GDF15融合蛋白及其用途的制作方法

gdf15融合蛋白及其用途
发明领域
1.本发明涉及融合蛋白、其药物组合物和使用此类物质预防和/或治疗疾病的方法。


背景技术：

2.生长分化因子15(gdf15)也称为巨噬细胞抑制性细胞因子-1或mic-1，是转化生长因子β超家族的成员。gdf15的功能未得到完全理解。现有研究显示gdf15可能在调节炎症通路中发挥作用，参与调节细胞凋亡、细胞修复和细胞生长，这些是在心血管和肿瘤性病症中观察到的生物过程。其他研究显示gdf15在诸如肥胖症的代谢病症中具有治疗效用。
3.代谢病症通常与胰岛素抵抗、内脏肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常等相关，其在世界范围内构成重大且不断升级的公共卫生和临床挑战。然而，代谢疾病的现有治疗面临诸如半衰期短和/或功效低的问题。
4.因此，需要用于治疗代谢疾病的改进的治疗方案。


技术实现要素：

5.本文提供gfd15融合蛋白，以及用于治疗/预防代谢病症的药物组合物和方法。
6.在一方面，本公开提供一种融合多肽，其包含：
7.a)第一多肽片段，所述第一多肽片段包含结合血清白蛋白的单域抗体；和
8.b)第二多肽片段，所述第二多肽片段包含gfral受体激动剂；
9.其中所述第一多肽片段和所述第二多肽片段直接或经由接头彼此连接。
10.在一些实施例中，所述单域抗体包含vhh结构域。
11.在一些实施例中，所述vhh结构域为人源化。
12.在一些实施例中，所述vhh结构域包含互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3，其中所述cdr1包含如seq id no:1所示的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，cdr2包含如seq id no:2所示的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，并且/或者cdr3包含如seq id no:3所示的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，其中所述vhh结构域保留了对血清白蛋白，任选地对人血清白蛋白的结合特异性。
13.在一些实施例中，所述vhh结构域包含互补决定区1(cdr1)，其包含如seq id no:1所示的序列；cdr2，其包含如seq id no:2所示的序列；和cdr3，其包含如seq id no:3所示的序列。
14.在一些实施例中，所述vhh结构域包含如seq id no:4所示的序列，或其与seq id no:4具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的变体，其中所述变体保留了对血清白蛋白的结合特异性和/或亲和力。
15.在一些实施例中，seq id no:4的所述变体相对于seq id no:4具有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸突变。
16.在一些实施例中，所述结合血清白蛋白的单域抗体进一步包含附接到所述vhh结构域的n末端延长序列。
17.在一些实施例中，所述n末端延长序列包含sg、ag、s或a的氨基酸残基。
18.在一些实施例中，所述结合血清白蛋白的单域抗体包含选自seq id no:4-8的序列。
19.在一些实施例中，所述gfral受体激动剂包含gdf15。
20.在一些实施例中，所述gdf15包含与seq id no:9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，同时保留seq id no:9的基本生物活性。
21.在一些实施例中，所述gdf15相对于seq id no:9包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2个突变，同时保留seq id no:9的基本生物活性。
22.在一些实施例中，所述gdf15相对于seq id no:9在选自下组的位置处包含一个或多个突变：a1、r2、n3、h6、p11、h18、t19、v20、r21、a30、m43、a47、r53、a54、m57、h66、r67、l68、a75、a81、p85、m86、q90、t92和l105或其任何组合。
23.在一些实施例中，gdf15中的所述一个或多个突变包含：
24.1)选自下组的n3突变：n3q、n3s、n3e、n3a、n3t、n3p、n3g、n3v、n3h、n3y和n3缺失；和/或
25.2)选自下组的m57取代：m57a、m57e和m57l；和/或
26.3)m86l或m86a的取代。
27.在一些实施例中，相对于seq id no:9，gdf15中的所述一个或多个突变选自下组：r2s、r2a、r2e、n3s、n3e、n3a、n3t、n3p、n3g、n3v、n3h、n3y、n3q、h6d、p11e、h18e、h18q、t19s、v20l、r21e、a30e、m43l、m43e、a47e、r53e、a54e、m57a、m57e、m57l、h66e、r67e、l68e、a75e、a81e、p85e、m86f、m86a、m86l、q90e、t92e、l105e、n3缺失以及n末端1-3个残基缺失或其任何组合。
28.在一些实施例中，所述gdf15包含或由选自下组的氨基酸序列组成：seq id no:9-12和14。
29.在一些实施例中，所述融合多肽从n末端至c末端包含所述结合血清白蛋白的单域抗体、所述接头和所述gdf15。
30.在一些实施例中，所述接头包含多肽接头。
31.在一些实施例中，所述多肽接头的长度为至少4个氨基酸残基(例如，至少4、12、24、40、50、60、70、80、90、100、110或120个氨基酸残基)。
32.在一些实施例中，所述多肽接头的长度为4-80或20-80或30-80或40-80个氨基酸残基。
33.在一些实施例中，所述多肽接头的长度为约4、8、20、40、50、60、70或80个氨基酸残基。
34.在一些实施例中，所述多肽接头包含至少一个酸性氨基酸残基。
35.在一些实施例中，所述至少一个酸性氨基酸残基包含谷氨酸(e)。
36.在一些实施例中，所述多肽接头包含重复序列的一个或多个重复。
37.在一些实施例中，所述重复序列由不超过4、5或6种类型的选自下组的氨基酸残基组成：g、q、a、e、p、t和s。
38.在一些实施例中，所述重复序列包含q。
39.在一些实施例中，所述重复序列由g、q、a、e和p组成。
40.在一些实施例中，所述重复序列由选自下组的序列组成：seq id no:15(gqepgaqp)、seq id no:16(gaqpgaqp)、seq id no:17(gqep)、seq id no:18(gaqp)、seq id no:40(sepatsgsetpgtsesatpesgpgtstepseg)、seq id no:19(gaqpgqepgaqp)、seq id no:20(gaqpgqep)、seq id no:21(geqp)、seq id no:22(gpqe)、seq id no:23(gpeq)、seq id no:24(gsep)、seq id no:25(gesp)、seq id no:26(gpse)、seq id no:27(gpes)、seq id no:28(gqap)、seq id no:29(gpaq)、seq id no:30(gpqa)、seq id no:31(gsqp)、seq id no:32(gasp)、seq id no:33(gpas)、seq id no:34(gpsa)、seq id no:35(gggs)、seq id no:36(gsgs)、seq id no:37(ggggs)、seq id no:38(gqepgqap)、seq id no:39:(gqapgqep)、seq id no:41(sepats)、seq id no:42(gsetpg)、seq id no:43(tsesat)、seq id no:44(pesgpg)、seq id no:45(tsteps)和gs。
41.在一些实施例中，所述多肽接头包含(重复1)r(重复2)s(重复3)x(重复4)y，其中重复1、重复2、重复3和重复4经由肽键或经由一个或多个氨基酸残基连接，重复1、重复2、重复3和重复4独立地包含选自下组的序列或由其组成：seq id no:15(gqepgaqp)、seq id no:16(gaqpgaqp)、seq id no:17(gqep)、seq id no:18(gaqp)、seq id no:40(sepatsgsetpgtsesatpesgpgtstepseg)、seq id no:19(gaqpgqepgaqp)、seq id no:219(gaqpgqep)、seq id no:21(geqp)、seq id no:22(gpqe)、seq id no:23(gpeq)、seq id no:24(gsep)、seq id no:25(gesp)、seq id no:26(gpse)、seq id no:27(gpes)、seq id no:28(gqap)、seq id no:29(gpaq)、seq id no:30(gpqa)、seq id no:31(gsqp)、seq id no:32(gasp)、seq id no:33(gpas)、seq id no:34(gpsa)、seq id no:35(gggs)、seq id no:36(gsgs)、seq id no:37(ggggs)、seq id no:38(gqepgqap)、seq id no:39(gqapgqep)、seq id no:41(sepats)、seq id no:42(gsetpg)、seq id no:43(tsesat)、seq id no:44(pesgpg)、seq id no:45(tsteps)和gs，并且在r、s、x和y不同时为0的条件下，r、s、x和y独立地为选自0至30的整数。
42.在一些实施例中，x和y为0，r和s独立地为选自1至30的整数，并且重复1和重复2为选自下组的组合：
43.a)重复1包含seq id no:15的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
44.b)重复1包含seq id no:17的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
45.c)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成；
46.d)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成；
47.e)重复1包含seq id no:19的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
48.f)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
49.g)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成；以及
50.h)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成。
51.在一些实施例中，r、x和y为0，s为选自1至30的整数，并且重复1包含seq id no:17的序列或由其组成。
52.在一些实施例中，y为0，r、s和x独立地为选自1至30的整数，并且重复1、重复2和重复3为选自下组的组合：
