一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法与流程

1.本发明涉及菌株培养技术领域，尤其涉及一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法。


背景技术：

2.在灭菌程序验证中，尽管可通过灭菌过程某些参数的监控来评估灭菌效果，但生物指示剂的被灭杀程度，则是评价一个灭菌程序有效性最直观的的指标。可使用市售的标准生物指示剂，也可使用有日常生产污染菌监控中分离的耐受性最强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证试验中，需确定孢子在实际灭菌条件下的d值，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比日常检出的微生物污染量大，耐受性强，以保证灭菌程序有更大的安全性。在最终灭菌法中，生物指示剂应放在灭菌柜的不同部位。并避免指示剂直接接触到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培养基中培养，确定生物指示剂中的孢子是否被完全杀灭。过度杀灭产品灭菌验证一般不考虑微生物污染水平，可采用市售的生物指示剂。对灭菌手段耐受性差的产品，设计灭菌程序时，根据经验预计在该生产工艺中产品微生物污染的水平，选择生物指示剂的菌种和孢子数量。这类产品的无菌保证应通过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验证所获得的数据进行评估。在医疗机构的灭菌生物监测中，ws310国家标准已明确规定：1、压力蒸汽灭菌过程为每周一次，使用压力蒸汽灭菌生物指示剂；2、环氧乙烷气体灭菌为每批次都要监测，使用环氧乙烷灭菌生物指示剂；3、低温等离子体灭菌为每日监测一次，使用低温等离子体灭菌生物指示剂。以上三种灭菌方式，也是目前医疗机构的主要灭菌方式，其中，压力蒸汽灭菌和过氧化氢等离子灭菌使用最为广泛。
3.嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，细菌繁殖体g兰氏染色阳性呈紫色，细菌芽孢孔雀绿着色。嗜热脂肪芽孢杆菌比较容易识别且对人体没有危害性，一般作为空间消毒的指示生物。嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢被广泛应用于压力蒸汽灭菌和过氧化氢等离子体灭菌的生物监测领域。目前，使用液体发酵法生产嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的具有数量大，发酵周期短等优点。但其主要问题为芽孢形成率低，极大限制了该工艺在生产嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢中的应用。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法，该方法能够解决液体发酵批量生产嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢中芽孢率形成率低的问题。
5.本发明提供的提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液组合，其特征在于，包括：活种子培养基和发酵培养基；
6.所述种子培养基包括水和0.5wt％～0.7wt％牛肉浸粉，1.0wt％～1.5wt％蛋白胨，0.3wt％～0.4wt％氯化钠，ph值为7.0～7.2；
7.所述发酵培养基包括水和葡萄糖0.3wt％～0.4wt％，蛋白胨1.0wt％～1.5wt％，胰蛋白胨0.2wt％～0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％～1.5wt％，磷酸二氢钾0.10wt％～0.15wt％，氯化镁0.02wt％～0.04wt％，酵母提取物0.3wt％～0.5wt％，氯化钠0.3wt％～0.4wt％，氯化亚铁0.0015wt％～0.002wt％，氯化钙0.02wt％～0.04wt％和0.01％～0.03％消泡剂，ph值为7.6。
8.一些实施例中，所述种子培养基包括水和0.5wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.3wt％氯化钠，ph值为7.0～7.2。
9.一些实施例中，所述发酵培养基包括水和葡萄糖0.3wt％～0.4wt％，蛋白胨1.0wt％～1.5wt％，胰蛋白胨0.2wt％～0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％～1.5wt％，磷酸二氢钾0.10wt％～0.15wt％，氯化镁0.02wt％～0.04wt％，酵母提取物0.3wt％～0.5wt％，氯化钠0.3wt％～0.4wt％，氯化亚铁0.0015wt％～0.002wt％，氯化钙0.02wt％～0.04wt％和0.01％～0.03％消泡剂，ph值为7.6。
