t细胞受体 (tcr)，其包含(a)seq id no:1-3、(b)seq id no:4-6、(c)seq id no:31-33、(d)seq id no:34-36、(e)seq id no:1-6或(f)seq id no:31-36的氨基酸序列，其中所述tcr对于人类白细胞抗原(hla)ii类分子呈递的在位置12处甘氨酸被缬氨酸取代的突变的人类ras氨基酸序列具有抗原特异性，并且其中所述突变的人类ras氨基酸序列为突变的人类kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras)、突变的人类harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(hras)、或突变的人类成神经细胞瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(nras)氨基酸序列，且其中位置12分别参考野生型人类 kras、野生型人类hras或野生型人类nras蛋白被定义。
6.本发明的另一个实施方案提供了包含本发明tcr的功能部分的分离的或纯化的多肽，其中所述功能部分包含以下的氨基酸序列：(a)全部seq id no:1-3、(b)全部seq id no:4-6、 (c)全部seq id no:31-33、(d)全部seq id no:34-36、(e)全部 seq id no:1-6或(f)全部seq id no:31-36。
7.本发明的另一个实施方案提供了包含本发明多肽中的至少一者的分离的或纯化的蛋白质。
8.本发明的其他实施方案提供了与本发明的tcr、多肽及蛋白质相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群及药物组合物。
9.本发明的实施方案提供了分离的或纯化的核酸，其自 5’至3’包含第一核酸序列和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列分别编码以下的氨基序列：seq id no:7和8；7和64；63和8；63和64；7和65；63和65；7和66； 63和66；8和7；64和7；8和63；64和63；65和7；65和63；66 和7；66和63；129和8；129和64；129和65；129和66；8和129； 64和129；65和129；66和129；130和8；130和64；130和65； 130和66；8和130；64和130；65和
130；66和130；37和38；37 和69；37和70；37和71；38和37；69和37；70和37；71和37； 23和24；23和84；83和24；83和84；23和87；83和87；23和90； 83和90；24和23；84和23；24和83；84和83；87和23；87和83； 90和23；90和83；133和24；133和84；133和87；133和90；24 和133；84和133；87和133；90和133；39和40；39和107；39和 112；39和115；40和39；107和39；112和39；115和39；136和 24；136和84；136和87；136和90；24和136；84和136；87和136；90和136；21和22；21和80；79和22；79和80；21和85； 21和88；79和85；79和88；22和21；80和21；22和79；80和79； 85和21；88和21；85和79；88和79；131和22；131和80；131和 85；131和88；22和131；80和131；85和131；88和131；134和 22；134和80；134和85；134和88；22和134；80和134；85和 134；88和134；77和78；77和82；81和78；81和82；77和86； 81和86；78和77；82和77；78和81；82和81；86和77；86和81； 132和78；132和82；132和86；78和132；82和132；86和132； 135和78；135和82；135和86；78和135；82和135；86和135； 77和89；81和89；89和77；89和81；132和89；89和132；135和 89；89和135；41和42；41和105；41和110；41和113；42和41； 105和41；110和41；113和41；103和104；103和111；103和114； 104和103；111和103；114和103；103和106；106和103；47和 48；48和47；67和68；67和76；68和67；76和67；49和50；50 和49；72和73；72和102；73和72；102和72；51和52；52和51； 53和54；54和53；55和56；56和55；57和58；58和57；91和92； 92和91；108和109；109和108；93和94；93和99；94和93；99 和93；97和98；97和101；98和97；101和97；95和96；95和100； 96和95；100和95；116和117；116和122；117和116；122和116； 120和121；120和124；121和120；124和120；118和119；118和 123；119和118或123和118。
10.本发明的实施方案还提供了检测哺乳动物中癌症存在的方法，治疗或预防哺乳动物中癌症的方法，诱导哺乳动物中针对癌症的免疫应答的方法，产生表达对于seq id no:30的肽具有抗原特异性的tcr的宿主细胞的方法及产生本发明的tcr、多肽及蛋白质的方法。
11.另外的实施方案如本文中所描述。附图简述
12.图1a呈现了流式细胞术点图，其显示了在用于选择进行扩增的t细胞的体外刺激(ivs)方案期间的细胞分选。rep为快速扩增方案。
13.图1b呈现了流式细胞术点图，其显示了在如图1a中所示选择及扩增t细胞之后的体外刺激(ivs)方案期间的细胞分选。
14.图1c为显示如图1b中所示分选的细胞的ifn-γelispot 分析结果的图。
15.图1d为显示如图1b中所示分选的细胞中的41bb/ox40 表面标志物上调的分析结果的图。
16.图2a为显示与载有ras
g12v
lp或ras
wt
lp的dc共培养的细胞的ifn-γelispot分析结果的图。
17.图2b为显示与载有ras
g12v
lp或ras
wt
lp的dc共培养的细胞中的41bb/ox40表面标志物上调的分析结果的图。
18.图3为显示用于鉴定由tcr识别的mhc-ii限制元件的 ifn-γelispot及41bb/ox40流式细胞术分析结果的图。
19.图4a为显示针对jurkat-cd4-nfat-荧光素酶细胞系测量的且随后与载有ras
g12v
、
ras
wt
lp或等量dmso的dc共培养的荧光素酶活性的条形图。
20.图4b和图4c为显示通过针对cd3