53.(a)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:19的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
54.(b)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
55.(c)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
56.(d)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:17的序列或由其组成；
57.(e)重复1包含seq id no:15的序列或由其组成，重复2包含seq id no:28的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
58.(f)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:15的序列或由其组成；
59.(g)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
60.(h)重复1包含seq id no:17的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:17的序列或由其组成；以及
61.(i)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:38的序列或由其组成。
62.在一些实施例中，r、s、x和y独立地为选自1至30的整数，并且重复1、重复2、重复3和重复4为选自下组的组合：
63.(a)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:20的序列或由其组成，重复3包含seq id no:17的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:18的序列或由其组成；
64.(b)重复1包含seq id no:15的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成，重复3包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:18的序列或由其组成；
65.(c)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成，重复3包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:18的序列或由其组成；
66.(d)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:28的序列或由其组成，重复3包含seq id no:18的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:15的序列或由其组成；以及
67.(e)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列
或由其组成，重复3包含seq id no:39的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:38的序列或由其组成。
68.在一些实施例中，所述多肽接头包含选自下组的氨基酸序列：seq id no:17、46-49和61。
69.在一些实施例中，所述融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：seq id no:50-60和13。
70.在另一方面，本公开提供一种多肽复合物，其包含本文提供的融合多肽的二聚体。
71.在一些实施例中，所述多肽复合物为同源二聚体。
72.在一些实施例中，所述二聚体以二硫键缔合。
73.在一些实施例中，所述二硫键在包含所述gdf15的所述第二多肽片段之间形成。
74.在另一方面，本公开提供一种多核苷酸，其编码本文提供的融合多肽或本文提供的多肽复合物。
75.在另一方面，本公开提供一种载体，其包含本文提供的多核苷酸。
76.在另一方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含本文提供的载体。
77.在一些实施例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
78.在另一方面，本公开提供一种产生本文提供的多肽复合物的方法，其包含在允许本文提供的多核苷酸表达的条件下培养本文提供的宿主细胞。
79.在一些实施例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
80.在一些实施例中，所述多肽复合物被表达为包涵体。
81.在一些实施例中，所述方法进一步包含从所述包涵体复性所述多肽复合物。
82.在另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含本文提供的融合多肽或本文提供的多肽复合物以及药学上可接受的载剂。
83.在另一方面，本公开提供了一种预防或治疗有需要的受试者的代谢病症的方法，其包含施用治疗有效量的本文提供的融合多肽或本文提供的多肽复合物。
84.在一些实施例中，所述代谢病症为糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ash)、糖尿病肾病、妊娠期糖尿病、代谢综合征诸如代谢综合征x、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(pbc)。
85.在整个本公开中，冠词“一(a/an)”和“所述”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“融合多肽”意指一个融合多肽或多于一个融合多肽。
86.在本技术中出现一系列叙述的数值的所有情况下，应理解，任何叙述的数值可以是数值范围的上限或下限。应进一步理解，本发明涵盖所有此类数值范围，即，具有数值上限和数值下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一者的数值可以是本文中叙述的任何数值。本文提供的范围理解为包括范围内的所有值。例如，1-10理解为包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当时分数值。类似地，由“至少”限定的范围理解为包括提供的下限值和所有更高的数字。
87.如本文所用，“约”理解为包括在平均值的三个标准差内或在特定技术中的标准公差范围内。在某些实施例中，约理解为不超过0.5的变化。
88.冠词“一(a/an)”在本文中用于指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。
89.术语“包括”在本文中用以意指短语“包括但不限于”且可与所述短语互换使用。类似地，“诸如”在本文中用以意指短语“诸如但不限于”且可与所述短语互换使用。
90.除非上下文另外明确指示，否则术语“或”在本文中包括地使用以意指术语“和/或”且可与所述术语互换使用。
附图说明
91.图1a至1d显示了受测融合蛋白在c57bl/6小鼠中的体内活性。图1a显示了融合蛋白1或2(索玛鲁肽(semaglutide)作为对照)给药后第1天至第11天的食物摄取。图1b显示了融合蛋白1或2(索玛鲁肽作为对照)给药后第1天至第11天的体重减轻。图1c显示了融合蛋白5或12给药后第1天至第11天的食物摄取。图1d显示了融合蛋白5或12给药后第1天至第11天的体重减轻。
92.图2显示了c57bl/6小鼠中受测融合蛋白的药代动力学测量。
93.图3a和3b显示了受测融合蛋白在dio小鼠中的体内功效。图3a显示了融合蛋白5或12给药后第1天至第12天的食物摄取。图3b显示了融合蛋白5或12给药后第1天至第12天的体重减轻。
94.图4a至4d显示了本公开中公开的序列。
具体实施方式
95.以下对本发明的描述仅旨在说明本发明的各种实施例。因此，所论述的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对本领域的技术人员将显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围的情况下作出各种等效物、变化和修改，并且应理解，此类等效实施例将包括在本文中。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用的方式并入本文中。
96.定义
97.如本文所用，术语“氨基酸”是指含有胺(-nh2)和羧基(-cooh)官能团以及每种氨基酸特有的侧链的有机化合物。在本公开中，氨基酸的名称也表示为标准的单字母或三字母代码。
[0098]“序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大数目的相同氨基酸(或核酸)之后，候选序列中的氨基酸(或核酸)残基与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。换句话说，氨基酸序列(或核酸序列)的序列同一性百分比(％)可以通过将相对于其比较的参考序列相同的氨基酸残基(或碱基)的数目除以候选序列或参考序列中氨基酸残基(或碱基)的总数(以较短者为准)来计算。氨基酸残基的保守取代不视为相同残基。可以进行比对来确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比，例如，使用公众可获得的工具诸如blastn、blastp(可在美国国家生物技术信息中心(ncbi)的网站上获得，也可参见altschul s.f.等人,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》,215:403
–
410(1990)；stephen f.等人,《核酸研究(nucleic acids res.)》,25:3389-3402(1997))、clustalw2(可在欧洲生物信息学研究所(european bioinformatics institute)的网站上获得，也可
参见higgins d.g.等人,《酶学方法(methods in enzymology)》,266:383-402(1996)；larkin m.a.等人,《生物信息学(bioinformatics)》(英国牛津),23(21):2947-8(2007))，以及align或megalign(dnastar)软件。本领域的技术人员可使用所述工具提供的默认参数，或可自定义适于比对的参数，诸如例如通过选择合适的算法进行。
[0099]
关于氨基酸序列的“保守取代”是指用具有类似生理化学特性的侧链的不同氨基酸残基置换氨基酸残基。例如，保守取代可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，met、ala、val、leu和ile)之间，在具有中性亲水侧链的残基(例如，cys、ser、thr、asn和gln)之间，在具有酸性侧链的残基(例如，asp、glu)之间，在具有碱性侧链的氨基酸(例如，his、lys和arg)之间，或者在具有芳香侧链的残基(例如，trp、tyr和phe)之间进行。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著变化，并且因此可保留蛋白质的生物活性。