10.本发明实施例中，所述消泡剂为有机硅烷类消泡剂。一些具体实施例中，所述消泡剂具体为df8018(来自德丰消泡剂公司)。
11.本发明提供的培养基，更有利于嗜热脂肪芽孢杆菌形成芽孢。相对于现有技术而言，以本发明提供的培养基培养嗜热脂肪芽孢杆菌能够获得更高的芽孢率。
12.本发明还提供了一种嗜热脂肪芽孢杆菌的培养方法，其将嗜热脂肪芽孢杆菌以所述培养液组合活化、发酵，制得嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢发酵液。
13.所述活化的条件包括：58～60℃，180～200转/min震荡16～18h。
14.所述发酵的温度为58～60℃，所述发酵的条件包括：接种后0～4h，0.5～1vvm通气不搅拌；4h～24h，溶氧为30％，搅拌转速为50～800转/min；第12～16h时，加入mn
2
至其质量分数为0.01％～0.03％。
15.一些实施例中，所述锰离子来自硫酸亚锰或氯化亚锰。
16.一些实施例中，所述加入mn
2
的时间是第12h。
17.本发明还提供了一种灭菌生物指示剂，其由生物指示物、恢复培养基和检测管组成，
18.所述生物指示物由本发明所述制备方法制得的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢发酵液和滤纸制得。
19.一些实施例中，所述恢复培养基包括水和9～12g/l葡萄糖，1～3g/l蔗糖，8～12g/l蛋白胨1～3g/l可溶性淀粉，2～4g/l氯化钠，0.3～0.5g/l的l-丙氨酸和1.6ml的1％溴甲酚紫。
20.本发明首先通过使用分段控制溶氧，前期30％溶氧，ph7.0保证菌体大量增殖，后期10％溶氧，ph7.6易于芽孢的形成，结合在12h～16h后锰离子加入到发酵液中诱导的方法，控制ph7.2-7.6之间，最高为7.6。在24小时内，实现了高密度、高芽孢率嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的液体发酵生产，芽孢率达到了95％以上，且芽孢生成周期较短。
21.本发明中，所述生物指示物的制备方法包括将本发明所述制备方法制得的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢发酵液经3500转/min，20min离心5次，沉淀以pbs缓冲液重悬后，3500转/min搅拌4h获得嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的菌悬液；将所述菌悬液滴染于滤纸，制备获得生物指示物。
22.本发明提供了提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌的培养液组合，及其培养方法。本发明提供的嗜热脂肪芽孢杆菌的培养液中成分合理，更适合芽孢形成。配合该方法，能够在24h内获得大量芽孢。该培养物用于灭菌生物指示剂具有良好的指示作用。
具体实施方式
23.本发明提供了一种提高芽孢率的嗜热脂肪芽孢杆菌培养液及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
24.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
25.实施例1
26.nb培养基：0.3wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.5wt％氯化钠，ph值7.2。
27.tsb培养基：1.7wt％胰酪胨，0.3％大豆木瓜蛋白酶水解物，0.5％氯化钠，0.25wt％磷酸氢二钾，0.25wt％葡萄糖。
28.嗜热脂肪芽孢杆菌种子液的培养方法包括：
29.①
将保存在-80℃下的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种经37℃的水浴快速解冻，之后用接种环蘸取一环菌种，将其接种于种子培养液中，活化条件包括：58℃，200转/min震荡18h。
30.1)配制一定体积的营养肉汤(nb)以及胰大豆蛋白肉汤(tsb)，分装于150ml锥形瓶中，每瓶50ml；
31.2)121℃、20min灭菌后备用；
32.3)在58℃条件下培养12h、24h，测定菌悬液浊度。
33.4)实验结果
34.表1 nb和tsb种子液的浓度对比
[0035][0036]
可以看出，nb活化的嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌体浓度要显著高于tsb培养液中的菌体含量。