/cd8

门控细胞(图4b) 或cd3

/cd4

门控细胞(图4c)的4-1bb及ox40(％4-1bb /ox40 )表达的流式细胞术分析评估的tcr反应性的图。(-)为未转导的。
21.图5a为显示通过指定片段的til的流式细胞术测量41bb 和ox40表达的图，所述指定片段通过ivs刺激且与用ras
g12v
lp肽脉冲的自体dc或用ras
g12v
fl转染的rna共培养。阴性对照：单独共培养的t细胞，用载有dmso的dc培养的pbl。阳性对照：用抗cd3/抗cd28抗体缀合的dynabeads培养的pbl。*表示细胞的合并。
22.图5b呈现了用于鉴定由til识别的mhc-ii限制元件的ifn-γelispot结果。
23.图6呈现了tcr 65-10与tcr1比较的ifn-γelispot结果。
24.图7a至图7d呈现了显示针对cd4(图7a)或cd8(图7b) 门控的tcr1转导的pbl及针对cd4(图7c)或cd8(图7d)门控的 tcr5转导的pbl的4-1bb及ox40(％4-1bb /ox40 )表达的流式细胞术分析结果的图。
25.图7e至图7g呈现了显示富集cd4细胞(图7e)或cd8细胞(图7f)的tcr1转导的pbl及分离成cd4或cd8细胞(图7g)的 tcr5转导的pbl的ifn-γ分泌的elispot测量结果的图。发明详述
26.ras家族蛋白质属于小gtp酶的大家族。不受特定理论或机制的束缚，认为当经突变时，ras蛋白可参与许多人类癌症的瘤形成早期的信号转导。单个氨基酸取代可能活化蛋白质。突变的ras蛋白产物可能组成型活化。突变的ras蛋白可在多种人类癌症中的任一种中表达，诸如(例如)胰腺癌(例如，胰腺肿瘤)、结肠直肠癌、肺癌(例如，肺腺癌)、子宫内膜癌、卵巢癌(例如，上皮卵巢癌)及前列腺癌。人类ras家族蛋白质包括kirsten 大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(kras)、harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(hras)及成神经细胞瘤大鼠肉瘤病毒癌基因同源物 (nras)。
27.kras亦称为gtp酶kras、v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因或kras2。存在kras的两种转录变体：kras变体a 及kras变体b。野生型(wt)kras变体a具有seq id no:9的氨基酸序列。野生型(wt)kras变体b具有seq id no:10的氨基酸序列。在下文中，除非另外规定，否则提及“kras”(突变的或未突变的(wt))是指变体a及变体b两者。在活化时，突变的kras 与鸟苷-5
’‑
三磷酸(gtp)结合且将gtp转化为鸟苷5
’‑
二磷酸 (gdp)。
28.hras为ras蛋白质家族的另一成员。hras亦称为 harvey大鼠肉瘤病毒癌蛋白、v-ha-ras harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物或ras家族小gtp结合蛋白h-ras。wt hras具有 seq id no:11的氨基酸序列。
29.nras为ras蛋白质家族的另一成员。nras亦称为 gtp酶nras、v-ras成神经细胞瘤ras病毒癌基因同源物或 nras1。wt nras具有seq id no:12的氨基酸序列。
30.本发明的实施方案提供了分离的或纯化的tcr，其对于由人类白细胞抗原(hla)ii类分子呈递的在位置12处的甘氨酸被缬氨酸取代的突变的人类ras氨基酸序列(在下文中，“突变的ras”)具有抗原特异性，其中所述突变的人类ras氨基酸序列为突变的人类kras、突变的人类hras或突变的人类 nras氨基酸序列，且其中位置12由分别参考wt人类kras、 wt人类hras或wt人类nras蛋白质定义。在下文中，除非另外规定，否则提及“tcr”亦指tcr的功能部分及功能变体。
36.在本发明的实施方案中，tcr对含有上文所描述的g12v 突变的ras肽具有抗原特异性，其中突变的ras肽具有任何长度。在本发明的实施方案中，突变的ras肽具有适合于与本文所描述的任何hla ii类分子结合的任何长度。例如，tcr可对含有g12v突变的 ras肽具有抗原特异性，ras肽的长度为约24个氨基酸残基。突变的ras肽可包含包括g12v突变的突变ras蛋白的任何连续氨基酸残基。在本发明的实施方案中，tcr可对含有g12v突变的ras肽具有抗原特异性，突变的ras肽的长度为约24个氨基酸残基。可由本发明g12v tcr识别的含有g12v的特定肽的实例为24-mer mteyklvvvgavgvgksaltiqli(seq id no:30)，其中seq id no: 27为该肽的wt形式。在本发明的实施方案中，tcr对seq id no: 30的突变人类ras氨基酸序列具有抗原特异性。在本发明的实施方案中，tcr对seq id no:27的野生型人类ras氨基酸序列不具有抗原特异性。不希望受理论所束缚，seq id no:30的24-mer可经加工且以较小区段呈现。
37.在本发明的实施方案中，本发明的tcr能够识别通过 hla ii类分子呈递的突变的ras。就此而言，tcr可在于hla ii类分子的环境内与突变的ras结合后引发免疫反应。除突变的ras之外，本发明的tcr可与hla ii类分子结合。
38.在本发明的一个实施方案中，hla ii类分子为hla-dp分子。hla-dp分子为α链(dpa)及β链(dpb)的异二聚体。hla-dpa链可为任何hla-dpa链。hla-dpb链可为任何hla-dpb链。在本发明的一个实施方案中，hla ii类分子为hla-dpa1链及hla-dpb1 链的异二聚体。hla-dpa1分子的实例可包括但不限于由hla-dpa1* 01:03或02:02等位基因编码的那些分子。hla-dpb1分子的实例可包括但不限于由hla-dpb1*03:01等位基因编码的那些分子。优选地， hla ii类分子为hla-dpa1*01:03或02:02链及hla-dpb1*03:01链的异二聚体。
39.本发明的tcr可提供多种优点中的任一种或多种，包括当由用于过继细胞转移的细胞表达时。突变的ras由癌细胞表达且不由正常非癌性细胞表达。不受特定理论或机制束缚，认为本发明的tcr有利地靶向癌细胞的破坏，同时使正常非癌细胞的破坏最小化或使其消除，从而降低毒性。此外，本发明的tcr可有利地成功治疗或预防对诸如(例如)化学疗法、手术或辐射的其他类型的治疗无反应的突变的ras阳性癌症。ras
g12
突变为许多癌症类型中发现的最常见的热点突变之一。例如，kras g12v 突变分别在约27％及约9％的患有胰腺癌及结肠直肠癌的患者中表达。此外，ras家族成员在不同癌症类型(例如黑色素瘤中的 nras)中共享g12热点突变。另外，本发明的tcr可提供对突变的ras的高度亲合识别，其可提供识别未操纵的肿瘤细胞(例如，尚未用干扰素(ifn)-γ处理、用编码突变的ras及hla
‑ꢀ
dpb1*03:01中的一种或两种的载体转染、用含有g12v突变的 ras肽脉冲或其组合的肿瘤细胞)的能力。此外，hla
‑ꢀ
dpb1*03:01等位基因在大约19％的美国高加索人种族中表达。因此，本发明的tcr可增加符合免疫疗法条件的癌症患者的数目以包括表达hla-dpb1*03:01等位基因的患者，其可能不符合使用识别由其他mhc分子呈递的ras的tcr进行免疫疗法的条件。此外，本发明的tcr、多肽及蛋白质包含人类氨基酸序列，与例如包含小鼠氨基酸序列的tcr、多肽及蛋白质相比，本发明的tcr、多肽及蛋白质可降低人类免疫系统排斥的风险。
40.如本文所使用的短语“抗原特异性”意指tcr可以以高亲合力特异性结合且免疫识别突变的ras。例如，如果表达tcr的约1
×
104至约1
×
105个t细胞在与以下共培养后分泌至少约200pg/ml或更大(例如，200pg/ml或更大、300pg/ml或更大、400pg/ml或更大、500 pg/ml或更大、600pg/ml或更大、700pg/ml或更大、1000pg/ml或更大、5,000pg/ml或更大、7,
000pg/ml或更大、10,000pg/ml或更大、20,000pg/ml或更大，或由前述值中的任两者所定义的范围)的 ifn-γ，则tcr可被视为对突变的ras具有“抗原特定性”：(a)抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞，其用低浓度的突变的ras肽(例如约 0.05ng/ml至约10ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、8ng/ml、 10ng/ml或由前述值中的任两者定义的范围)脉冲；或(b)抗原阴性 hla ii类分子阳性靶细胞，其中已引入编码突变的ras的核苷酸序列以使得该靶细胞表达突变的ras。表达本发明tcr的细胞亦可在与用较高浓度的突变的ras肽脉冲的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞共培养后分泌ifn-γ。hla ii类分子可为本文所述的hla ii类分子中的任一种(例如hla-dpb1*03:01分子)。
41.或者或另外，如果与由阴性对照表达的ifn-γ的量相比，表达tcr的t细胞在与以下共培养后分泌至少两倍的ifn-γ，则tcr可被视为对突变的ras具有“抗原特定性”：(a)用低浓度的突变的ras 肽脉冲的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞；或(b)抗原阴性hla ii 类分子阳性靶细胞，其中已引入编码突变的ras的核苷酸序列以使得该靶细胞表达突变的ras。阴性对照可为例如(i)表达tcr的t细胞，其与(a)用相同浓度的不相关肽(例如，与突变的ras肽具有不同序列的一些其他肽)脉冲的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞或(b)其中已引入编码不相关肽的核苷酸序列以使得靶细胞表达不相关肽的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞共培养；或(ii)未转导的t细胞(例如，衍生自pbmc，其不表达tcr)，其与(a)用相同浓度的突变的ras肽脉冲的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞或(b)其中已引入编码突变的 ras的核苷酸序列以使得该靶细胞表达突变的ras的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞共培养。由阴性对照的靶细胞表达的hla ii类分子将为由与所测试的t细胞共培养的靶细胞表达的相同hla ii类分子。hla ii类分子可为本文所述的hla ii类分子中的任一种(例如 hla-dpb1*03:01分子)。ifn-γ分泌可通过本领域中已知的方法(诸如例如酶联免疫吸附分析(elisa))来测量。
42.或者或另外，如果与分泌ifn-γ的阴性对照t细胞的数目相比，表达tcr的t细胞在与(a)用低浓度的突变的ras肽脉冲的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞或(b)其中已引入编码突变的ras的核苷酸序列以使得靶细胞表达突变的ras的抗原阴性hla ii类分子阳性靶细胞共培养后分泌至少两倍数目的ifn-γ，则tcr可被视为对突变的ras具有“抗原特异性”。hla ii类分子、肽的浓度及阴性对照可如本文中关于本发明的其他方面所描述。分泌ifn-γ的细胞的数目可通过本领域中已知的方法(诸如例如elispot)来测量。
43.或者或另外，如果在用表达突变的ras的靶细胞刺激之后，表达tcr的t细胞上调一种或多种t细胞活化标志物的表达，如通过例如流式细胞术所测量的，则tcr可被视为对突变的ras具有“抗原特异性”。t细胞活化标志物的实例包括4-1bb、ox40、cd107a、 cd69及在抗原刺激后上调的细胞因子(例如，肿瘤坏死因子(tnf)、白介素(il)-2等)。
44.本发明的实施方案提供了包含两条多肽(即多肽链)的tcr，如tcr的α(α)链、tcr的β(β)链、tcr的γ(γ)链、tcr的δ(δ)链或其组合。本发明tcr的多肽可包含任何氨基酸序列，条件是tcr对突变的ras具有抗原特异性。在一些实施方案中，tcr为非天然存在的。
45.在本发明的实施方案中，tcr包含两条多肽链，其中的每一者包含可变区，该可变区包含tcr的互补决定区(cdr)1、 cdr2及cdr3。在本发明的实施方案中，tcr包含第一多肽链，所述第一多肽链包含cdr1，其包含seq id no:1的氨基酸序列 (α链的cdr1)，cdr2，其包含seq id no:2的氨基酸序列(α链的 cdr2)及cdr3，其包含seq id no:3的氨基酸序列(α链
的 cdr3)；及第二多肽链，所述第二多肽链包含cdr1，其包含seq id no:4的氨基酸序列(β链的cdr1)，cdr2，其包含seq id no:5 的氨基酸序列(β链的cdr2)及cdr3，其包含seq id no:6的氨基酸序列(β链的cdr3)。
46.在本发明的另一个实施方案中，tcr包含第一多肽链，所述第一多肽链包含cdr1，其包含seq id no:31的氨基酸序列(α链的cdr1)，cdr2，其包含seq id no:32的氨基酸序列 (α链的cdr2)及cdr3，其包含seq id no:33的氨基酸序列(α链的cdr3)；及第二多肽链，所述第二多肽链包含cdr1，其包含seq id no:34的氨基酸序列(β链的cdr1)，cdr2，其包含 seq id no:35的氨基酸序列(β链的cdr2)及cdr3，其包含 seq id no:36的氨基酸序列(β链的cdr3)。
47.就此而言，本发明的tcr可包含选自seq id no:1-6及 31-36的任何一个或多个氨基酸序列。在本发明的实施方案中，tcr包含以下的氨基酸序列：(a)全部seq id no:1-3，(b)全部seq id no: 4-6，(c)全部seq id no:31-33，(d)全部seq id no:34-36，(e)全部 seq id no:1-6，或(f)全部seq id no:31-36。在尤其优选的实施方案中，tcr包含以下的氨基酸序列：(i)全部seq id no:1-6或(ii)全部seq id no:31-36。
48.seq id no:3、6、33或36中的任一个或多个(即α链或β链或两者)的cdr3还可包含紧接cdr的第一氨基酸的n端的半胱氨酸或紧接最终氨基酸的c端的苯丙氨酸或两者。
49.在本发明的实施方案中，tcr包含含有上述cdr的tcr 的可变区的氨基酸序列。tcr可包含人类可变区，例如人类α链可变区及人类β链可变区。就此而言，tcr可包含以下的氨基酸序列：seq id no:7(含有wt n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:129(含有替代wt n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:8(含有变体n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:37(含有wt n端信号肽的4360 tcr5α链的可变区)；seq id no: 38(含有变体n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)；seq id no: 47(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)； seq id no:48(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:49(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5α链的可变区)；seq id no:50(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)；seq id no:63(含有变体n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:130(含有替代变体n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:64(含有wt n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:67(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:68(使用 signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:72(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5α链的可变区)；seq id no:73(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5 β链的可变区)；seq id no:65(含有替代变体n端信号肽的4360 tcr1 β链的可变区)；seq id no:66(含有替代wt n端信号肽的4360 tcr1 β链的可变区)；seq id no:69(含有替代变体n端信号肽的4360 tcr5 β链的可变区)；seq id no:70(含有wt n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)；seq id no:71(含有替代wt n端信号肽的4360 tcr5 β链的可变区)；seq id no:76(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1β链的替代可变区)；seq id no:102(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5β链的替代可变区)；seq id no:7 和8两者；seq id no:129和8两者；seq id no:63和8两者；seq id no:130和8两者；seq id no:7和64两者；seq id no:129和 64两者；seq id no:63和64两者；seq id no:130和64两者；seq id no:7和65两者；seq id no:129和65
两者；seq id no:63和 65两者；seq id no:130和65两者；seq id no:7和66两者；seq id no:129和66两者；seq id no:63和66两者；seq id no:130 和66两者；seq id no:37和38两者；seq id no:37和69两者； seq id no:37和70两者；seq id no:37和71两者；seq id no: 47和48两者；seq id no:67和68两者；seq id no:67和76两者； seq id no:49和50两者；seq id no:72和73两者；或seq id no: 72和102两者。优选地，tcr包含以下的氨基酸序列：(i)seq id no: 7和8两者；(ii)seq id no:63和64两者；(iii)seq id no:7和65两者；(iv)seq id no:63和66两者；(v)seq id no:37和38两者； (vi)seq id no:37和70两者；(vii)seq id no:47和48两者；(viii)seq id no:67和68两者；(ix)seq id no:67和76两者；(x)seq id no: 49和50两者；(xi)seq id no:72和73两者；或(xii)seq id no:72 和102两者。
50.本发明的tcr还可包含α链恒定区及β链恒定区。恒定区可衍生自诸如例如人类或小鼠的任何合适的物种。在本发明的实施方案中，tcr还包含鼠类α及β链恒定区或人类α及β链恒定区。如本文所用，当提及tcr或本文所述的tcr的任何组分(例如，互补决定区(cdr)、可变区、恒定区、α链和/或β链)时，术语“鼠类”或“人类”意指分别来源于小鼠或人类的 tcr(或其组分)，即，分别来源于小鼠t细胞或人类t细胞或者曾经由小鼠t细胞或人类t细胞表达的tcr(或其组分)。