[0100]
如本文所用，术语“功能形式”是指亲本分子的不同形式(诸如变体、片段、融合体、衍生物和模拟物)，其尽管在氨基酸序列或化学结构中具有差异，但仍保留亲本分子的基本生物活性。如本文所用，表述“保留基本生物活性”意指表现出亲本分子的至少部分(例如，不少于约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)或全部生物活性。亲本多肽的功能形式可包括天然存在的变体形式和非天然存在的形式，诸如通过重组方法或化学合成获得的那些。功能形式可含有非天然氨基酸残基。
[0101]
如本文所用，术语“变体”是指与亲本多肽具有至少70％序列同一性的多肽。变体与亲本肽的不同之处可在于一个或多个氨基酸残基。例如，变体可具有亲本多肽的一个更多氨基酸残基的取代、添加、缺失、插入或截短。
[0102]
如本文所用，术语“片段”是指任何长度的亲本多肽的部分序列。片段仍可保留亲本多肽的至少部分功能。
[0103]
如本文所用，术语“衍生物”是指化学修饰的多肽或融合多肽，其中一个或多个明确限定数目的取代基已共价附接到多肽或融合多肽的一个或多个特定氨基酸残基。示例性化学修饰可以是，例如，一个或多个氨基酸的烷化、酰化、酯化、酰胺化、磷酸化、糖基化、标记、甲基化，或者与一个或多个部分缀合。
[0104]
如本文所用，术语“模拟物”是指充当氨基酸、肽、多肽或融合多肽的替代物的分子结构。例如，如本文所用，氨基酸模拟物可以是合成结构(已知或未知)，其可为或可不为氨基酸，但保留亲本氨基酸的功能特征，同时氨基酸模拟物的结构不同于亲本氨基酸的结构。实例包括酰胺的甲基丙烯酰基或丙烯酰基衍生物、β-、γ-、δ-亚氨基酸(诸如哌啶-4-羧酸)等。
[0105]
如本文所用，病况的“治疗(treating或treatment)”包括预防或减轻病况，减缓病况的发作或发展速率，降低罹患病况的风险，预防或延迟与病况相关的症状的发展，减少或结束与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况或其某一组合。
[0106]
如本文所用，术语“载体”是指编码蛋白质的多核苷酸可以可操作地插入该载体中，从而引起该蛋白质表达的媒剂。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的基因元件在宿主细胞内表达。载体的实例包括质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体(诸如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1衍生的人工染色体(pac))、噬菌体(诸如λ噬菌体或m13噬菌体)和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、
腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，sv40)。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒粒子、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供载体(例如，表达载体)，其含有本文提供的编码融合多肽的核酸序列、可操作地连接到所述核酸序列的至少一个启动子(例如，sv40、cmv、ef-1α)和至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如，sv40)、λ噬菌体和m13噬菌体、质粒pcdna3.3、pmd18-t、poptivec、pcmv、pegfp、pires、pqd-hyg-gseu、palter、pbad、pcdna、pcal、pl、pet、pgemex、pgex、pci、pegft、psv2、pfuse、pvitro、pvivo、pmal、pmono、pselect、puno、pduo、psg5l、pbabe、pwpxl、pbi、p15tv-l、ppro18、ptd、prs10、plexa、pact2.2、pcmv-script.rtm.、pcdm8、pcdna1.1/amp、pcdna3.1、prc/rsv、pcr 2.1、pef-1、pfb、psg5、pxt1、pcdef3、psvsport、pef-bos等。
[0107]
如本文所用，短语“宿主细胞”是指已引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。
[0108]
术语“药学上可接受的”表示指定的载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与包含制剂的其他成分在化学上和/或物理上相容，并与其接受者在生理上相容。
[0109]
如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”是指需要诊断、预后、改善、预防和/或治疗疾病或病症的人或非人动物，包括哺乳动物或灵长类动物。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或玩赏动物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。
[0110]
融合多肽
[0111]
本文提供包含结合血清白蛋白的单域抗体和胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)受体α样(gfral受体)激动剂的融合蛋白或融合多肽。
[0112]
术语“融合”或“融合的”在用于氨基酸序列(例如，肽、多肽或蛋白质)时是指将两个或更多个氨基酸序列，例如通过化学键合或重组方式组合成天然不存在的单一氨基酸序列。融合氨基酸序列可以通过两个编码多核苷酸序列的遗传重组产生，并且可以通过将含有重组多核苷酸的构建体引入到宿主细胞中的方法表达。
[0113]
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指由共价键诸如肽键连接的氨基酸残基的聚合物。如本文提供的蛋白质或多肽可包含天然存在的氨基酸残基或非天然氨基酸残基或两者。本文提供的多肽和蛋白质可包含任何合适长度的氨基酸残基，例如长度为至少5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸残基。
[0114]
如本文所用，术语“天然存在的”氨基酸残基是指在天然蛋白质或肽中发现的氨基酸残基，如果其结构允许d和l立体异构体形式，则均呈此类立体异构形式。天然存在的氨基酸残基的实例包括但不限于20种标准氨基酸，包括甘氨酸(gly或g)、丙氨酸(ala或a)、缬氨酸(val或v)、亮氨酸(leu或l)、异亮氨酸(ile或i)、丝氨酸(ser或s)、半胱氨酸(cys或c)、苏氨酸(thr或t)、蛋氨酸(met或m)、脯氨酸(pro或p)、苯丙氨酸(phe或f)、酪氨酸(tyr或y)、色氨酸(trp或w)、组氨酸(his或h)、赖氨酸(lys或k)、精氨酸(arg或r)、天冬氨酸(asp或d)、谷氨酸(glu或e)、天冬酰胺(asn或n)和谷氨酰胺(gln或q)，以及其天然类似物，诸如刀豆氨
酸、吡咯赖氨酸(pyl)、硒代半胱氨酸、吡咯啉-羧基-赖氨酸(pcl)、肌氨酸、β-丙氨酸、磷酸丝氨酸、γ-羧基谷氨酸和鸟氨酸。呈d立体异构体的天然存在的氨基酸残基的实例包括例如d-天冬氨酸、d-丝氨酸、d-半胱氨酸、d-丙氨酸、d-谷氨酸等。
[0115]“氨基酸类似物”为具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基以及r基结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物可以具有修饰的r基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但将保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
[0116]
如本文所用，“非天然”氨基酸残基是指未在自然界中发现的任何氨基酸残基，包括但不限于修饰的氨基酸残基和/或氨基酸模拟物，其不是已知天然存在的氨基酸中的一者，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用。修饰的氨基酸或模拟物可通过添加化学实体来产生，所述化学实体诸如碳水化合物基、磷酸基、法呢基、异法呢基、脂肪酸基和用于缀合、官能化或其他修饰等的接头。非天然氨基酸还可指通过化学合成制造的氨基酸。示例性非天然氨基酸包括但不限于2-氨基异丁酸(aib)、咪唑-4-乙酸盐(ia)、咪唑丙酸(ipa)、α-氨基丁酸(abu)、叔丁基甘氨酸(tle)、β-丙氨酸、3-氨甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、脱氨基组氨酸(简称desaminohis，别名为咪唑丙酸(简称lmpr))、氨基酸的β类似物(如β-丙氨酸、2-氨基组氨酸、β-羟基组氨酸)、同型组氨酸、nα-乙酰组氨酸、α-氟甲基组氨酸、α-甲基组氨酸、α,α-二甲基谷氨酸、m-cf3-苯丙氨酸、α,β-二氨基丙酸(简称dap)、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)羧酸、(1-氨基环丁基)-羧酸、(1-氨基环戊基)羧酸、(1-氨基环己基)羧酸、(1-氨基环庚基)羧酸和(1-氨基环辛基)羧酸。
[0117]
将非天然氨基酸引入到融合多肽、多肽片段和/或多肽复合物中可通过以下中描述的技术实现：wang等人,《科学(science)》292:498-500,2001；deiters等人,《美国化学会志(jam chem soc)》125:11782-11783,2003；wang和schultz,《科学》301:964-967,2003；zhang等人,《科学》303:371-373,2004或美国专利第7,083,970号。简单来说，这些表达系统中的一些涉及定点诱变以将终止密码子(诸如琥珀(uag)、赭石(uaa)和蛋白石(uga)密码子)引入到编码本公开的融合多肽的开放阅读框中。其他密码子，诸如四碱基密码子(例如，agga、aggu、cggu、cgcu、cgau、cccu、cucu、cuau和gggu)、五碱基密码子、六碱基密码子等也可引入非天然氨基酸的表达系统。然后将此类表达载体引入到可利用对引入的终止密码子或其他密码子具特异性且携带所选非天然氨基酸的trna的宿主中。
[0118]
在某些实施例中，融合多肽是单链多肽。单链多肽仍可在分子内具有链内键，但不包括由一个或多个链间键形成的复合物。
[0119]
在一方面，本公开提供了一种融合多肽，其包含：a)第一多肽片段，所述第一多肽片段包含结合血清白蛋白的单域抗体；和b)第二多肽片段，所述第二多肽片段包含胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)受体α样(gfral受体)激动剂；其中所述第一多肽片段和所述第二多肽片段直接或经由接头彼此连接。
[0120]
融合多肽中的gfral受体激动剂作为治疗部分，并且结合血清白蛋白的单域抗体作为融合伴侣，以增加gfral受体激动剂的半衰期。在一些实施例中，融合多肽在指定动物(例如，小鼠、猴、人类以及其他)中的半衰期比相应治疗部分本身的半衰期长至少1.5倍(例如，至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少150倍或至少200倍)。在一些实施例中，与在指