51.本发明的实施方案提供了包含人类可变区及鼠类恒定区的嵌合tcr，其中tcr对由hla ii类分子呈递的突变的人类ras氨基酸序列具有抗原特异性。鼠类恒定区可以提供任何一个或多个优点。例如，鼠类恒定区可减少本发明的tcr与引入本发明的tcr的宿主细胞的内源性tcr的错配。或者或另外，与具有人类恒定区的相同tcr相比，鼠类恒定区可增加本发明tcr的表达。嵌合tcr可包含以下的氨基酸序列：seq id no:19的氨基酸序列(野生型(wt)鼠类α链恒定区)、seq id no: 20(wt鼠类β链恒定区)、seq id no:74的氨基酸序列(变体鼠类α链恒定区)、seq id no:75(变体鼠类β链恒定区)或seq id no:19及20 两者或74及75两者。优选地，本发明的tcr包含seq id no:19及 20两者或74及75两者的氨基酸序列。嵌合tcr可包含本文所描述的鼠类恒定区中的任一个与如本文中关于本发明的其他方面所描述的 cdr区中的任一个的组合。就此而言，tcr例如可包含以下的氨基酸序列：(a)全部seq id no:1-3及19；(b)全部seq id no:4-6及20； (c)全部seq id no:1-3及74；(d)全部seq id no:4-6及75；(e)全部 seq id no:31-33及19；(f)全部seq id no:34-36及20；(g)全部seq id no:31-33及74；(h)全部seq id no:34-36及75；(i)全部seq id no:1-6及19-20；(j)全部seq id no:1-6及74-75；(k)全部seq id no:31-36及19-20；或(l)全部seq id no:31-36及74-75。在本发明的另一个实施方案中，嵌合tcr可包含本文所描述的鼠类恒定区中的任一个与本文中关于本发明的其他方面所描述的可变区中的任一个的组合。就此而言，tcr例如可包含以下的氨基酸序列：(i)seq id no: 7及19两者；(ii)seq id no:129及19两者；(iii)seq id no:8及20 两者；(iv)seq id no:7及74两者；(v)seq id no:129及74两者； (vi)seq id no:8及75两者；(vii)seq id no:37及19两者；(viii)seq id no:38及20两者；(ix)seq id no:37及74两者；(x)seq id no: 38及75两者；(xi)全部seq id no:7-8及19-20；(xii)seq id no: 129、8及19-20全部；(xiii)全部seq id no:37-38及19-20；(xiv) 全部seq id no:7-8及74-75；(xv)全部seq id no:129、8及74
‑ꢀ
75；或(xvi)全部seq id no:37-38及74-75。
52.在本发明的另一个实施方案中，tcr包含以下的氨基酸序列：seq id no:23(含有
wt鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:133(含有wt鼠类恒定区及替代wt n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:24(含有wt鼠类恒定区及变体n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:39(含有wt鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr5的α链)、seq id no:40(含有wt鼠类恒定区及变体n端信号肽的4360 tcr5的β链)、seq id no:51(如使用imgt预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:52(如使用imgt预测的含有wt 鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no: 53(如使用imgt预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的 4360 tcr5的α链)、seq id no:54(如使用imgt预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5的β链)、seq id no:77(含有取代的鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:132(含有取代的鼠类恒定区及替代wt n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:78(含有wt鼠类恒定区及变体n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:81(含有取代的鼠类恒定区及变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:135(含有取代的鼠类恒定区及替代变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no: 82(含有取代的鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr1的β链)、 seq id no:83(含有wt鼠类恒定区及变体n端信号肽的4360 tcr1 的α链)、seq id no:136(含有wt鼠类恒定区及替代变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:84(含有wt鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:91(如使用imgt预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)、 seq id no:92(如使用imgt预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n 端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:95(如使用signalp预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)、 seq id no:96(如使用signalp预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n 端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:97(如使用signalp预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)、seq id no:98(如使用signalp预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:86(含有取代的鼠类恒定区及替代变体n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:87(含有wt 鼠类恒定区及替代变体n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no: 89(含有取代的鼠类恒定区及替代wt n端信号肽的4360 tcr1的β链)、seq id no:90(含有wt鼠类恒定区及替代wt n端信号肽的 4360 tcr1的β链)、seq id no:100(如使用signalp预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)、seq id no:101(如使用signalp预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)、seq id no:103(含有取代的鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr5的α链)、seq id no:104(含有取代的鼠类恒定区及变体n端信号肽的4360 tcr5的β链)、seq id no: 106(含有取代的鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr5的β链)、 seq id no:107(含有wt鼠类恒定区及wt n端信号肽的4360 tcr5 的β链)、seq id no:108(如使用imgt预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)、seq id no:109(如使用 imgt预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5 的β链)、seq id no:118(如使用signalp预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)、seq id no:119(如使用 signalp预测的含有取代的鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5 的β链)、seq id no:120(如使用signalp预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)、seq id no:121(如使用 signalp预测的含有wt鼠类恒定区且不含n端信号肽的4360 tcr5 的β链)、seq id no:111(含有取代的鼠类恒定区及
no:55的位置226处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe或 trp；以及(iv)seq id no:55的位置227处的x为gly、ala、val、 leu、ile、pro、phe、met或trp；(j)含有seq id no:56的氨基酸序列的β链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:56的位置173处的x为ser或cys；(k)含有seq id no:57的氨基酸序列的α链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的 4360 tcr5的α链)，其中：(i)seq id no:57的位置159处的x为thr 或cys；(ii)seq id no:57的位置223处的x为ser、ala、val、leu、 ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:57的位置225处的x为 met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:57的位置226处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp； (l)含有seq id no:58的氨基酸序列的β链(如使用imgt预测的不含 n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:58的位置172处的x为ser或cys；(m)(i)及(j)两者；(n)(k)及(l)两者；(o)含有seq id no:79的氨基酸序列的α链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:79的位置179处的x为thr或cys；(ii)seq id no:79的位置243处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp；(iii)seq id no:79的位置245处的x为met、ala、val、 leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:79的位置246处的x 为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(p)含有seq id no:134的氨基酸序列的α链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:134的位置180处的x为thr或cys；(ii)seq id no:134的位置244处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp；(iii)seq id no:134的位置246处的x为met、ala、val、 leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:134的位置247处的 x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(q)含有seq id no:80的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:80的位置198处的x为ser或cys；(r)含有 seq id no:105的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:105的位置197处的x为ser或cys； (s)(o)及(q)两者；(t)(p)及(q)两者；(u)(d)及(r)两者；(v)含有seq id no: 93的氨基酸序列的α链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:93的位置159处的x为thr或 cys；(ii)seq id no:93的位置223处的x为ser、ala、val、leu、 ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:93的位置225处的x为 met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:93的位置226处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp； (w)含有seq id no:94的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:94的位置177 处的x为ser或cys；(x)含有seq id no:116的氨基酸序列的α链 (如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)，其中： (i)seq id no:116的位置158处的x为thr或cys；(ii)seq id no: 116的位置222处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或 trp；(iii)seq id no:116的位置224处的x为met、ala、val、leu、 ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:116的位置225处的x为 gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(y)含有seq id no: 117的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的 4360 tcr5的β链)，其中seq id no:117的位置176处的x为ser 或cys；(z)(v)及(w)两者；(aa)(x)及(y)两者；(bb)含有seq id no:85 的氨基酸序列的β链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:85的位置187处的x为ser或cys；(cc)含有seq id no:88的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:88的位置187处的x为ser或cys；(dd) 含有seq id no:99的氨基酸序列的β链(如使
用signalp预测的不含 n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:99的位置 172处的x为ser或cys；(ee)(a)及(bb)两者；(ff)(b)及(bb)两者；(gg)(o) 及(cc)两者；(hh)(p)及(cc)两者；(ii)(v)及(dd)两者；(jj)含有seq id no: 110的氨基酸序列的β链(含有变体n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no:110的位置186处的x为ser或cys；(kk)含有seq id no:113的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no:113的位置186处的x为ser或 cys；(ll)含有seq id no:122的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no: 122的位置171处的x为ser或cys；(mm)(d)及(jj)两者；(nn)(d)及(kk) 两者；或(oo)(x)及(ll)两者。在本发明的实施方案中，包含seq id no: 21的tcr不包含seq id no:23(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:131的tcr不包含seq id no:133(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:22的tcr不包含 seq id no:24(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:41的tcr不包含seq id no:39(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:42的tcr不包含seq id no:40(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:55的tcr不包含seq id no:51(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:56的tcr不包含seq id no:52(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:57的tcr不包含seq id no:53(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:58的tcr不包含seq id no:54(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含 seq id no:79的tcr不包含seq id no:83(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:134的tcr不包含seq id no: 136(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:80的 tcr不包含seq id no:84(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:93的tcr不包含seq id no:97(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:94的tcr不包含seq id no:98(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:85 的tcr不包含seq id no:87(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:88的tcr不包含seq id no:90(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:99的tcr不包含seq id no:101(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no: 116的tcr不包含seq id no:120(未取代的α链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:117的tcr不包含seq id no:121(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:105的tcr不包含seq id no:107(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:110的tcr不包含seq id no:112(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:113的tcr不包含seq id no:115(未取代的β链)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:122的tcr 不包含seq id no:124(未取代的β链)。
54.本文所描述的小鼠α恒定区中的任一个的第一氨基酸可不同于如seq id no:17及19中所提供的n。例如，在如本文所描述的任何tcr构建体、多肽、蛋白质等中，此第一氨基酸可由分裂密码子 (具有来自可变区及恒定区两者的核苷酸)编码，使得鼠类α恒定区中的任一个可在该位置具有不同的氨基酸。类似地，本文所描述的小鼠β恒定区中的任一个的第一氨基酸可不同于如seq id no:18及20中所提供的e，例如此第一氨基酸可由分裂密码子编码。
55.在本发明的实施方案中，tcr包含取代的恒定区。就此而言，tcr例如可包含在α及β
链之一或两者的恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的本文所描述的任何tcr 的氨基酸序列。优选地，tcr包含在α及β链之一或两者的鼠类恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代的鼠类恒定区。在尤其优选的实施方案中，tcr包含在α链的鼠类恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸取代且在β链的鼠类恒定区中具有一个氨基酸取代的鼠类恒定区。在一些实施方案中，与包含未取代的(野生型)恒定区的亲本tcr相比，包含取代的恒定区的tcr有利地提供以下中的一种或多种：突变的ras