institutes ofhealth)，马里兰州贝塞斯达(bethesda,md.)(1991)；marie-paule lefranc等人《发育与比较免疫学(developmental and comparative immunology)》,27:55-77(2003)；marie-paule lefranc等人《免疫组研究(immunome research)》,1(3),(2005)；marie-paule lefranc《b细胞的分子生物学(molecular biology ofb cells)》(第二版)，第26章，481-514,(2015))。这三个cdr插入被称为框架区(fr，即轻链或重链的fr1、fr2、fr3和fr4)的侧翼调控区之间，这些区比cdr更高度保守，形成支架来支持高度可变的环。重链和轻链的恒定域不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。常规抗体基于其重链恒定域的氨基酸序列进行分类。
[0126]
术语“单域抗体”是指含有重链的单个可变域或轻链的单个可变域的抗体片段。单域抗体含有3个互补决定区(cdr)，并且能够结合特异性抗原(例如，血清白蛋白)。
[0127]
该单个可变域可来源于骆驼科抗体的可变域(vhh结构域)，或软骨鱼抗体的可变域(vnar结构域)。骆驼科抗体和软骨鱼抗体都天然缺乏轻链并由一对重链组成。可替代地，单个可变域可衍生自常规抗体(例如，来自人或小鼠)重链的可变域(vh结构域)或普通抗体轻链的可变域(vl结构域)。预期单域抗体的大小相当小，例如，分子量不超过25kd、不超过20kd、不超过15kd或不超过10kd。
[0128]
该术语“单域抗体”在本文中以其最广泛的意义使用，并不限于特定的生物来源或特定的制备方法。例如，可通过以下方式获得单域抗体，例如：(1)通过分离天然存在的重链抗体的vhh结构域或vnar结构域；(2)通过表达编码天然存在的vhh结构域或vnar结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的vhh结构域或vnar结构域的“人源化”(如下所述)，或通过表达编码此类人源化vhh结构域或vnar结构域的核酸；(4)通过“骆驼化”来自任何动物物种，特别是哺乳动物物种(诸如来自人类)的天然存在的vh结构域，或通过表达编码此类骆驼化vh结构域的核酸；5)使用合成或半合成技术制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列；和/或(6)通过前述项的任何组合。专业人员十分清楚用于执行前述项的合适方法和技术。
[0129]
在一些实施例中，本文所述的单域抗体包含衍生自在骆驼科物种(例如，骆驼、单峰骆驼、羊驼和原驼)中培育的抗体的vhh结构域。包含vhh结构域的单域抗体高度可溶且在热、ph、蛋白酶和其他变性剂或条件下高度稳定。
[0130]
在一些实施例中，第一多肽片段包含一种或多种能够特异性结合血清白蛋白的单域抗体。
[0131]
参考结合分子(例如，抗体)与其结合伴侣(例如，抗原)的相互作用，该术语“结合特异性”或“特异性结合”意指相互作用依赖于结合伴侣上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在。换句话说，即使当该结合伴侣存在于其他分子或生物体的一种混合物中时，该抗体也优先结合或识别该结合伴侣。免疫特异性结合抗原的抗体或其片段可以与携带相同表位的相关抗原交叉反应。“结合特异性”通常是针对非特异性背景结合来衡量。通常，当抗体与靶抗原的结合比背景结合高至少10倍时，可认为该抗体具有特异性。
[0132]
本文所考虑的血清结合单域抗体可与血清白蛋白结合或以其他方式与之联合，使得所述血清白蛋白分子与fcrn的结合不会被(显著地)降低或抑制(即，相较于单域抗体不与其结合时所述血清白蛋白分子与fcrn的结合)。在本发明的这一方面，“未显著降低或抑制”意指血清白蛋白与fcrn的结合亲和力(使用合适的测定法(诸如spr)测定)降低不超过50％，优选降低不超过30％，甚至更优选降低不超过10％(诸如降低不超过5％，或基本上未
降低)。在这方面，“未显著减少或抑制”也可意指血清白蛋白分子的半衰期未显著减少(例如，减少不超过50％，优选减少不超过30％，甚至更优选减少不超过10％，诸如减少不超过5％，或基本上未减少，如使用已知的合适技术测量的)。在一些实施例中，单域抗体能够结合血清白蛋白上不参与血清白蛋白与fcrn结合的氨基酸残基。
[0133]
在一些实施例中，本文所述的单域抗体结合选自以下的血清白蛋白：hsa、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。在一些实施例中，对小鼠血清白蛋白的结合亲和力比对人或食蟹猴血清白蛋白的结合亲和力弱。在一些实施例中，单域抗体特异性结合hsa。
[0134]
在一些实施例中，本文所述的单域抗体以足够的结合亲和力结合血清白蛋白。如本文所用，术语“亲和力”是指免疫球蛋白分子(即抗体)或其片段与抗原之间非共价相互作用的强度。亲和力可使用“kd”值用数字表示。一般来说，kd值越低，结合越强。可使用本领域已知的任何常规方法来确定kd，包括但不限于放射免疫测定法(ria)、酶联免疫吸附测定法(elisa)、表面等离子共振(spr)法、微量热泳动法、hplc-ms法和流式细胞术(诸如facs)法。在一些实施例中，这里公开的抗体对特异性抗原的kd值≤10-6
m(例如，≤5
×
10-7
m，≤2
×
10-7
m，≤10-7
m，≤5
×
10-8
m，≤2
×
10-8
m，≤10-8
m，≤5
×
10-9
m，≤4
×
10-9
m，≤3
×
10-9
m，≤2
×
10-9
m或≤10-9
m)。
[0135]
在某些实施例中，本文提供的单域抗体能够以10-5
m至1
×
10-12
m或更低、10-7
m至1
×
10-12
m或更低、或10-8
m至1
×
10-12
m或更低的kd值结合hsa。在一些实施例中，kd不超过1
×
10-7
m(例如，不超过5
×
10-7
m、不超过2
×
10-7
m、不超过10-7
m、不超过5
×
10-8
m、不超过2
×
10-8
m、不超过10-8
m、不超过5
×
10-9
m、不超过4
×
10-9
m、不超过3
×
10-9
m、不超过2
×
10-9
m或不超过10-9
m)。
[0136]
在一些实施例中，本文提供的单域抗体是人源化抗体。如本文所用，术语“人源化”意指单域抗体包含衍生自非人动物的cdr和来自人的fr区。人源化抗体多肽在人中的免疫原性降低，能够满足需求。非人cdr序列被移植到人或基本上人fr序列上，因此人源化抗体多肽在其可变区是嵌合的。基本上可用非人(诸如骆驼科)cdr基因取代人免疫球蛋白基因中相应的人cdr基因来将抗体多肽人源化(参见，例如，jones等人(1986)《自然》321:522-525；riechmann等人(1988)《自然》332:323-327；verhoeyen等人(1988)《科学》239:1534-1536)。
[0137]
已知本领域中有各种能够以高亲和力特异性结合hsa的单域抗体，诸如使用阶段展示技术分离的全人类域抗体、在骆驼科中培养的vhh抗体和在软骨鱼中培养的vnar抗体，参见zorzi,a等人《医学化学通讯(med chem commun)》,2019,10,1068。示例性hsa结合单域抗体公开于us8188223b2、us9067991b2、us9321832b2、pct申请wo2008028977a2、wo2008043822a2、wo2020099871a1，g.winter等人《免疫学年度综述(annu.rev.immunol.)》,1994,12,433
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–
685，所有这些都在本公开的范围内，并通过引用并入。
[0138]
在一些实施例中，单域抗体包含vhh结构域。在一些实施例中，vhh结构域为人源化的。
[0139]
在一些实施例中，vhh结构域包含互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3，其中cdr1包含seq id no:1(sfgms)的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，cdr2包含seq id no:2(sisgsgsdtlyadsvkg)的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，并且/或者cdr3包含seq id no:3(ggslsr)的序列或其具有至多3、2或1个氨基酸突变的变体，其中vhh结构域保留了对血清白蛋白(任选地，人血清白蛋白)的结合特异性。
[0140]
在一些实施例中，所述vhh结构域包含互补决定区1(cdr1)，其包含如seq id no:1所示的序列；cdr2，其包含如seq id no:2所示的序列；和cdr3，其包含如seq id no:3所示的序列。
[0141]
在一些实施例中，vhh结构域包含互补决定区1(cdr1)(由如seq id no:1所示的序列组成)、cdr2(由如seq id no:2所示的序列组成)和cdr3(由如seq id no:3所示的序列组成)。
[0142]
在一些实施例中，所述vhh结构域包含如seq id no:4所示的序列，或其与seq id no:4具有至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％、99％同一性的变体，其中所述变体保留了对血清白蛋白的结合特异性和/或亲和力。
[0143]
在一些实施例中，seq id no:4的所述变体相对于seq id no:4具有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸突变。
[0144]
在某些实施例中，结合血清白蛋白的单域抗体还包含附接至vhh结构域的n末端延长序列。在某些实施例中，n末端延长序列包含sg、ag、s或a的氨基酸残基。在某些实施例中，n末端延长序列包含标签，任选地可裂解的标签。不希望受任何理论束缚，据信某些n末端延长序列可用于表达和翻译后加工。
[0145]
在某些实施例中，结合血清白蛋白的单域抗体不包含附接至vhh结构域的n末端延长序列。例如，vhh结构域可附接至可切割的标签上，该标签在切割后不再存在于最终产物中。
[0146]
在某些实施例中，结合血清白蛋白的单域抗体包含选自seq id no:4-8的序列。
[0147]
在一些实施例中，第一多肽片段包含一种或多种结合血清白蛋白的单域抗体。
[0148]
本领域的普通技术人员应了解，可在本文所述的任何多肽片段的序列中进行各种氨基酸取代，例如保守氨基酸取代，而不必定降低其活性。氨基酸取代的实例包括将l-氨基酸取代为其对应的d-氨基酸，将半胱氨酸取代为高半胱氨酸或具有含硫醇侧链的其他非天然氨基酸，将赖氨酸取代为高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有含氨基侧链的其他非天然氨基酸，或将丙氨酸取代为正缬氨酸等。
[0149]
gdf15
[0150]
术语“gdnf受体α样(gfral)受体”或“gfral受体”或“胶质细胞系衍生神经营养因
子受体α样(gfral)受体”是指如wo2017/121865中所述的gdf15识别和结合、从而启动信号转导的受体，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0151]
如本文所用，术语“gdnf受体α样(gfral)受体激动剂”或“gfral受体激动剂”是指一种其自身或其二聚体或多聚体能够结合并激活gfral受体的分子。gfral受体激动剂可引发与天然配体类似或为其部分的gfral受体反应的量值。
[0152]
gfral受体激动剂可包括受体的天然配体和人工设计或修饰的分子，所述分子表现出的激动剂活性与天然配体的相当或不低于天然配体的30％、40％或50％。在某些实施例中，gfral受体激动剂包括但不限于gdf15(包括其单体和二聚体)，以及wo 2017/109706、wo 2013/148117、wo 2014/120619、wo 2012/138919、wo 2013/113008、wo 2015/017710中公开的那些，这些文件的公开内容全部并入本文。
[0153]
在某些实施例中，gfral受体激动剂包含gdf15。
[0154]
如本文所用，术语“生长分化因子15”或“gdf15”旨在广泛涵盖天然gdf15单体肽的成熟域、其同二聚体及其所有功能形式，诸如其功能变体、片段、融合体、衍生物和模拟物。全长天然gdf15肽由308个氨基酸残基组成(nci参考序列np_004855.2)，其中氨基酸1-29是信号肽，氨基酸30-196是前域，氨基酸197-308是112个氨基酸的成熟域。本公开中提供的gdf15可以是全长天然gdf15单体、二聚体或其功能变体、片段、融合体、衍生物或模拟物的112个氨基酸成熟域。
[0155]
成熟gdf15肽含有九个半胱氨酸残基，其形成四个链内二硫键和一个链间二硫键，其产生共价连接的同二聚体。换句话说，生物活性gdf15是成熟肽通过一个链间二硫键共价连接的同二聚体。如本文使用，术语“gdf15”还包括蛋白质的单体、多聚体，更具体地说是二聚体。
[0156]
天然gdf15多肽的成熟域的功能形式能够在与天然gdf15多肽的成熟域相当的水平或不低于其约20％(或不低于其30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％)的水平下激活gfral受体。gfral受体的激活可产生生物活性，诸如例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；减轻体重的能力；或改善葡萄糖耐受性、脂质耐受性或胰岛素敏感性的能力；降低尿糖和蛋白质排泄的能力。天然gdf15多肽的成熟结构域的许多功能形式是本领域中已知的，例如但不限于wo 2015/197446、wo2017/121865、wo2017/109706、wo2013/148117、wo2014/120619(对疾病的定义)、wo2012/138919、wo2013/113008、wo2015/017710中公开的那些，所述专利的公开内容全文并入本文中。
[0157]
在某些实施例中，本文提供的gdf15包含与seq id no:9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，同时保留了seq id no:9的基本生物活性。
[0158]
在某些实施例中，相对于seq id no:9，gdf15包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2个取代，同时保留seq id no:9的基本生物活性。在某些实施例中，相对于seq id no:9，gdf15包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个取代，同时保留seq id no:9的基本生物活性。
[0159]
在某些实施例中，gdf15在选自下组中的位置处包含一个或多个突变：a1、r2、n3、h6、p11、h18、t19、v20、r21、a30、m43、a47、r53、a54、m57、h66、r67、l68、a75、a81、p85、m86、q90、t92和l105，或其任何组合。例如，据信n3处的取代用于防止脱酰胺并且m57处的取代用于减少氧化。在某些实施例中，gdf15中的一个或多个额外取代发生在n3和/或m57的位置。在某些实施例中，一个或多个突变包含保守取代。如本文所用，gdf15中残基的编号参考如
seq id no:9中列出的112个氨基酸的单体序列提及，其中残基1为丙氨酸(a1)并且残基112为异亮氨酸(i112)。
[0160]
在某些实施例中，gdf15包含选自下组的n3的突变：n3q、n3s、n3e、n3a、n3t、n3p、n3g、n3v、n3h、n3y和n3的缺失。在某些实施例中，gdf15包含m57的取代，其为m57a、m57e或m57l。在某些实施例中，gdf15包含r2的取代，其为r2s、r2a或r2e。
[0161]
在某些实施例中，gdf15中的一个或多个突变选自下组：r2s、r2a、r2e、n3s、n3e、n3a、n3t、n3p、n3g、n3v、n3h、n3y、n3q、h6d、p11e、h18e、h18q、t19s、v20l、r21e、a30e、m43l、m43e、a47e、r53e、a54e、m57a、m57e、m57l、h66e、r67e、l68e、a75e、a81e、p85e、m86f、m86a、m86l、q90e、t92e、l105e、n3的缺失、n末端1-3个残基的缺失(即a1r2n3)或其任何组合。可在不显著降低gdf15的生物活性的情况下对其作出的更多合适突变描述于wo2012138919、wo2013148117、wo2014120619、wo2016018931、wo2017202936和wo2018215525中，所述专利的公开内容全文并入本文中。
[0162]
在某些实施例中，本文提供的第二多肽片段包含gdf15，所述gdf15包含或由选自下组的氨基酸序列组成：seq id no:9-12和14。
[0163]
接头
[0164]
在某些实施例中，融合多肽从n末端至c末端包含结合血清白蛋白的单域抗体，其可直接或经由接头连接到gdf15。
[0165]
如本文所用，术语“接头”可以是能够与至少两个待连接的实体反应，从而键结实体形成一个分子或维持实体足够紧密近接缔合的任何合适双官能部分。接头可整合在所得连接的分子或结构中，具有或不具有其已反应的官能团。在某些实施例中，接头将第一多肽片段与第二多肽片段分离，基本上不干扰任一片段各自的生物活性。合适的接头可以是例如但不限于多肽接头和非肽接头，诸如双官能化学部分，或聚合物，诸如peg。
[0166]
直接连接可以是例如共价键(诸如肽键)，接头可以是例如多肽接头。在某些实施例中，融合多肽从n末端至c末端包含结合血清白蛋白的单域抗体、多肽接头和gdf15。
[0167]
在某些实施例中，接头包含多肽接头。多肽接头可由通过肽键连接在一起的氨基酸残基构成。多肽接头可进一步包含一个或多个非天然氨基酸。
[0168]
在某些实施例中，多肽接头包含至少1、4、5、10、12、20、24、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或172个氨基酸残基，或更多。在某些实施例中，多肽接头的长度为1至200(1-200)、1-180、1-170、1-160、1-150、1-140、1-130、1-120、1-110、1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-40、4-80、20-80、30-80、40-200、40-180、40-170、40-160、40-150、40-140、40-130、40-120、40-110、40-100、40-90或40-80个氨基酸残基。不希望受任何理论束缚，据信多肽接头的合适长度可进一步改善所连接的多肽分子的生物活性或稳定性或药代动力学参数。
[0169]
在某些实施例中，多肽接头的长度为4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、50、52、56、60、64、68、70、72、76或80个氨基酸残基。
[0170]
可使用任何合适的多肽接头。例如，多肽接头可包含选自以下氨基酸的氨基酸残基或由其组成：甘氨酸(g)、谷氨酰胺(q)、丙氨酸(a)、谷氨酸(e)、脯氨酸(p)、苏氨酸(t)、丝氨酸(s)、甲硫氨酸(m)或天冬酰胺(n)。在一些实施例中，多肽接头可由大部分非空间位阻的氨基酸诸如甘氨酸和丙氨酸组成。在一些实施例中，接头为聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸
和丙氨酸的组合(诸如聚(gly-ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(诸如聚(gly-ser))。
[0171]
在某些实施例中，多肽接头包含至少一个酸性氨基酸残基。酸性氨基酸残基是指具有酸性侧链的氨基酸残基，所述侧链含有pka介于3.5和4.5之间的羧酸基团。示例性酸性氨基酸残基包括但不限于天冬氨酸和谷氨酸。在某些实施例中，至少一个酸性氨基酸残基包含天冬氨酸或谷氨酸。
[0172]
在某些实施例中，多肽接头包含重复序列的一个或多个重复或由其组成。在某些实施例中，多肽接头包含以下或由以下组成：重复序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个重复，或在由以上所列的任何两个数字限定的任何数值范围内。
[0173]
在某些实施例中，重复序列包含不超过4、5或6种的氨基酸残基或由其组成，该氨基酸残基选自下组：g、q、a、e、p、t和s。在某些实施例中，重复序列包含不超过4、5或6种氨基酸残基或由其组成，该氨基酸残基选自下组：g、q、a、e、p和s。在某些实施例中，重复序列包含q。在某些实施例中，重复序列由q和不超过3、4或5种氨基酸残基组成，该氨基酸残基选自下组：g、a、e、p和s。
[0174]
在某些实施例中，重复序列由g、q、a、e和p组成。
[0175]
在某些实施例中，重复序列包含选自下组的序列或由其组成：seq id no:15-45和gs。
[0176]
在某些实施例中，多肽接头包含多于一个重复序列或由其组成。例如，多肽接头包含2、3或4个不同重复序列或由其组成。在某些实施例中，多肽接头包含不同重复序列的顺序或串联重复或由其组成。
[0177]
在某些实施例中，多肽接头包含(重复1)r(重复2)s(重复3)x(重复4)y或由其组成，其中：
[0178]
重复1、重复2、重复3和重复4经由肽键或经由一个或多个氨基酸残基连接；
[0179]
重复1、重复2、重复3和重复4独立包含选自下组的序列或由其组成seq id no:15-45和gs，并且
[0180]
r、s、x和y独立地为选自0至30(例如，0-29、0-28、0-27、0-26、0-25、0-24、0-23、0-22、0-21、0-20、0-19、0-18、0-17、0-16、0-15、0-14、0-13、0-12、0-11、0-10、0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2或0-1)中的整数，条件是r、s、x和y不可同时为0。
[0181]
在某些实施例中，x和y为0，r和s独立地为选自1至30(例如，1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2)中的整数，重复1和重复2为选自下组的组合：
[0182]