靶标的识别增加、宿主细胞的表达增加、与内源性tcr的错配减少及抗肿瘤活性增加。一般而言，tcrα及β链的鼠类恒定区的取代的氨基酸序列(seq id no:17及18)，当与具有一个氨基酸取代的seq id no:19及seq id no:18相比时，分别对应于未取代的鼠类恒定区氨基酸序列seq id no:19及20的全部或部分，当与seq id no:20相比时，分别对应于具有一个、二个、三个或四个氨基酸取代的seq id no:17。就此而言，本发明的实施方案提供了包含以下的氨基酸序列的tcr：(a)seq id no:17(α链的恒定区)，其中(i)位置48处的x为thr或cys；(ii)位置112 处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii) 位置114处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；及(iv)位置115处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp；(b)seq id no:18(β链的恒定区)，其中位置57处的 x为ser或cys；或(c)seq id no:17及18两者。在本发明的实施方案中，包含seq id no:17的tcr不包含seq id no:19(α链的未取代的鼠类恒定区)。在本发明的实施方案中，包含seq id no:18的tcr不包含seq id no:20(β链的未取代的鼠类恒定区)。
56.在本发明的实施方案中，取代的恒定区包括α及β链之一或两者的恒定区中的半胱氨酸取代以提供半胱氨酸取代的 tcr。α及β链中相对的半胱氨酸提供二硫键，该二硫键将取代 tcr的α及β链的恒定区彼此连接且其不存在于包含未取代的鼠类恒定区的tcr中。就此而言，tcr可为半胱氨酸取代的tcr，其中seq id no:19的位置48处的天然thr(thr48)及seq id no:20的位置57处的天然ser(ser57)之一或两者可以用cys取代。优选地，seq id no:19的天然thr48及seq id no:20的天然ser57 两者被cys取代。半胱氨酸取代的tcr恒定区序列的实例阐述于表2中。在本发明的实施方案中，半胱氨酸取代的tcr包含(i)seq id no:17、(ii)seq id no:18或(iii)seq id no:17及18两者，其中seq id no:17及18两者如表2中所定义。除本文所描述的cdr 或可变区中的任一种之外，本发明的半胱氨酸取代的tcr可包括取代的恒定区。
57.在本发明的实施方案中，半胱氨酸取代的嵌合tcr包含全长α链及全长β链。半胱氨酸取代的嵌合tcrα链及β链序列的实例阐述于表2中。在本发明的实施方案中，tcr包含：(i)seq id no:21、 (ii)seq id no:131、(iii)seq id no:22、(iv)seq id no:41、(v)seq id no:42、(vi)seq id no:21及22两者、(vii)seq id no:131及22 两者、(viii)seq id no:41及42两者、(ix)seq id no:55、(x)seq id no:56、(xi)seq id no:57、(xii)seq id no:58、(xiii)seq id no:55 及56两者或(xiv)seq id no:57及58两者、(xv)seq id no:79、 (xvi)seq id no:134、(xvii)seq id no:80、(xviii)seq id no:105、 (xix)seq id no:79及80两者、(xx)seq id no:134及80两者、 (xxi)seq id no:41及105两者、(xxii)seq id no:93、(xxiii)seq id no:94、(xxiv)seq id no:116、(xxv)seq id no:117、(xxvi)seq id no:93及94两者、(xxvii)seq id no:116及117两者、(xxviii)seq id no:85、(xxix)seq id no:88、(xxx)seq id no:99、(xxxi)seq id no:21及85两者、(xxxii)seq id no:131及85两
者、(xxxiii)seq id no:79及88两者、(xxxiv)seq id no:134及88两者、(xxxv)seq id no:93及99两者、(xxxvi)seq id no:110、(xxxvii)seq id no:113、 (xxxviii)seq id no:122、(xxxix)seq id no:41及110两者、(xl)seq id no:41及113两者、(xli)seq id no:116及122两者，其中全部 seq id no:17、18、21、22、41、42、55-58、79、80、85、88、93、 94、99、105、110、113、116、117、122、131及134如表2中所定义。表2
58.在本发明的实施方案中，取代的氨基酸序列包括用疏水性氨基酸取代α链的恒定区的跨膜(tm)结构域中的一个、两个或三个氨基酸以提供疏水性氨基酸取代的tcr(在本文中亦称为“lvl修饰的tcr”)。与tm结构域中没有疏水性氨基酸取代的tcr相比，tcr的tm结构域中的疏水性氨基酸取代可以增加tcr的tm结构域的疏水性。就此而言，tcr为lvl修饰的 tcr，其中seq id no:19的天然ser112、met114及gly115中的一个、两个或三个可独立地被ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp取代；优选地被leu、ile或val取代；且seq id no:20的天然ser57可以被cys取代。优选地，seq id no:19 的全部三个天然ser112、met114及gly115可独立地被ala、val、 leu、ile、pro、phe、met或trp取代；优选地被leu、ile或val 取代。在本发明的实施方案中，lvl修饰的tcr包含(i)seq id no:17，(ii)seq id no:18，或(iii)seq id no:17及18两者，其中seq id no:17及18两者如表3中所定义。除本文所描述的 cdr或可变区中的任一种之外，本发明的lvl修饰的tcr可包括取代的恒定区。
59.在本发明的实施方案中，lvl修饰的tcr包含全长α链及全长β链。lvl修饰的tcrα链及β链序列的实例阐述于表3中。在本发明的实施方案中，lvl修饰的tcr包含(i)seq id no:21、(ii)seq id no:131、(iii)seq id no:22、(iv)seq id no:41、(v)seq id no: 42、(vi)seq id no:21及22两者、(vii)seq id no:131及22两者、 (viii)seq id no:41及42两者、(ix)seq id no:55、(x)seq id no: 56、(xi)seq id no:57、(xii)seq id no:58、(xiii)seq id no:55及 56两者或(xiv)seq id no:57及58两者、(xv)seq id no:79、(xvi)seq id no:134、(xvii)seq id no:80、(xviii)seq id no:105、(xix)seq id no:79及80两者、(xx)seq id no:134及80两者、(xxi)seq id no:41及105两者、(xxii)seq id no:93、(xxiii)seq id no:94、 (xxiv)seq id no:116、(xxv)seq id no:117、(xxvi)seq id no:93及 94两者、(xxvii)seq id no:116及117两者、(xxviii)seq id no:85、 (xxix)seq id no:88、(xxx)seq id no:99、(xxxi)seq id no:21及 85两者、(xxxii)seq id no:131及85两者、(xxxiii)seq id no:79及 88两者、(xxxiv)seq id no:134及88两者、(xxxv)seq id no:93及 99两者、(xxxvi)seq id no:110、(xxxvii)seq id no:113、(xxxviii)seq id no:122、(xxxix)seq id no:41及110两者、(xl)seq id no:41及 113两者、(xli)seq id no:116及122两者，其中全部seq id no:17、 18、21、22、41、42、55-58、79、80、85、88、93、94、99、105、110、 113、116、117、122、131及134如表3中所定义。
表3表3
60.在本发明的实施方案中，取代的氨基酸序列包括α链及β链之一或两者的恒定区中的半胱氨酸取代与α链的恒定区的跨膜(tm)结构域中的一个、两个或三个氨基酸被疏水性氨基酸取代(在本文中亦称为“半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr”)的组合。就此而言，tcr为半胱氨酸取代的lvl修饰的嵌合tcr，其中seq id no:19的天然thr48被cys取代；seq id no:19的一个、两个或三个天然ser112、met114及gly115独立地被ala、val、leu、ile、 pro、phe、met或trp取代；优选地被leu、ile或val取代；及seq id no:20的天然ser57被cys取代。优选地，seq id no:19的全部三个天然ser112、met114及gly115可独立地被ala、val、leu、ile、 pro、phe、met或trp取代；优选地被leu、ile或val取代。在本发明的实施方案中，半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr包含(i)seq id no:17，(ii)seq id no:18，或(iii)seq id no:17及18两者，其中 seq id no:17及18两者如表4中所定义。除本文所描述的cdr或可变区中的任一种之外，本发明的半胱氨酸取代的lvl修饰的 tcr可包括取代的恒定区。
61.在实施方案中，半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr包含全长α链及全长β链。在本发明的实施方案中，半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr包含：(i)seq id no:21、(ii)seq id no:131、(iii)seq id no: 22、(iv)seq id no:41、(v)seq id no:42、(vi)seq id no:21及22 两者、(vii)seq id no:131及22两者、(viii)seq id no:41及42两者、(ix)seq id no:55、(x)seq id no:56、(xi)seq id no:57、(xii)seq id no:58、(xiii)seq id no:55及56两者或(xiv)seq id no:57及58 两者、(xv)seq id no:79、(xvi)seq id no:134、(xvii)seq id no:80、 (xviii)seq id no:105、(xix)seq id no:79及80两者、(xx)seq id no:134及80两者、(xxi)seq id no:41及105、(xxii)seq id no:93、 (xxiii)seq id no:94、(xxiv)seq id no:116、(xxv)seq id no:117、 (xxvi)seq id no:93及94两者、(xxvii)seq id no:116及117两者、 (xxviii)seq id no:85、(xxix)seq id no:88、(xxx)seq id no:99、 (xxxi)seq id no:21及85两者、(xxxii)seq id no:131及85两者、 (xxxiii)seq id no:79及88两
者、(xxxiv)seq id no:134及88两者、 (xxxv)seq id no:93及99两者、(xxxvi)seq id no:110、(xxxvii)seq id no:113、(xxxviii)seq id no:122、(xxxix)seq id no:41及110 两者、(xl)seq id no:41及113两者、(xli)seq id no:116及122两者，其中全部seq id no:17、18、21、22、41、42、55-58、79、80、 85、88、93、94、99、105、110、113、116、117、122、131及134如表4中所定义。表4
id no:82(含有wt n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr1的β链)；(k)seq id no:89(含有wt n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr1的替代β链)；(l)seq id no:86(含有变体n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr1的β链)；(m)seq id no:100(通过signalp预测的不含n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的 4360 tcr1的β链)；(n)seq id no:132(含有替代wt n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr1的α链)；(o)seq id no: 135(含有替代变体n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr1的α链)；(p)(a)及(b)两者；(q)(c)及(d)两者；(r)(e)及(f)两者；(s)(g) 及(h)两者；(t)(i)及(j)两者；(u)(i)及(k)两者；(v)(c)及(l)两者；(w)(g)及 (m)两者；(x)(n)及(d)两者；或(o)及(j)两者。
63.在本发明的实施方案中，半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr 包含：(a)seq id no:74(半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr的α链恒定区)；(b)seq id no:75(半胱氨酸取代的lvl修饰的tcr的β链恒定区)；(c)seq id no:103(含有wt n端信号序列的半胱氨酸取代的 lvl修饰的4360 tcr5的α链)；(d)seq id no:104(含有变体n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的β链)；(e)seq id no:108(通过imgt预测的不含n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl 修饰的4360 tcr5的α链)；(f)seq id no:109(通过imgt预测的不含n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的β链)； (g)seq id no:118(通过signalp预测的不含n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的α链)；(h)seq id no:119(通过 signalp预测的不含n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的β链)；(j)seq id no:106(含有wt n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的β链)；(k)seq id no:114(含有wt n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的替代β链)； (l)seq id no:111(含有变体n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的替代β链)；(m)seq id no:123(通过signalp预测的不含n端信号序列的半胱氨酸取代的lvl修饰的4360 tcr5的替代β链)；(n)(a)及(b)两者；(o)(c)及(d)两者；(p)(e)及(f)两者；(q)(g)及 (h)两者；(r)(c)及(j)两者；(s)(c)及(k)两者；(t)(c)及(l)两者；或(u)(g)及 (m)两者。
64.本发明的实施方案还提供了包含本文中所描述的tcr 中任一种的功能部分的多肽。如本文所用，术语“多肽”包括寡肽且是指由一个或多个肽键连接的单链氨基酸。
65.关于本发明的多肽，功能部分可为任何部分，其包含所述部分来源的tcr的连续氨基酸，条件是功能部分与突变的 ras特异性结合。当在提及tcr中使用时，术语“功能部分”是指本发明的tcr的任何部分或片段，该部分或片段保留所述部分或片段来源的tcr(亲本tcr)的生物活性。功能部分涵盖，例如保留与亲本tcr相似程度、相同程度或者比亲本tcr更高程度地特异性结合突变的ras(例如在hla-dpb1*03:01分子的环境中)或者检测、治疗或预防癌症的能力的tcr的那些部分。提及亲本tcr，功能部分可包含例如亲本tcr的约10％、约25％、约30％、约50％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多。
66.功能部分可在该部分的氨基或羧基端或在两端包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸在亲本tcr的氨基酸序列中不存在。理想地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如特异性结合突变的ras；和/或具有检测癌症、治疗或预防癌症等的能力。更理想地，与亲本tcr的生物活性相比，另外的氨基酸增强了生物活性。
67.多肽可包含本发明的tcr的α链及β链中的任一个或两者的功能部分，如包含本发
明的tcr的α链和/或β链的可变区的cdr1、 cdr2及cdr3中的一个或多个的功能部分。在本发明的实施方案中，多肽可包含seq id no:1(α链的cdr1)、seq id no:2(α链的cdr2)、 seq id no:3(α链的cdr3)、seq id no:4(β链的cdr1)、seq id no:5(β链的cdr2)、seq id no:6(β链的cdr3)或其组合的氨基酸序列。在本发明的另一个实施方案中，多肽可包含seq id no:31(α链的cdr1)、seq id no:32(α链的cdr2)、seq id no:33(α链的cdr3)、 seq id no:34(β链的cdr1)、seq id no:35(β链的cdr2)、seq id no:36(β链的cdr3)或其组合的氨基酸序列。
68.就此而言，本发明的多肽可包含选自seq id no:1-6及31
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36的氨基酸序列中的任一个或多个。在本发明的实施方案中，tcr包含以下的氨基酸序列：(a)全部seq id no:1-3，(b)全部seq id no: 4-6，(c)全部seq id no:31-33，(d)全部seq id no:34-36，(e)全部 seq id no:1-6，或(f)全部seq id no:31-36。在优选的实施方案中，多肽包含以下的氨基酸序列：(i)全部seq id no:1-6或(ii)全部seq id no:31-36。seq id no:3、6、33或36中的任一个或多个(即α链或β链或两者)的cdr3还可包含紧接cdr的第一氨基酸的n端的半胱氨酸或紧接最终氨基酸的c端的苯丙氨酸或两者。
69.在本发明的实施方案中，本发明的多肽可包含例如本发明 tcr的可变区，该可变区包含上文阐述的cdr区的组合。就此而言， tcr可包含以下的氨基酸序列：seq id no:7(含有wt n端信号肽的 4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:129(含有替代wt n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:8(含有变体n端信号肽的 4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:37(含有wt n端信号肽的4360 tcr5α链的可变区)；seq id no:38(含有变体n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)；seq id no:47(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:48(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:49(使用 imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5α链的可变区)；seq id no:50(使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)；seq id no:63(含有变体n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:130(含有替代变体n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:64(含有wt n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:67(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1α链的可变区)；seq id no:68(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:72(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5α链的可变区)；seq id no:73(使用 signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)；seq id no:65(含有替代变体n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:66(含有替代wt n端信号肽的4360 tcr1β链的可变区)；seq id no:69(含有替代变体n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)； seq id no:70(含有wt n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)； seq id no:71(含有替代wt n端信号肽的4360 tcr5β链的可变区)； seq id no:76(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1β链的替代可变区)；seq id no:102(使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5β链的替代可变区)；seq id no:7及8两者；seq id no:129及8两者；seq id no:63及8两者；seq id no:130及8两者；seq id no:7及64两者；seq id no:129及64两者；seq id no:63及64两者；seq id no:130及64两者；seq id no:7及65 两者；seq id no:129及65两者；seq id no:63及65两者；seq id no:130及65两者；seq id no:7及66两者；seq id no:129及 66两者；seq id no:63及66两者；seq id no:130及66两者；seq id no:37及38两者；seq id no:
no:93及99两者、seq id no:95及100两者或seq id no:97 及101两者。就此而言，本发明多肽可包含以下的氨基酸序列：seq id no:41、seq id no:42、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:107、seq id no:110、seq id no:111、seq id no:112、seq id no:113、seq id no:114、seq id no:115、seq id no:41及42 两者、seq id no:39及40两者、seq id no:103及104两者、seq id no:41及105两者、seq id no:103及106两者、seq id no:39 及107两者、seq id no:41及110两者、seq id no:39及112两者、seq id no:103及111两者、seq id no:41及113两者、seq id no:39及115两者、seq id no:103及114两者、seq id no:57、 seq id no:58、seq id no:53、seq id no:54、seq id no:108、 seq id no:109、seq id no:116、seq id no:117、seq id no:118、 seq id no:119、seq id no:120、seq id no:121、seq id no:122、 seq id no:123、seq id no:124两者、seq id no:57及58两者或 seq id no:53及54两者、seq id no:108及109两者、seq id no: 116及117两者、seq id no:118及119两者、seq id no:120及121 两者、seq id no:116及122两者、seq id no:120及124两者或 seq id no:118及123两者。或者，本发明的多肽可包含本文所描述的tcr的两条链。