(a)重复1包含seq id no:15的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0183]
(b)重复1包含seq id no:17的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0184]
(c)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成；
[0185]
(d)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列
或由其组成；
[0186]
(e)重复1包含seq id no:19的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0187]
(f)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0188]
(g)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成；以及
[0189]
(h)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成。
[0190]
在某些实施例中，r、x和y为0，s为选自1至30(例如，1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2)中的整数，重复1包含seq id no:7的序列或由其组成。
[0191]
在某些实施例中，y为0，r、s和x独立地为选自1至30(例如，1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2)中的整数，重复1、重复2和重复3是选自下组的组合：
[0192]
(j)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:19的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0193]
(k)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0194]
(l)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:17的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0195]
(m)重复1包含seq id no:40的序列或由其组成，重复2包含seq id no:18的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:17的序列或由其组成；
[0196]
(n)重复1包含seq id no:15的序列或由其组成，重复2包含seq id no:28的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0197]
(o)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:15的序列或由其组成；
[0198]
(p)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0199]
(q)重复1包含seq id no:17的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:17的序列或由其组成；以及
[0200]
(r)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复3包含seq id no:38的序列或由其组成。
[0201]
在某些实施例中，r、s、x和y独立地为选自1至30(例如，1-29、1-28、1-27、1-26、1-25、1-24、1-23、1-22、1-21、1-20、1-19、1-18、1-17、1-16、1-15、1-14、1-13、1-12、1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1-2)中的整数，重复1、重复2、重复3和重复4是选自下组的组合：
[0202]
(a)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:20的序列
或由其组成，重复3包含seq id no:17的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0203]
(b)重复1包含seq id no:15的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成，重复3包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0204]
(c)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:38的序列或由其组成，重复3包含seq id no:15的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:18的序列或由其组成；
[0205]
(d)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:28的序列或由其组成，重复3包含seq id no:18的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:15的序列或由其组成；以及
[0206]
(e)重复1包含seq id no:18的序列或由其组成，重复2包含seq id no:15的序列或由其组成，重复3包含seq id no:39的序列或由其组成，并且重复4包含seq id no:38的序列或由其组成。
[0207]
在某些实施例中，多肽接头包含选自下组的氨基酸序列：seq id no:17和46-49。在某些实施例中，多肽接头包含选自下组的氨基酸序列：seq id no:48-49。
[0208]
在某些实施例中，本文提供的融合多肽包含选自下组的氨基酸序列：seq id no:50-59和13。
[0209]
下表1显示了示例性融合多肽序列的seq id no，以及本文提供的融合多肽中含有的结合血清白蛋白的单域抗体、接头和gdf15序列的seq id no。下表1还显示了结合血清白蛋白的单域抗体和gdf15中的突变，以及接头序列中的重复序列和重复数。
[0210]
表1.示例性融合多肽序列
[0211][0212]
**：单域抗体中的突变意指相对于seq id no:4的突变，其中第一个残基是e1，最后一个残基是s116；-1位是指从seq id no:4的n末端延长序列的第一个残基，并且-n位是指从seq id no:4的n末端延长序列的第n个残基。
[0213]
#
：gdf15中的突变意指相对于seq id no:9的突变，其中第一个残基是a1，最后一个残基是i112；
[0214]
多肽复合物
[0215]
在另一方面，本公开提供一种多肽复合物，其包含本文提供的融合多肽的二聚体。
[0216]
如本文使用，术语“多肽复合物”意指包含通过共价相互作用(例如，半胱氨酸之间的二硫键)或非共价相互作用结合在一起的两种或更多种融合多肽、多肽或多肽片段的复合物。多肽复合物可天然或合成产生。多肽复合物中的两个或更多个融合多肽、多肽或多肽片段可相同或不同。在某些实施例中，多肽复合物是同二聚体。
[0217]
在某些实施例中，二聚体以二硫键缔合。在某些实施例中，二硫键在包含gdf15的第二多肽片段之间形成。
[0218]
制备方法
[0219]
本公开提供编码本文提供的融合多肽或本文提供的多肽复合物的分离的核酸或多核苷酸。
[0220]
如本文所用，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)和其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并以类似于天然存在的核苷酸
的方式进行代谢。除非另外指示，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变异体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列，以及明确指示的序列。具体地，可通过生成序列来实现简并密码子取代，其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见batzer等人《核酸研究》19:5081(1991)；ohtsuka等人《生物化学杂志(j.biol.chem.)》260:2605-2608(1985)；和rossolini等人《分子与细胞探测(mol.cell.probes)》8:91-98(1994))。
[0221]
编码本文提供的融合多肽或本文提供的多肽复合物的核酸或多核苷酸可使用重组技术构建。为此，可获得且可连接编码结合血清白蛋白的单域抗体(诸如hsa特异性vhh结构域)的dna和编码gfarl激动剂(诸如gfd 15)融合多肽或多肽复合物的dna，以便在宿主细胞中转录和表达，从而产生融合多肽。如果需要，还可操作地连接编码一个或多个接头的多核苷酸序列以允许表达所需产物。
[0222]
编码多核苷酸序列可进一步可操作地连接到一个或多个调控序列，任选地在表达载体中，使得融合多肽或多肽复合物的表达或产生可行并且在适当控制下。
[0223]
可使用本领域中已知的重组技术将编码多核苷酸序列插入到载体中以用于进一步克隆(dna扩增)或表达。许多载体是可供使用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子(例如，原核启动子，诸如t7、t7lac、sp6、arabad、trp、lac、tac、plm、a3、lac、lpp、npr、pac、syn、trc和t3，或真核启动子，诸如sv40、cmv和ef-1α)，和转录终止序列。
[0224]
载体和宿主细胞
[0225]
在另一方面，本公开提供一种载体，其包含本文提供的多核苷酸。
[0226]
可将包含本文提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中进行克隆或基因表达。如本文所用，短语“宿主细胞”是指已引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。在其他实施例中，载体是染色体外的。若需要，可分离宿主细胞。在某些实施例中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
[0227]
用于克隆或表达本文载体中的dna的合适的宿主细胞主要是原核生物。用于此目的的合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌(如大肠杆菌)、肠杆菌、欧文氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙门氏菌(如鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌(如粘质沙雷氏菌)和志贺氏菌，以及杆菌(诸如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)、假单胞菌(诸如铜绿假单胞菌)和链霉菌。在一些实施例中，宿主细胞为真核生物(诸如酵母)和哺乳动物细胞(例如，永生化哺乳动物细胞)。