73.在本发明的实施方案中，多肽包含：(a)含有seq id no:21 的氨基酸序列的α链(含有野生型n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:21的位置179处的x为thr或cys；(ii)seq id no:21的位置243处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met 或trp；(iii)seq id no:21的位置245处的x为met、ala、val、leu、 ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:21的位置246处的x为 gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(b)含有seq id no: 131的氨基酸序列的α链(含有野生型n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:131的位置180处的x为thr或cys；(ii)seq id no:131的位置244处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp；(iii)seq id no:131的位置246处的x为met、ala、val、 leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:131的位置247处的 x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(c)含有seq id no:22的氨基酸序列的β链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:22的位置198处的x为ser或cys；(d)含有 seq id no:41的氨基酸序列的α链(含有wt n端信号肽的4360 tcr5 的α链)，其中：(i)seq id no:41的位置179处的x为thr或cys； (ii)seq id no:41的位置243处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、 phe、met或trp；(iii)seq id no:41的位置245处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:41的位置246处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(e)含有seq id no:42的氨基酸序列的β链(含有变体n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:42的位置197处的x为ser或cys；(f)(a)及 (c)两者；(g)(b)及(c)两者；或(h)(d)及(e)两者；(i)包含seq id no:55 的氨基酸序列的α链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:55的位置160处的x为thr或 cys；(ii)seq id no:55的位置224处的x为ser、ala、val、leu、 ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:55的位置226处的x为 met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:55的位置227处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp； (j)含有seq id no:56的氨基酸序列的β链(如使用imgt预测的不含 n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:56的位置173处的x为ser或cys；(k)含有seq id no:57的氨基酸序列的α链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)，其中：(i)seq id no:57的位置159处的x为
thr或cys；(ii)seq id no:57的位置 223处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:57的位置225处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe 或trp；以及(iv)seq id no:57的位置226处的x为gly、ala、val、 leu、ile、pro、phe、met或trp；(l)含有seq id no:58的氨基酸序列的β链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:58的位置172处的x为ser或cys；(m)(i)及(j)两者；或(n)(k)及(l)两者；(o)含有seq id no:79的氨基酸序列的α链 (含有变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:79 的位置179处的x为thr或cys；(ii)seq id no:79的位置243处的 x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no: 79的位置245处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:79的位置246处的x为gly、ala、val、leu、 ile、pro、phe、met或trp；(p)含有seq id no:134的氨基酸序列的α链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no: 134的位置180处的x为thr或cys；(ii)seq id no:134的位置244 处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:134的位置246处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe 或trp；以及(iv)seq id no:134的位置247处的x为gly、ala、val、 leu、ile、pro、phe、met或trp；(q)含有seq id no:80的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:80的位置198处的x为ser或cys；(r)含有seq id no:105的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中 seq id no:105的位置197处的x为ser或cys；(s)(o)及(q)两者； (t)(p)及(q)两者；(u)(d)及(r)两者；(v)含有seq id no:93的氨基酸序列的α链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:93的位置159处的x为thr或cys；(ii)seq id no:93的位置223处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp；(iii)seq id no:93的位置225处的x为met、ala、val、 leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:93的位置226处的x 为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(w)含有seq id no:94的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:94的位置177处的x为ser 或cys；(x)含有seq id no:116的氨基酸序列的α链(如使用signalp 预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)，其中：(i)seq id no: 116的位置158处的x为thr或cys；(ii)seq id no:116的位置222 处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:116的位置224处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe 或trp；以及(iv)seq id no:116的位置225处的x为gly、ala、val、 leu、ile、pro、phe、met或trp；(y)含有seq id no:117的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:117的位置176处的x为ser或cys；(z)(v)及 (w)两者；(aa)(x)及(y)两者；(bb)含有seq id no:85的氨基酸序列的β链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:85的位置187处的x为ser或cys；(cc)含有seq id no:88的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:88的位置187处的x为ser或cys；(dd)含有seq id no:99的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:99的位置172处的x 为ser或cys；(ee)(a)及(bb)两者；(ff)(b)及(bb)两者；(gg)(o)及(cc)两者；(hh)(p)及(cc)两者；(ii)(v)及(dd)两者；(jj)含有seq id no:110的氨基酸序列的β链(含有变体n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no:110的位置186处的x为ser或cys；(kk)含有seq id no:113的氨基酸序列的β链(含有wt n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中
seq id no:113的位置186处的x为ser或cys； (ll)含有seq id no:122的氨基酸序列的β链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no:122的位置171处的x为ser或cys；(mm)(d)及(jj)两者；(nn)(d)及(kk)两者；或(oo)(x)及(ll)两者。在本发明的实施方案中，多肽的seq id no:21、 22、41、42、55-58、79、80、85、88、93、94、99、105、110、113、 116、117、122、131或134中的任一个或多个如表2-4中的任一种所定义。
74.本发明的实施方案还提供了包含至少一种本文所描述的多肽的蛋白质。“蛋白质”意指包含一条或多条多肽链的分子。
75.在实施方案中，本发明的蛋白质可包含：(a)含有seq id no: 1-3的氨基酸序列的第一多肽链及含有seq id no:4-6的氨基酸序列的第二多肽链；或(b)含有seq id no:31-33的氨基酸序列的第一多肽链及含有seq id no:34-36的氨基酸序列的第二多肽链。seq id no: 3、6、33或36中的任一个或多个(即α链或β链或两者)的cdr3还可包含紧接cdr的第一氨基酸的n端的半胱氨酸或紧接最终氨基酸的 c端的苯丙氨酸或两者。
76.在本发明的另一个实施方案中，蛋白质可含有：(i)含有seq id no:7的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:8的氨基酸序列的第二多肽链；(ii)含有seq id no:129的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:8的氨基酸序列的第二多肽链；(iii)含有seq id no:63的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:8的氨基酸序列的第二多肽链；(iv)含有seq id no:130的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:8的氨基酸序列的第二多肽链；(v) 含有seq id no:7的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no: 64的氨基酸序列的第二多肽链；(vi)含有seq id no:129的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:64的氨基酸序列的第二多肽链； (vii)含有seq id no:63的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:64的氨基酸序列的第二多肽链；(viii)含有seq id no:130的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:64的氨基酸序列的第二多肽链；(ix)含有seq id no:7的氨基酸序列的第一多肽链以及含有 seq id no:65的氨基酸序列的第二多肽链；(x)含有seq id no:129 的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:65的氨基酸序列的第二多肽链；(xi)含有seq id no:63的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:65的氨基酸序列的第二多肽链；(xii)含有seq id no:130的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:65的氨基酸序列的第二多肽链；(xiii)含有seq id no:7的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:66的氨基酸序列的第二多肽链；(xiv)含有 seq id no:129的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:66 的氨基酸序列的第二多肽链；(xv)含有seq id no:63的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:66的氨基酸序列的第二多肽链； (xvi)含有seq id no:130的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:66的氨基酸序列的第二多肽链；(xvii)含有seq id no:37的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:38的氨基酸序列的第二多肽链；(xviii)含有seq id no:37的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:69的氨基酸序列的第二多肽链；(xix)含有seq id no:37的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:70的氨基酸序列的第二多肽链；(xx)含有seq id no:37的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:71的氨基酸序列的第二多肽链；(xxi)含有 seq id no:47的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:48 的氨基酸序列的第二多肽链；(xxii)含有seq id no:67的氨基酸序列的第一多肽链以及含有seq id no:68的氨基酸序列的第二多肽链； (xxiii)含有seq id no:67的氨基酸序
met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:55的位置227处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp； (j)含有seq id no:56的氨基酸序列的第二多肽链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:56的位置173处的x为ser或cys；(k)含有seq id no:57的氨基酸序列的第一多肽链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)，其中：(i)seq id no:57的位置159处的x为thr或cys；(ii)seq id no:57的位置223处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、 met或trp；(iii)seq id no:57的位置225处的x为met、ala、val、 leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:57的位置226处的x 为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(l)含有seq id no:58的氨基酸序列的第二多肽链(如使用imgt预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:58的位置172处的x 为ser或cys；(m)(i)及(j)两者；或(n)(k)及(l)两者；(o)含有seq id no:79的氨基酸序列的第一多肽链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1 的α链)，其中：(i)seq id no:79的位置179处的x为thr或cys； (ii)seq id no:79的位置243处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、 phe、met或trp；(iii)seq id no:79的位置245处的x为met、ala、 val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:79的位置246处的x gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(p)含有seq id no:134的氨基酸序列的第一多肽链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:134的位置180处的x为thr或 cys；(ii)seq id no:134的位置244处的x为ser、ala、val、leu、 ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:134的位置246处的x为 met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:134 的位置247处的x为gly、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp； (q)含有seq id no:80的氨基酸序列的第二多肽链(含有wt n端信号肽的4360 tcr1的β链)，其中seq id no:80的位置198处的x 为ser或cys；(r)含有seq id no:105的氨基酸序列的第二多肽链(含有wt n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:105的位置197处的x为ser或cys；(s)(o)及(q)两者；(t)(p)及(q)两者；(u)(d) 及(r)两者；(v)含有seq id no:93的氨基酸序列的第一多肽链(如使用 signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的α链)，其中：(i)seq id no:93的位置159处的x为thr或cys；(ii)seq id no:93的位置 223处的x为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no:93的位置225处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe 或trp；以及(iv)seq id no:93的位置226处的x为gly、ala、val、 leu、ile、pro、phe、met或trp；(w)含有seq id no:94的氨基酸序列的第二多肽链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1 的β链)，其中seq id no:94的位置177处的x为ser或cys；(x)含有seq id no:116的氨基酸序列的第一多肽链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的α链)，其中：(i)seq id no:116的位置158处的x为thr或cys；(ii)seq id no:116的位置222处的x 为ser、ala、val、leu、ile、pro、phe、met或trp；(iii)seq id no: 116的位置224处的x为met、ala、val、leu、ile、pro、phe或trp；以及(iv)seq id no:116的位置225处的x为gly、ala、val、leu、 ile、pro、phe、met或trp；(y)含有seq id no:117的氨基酸序列的第二多肽链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的β链)，其中seq id no:117的位置176处的x为ser或cys；(z)(v)及 (w)两者；(aa)(x)及(y)两者；(bb)含有seq id no:85的氨基酸序列的第二多肽链(含有变体n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中 seq id no:85的位置187处的x为ser或cys；(cc)含有seq id no: 88的氨基酸序列的第二多肽链(含有wt n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:88的位置187处
的x为ser或cys；(dd) 含有seq id no:99的氨基酸序列的第二多肽链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr1的替代β链)，其中seq id no:99 的位置172处的x为ser或cys；(ee)(a)及(bb)两者；(ff)(b)及(bb)两者；(gg)(o)及(cc)两者；(hh)(p)及(cc)两者；(ii)(v)及(dd)两者；(jj)含有seq id no:110的氨基酸序列的第二多肽链(含有变体n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no:110的位置186处的x 为ser或cys；(kk)含有seq id no:113的氨基酸序列的第二多肽链 (含有wt n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no: 113的位置186处的x为ser或cys；(ll)含有seq id no:122的氨基酸序列的第二多肽链(如使用signalp预测的不含n端信号肽的4360 tcr5的替代β链)，其中seq id no:122的位置171处的x为ser或cys；(mm)(d)及(jj)两者；(nn)(d)及(kk)两者；或(oo)(x)及(ll)两者。在本发明的实施方案中，seq id no:21、22、41、42、55-58、79、80、 85、88、93、94、99、105、110、113、116、117及122中的一或个多个如表2-4中的任一种所定义。
80.本发明的蛋白质可为tcr。或者，如果例如蛋白质包含含有以下氨基酸序列的单一多肽链：seq id no:21及22两者、seq id no:131及22、seq id no:23及24两者、seq id no:133及24两者、seq id no:77及78两者、seq id no:132及78两者、seq id no:79及80两者、seq id no:134及80两者、seq id no:81及82 两者、seq id no:135及82两者、seq id no:83及84两者、seq id no:136及84两者、seq id no:21及85两者、seq id no:131 及85两者、seq id no:23及87两者、seq id no:133及87两者、 seq id no:77及86两者、seq id no:132及86两者、seq id no: 79及88两者、seq id no:134及88两者、seq id no:83及90两者、seq id no:136及90两者、seq id no:81及89两者、seq id no:135及89两者，或者如果蛋白质的第一和/或第二多肽链还包含其他氨基酸序列，例如编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白质可为融合蛋白。就此而言，本发明的实施方案还提供了融合蛋白，其包含至少一种本文所描述的本发明的多肽以及至少一种其它多肽。其它多肽可以以融合蛋白的单独多肽存在，或者可以以多肽存在，其与本文所描述的本发明多肽之一在框内(串联)表达。其它多肽可编码任何肽或蛋白质分子或其部分，包括但不限于免疫球蛋白、cd3、 cd4、cd8、mhc分子、cd1分子，例如cd1a、cd1b、cd1c、cd1d 等。
81.融合蛋白可包含本发明多肽的一个或多个拷贝和/或另一多肽的一个或多个拷贝。例如，融合蛋白可包含本发明多肽和/或另一多肽的1、2、3、4、5或更多个拷贝。制备融合蛋白的适合方法为本领域中已知的，并且包括例如重组方法。