[0228]
可使用本领域技术人员已知的任何合适方法，例如转化、转染或转导，将包含本文提供的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中。在一个实例中，可将编码结合血清白蛋白的单域抗体/gdf15融合多肽的多核苷酸序列亚克隆到表达载体(在宿主细胞中以包涵体形式表达)。载体可为病毒载体，并且在这一能力中可使用任何合适病毒载体。
[0229]
在另一方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含本文提供的载体。宿主细胞为原核细胞或真核细胞。用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞可在常规营养培养基中培养，所述培养基视需要经修饰以诱导启动子、选择转化子或扩增克隆载体。
[0230]
在另一方面，本公开提供一种产生本文提供的多肽复合物的方法，其包含在允许本文提供的多核苷酸表达的条件下培养本文提供的宿主细胞。
[0231]
为了产生本文提供的融合多肽或多肽复合物，可在多种培养基中培养用表达载体转化的宿主细胞。诸如terrific肉汤、lb肉汤、lb琼脂、m9基本培养基、magiamedia培养基以及immedia培养基(赛默飞世尔(thermofisher))的市售细菌生长培养基适用于培养细菌宿主细胞。诸如ham f10(西格玛(sigma))、最小必需培养基(mem)(西格玛)、rpmi-1640(西格玛)和杜尔贝科氏改良伊格尔培养基(dmem)(西格玛)的市售培养基适用于培养真核宿主细胞。这些培养基中的任一种都可以视需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如hepes)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如gentamycin
tm
药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以按照本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件(诸如温度、ph等)是先前与所选的用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
[0232]
在一方面，本公开提供一种表达本文提供的融合多肽和/或多肽复合物的方法，包含在表达融合多肽和/或多肽复合物的条件下培养本文提供的宿主细胞。
[0233]
在某些实施例中，多肽复合物表达为包涵体。在某些实施例中，所述方法进一步包含从包涵体复性多肽复合物。
[0234]
当使用重组技术时，本文提供的融合多肽和多肽复合物可在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果产物在细胞内产生，则作为第一步，例如通过离心或超滤去除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。carter等人,《生物技术(bio/technology)》10:163-167(1992)描述了一种用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的蛋白质的程序。简单来说，将细胞糊状物在乙酸钠(ph 3.5)、edta和苯甲基磺酰氟(pmsf)的存在下经约30分钟解冻。细胞碎片可通过离心去除。在产物被分泌到培养基中的情况下，一般首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如艾米康(amicon)或密理博(millipore)pellicon超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂诸如pmsf可以包括在任何前述步骤中，以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
[0235]
在某些实施例中，所述方法进一步包含分离融合多肽和/或多肽复合物。
[0236]
由细胞制备的本文提供的融合多肽和多肽复合物可使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、deae-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱纯化。
[0237]
用于蛋白质纯化的其他技术，诸如离子交换柱分级分离、乙醇沉淀、反相hplc、硅上色谱、肝素sepharose
tm
色谱、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)色谱、色谱焦聚、sds-page以及硫酸铵沉淀也是可用的，这取决于待回收的蛋白质。
[0238]
药物组合物
[0239]
在另一方面，本公开还提供一种包含本文提供的融合多肽或多肽复合物和药学上可接受的载剂的药物组合物。
[0240]
术语“药学上可接受的”表示指定的载剂、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与包含制剂的其他成分在化学上和/或物理上相容，并与其接受者在生理上相容。
[0241]“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中除了活性成分以外的生物活性可接受且对受试者无毒的成分。用于本文公开的药物组合物的药学上可接受的载剂可包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固体载剂、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、螯合(sequestering/chelating)剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或
无毒辅助物质、本领域中已知的其他组分或其各种组合。
[0242]
合适的组分可包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂诸如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、edta、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、硫代乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开，在本文提供的药物组合物中包括一种或多种抗氧化剂(诸如蛋氨酸)减少多肽复合物或双特异性多肽复合物的氧化。这种氧化的减少防止或减少了结合亲和力的损失，从而提高了蛋白质的稳定性并最大限度地延长了保存期。因此，在某些实施例中，提供了包含本文所公开的融合多肽、多肽复合物或缀合物以及一种或多种抗氧化剂(诸如蛋氨酸)的组合物。
[0243]
为了进一步说明，药学上可接受的载剂可以包括例如含水媒剂(诸如氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌注射用水或葡萄糖和乳酸林格注射液)、非水媒剂(诸如植物源不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油)、抑菌或抑真菌浓度的抗微生物剂、等渗剂(诸如氯化钠或葡萄糖)、缓冲剂(诸如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、抗氧化剂(诸如硫酸氢钠)、局部麻醉剂(诸如盐酸普鲁卡因)、助悬剂和分散剂(诸如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、乳化剂(诸如聚山梨醇酯80(tween-80))、螯合剂(诸如edta(乙二胺四乙酸))或egta(乙二醇四乙酸))、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。用作载剂的抗微生物剂可添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可包括例如水、生理盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂、稳定剂、溶解性增强剂或诸如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
[0244]
药物组合物可为液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或散剂。口服制剂可包括标准载剂，诸如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0245]
在实施例中，药物组合物被配制成可注射组合物。可注射的药物组合物可以任何常规形式制备，诸如例如液体溶液、悬浮液、乳液或适合产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包括准备好用于注射的无菌和/或无热原质溶液；准备好临在使用之前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，诸如冻干粉末，包括皮下片剂；准备好用于注射的无菌悬浮液；准备好临在使用之前与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品；和无菌和/或无热原质乳液。溶液可以是水性或非水性的。
[0246]
在某些实施例中，单位剂量的肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带针头的注射器中。所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原质的，正如本领域中已知和实践的那样。
[0247]
在某些实施例中，无菌冻干粉是通过将如本文所公开的融合多肽、多肽复合物或缀合物溶解于合适的溶剂中来制备。溶剂可含有提高粉末或由粉末制备的复原溶液的稳定性或其他药理学组分的赋形剂。可使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的试剂。溶剂可含有缓冲剂，诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂，在一个实施例中，ph值为约
ofmedical care in diabetes care-2011)》的糖尿病护理第34卷增补1，si 1-s61中找到，其通过引用并入本文。
[0257]
本文提供的融合多肽和多肽复合物的治疗有效量将取决于本领域中已知的各种因素，诸如例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、健康状况和交叉反应、过敏、敏感性和不良副作用的可能性，以及施用途径和疾病发展的程度。如由这些和其他情况或要求所指示，本领域一般技术人员(例如，医生或兽医)可按比例减少或增加剂量。治疗有效量可以是本文提供的融合多肽、多肽复合物和缀合物引发研究人员、医生或其他临床医师寻求的组织系统、动物或人的生物或医学反应的量，所述反应包括减轻或改善所治疗的疾病或病症的症状，即，支持可观察水平的一种或多种所需生物或医学反应，例如降低血糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；减轻体重；或改善葡萄糖耐量、能量消耗或胰岛素敏感性的量。
[0258]