82.在本发明的一些实施方案中，本发明的tcr、多肽及蛋白质可表达为包含连接α链及β链的接头肽的单一蛋白质。就此而言，本发明的tcr、多肽及蛋白质还可包含接头肽。接头肽可有利地促进重组tcr、多肽和/或蛋白质在宿主细胞中的表达。接头肽可包含任何适合的氨基酸序列。例如，接头肽可为包含seq id no:25的氨基酸序列的弗林蛋白酶-sgsg-p2a接头。当通过宿主细胞表达包括接头肽的构建体后，接头肽可以被切割，从而产生分离的α及β链。在本发明的实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含氨基酸序列，其包含全长α链、全长β链及位于α链与β链之间的接头肽，例如α链-接头-β链或β链
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接头-α链。
83.在本发明的实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含如seq id no:125所示的氨基酸序列，其自n端至c端包含β链、接头(seq id no:25)及α链。变体包含如seq id no:8所示的β链可变区(含有变体信号肽)及如seq id no:75所示的修饰的β恒定结构域。变体的全长β链示于seq id no:78中。变体还包含如seq id no:7所示的α链可变区(含有wt信号肽)及
如seq id no:74所示的修饰的α恒定结构域。变体的全长α链示于seq id no:77中。
84.在本发明的另一个实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含如seq id no:126中所示的氨基酸序列，其自n端至c端包含α链、接头(seq id no:25)及β链。变体包含如seq id no:63所示的α链可变区(含有变体信号肽)及如seq id no:74所示的修饰的α恒定结构域。变体的全长α链示于seq id no:81中。变体还包含如seq id no:64所示的β链可变区(含有wt信号肽)及如seq id no:75所示的修饰的β恒定结构域。变体的全长β链示于seq id no:82中。
85.在本发明的实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含如seq id no:127所示的氨基酸序列，其自n端至c端包含β链、接头(seq id no:25)及α链。变体包含如seq id no:38所示的β链可变区(含有变体信号肽)及如seq id no:75所示的修饰的β恒定结构域。变体的全长β链示于seq id no:104中。变体还包含如seq id no:37所示的α链可变区及如seq id no:74所示的修饰的α恒定结构域。变体的全长α链示于seq id no:103中。
86.在本发明的另一个实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含如seq id no:128所示的氨基酸序列，其自n端至c端包含α链、接头(seq id no:25)及β链。变体包含如seq id no:37所示的α链可变区及如seq id no:74所示的修饰的α恒定结构域。变体的全长α链示于seq id no:103中。变体还包含如seq id no:70所示的β链可变区(含有wt信号肽)及如seq id no:75所示的修饰的β恒定结构域。变体的全长β链示于seq id no:106中。
87.在本发明的实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含如seq id no:137所示的替代氨基酸序列，其自n端至c端包含β链、接头 (seq id no:25)及α链。变体包含如seq id no:8所示的β链可变区(含有变体信号肽)及如seq id no:75所示的修饰的β恒定结构域。变体的全长β链示于seq id no:78中。变体还包含如seq id no: 129所示的α链可变区及如seq id no:74所示的修饰的α恒定结构域。变体的全长α链示于seq id no:132中。
88.在本发明的另一个实施方案中，tcr、多肽或蛋白质可包含如seq id no:138所示的替代氨基酸序列，其自n端至c端包含α链、接头(seq id no:25)及β链。变体包含如seq id no:130所示的替代α链可变区及如seq id no:74所示的修饰的α恒定结构域。变体的全长α链示于seq id no:135中。变体还包含如seq id no:64 所示的β链可变区(含有wt信号肽)及如seq id no:75所示的修饰的β恒定结构域。变体的全长β链示于seq id no:82中。
89.在一些实施方案中，本文所公开的tcr、多肽或蛋白质包含如本文所公开的包含信号肽的α链和/或β链。在一些实施方案中，本文所公开的α链和/或β链中的任一个的信号肽的序列包含在位置2处取代野生型残基的丙氨酸或组氨酸残基。
90.在一些实施方案中，本文所公开的tcr、多肽或蛋白质包含如本文所公开的α链和/或β链的缺乏信号肽的成熟形式。信号肽的序列或α链和/或β链的成熟形式可根据本领域中已知的任何方法(包括imgt及signalp)进行。
91.本发明的蛋白质可为重组抗体或其抗原结合部分，其包含至少一种本文所描述的本发明的多肽。如本文所用，“重组抗体”是指包含至少一种本发明的多肽及抗体或其抗原结合部分的多肽链的重组(例如，基因工程改造的)蛋白。抗体或其抗原结合部分的多肽可为抗体的重链、轻链、重链或轻链的可变区或恒定区、单链可变片段(scfv)或fc、fab或f(ab)2’
片段等。抗体或其抗原结合部分的多肽链可以以重组抗体的单独多肽存在。或者，抗体或其抗原结合部分的多肽链可以以多肽存在，其与本发明的多肽在框内(串联)表达。抗
体或其抗原结合部分的多肽可为包括本文所描述的任何抗体及抗体片段的任何抗体或任何抗体片段的多肽。
92.本文所描述的本发明tcr、多肽或蛋白质的功能变体包括在本发明的范围内。如本文所用，术语“功能变体”是指与亲本tcr、多肽或蛋白质具有实质或显著的序列同一性或类似性的tcr、多肽或蛋白质，该功能变体保留变体所来源的tcr、多肽或蛋白质的生物活性。功能变体涵盖例如本文中描述的tcr、多肽或蛋白质(亲本tcr、多肽或蛋白质)的变体，其保留特异性结合突变的ras的能力，亲本tcr对g12d ras具有抗原特异性，或者亲本多肽或蛋白质以与亲本tcr、多肽或蛋白质类似的程度、相同的程度或更高的程度特异性结合g12d ras。提及亲本 tcr、多肽或蛋白质，功能变体可例如分别与亲本tcr、多肽或蛋白质在氨基酸序列中至少约30％、约50％、约75％、约80％、约 90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多相同。
93.功能变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本tcr、多肽或蛋白质的氨基酸序列。保守氨基酸取代为本领域中已知的且包括以下氨基酸取代，其中一个具有某些物理和/或化学特性的氨基酸交换为另一个具有相同化学或物理特性的氨基酸。例如，保守性氨基酸取代可为酸性氨基酸取代另一酸性氨基酸(例如，asp或glu)、具有非极性侧链的氨基酸取代另一具有非极性侧链的氨基酸(例如，ala、gly、val、ile、leu、met、phe、pro、trp、val等)、碱性氨基酸取代另一碱性氨基酸 (lys、arg等)、具有极性侧链的氨基酸取代另一具有极性侧链的氨基酸(asn、cys、gln、ser、thr、tyr等)等。
94.或者或另外，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本tcr、多肽或蛋白质的氨基酸序列。在此情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。优选地，非保守氨基酸取代增强功能变体的生物活性，以使得与亲本tcr、多肽或蛋白质相比，功能变体的生物活性增加。
95.本文所描述的tcr、多肽、蛋白质、功能变体及功能部分的每个信号肽(存在时)可为任何适合的tcr信号肽，只要表达 tcr、多肽、蛋白质或功能变体且tcr、多肽、蛋白质或功能变体对于由hla ii类分子呈递的在位置12处的甘氨酸被缬氨酸取代的突变的人类ras氨基酸序列具有抗原特异性。
96.tcr、多肽或蛋白质可基本上由本文所描述的指定氨基酸序列组成，使得tcr、多肽或蛋白质的其他组分(例如其他氨基酸)不实质上改变tcr、多肽或蛋白质的生物活性。就此而言，本发明的tcr、多肽或蛋白质可例如基本上由以下的氨基酸序列组成：seq id no:21、 seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:21-22 两者或seq id no:23-24两者、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41-42两者或seq id no:39
‑ꢀ
40两者。此外，例如，本发明的tcr、多肽或蛋白质可基本上由以下的氨基酸序列组成：(i)seq id no:7、(ii)seq id no:8、(iii)seq id no:37、(iv)seq id no:38、(v)seq id no:7及8两者或(vi)seq id no:37及38两者。此外，本发明的tcr、多肽或蛋白质可基本上由以下的氨基酸序列组成：(a)seq id no:1-6及31-36中的任一个或多个；(b)全部seq id no:1-3；(c)全部seq id no:4-6；(d)全部seq id no:31-33；(e)全部seq id no:34-36；(f)全部seq id no:1-6；或(g)全部seq id no:31-36。
97.本发明的tcr、多肽及蛋白质可具有任何长度，即可包含任何数目的氨基酸，条件是tcr、多肽或蛋白质保留其生物活性，例如能够特异性结合突变的ras；检测哺乳动物中的
癌症；或治疗或预防哺乳动物中的癌症等。例如，多肽的长度范围可以为约50至约 5000个氨基酸，如约50、约70、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约 800、约900、约1000个或更多个氨基酸。就此而言，本发明的多肽还包括寡肽。
98.本发明的tcr、多肽及蛋白质可包含代替一种或多种天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸为本领域中已知的，且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、s-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸及反式
ꢀ‑
4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、 4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸、β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、 1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、 n
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苯甲基-n
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甲基-赖氨酸、n’,n
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二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸及α-叔丁基甘氨酸。
99.本发明的tcr、多肽及蛋白质可被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、n-酰化、经由例如二硫键环化或转化为酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合或缀合。
100.本发明的tcr、多肽和/或蛋白质可通过本领域中已知的方法(诸如(例如)从头合成)获得。此外，多肽及蛋白质可使用本文所描述的核酸，使用标准重组方法以重组方式产生。参见例如green和sambrook，molecular cloning:a laboratory manual，第4版，cold spring harbor press，cold spring harbor，ny(2012)。或者，本文所描述的tcr、多肽和/或蛋白质可由商业实体商业合成。在这方面，本发明的tcr、多肽及蛋白质可为合成的、重组的、分离的和/或纯化的。本发明的实施方案提供了由本文关于本发明的其他方面所描述的核酸或载体中的任一种编码的分离的或纯化的tcr、多肽或蛋白质。本发明的另一个实施方案提供了分离的或纯化的tcr、多肽或蛋白质，其由本文关于本发明的其他方面所描述的核酸或载体中的任一种在细胞中的表达产生。本发明的又一实施方案提供了产生本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种的方法，所述方法包括培养本文所描述的宿主细胞或宿主细胞群中的任一种，以便产生tcr、多肽或蛋白质。
101.缀合物(例如，生物缀合物)包括在本发明的范围中，其包含本发明的tcr、多肽或蛋白质(包括其功能部分或变体中的任一种)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群或抗体或其抗原结合部分中的任一种。缀合物以及合成缀合物的方法一般而言为本领域中已知的。
102.本发明的实施方案提供了核酸，其包含编码本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种的核苷酸序列。如本文所用，“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”及“核酸分子”，且通常意指dna或rna的聚合物，其可为单链的或双链的，可含有天然、非天然或改变的核苷酸，且可含有天然、非天然或改变的核苷酸间连键，如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键替代未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一个实施方案中，核酸包含互补dna(cdna)。通常优选地，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。然而，在一些情况下，如本文所论述，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或取代可为适合的。
103.优选地，本发明的核酸为重组体。如本文所用，术语“重组体”是指(i)在活细胞外通过将天然或合成核酸区段接合至可在活细胞中复制的核酸分子而构建的分子，或(ii)由
(如果存在)核苷酸序列与模板或靶标链之间的错配，并且特别适合于检测任何本发明的tcr的表达。普遍认为通过添加增加量的甲酰胺可以导致更严格的条件。
109.本发明还提供了这样的核酸，其包含与本文所述的核酸中的任一种至少约70％或更多，例如约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％相同的核苷酸序列。就此而言，核酸可基本上由本文所述的任何核苷酸序列组成。
110.本发明的实施方案提供了分离的或纯化的核酸，其自5’至 3’包含第一核酸序列及第二核苷酸序列，其中该第一核苷酸序列及第二核苷酸序列分别编码以下的氨基序列：7和8；7和64；63和8；63 和64；7和65；63和65；7和66；63和66；8和7；64和7；8和 63；64和63；65和7；65和63；66和7；66和63；129和8；129和 64；129和65；129和66；8和129；64和129；65和129；66和129； 130和8；130和64；130和65；130和66；8和130；64和130；65 和130；66和130；37和38；37和69；37和70；37和71；38和37； 69和37；70和37；71和37；23和24；23和84；83和24；83和84； 23和87；83和87；23和90；83和90；24和23；84和23；24和83； 84和83；87和23；87和83；90和23；90和83；133和24；133和 84；133和87；133和90；24和133；84和133；87和133；90和 133；39和40；39和107；39和112；39和115；40和39；107和39； 112和39；115和39；136和24；136和84；136和87；136和90； 24和136；84和136；87和136；90和136；21和22；21和80；79 和22；79和80；21和85；21和88；79和85；79和88；22和21； 80和21；22和79；80和79；85和21；88和21；85和79；88和79； 131和22；131和80；131和85；131和88；22和131；80和131； 85和131；88和131；134和22；134和80；134和85；134和88； 22和134；80和134；85和134；88和134；77和78；77和82；81 和78；81和82；77和86；81和86；78和77；82和77；78和81； 82和81；86和77；86和81；132和78；132和82；132和86；78和 132；82和132；86和132；135和78；135和82；135和86；78和 135；82和135；86和135；77和89；81和89；89和77；89和81； 132和89；89和132；135和89；89和135；41和42；41和105；41 和110；41和113；42和41；105和41；110和41；113和41；103 和104；103和111；103和114；104和103；111和103；114和103； 103和106；106和103；47和48；48和47；67和68；67和76；68 和67；76和67；49和50；50和49；72和73；72和102；73和72； 102和72；51和52；52和51；53和54；54和53；55和56；56和 55；57和58；58和57；91和92；92和91；108和109；109和108； 93和94；93和99；94和93；99和93；97和98；97和101；98和 97；101和97；95和96；95和100；96和95；100和95；116和117；116和122；117和116；122和116；120和121；120和124；121和 120；124和120；118和119；118和123；119和118；或123和118。
111.在本发明的实施方案中，分离的或纯化的核酸还包含插入在第一核苷酸序列与第二核苷酸序列之间的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列编码可切割的接头肽。在本发明的实施方案中，可切割的接头肽包含seq id no:25的氨基酸序列。
112.可以将本发明的核酸掺入到重组表达载体中。就此而言，本发明提供了包含本发明的核酸中的任一种的重组表达载体。在本发明的实施方案中，重组表达载体包含编码α链、β链及接头肽的核苷酸序列。
113.出于本文的目的，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mrna、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，且载体在足以使mrna、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，允许宿主细胞表达mrna、蛋白质、多肽
或肽。本发明的载体整体上不为天然存在的。然而，部分载体可为天然存在的。本发明的重组表达载体可包含任何类型的核苷酸，包括(但不限于)dna及rna，其可为单链的或双链的、合成的或部分地获自天然来源且可含有天然、非天然或改变的核苷酸。重组表达载体可包含天然存在的、非天然存在的核苷酸间连键或这两种类型的连键。优选地，非天然存在或改变的核苷酸或核苷酸间连键不阻碍载体的转录或复制。
114.本发明的重组表达载体可为任何适合的重组表达载体且可用于转化或转染任何适合的宿主细胞。适合载体包括设计成用于增殖及扩增或用于表达或用于该两者的载体，如质粒及病毒。载体可选自puc系列(fermentas life sciences)、pbluescript 系列(stratagene,lajolla,ca)、pet系列(novagen,madison,wi)、 pgex系列(pharmacia biotech,uppsala,sweden)及pex系列(clontech,palo alto,ca)。也可使用噬菌体载体，如λgt10、λgt11、λzapii(stratagene)、λembl4及λnm1149。植物表达载体的实例包括pbi01、pbi101.2、pbi101.3、pbi121及 pbin19(clontech)。动物表达载体的实例包括peuk-cl、pmam及 pmamneo(clontech)。优选地，重组表达载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体。在尤其优选的实施方案中，重组表达载体为 msgv1载体。在本发明的实施方案中，该重组表达载体为转座子或慢病毒载体。
115.本发明的重组表达载体可使用描述于例如green和 sambrook等人，同上中的标准重组dna技术制备。可以制备环状或线性表达载体的构建体以含有在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以来源于例如colel、2μ质粒、λ、 sv40、牛乳头瘤病毒等。
116.理想地，重组表达载体包含诸如转录及翻译起始及终止密码子的调节序列，所述调节序列按需要且考虑载体是基于dna的还是基于rna的而对将引入载体的寄主细胞类型(例如细菌、真菌、植物或动物)具有特异性。
117.重组表达载体可包括一种或多种标志物基因，其允许选择转化的或转染的宿主细胞。标志物基因包括杀生物剂抗性 (例如，对抗生素、重金属等具有抗性)，在营养缺陷型宿主细胞中互补以提供原营养等。用于本发明表达载体的适合标志物基因包括例如新霉素/g418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因及氨苄西林抗性基因。
118.重组表达载体可包含天然或非天然启动子，其与编码 tcr、多肽或蛋白质的核苷酸序列，或者与编码tcr、多肽或蛋白质的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列可操作地连接。启动子的选择(例如强、弱、诱导型、组织特异性及发育特异性的) 在本领域普通技术人员的能力内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域普通技术人员的能力内。启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子，及存在于鼠类干细胞病毒的长端重复序列中的启动子。
119.本发明的重组表达载体可被设计用于瞬时表达、用于稳定表达，或用于两者。此外，可制备用于组成型表达或用于诱导型表达的重组表达载体。
120.此外，可制备包含自杀基因的重组表达载体。如本文所用，术语“自杀基因”是指使表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可为赋予基因在其中表达的细胞针对试剂(例如药物) 的敏感性的基因，并且当细胞与所述试剂接触或者暴露于所述试剂时引起细胞死亡。自杀基因为本领域中已知的，且包括例如单纯疱疹病毒(hsv)胸苷激酶(tk)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、硝基还原酶及诱导型半胱天冬酶9基因系统。
121.本发明的另一个实施方案还提供了包含本文所描述的任何重组表达载体的宿主
细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可为真核细胞(例如，植物、动物、真菌或藻类)或可为原核细胞(例如，细菌或原生动物)。宿主细胞可为培养的细胞或原代细胞，即直接从有机体(例如人类或小鼠)分离的细胞。宿主细胞可以为贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。适合的宿主细胞为本领域中已知且包括例如dh5α大肠杆菌(e.coli)细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴vero细胞、cos细胞、hek293细胞等。出于扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞优选为原核细胞，例如 dh5α细胞。出于制备重组tcr、多肽或蛋白质的目的，宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞为人类细胞。虽然宿主细胞可为任何细胞类型，可来源于任何类型的组织，且可处于任何发育阶段，但宿主细胞优选为外周血淋巴细胞(pbl)或外周血单核细胞(pbmc)。更优选地，宿主细胞为t细胞。在本发明的实施方案中，宿主细胞为人类淋巴细胞。在本发明的另一个实施方案中，宿主细胞选自t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、恒定自然杀伤t(inkt)细胞及自然杀伤(nk)细胞。本发明的又一实施方案提供了产生表达对seq id no:30的肽具有抗原特异性的tcr 的宿主细胞的方法，所述方法包括在允许将载体引入至细胞的条件下使细胞与本文所描述的载体中的任一种接触。
122.出于本文的目的，t细胞可为任何t细胞，如培养的t细胞(例如，原代t细胞)，或来自培养的t细胞系的t细胞(例如， jurkat，supt1等)，或获自哺乳动物的t细胞。如果获自哺乳动物，则t细胞可获自众多来源，包括(但不限于)血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或体液。也可以富集或纯化t细胞。优选地，t细胞为人类t细胞。t细胞可为任何类型的t细胞且可处于任何发育阶段，包括(但不限于)cd4