在某些实施例中，本文提供的融合多肽或多肽复合物可以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如，约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施例中的某些中，本文提供的融合多肽或多肽复合物以约50mg/kg或更低的剂量施用，并且在这些实施例中的某些中，剂量是10mg/kg或更低、5mg/kg或更低、1mg/kg或更低、0.5mg/kg或更低或0.1mg/kg或更低。在某些实施例中，施用剂量可在治疗过程中改变。例如，在某些实施例中，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施例中，取决于受试者的反应，施用剂量可在治疗过程中改变。
[0259]
可调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可施用单次剂量，或可随时间推移施用若干分次剂量。
[0260]
本文提供的融合多肽或多肽复合物可通过本领域中已知的任何途径施用，诸如例如肠胃外(例如，皮下、腹膜内、静脉内(包括静脉内输注)、肌肉内或皮内注射)或非肠胃外(例如口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
[0261]
融合多肽或多肽复合物可以单独施用或与一种或多种其他治疗手段或药剂组合施用。
[0262]
在某些实施例中，当用于治疗代谢疾病时，本文提供的融合多肽或多肽复合物可与用于治疗代谢疾病或相关的任何医学病症的任何其他治疗剂组合施用。如本文所用，“组合施用”包括作为相同药物组合物的部分同时施用、作为独立组合物同时施用或作为独立组合物在不同时间施用。如短语“组合”在本文中所用，在另一药剂之前或之后施用的组合物视为与该药剂“组合”施用，即使组合物和第二药剂经由不同途径施用。在可能的情况下，与本文提供的融合多肽、多肽复合物或缀合物组合施用的额外治疗剂根据额外治疗剂的产品信息表中列出的一览表施用，或根据医师案头参考(《医师案头参考(physicians'desk reference)》第70版(2016))或本领域众所周知的方案施用。可与药物组合物组合施用的化合物的非限制性实例包含包括罗格列酮(rosiglitizone)、吡格列酮(pioglitizone)、瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglitinide)、二甲双胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)、西他列汀(stiagliptin)、普兰林肽(pramlintide)、格列吡嗪(glipizide)、
格列美脲-阿卡波糖(glimeprirideacarbose)和米格列醇(miglitol)。
[0263]
试剂盒
[0264]
还提供用于实践所公开方法的试剂盒。此类试剂盒可包含诸如本文所述的药物组合物，包括编码本文提供的融合多肽或多肽复合物的核酸、包含此类核酸的载体和细胞、以及包含此类含核酸化合物的药物组合物，其可在无菌容器中提供。任选地，还可包括关于如何采用所提供的药物组合物治疗代谢病症的说明书，或使患者或医疗服务提供者可获得所述说明书。
[0265]
在一方面，试剂盒包含：(a)药物组合物，其包含治疗有效量的融合多肽或多肽复合物；和(b)一个或多个用于药物组合物的容器。此类试剂盒还可包含其使用说明书；说明书可根据所治疗的具体代谢病症进行定制。说明书可描述试剂盒中所提供的材料的用途和性质。在某些实施例中，试剂盒包括患者进行施用以治疗代谢病症的说明书，所述代谢病症诸如葡萄糖水平升高、胰岛素水平升高、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、心血管如血脂异常、动脉粥样硬化、酒精性脂肪性肝炎(ash)、糖尿病肾病、代谢综合征诸如代谢综合征x、非酒精性脂肪肝病(nafld)、终末期肝病、肝脂肪变性(脂肪肝)、肝硬化或原发性胆汁性肝硬化(pbc)。
[0266]
说明书可以印刷在基材(诸如纸或塑料等)上，并且可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标签中(即与包装相关联)等。在其他实施例中，说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如cd-rom、磁盘等。在其他实施例中，实际说明书不存在于试剂盒中，而是提供用于如通过互联网从远程源获得说明书的手段。该实施例的实例是包括网址的试剂盒，在该网址中可以查看说明书和/或可以从该网址下载说明书。通常希望将试剂盒的一些或所有组件包装在合适的包装中以维持无菌。试剂盒的组件可以包装在试剂盒容纳元件中以制造单个易于处置的单元，其中试剂盒容纳元件(例如盒子或类似结构)可以是或可以不是气密容器，例如以进一步保持试剂盒的一些或全部组件的无菌性。
[0267]
实例1：融合蛋白的重组表达
[0268]
表1中所列的gdf15融合多肽是使用bl21(de3)衍生菌株从细菌大肠杆菌表达系统中产生的同源二聚体。编码gdf15融合前体的dna针对大肠杆菌表达进行了密码子优化，从头合成并亚克隆到pet衍生表达载体(novagen)中。氨基酸取代通过修饰相应遗传密码实现。当细胞密度在极品肉汤(terrific broth(tb))培养基中的od600达到2.0时，使用0.5mm异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)来诱导gdf15融合蛋白复合物作为包涵体进行过表达。在37℃进行蛋白质诱导20-22小时后，收集细胞。用显微成像分析包涵体的质量。
[0269]
实例2：再折叠和纯化
[0270]
如实例1所述收集细胞，并将其置于20mm tris ph 8.0、0.15m氯化钠缓冲液中，使用细胞粉碎机(900巴，两次)进行裂解。收集含有融合蛋白(即同源二聚体)的不溶性部分，并在同一缓冲液中将其离心(8,000xg，30分钟)洗涤两次。然后使用含10mm dtt缓冲液的8m尿素来溶解包涵体。1小时后，用再折叠缓冲液将溶液稀释20倍。将再折叠样品在室温下搅拌12小时。在使用蛋白酶去除标签后，使用source 30q树脂通用电气医疗集团(ge healthcare))将蛋白质装载到阴离子交换色谱上，用20mm tris 9.0和0.5mnacl进行梯度洗脱。在某些情况下，通过疏水作用色谱法进行进一步抛光。每个步骤中的样品通过lc/ms
表征以确认正确分子量。
[0271]
实例3：融合蛋白的体外活性。
[0272]
方法：
[0273]
使用过表达人gfral、c-ret受体和sre荧光素酶报告物的细胞系来评定融合蛋白(即同源二聚体)的体外gdf15活性。使用3倍系列稀释液(最高浓度为5nm)来测试融合蛋白。为了评定白蛋白结合的影响，还在存在1％hsa的情况下测试了融合蛋白。处理3-5小时后，使用steadylite plus试剂盒(珀金埃尔默公司(perkin elmer)，6066751)来测定荧光素酶活性。
[0274]
每种蛋白质的活性由从非线性回归分析导出的ec
50
表示。下表2总结了一些示例性蛋白质缀合物的数据，以天然gdf15作为参考。
[0275]
表2：融合蛋白的体外活性。
[0276][0277]
结论：
[0278]
分别具有seq id no:50、51、54、56、57、58和59的氨基酸序列的融合蛋白1、2、5、7、8、9和12在无hsa的条件下，在基于细胞的测定中显示出与天然gdf15相当的体外效力。然而，融合蛋白7、8和9在补充有1％hsa的测定中显示出低得多的效力，这意味着白蛋白结合对融合蛋白7、8和9的体外效力具有显著影响。白蛋白结合对融合蛋白1、2、5和12的体外效力仅具有轻微影响。因此，意外地发现在白蛋白存在的情况下，接头长度决定了gdf15的活性。
[0279]
实例4：融合蛋白的体内活性。
[0280]
方法：
[0281]
对10周龄的雄性c57bl/6小鼠每天皮下注射30nmol/kg的融合蛋白，持续10天(n＝5/组)，平行研究索玛鲁肽以作为对照。对每个治疗组整体每天测量每只动物的体重(bw)，并且每天测量食物摄入量。第1天和第10天是治疗的第一天和最后一天。bw减轻％＝100*(第n天bw-第1天bw)/(第1天bw)。第n天的累积食物摄入量表示第1天到第n天的食物摄入量
总和。数据指示为平均值和标准误差(sem)或合并值。第11天的体重减轻按-1*(治疗组的bw减轻％-媒剂组的bw减轻％)来计算；第11天的累积食物摄入量减少按-100*(治疗组的累积食物摄入量-媒剂组的累积食物摄入量)/媒剂组的累积食物摄入量来计算。
[0282]
表3a.第11天c57小鼠的食物摄入量减少和体重减轻
[0283][0284]
表3b.第11天c57小鼠的食物摄入量减少和体重减轻
[0285][0286]
结论
[0287]
在治疗期结束时，融合蛋白显示出比索玛鲁肽更好的减轻bw的功效(图1a和1b以及表3a和3b)。
[0288]
实例5：融合蛋白的药代动力学测量。
[0289]
方法：
[0290]
对6-8周龄的雄性c57bl/6小鼠(n＝2/组)单次皮下注射给药30nmol/kg的融合蛋白。给药前(-5分钟)、注射后0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、24小时、48小时和72小时收集血浆样品。使用gdf15 elisa测定法(r&d systems，dy957)测量血浆中融合蛋白的浓度。
[0291]
结论：
[0292]
如图2所示，两种融合蛋白在小鼠体内均显示出高cmax和长半衰期。由于样品收集时间短，因此很难准确计算每种化合物的t1/2，其将大于50小时。
[0293]
实例6：疾病模型中的功效研究
[0294]
在疾病动物模型(诸如dio小鼠)中评定所选分子，以确定慢性研究中的体重、食物摄入量、葡萄糖功效以及剂量反应。还测量一些生物标记，包括空腹胰岛素、血浆甘油三酯、胆固醇、肝甘油三酯和炎症生物标记(alt、ast和crp)。
[0295]
方法：
[0296]
对22周龄的dio雄性c57bl/6小鼠(约40g)每天(qd)皮下注射一次融合蛋白(融合蛋白5和12)，持续12天。每天测量食物摄入量和体重。每个治疗组使用五只动物。监测每只动物的体重，但每组动物的食物摄入量是在合并测量后再除以动物数量得出的。第1天和第12天是分子给药的第一天和最后一天。数据指示为平均值和标准误差(sem)或合并值。通过单因素anova进行统计分析。第12天的体重减轻按-1*(bw减轻％-媒剂组bw减轻％)进行计算；累积食物摄入量减少按-100*(累积食物摄入量-媒剂累积食物摄入量)/媒剂累积食物
摄入量进行计算。
[0297]
结论：在dio研究中，如图3a和3b所示，融合蛋白5和12在减轻体重和抑制食物摄入方面具有显著影响。
[0298]
实例7：非人灵长类动物的pk研究。
[0299]
在猴中评定所选分子的药代动力学。进行皮下和静脉内注射两者。
[0300]
实例8：免疫原性评定。
[0301]
还通过计算机模拟(itope和tced方法)和离体(episcreen)方法评定所选融合蛋白缀合物的免疫原性。
[0302]
实例9：稳定性评定。
[0303]
为了测试稳定性，在具有不同组合物(ph 6、7、7.4和8.0)的缓冲液中配制不同的缀合融合蛋白，并在不同温度(诸如25℃和37℃)下储存2-4周。通过体积排阻色谱(sec)-hplc来分析hmwp％和lmw％。通过反相(rp)-uplc和lc/ms分析浓度和修饰。