/cd8

双阳性t细胞、cd4

辅助t细胞 (例如，th1及th2细胞)、cd4

t细胞、cd8

t细胞(例如，细胞毒性t细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、记忆t细胞(例如，中央记忆t细胞及效应记忆t细胞)、初始t细胞等。
123.本发明还提供了细胞群，其包含至少一种本文中所描述的宿主细胞。细胞群可为包含宿主细胞的异质群体，除不包含任何重组表达载体的至少一种其他细胞，例如，宿主细胞(例如， t细胞)或除t细胞外的细胞(例如，b细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红血球、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等)，该宿主细胞还包含所描述的任何重组表达载体。或者，细胞群可为基本上同质的群体，其中该群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如基本上由含有重组表达载体的宿主细胞组成)。群体也可为克隆细胞群，其中该群体的所有细胞为包含重组表达载体的单一宿主细胞的克隆，使得该群体的所有细胞包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群为包含含有如本文所描述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
124.在本发明的实施方案中，群体中细胞的数目可快速扩增。t细胞数目的扩增可以通过如例如，美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请公开号2012/0244133；dudley等人,j.immunother.,26:332-42(2003)；以及riddell等人,j. immunol.methods,128:189-201(1990)中所述的本领域已知的许多方法的任一种来实现。在一个实施方案中，通过用okt3抗体、 il-2及饲养pbmc(例如辐照的同种异体pbmc)培养t细胞来进行t细胞数目的扩增。
125.本发明的tcr、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体及宿主细胞(包括其群体)可为分离的和/或纯化的。如本文所用，术语“分离的”意指已从其天然环境中移出。如本文所用，术语“纯化的”意指纯度已增加，其中“纯度”为相对术语且不必理解为绝对纯度。例如，纯度可
为至少约50％，可大于约60％、约70％、约80％、约90％、约95％，或可为约100％。
126.可将本发明的tcr、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体及宿主细胞(包括其群体)(其皆在下文中统称为“本发明的tcr 材料”)配制成组合物，如药物组合物。就此而言，本发明提供了药物组合物，其包含本文所描述的tcr、多肽、蛋白质、核酸、表达载体及宿主细胞(包括其群体)中的任一种及药学上可接受的载体。含有本发明的tcr材料中的任一种的本发明药物组合物可包含超过一种本发明的tcr材料，例如多肽及核酸，或两种或更多种不同的tcr。或者，药物组合物可包含本发明的tcr材料与另一种药物活性剂或药物(如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、道诺霉素 (daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、氟尿嘧啶、吉西他滨 (gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等) 的组合。
127.优选地，载体为药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可为常规用于考虑中的特定的本发明tcr材料的那些载体中的任一种。用于制备可施用组合物的方法为本领域技术人员已知的或对于本领域技术人员为显而易见的且在例如 remington:the science and practice of pharmacy,第22版， pharmaceutical press(2012)中更详细地描述。优选地，药学上可接受的载体为在使用条件下不具有有害副作用或毒性的载体。
128.载体的选择将部分地通过特定的本发明tcr材料以及通过用于施用本发明tcr材料的特定方法来决定。因此，存在本发明的药物组合物的多种适合制剂。适合的制剂可包括用于肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、瘤内或腹膜内施用的那些制剂中的任一种。可使用超过一种途径来施用本发明的tcr材料，且在某些情况下，特定途径可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。
129.优选地，本发明的tcr材料通过注射(例如，经静脉内) 施用。当本发明的tcr材料为表达本发明tcr的宿主细胞(或其群体)时，注射用的细胞的药学上可接受的载体可包括任何等张性载体，诸如(例如)生理盐水(约0.90％w/v的nacl于水中、约300 mosm/l nacl于水中或每公升水约9.0g nacl)、normosol r电解质溶液(abbott，chicago，il)、plasma-lyte a(baxter， deerfield，il)、约5％右旋糖水溶液或林格氏乳酸盐(ringer's lactate)。在实施方案中，药学上可接受的载体补充有人类血清白蛋白。
130.出于本发明的目的，施用的本发明tcr材料的量或剂量(例如当本发明的tcr材料为一或多种细胞时细胞的数目)应足以在合理时间范围内在对象或动物中起作用，例如治疗性或预防性反应。例如，本发明tcr材料的剂量应足以结合癌症抗原 (例如，突变的ras)，或在距施用时间约2小时或更长(例如，12 至24或更多小时)的时段中检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时段可甚至为较长的。剂量将通过特定的本发明tcr材料的功效及动物(例如，人类)的病况以及待治疗的动物(例如，人类)的体重来决定。
131.用于确定施用剂量的许多分析为本领域中已知的。出于本发明的目的，可使用包含将在施用给定剂量的此类t细胞后靶细胞裂解或ifn-γ由表达本发明的tcr、多肽或蛋白质的t细胞分泌的程度与各自被给予不同剂量的t细胞的一组哺乳动物中的哺乳动物进行比较的分析，来确定向哺乳动物施用的起始剂量。在施用某一剂量后裂解靶细胞或分泌ifn-γ的程度可通过本领域中已知的方法测定。
132.还将通过可能伴随施用特定的本发明tcr材料的任何不良副作用的存在、性质及
程度来确定本发明tcr材料的剂量。通常，主治医师将考虑各种因素，如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的本发明的tcr材料、施用途径及所治疗癌症的严重程度，来决定用以治疗各个体患者的本发明tcr材料的剂量。在本发明的tcr材料为细胞群的实施方案中，每次输注施用的细胞数目可例如自约1
×
106至约1
×
10
12
个细胞或更多个细胞变化。在某些实施方案中，可施用少于1
×
106个细胞。
133.本领域普通技术人员将容易理解，本发明的tcr材料可以许多方式进行修饰，使得通过修饰来提高本发明tcr材料的治疗性或预防性功效。例如，本发明的tcr材料可直接地与化学治疗剂缀合或通过桥间接地与化学治疗剂缀合。将化合物与化学治疗剂缀合的实践为本领域中已知。本领域普通技术人员认识到，本发明的tcr材料上对于本发明的tcr材料的功能不必要的位点为用于连接桥和/或化学治疗剂的适合位点，条件是一旦连接至本发明的tcr材料，桥和/或化学治疗剂就不干扰本发明 tcr材料的功能，即与突变的ras结合或检测、治疗或预防癌症的能力。
134.预期本发明的药物组合物、tcr、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞及细胞群可用于治疗或预防癌症的方法中。不受特定理论束缚，认为本发明的tcr特异性结合突变的 ras，使得tcr(或相关的本发明的多肽或蛋白质)在由细胞表达时能够介导针对表达突变的ras的靶细胞的免疫应答。就此而言，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量向哺乳动物施用本文所描述的药物组合物、tcr、多肽或蛋白质中的任一种，包含编码本文所描述的tcr、多肽、蛋白质中任一种的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体或者包含编码本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种的重组载体的任何宿主细胞或细胞群。
135.本发明的实施方案提供了诱导哺乳动物中针对癌症的免疫应答的方法，其包括以有效诱导哺乳动物中针对癌症的免疫应答的量向哺乳动物施用本文所描述的药物组合物、tcr、多肽或蛋白质中的任一种，包含编码本文所描述的tcr、多肽、蛋白质中任一种的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体或者包含编码本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种的重组载体的任何宿主细胞或细胞群。
136.本发明的实施方案提供了本文所描述的药物组合物、 tcr、多肽或蛋白质中的任一种，包含编码本文所描述的tcr、多肽、蛋白质中任一种的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体或者包含编码本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种的重组载体的任何宿主细胞或细胞群，其用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的用途中。
137.本发明的实施方案提供了本文所描述的药物组合物、 tcr、多肽或蛋白质中的任一种，包含编码本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体或者包含编码本文所描述的tcr、多肽或蛋白质中的任一种重组载体的任何宿主细胞或细胞群，其用于诱导哺乳动物中针对癌症的免疫应答的用途中。
138.如本文所用，术语“治疗”及“预防”以及衍生自其的措辞不一定暗示100％或完全治疗或预防。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的治疗或预防。就此而言，本发明的方法可在哺乳动物中提供任何量的任何水平的癌症治疗或预防。此外，由本发明方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防所治疗或预防的癌症的一种或多种病况或症状。例如，治疗或预防可包括促进肿瘤的消退。此外，出于本文的目的，“预防”可涵盖延迟癌症或其症状或病况的发作。或者或另外，“预防”可涵盖预防或延迟癌
症或其症状或病况的复发。
139.还提供了检测哺乳动物中存在癌症的方法。所述方法包括(i)使包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与本文所描述的本发明的tcr、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或药物组合物中的任一种接触，从而形成复合物，及(ii)检测复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物中存在癌症。
140.关于检测哺乳动物中的癌症的本发明方法，细胞的样品可为包含全细胞、其裂解物或全细胞裂解物的部分(例如，核或细胞质部分、全蛋白部分或核酸部分)的样品。
141.出于检测癌症的本发明方法的目的，接触可相对于哺乳动物在体外或体内进行。优选地，接触为体外的。
142.此外，复合物的检测可通过本领域中已知的许多方式进行。例如，本文所描述的本发明的tcr、多肽、蛋白质、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群可标记有可检测标志物，诸如(例如)放射性同位素、荧光团(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、藻红素(pe))、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)及元素颗粒(例如，金颗粒)。
143.出于本发明方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群，细胞可为哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞对哺乳动物自体的。
144.关于本发明的方法，癌症可为任何癌症，其包括例如以下中的任一种：急性淋巴细胞性癌症、急性髓细胞性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、子宫宫颈癌、肠胃类癌瘤、胶质瘤、霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)、喉咽癌、肾脏癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌及肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、尿管癌及膀胱癌。优选的癌症为胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌或前列腺癌。优选地，肺癌为肺腺癌，卵巢癌为上皮卵巢癌且胰腺癌为胰脏腺癌。在本发明的实施方案中，癌症表达突变的人类ras氨基酸序列，其中所述突变的人类ras氨基酸序列为突变的人类kras、突变的人类hras或突变的人类nras氨基酸序列。由癌症表达的突变的人类kras、突变的人类hras及突变的人类nras可如本文关于本发明的其他方面所描述。
145.在本发明的方法中所提及的哺乳动物可为任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(rodentia)的哺乳动物(如小鼠及仓鼠)及兔形目 (logomorpha)的哺乳动物(如兔)。优选地，所述哺乳动物来自食肉目(carnivora)，包括猫科动物(猫)及犬科动物(狗)。更优选地，所述哺乳动物来自偶蹄目(artiodactyla)，包括牛科动物(牛)及猪科动物(猪)；或者奇蹄目(perssodactyla)，包括马科动物(马)。最优选地，哺乳动物为灵长目、四足猴目(ceboids)或猴目 (simoids)(猴)或类人猿目(人类及猿)。尤其优选的哺乳动物为人类。
146.应注意，前述仅为实施方案的实例。其他示例性实施方案从本文中的全部描述显而易见。本领域普通技术人员还将理解，这些实施方案中的每一个可以以各种组合与本文中所提供的其他实施方案一起使用。
147.以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。
实施例1
148.此实施例显示对ras
g12v
具有反应性的外周血淋巴细胞(pbl)的鉴定。
149.将pbl分选为cd4或cd8记忆和效应t细胞。
150.对富集cd4或cd8细胞的患者4360的pbl分别进行体外刺激(ivs)。用载有10μg/ml ras
g12v
长肽 (lp)(mteyklvvvgavgvgksaltiqli，seq id no:30)的dc刺激 pbl。刺激两周后，对t细胞进行再刺激及facs分选。图1a显示了示出门控策略的流式细胞术分析点图，其中对高度表达ox40及41bb 表面标志物的cd4淋巴t细胞进行分选，之后进行ras
g12v
lp ivs(用 dmso处理的dc用作阴性对照)。然后如图1a所指示，对分选的细胞进行分选，且使用快速扩增(rep)扩增14天。
151.然后用载有10μg/ml ras
g12v
lp的dc或用dmso处理的 dc刺激扩增的细胞。然后如图1b中所指示，将高度表达ox40及 41bb表面标志物的cd4淋巴t细胞分选至96孔板中用于单细胞测序。
152.通过与用wt/突变串联小基因(tmg)转染或载有1μg/ml的 ras
g12v lp(seq id no:30)或ras
wt lp(mteyklvvvgaggvgksaltiqli，seq id no:27)或用当量 dmso处理的dc共培养来测试上文ivs之后的细胞针对ras的反应性。将经刺激且然后使用rep扩增，但并未如上文及图1a中所述进行分选的细胞(“未分选”细胞)或仅在il2情况下生长且并未用携带 ras抗原的dc刺激的细胞(“未ivs”细胞)用作对照。此外，分别将含有及不含有抗cd28/cd3珠粒的t细胞用作阴性及阳性对照。过夜共培养后，通过ifn-γelispot(图1c)以及通过流式细胞术针对活 /cd3

/cd4

门控群体中的41bb/ox40表面标志物上调(图1d)分析细胞。实施例2
153.此实施例显示实施例1的pbl的表征。
154.在ras
g12v
lp ivs(包括分选后的一次rep)之后，如图1b 中84.2％的细胞中所示，对实施例1的cd4 pbl细胞进行测试。将细胞与载有各种浓度的ras
g12v
lp或ras
wt
lp的dc共培养。过夜共培养后，使用ifn-γelispot(图2a)及流式细胞术(图2b，活/cd3

/cd4

门控群体中的41bb/ox40表面标志物上调)分析细胞。观察到对 ras
g12v
的强亲合力(低至约10pg/ml lp)。
155.使用ifn-γelispot(图3，左轴及条柱)及41bb/ox40流式细胞术分析(图3，右轴及圆圈)鉴定由经历ras
g12v
lp ivs的cd4 pbl 识别的mhc-ii限制元件。将细胞与用含有患者的mhc-iiα链及β链的不同组合的dna质粒转染且载有ras
g12v
lp的cos7共培养。发现针对由dpb1*03:01限制的ras
g12v
的细胞反应性。实施例3
156.此实施例显示根据本发明的实施方案鉴定实施例2的pbl 的tcr。
157.对通过自lp ivs(在如图1b中所示及实施例1中所说明的 84.2％的细胞内)后的患者4360 cd4 pbl进行单细胞测序而鉴定的两种tcr(tcr1，tcr2)进行测序。
158.表6显示4360 tcr1的序列，其中cdr序列加下划线。表6
159.发现tcr2具有cdr3β序列asssgtgvaeaf(seq id no: 26)。还发现该序列具有在第一氨基酸(丙氨酸)的n端的半胱氨酸以及在最后氨基酸(苯丙氨酸)的c端的苯丙氨酸。
160.来自四个肿瘤片段的dna提取物的深度测序(adaptive biotechnologies,seattle,wa,usa)揭示了tcr1存在于这些片段之一 (100,000个细胞中5.7个重复)，但tcr2不存在于任何片段中。实施例4
161.此实施例显示根据本发明的实施方案构建编码tcr1及 tcr2的逆转录病毒载体。
162.构建基于msgv1的逆转录病毒载体，其编码tcr1的tcr α链及β链可变区，不同之处在于β链的n端信号肽的位置2处的氨基酸残基变成丙氨酸以便促进克隆至载体中。如下文更详细地描述进行野生型tcr的另外修饰。
163.如先前所述进行cd22特异性tcr的构建(jin等人,jci insight,3(8):e99488(2018)，通过引用以其整体并入本文)。简而言之，使tcrβvdj区与小鼠tcrβ恒定链融合，且使tcrαvj区与小鼠 tcrα恒定链融合。不受特定理论或机制束缚，认为使用鼠类恒定区改善tcr表达及功能(cohen等人,cancer res.,66(17):8878-8886(2006))。
164.另外，鼠类tcrα及tcrβ恒定链是半胱氨酸修饰的，且将跨膜疏水性突变引入至鼠类tcrα恒定链中。不受特定理论或机制束缚，认为这些修饰导致所引入的tcr链的优先配对以及增强的tcr 表面表达和功能(cohen等人,cancer res.,67(8):3898-903(2007)；haga
‑ꢀ
friedman等人,j.immu.,188:5538-5546(2012))。
165.tcrβ链及tcrα链通过弗林蛋白酶sgsg p2a接头(rakrsgsgatnfsllkqagdveenpgp)
(seq id no:25)分开，以确保两个链的表达效率相当(szymczak等人,nat.biotechnol.,22(5):589
‑ꢀ
94(2004))。
166.为了允许将tcr表达盒克隆至msgv1载体5’ncoi位点中，将tcrvβ链中的第二氨基酸(n端信号肽内的第二氨基酸)变成丙氨酸(a)。表达盒具有以下构造：5’ncoi-vdjβ-mcβ-弗林蛋白酶 /sgsg/p2a-vjα-mcα-sali3’。tcr的核苷酸序列通过genscript密码子优化工具经密码子优化以进行人类t细胞表达。此实施例描述了以 5’tcrβ至tcrα3’方向合成双顺反子载体，但tcrβ至tcrα的顺序可以颠倒。载体插入序列经密码子优化以在人类组织中表达。实施例5
167.此实施例显示根据本发明的实施方案使用实施例4的逆转录病毒载体表征如实施例中3所鉴定的实施例2的pbl的tcr。
168.tcr1及tcr2中的每一种经病毒转导至jurkat-cd4-nfat
‑ꢀ
荧光素酶细胞系中，然后与载有1μg/ml的ras
g12v
lp、ras
wt
lp的 dc或用当量dmso处理的dc共培养。测量荧光素酶活性(图4a)。
169.患者4360的pbl用tcr1或tcr2转导，或对于阴性对照，用wt gfp、空质粒(模拟)转导或未经转导。对于阳性对照，使用 lp ivs之后的pbl(来自实施例1，图1及图2)。然后将细胞与载有 ras
g12v
lp或ras
wt
lp的自体dc共培养或者与用ras
g12v
全长 (fl)(seq id no:14)或ras
wt fl(seq id no:10)转染的自体dc mrna共培养。将单独培养的t细胞及在dmso情况下培养的pbl 用作阴性对照。将用抗cd3/抗cd28抗体缀合的dynabeads活化的 pbl用作阳性对照。此外，将lp ivs后的pbl用作阳性对照。通过流式细胞术分析针对cd3

/cd8

门控细胞(图4b)或cd3

/cd4

门控细胞(图4c)的4-1bb及ox40(％4-1bb /ox40 )表达评估tcr反应性。实施例6
170.此实施例显示，发现ivs后的til对ras
g12v
具有反应性且识别与tcr1相同的mhc-ii限制。
171.将til片段用作细胞来源且通过ivs刺激。将til与用 ras
g12v
lp肽脉冲的自体dc共培养或与用ras
g12v fl转染的自体 dc rna共培养。在ivs的任何阶段，如果没有足够的细胞，则将一些片段与其他片段合并在一起。将单独共培养的和与载有dmso的 dc共培养的t细胞(til)用作阴性对照。将用抗cd3/抗cd28抗体缀合的dynabeads培养的til用作阳性对照。通过利用流式细胞术(图 5a)测量41bb和ox40的表达以及通过ifn-γelispot测量ifn-γ分泌(表7)来测试ivs后的til的反应性。表7
*合并的til
172.使用ifn-γelispot测定通过ivs之后的4360 cd4 til识别的mhc-ii限制元件。将细胞与用含有患者的mhc-iiα链及β链的不同组合的dna质粒转染且载有ras
g12v
lp的cos7共培养。将经 tcr 1病毒转导的pbl用作阳性对照。结果显示在图5b中。发现ivs 后的til识别与tcr1相同的mhc-ii限制。实施例7
173.此实施例显示til中发现的tcr留存于肿瘤片段中。
174.使用单细胞测序，如实施例6中所述从ivs后的til中发现六个另外的tcr序列(tcr 5至10)。
175.表8显示了4360 tcr5的序列，其中cdr序列加下划线。表8
176.发现tcr 6-10具有以下cdr3β序列。tcr 6： astlqgraganvlt(seq id no:29)；tcr 7： assqpglagggdtqy(seq id no:59)；tcr 8： assqstsgsgssiqy(seq id no:60)；tcr 9：atsrdvgsveqy(seq id no:61)；tcr10：asspnagnteaf(seq id no:62)。发现tcr 5
‑ꢀ
10具有
第一氨基酸(丝氨酸/丙氨酸)的n端的半胱氨酸，且发现tcr 5-9具有最后氨基酸(酪氨酸/苯丙氨酸)的c端的苯丙氨酸。
177.自患者4360的四个不同肿瘤片段(frtu)的深度测序的结果显示，tcr 5存在于所有测试片段中，tcr 6、8及9存在于一个片段中，tcr 7存在于两个片段中，且tcr 10不存在。
178.通过与载有ras
g12v
或ras
wt
lp的自体dc共培养来测试经tcr病毒转导的pbl的反应性。将载有dmso的dc用作阴性对照。将用抗cd3/抗cd28抗体缀合的dynabeads培养的pbl用作阳性对照。进行ifn-γelispot测量(图6)。在tcr 6、7、9或10中未检测到反应性。tcr8在所有实验中表现出反应性且未进行进一步研究。实施例8
179.此实施例显示根据本发明的实施方案构建编码tcr5的逆转录病毒载体。
180.构建基于msgv1的逆转录病毒载体，其编码tcr1的tcr α链及β链可变区，不同之处在于β链的n端信号肽的位置2处的氨基酸残基变成丙氨酸以便促进克隆至载体中。如下文更详细地描述进行野生型tcr的另外修饰。
181.如先前所述进行cd22特异性tcr的构建(jin等人,jci insight,3(8):e99488(2018)，通过引用以其整体并入本文)。简而言之，使tcrβvdj区与小鼠tcrβ恒定链融合，且使tcrαvj区与小鼠 tcrα恒定链融合。不受特定理论或机制束缚，认为使用鼠类恒定区改善tcr表达及功能(cohen等人,cancer res.,66(17):8878-8886(2006))。
182.另外，鼠类tcrα及tcrβ恒定链是半胱氨酸修饰的，且将跨膜疏水性突变引入至鼠类tcrα恒定链中。不受特定理论或机制束缚，认为这些修饰导致所引入的tcr链的优先配对以及增强的tcr 表面表达和功能(cohen等人,cancer res.,67(8):3898-903(2007)；haga
‑ꢀ
friedman等人,j.immu.,188:5538-5546(2012))。
183.tcrβ链及tcrα链通过弗林蛋白酶sgsg p2a接头 (rakrsgsgatnfsllkqagdveenpgp)(seq id no:25)分开，以确保两个链的表达效率相当(szymczak等人,nat.biotechnol.,22(5):589
‑ꢀ
94(2004))。
184.为了允许将tcr表达盒克隆至msgv1载体5’ncoi位点中，将tcrvβ链中的第二氨基酸(n端信号肽内的第二氨基酸)变成丙氨酸(a)。表达盒具有以下构造：5’ncoi-vdjβ-mcβ-弗林蛋白酶 /sgsg/p2a-vjα-mcα-sali3’。tcr的核苷酸序列通过genscript密码子优化工具经密码子优化以进行人类t细胞表达。此实施例描述了以 5’tcrβ至tcrα3’方向合成双顺反子载体，但tcrβ至tcrα的顺序可以颠倒。载体插入序列经密码子优化以在人类组织中表达。实施例9
185.此实施例显示根据本发明的实施方案的tcr1及tcr5的亲合力。
186.使用实施例4及8中所描述的逆转录病毒载体将tcr1及 tcr5病毒转导至pbl中，然后将pbl与载有不同浓度的ras
g12v
lp 或ras
wt
lp的自体dc共培养。4-1bb及ox40(％4-1bb /ox40 )表达的流式细胞术分析及ifn-γ分泌的elispot测量(每3e4个细胞的斑点数目)的结果显示在图7a-7g中。
187.本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入本文，其程度如同每篇参考文献均被单独且具体地指示为通过引入并入本文并在本文整体阐述。
188.在描述本发明的上下文中(尤其是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一
种”和“该”和“至少一种”以及类似指代物的使用应被解释为涵盖了单数和复数两种，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”之后是一项或多项的列表(例如，“a和b中的至少一种”)的使用应理解为意指选自所列项(a或b)的一项或所列项(a和b)的两种或多种的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就好像它在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。
189.本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读前述说明书之后，那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人有意以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素在其所有可能的变型中的任何组合。