[0037]
实施例2
[0038]
种子培养基：0.3wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.5wt％氯化钠，其余成分为水。ph7.2。
[0039]
发酵培养基：0.2wt％葡萄糖，0.3wt％，蛋白胨1.5wt％，胰蛋白胨0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，磷酸二氢钾0.15wt％，氯化镁0.03wt％，酵母提取物0.5wt％，氯化钠0.3wt％，氯化亚铁0.0015wt％，氯化钙0.02wt％和0.03％消泡剂，ph值为7.2。
[0040]
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的培养方法包括：
[0041]
①
将保存在-80℃下的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种经37℃的水浴快速解冻，之后用接种环蘸取一环菌种，将其接种于种子培养液中，活化条件包括：58℃，200转/min震荡18h。
[0042]
②
将步骤
①
制得的种子液接种于经121℃/25min的压力蒸汽灭菌液体培养基的发酵罐中(接种量为5v/v％)。液体发酵的条件为：从接种后开始计算时间，ph保证全发酵过程为7.2，前4h采取仅通气(通气量为0.5vvm)不搅拌静止培养；4～24h采取转速(搅拌转速为50-800转/min,1vvm)关联溶氧的方法设定溶氧为30％，在发酵时间为12h时，加入0.02％的mn
2
(氯化亚锰)，继续发酵至24小时，整个发酵期间取样记录芽孢形成情况。
[0043]
表2添加二价锰离子实验组芽孢率的记录
[0044]
时间0h4h8h10h12h16h18h20h24h芽孢率03.1％10.3％22.8％46.4％58.3％74.8％85.2％91.4％
[0045]
可以看出，二价锰离子的加入可以显著提高芽孢的形成率。
[0046]
作为对比例，在12h以后不添加二价锰离子，其他条件与实验组一致，记录整个发酵期间取样芽孢形成情况，结果如表3。
[0047]
表3无添加对比组芽孢率的记录
[0048]
时间0h4h8h10h12h16h18h20h24h芽孢率04.1％9.7％18.8％44.5％48.3％54.8％53.2％54.1.％
[0049]
可以看出，无二价锰离子的加入，24h发酵收获的发酵液中芽孢的形成率要显著低于表2中二价锰离子诱导组。
[0050]
实施例3
[0051]
种子培养基：0.3wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.5wt％氯化钠，其余成分为水。ph7.2。
[0052]
发酵培养基：0.2wt％葡萄糖，0.3wt％，蛋白胨1.5wt％，胰蛋白胨0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，磷酸二氢钾0.15wt％，氯化镁0.03wt％，酵母提取物0.5wt％，氯化钠0.3wt％，氯化亚铁0.0015wt％，氯化钙0.02wt％和0.03％消泡剂，ph值为7.2。
[0053]
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的培养方法包括：
[0054]
①
将保存在-80℃下的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种经37℃的水浴快速解冻，之后用接种环蘸取一环菌种，将其接种于种子培养液中，活化条件包括：58℃，200转/min震荡18h。
[0055]
②
将步骤
①
制得的种子液接种于经121℃/25min的压力蒸汽灭菌液体培养基的发酵罐中(接种量为5v/v％)。液体发酵的条件为：从接种后开始计算时间，ph全发酵过程保证为7.2，前4h采取仅通气(通气量为0.5vvm)不搅拌静止培养；4～24h采取转速(搅拌转速为50-800转/min,1vvm)关联溶氧的方法设定溶氧为30％，在发酵时间为12h时，加入0.02％的mn
2
(氯化亚锰)，继续发酵至24小时，整个发酵期间取样记录芽孢形成情况，如表4。
[0056]
表4实验组芽孢率的记录
[0057]
时间0h4h8h10h12h16h18h20h24h芽孢率03.1％10.3％22.846.4％58.3％74.8％85.2％91.4％
[0058]
作为对比例，4～24h转速保持恒定300转/min，分别的通气量分别改为0vvm,0.5vvm,1。0vvm,1.5vvm,2.0vvm，其他条件与实验组一致，记录整个发酵期间取样芽孢形成情况，如表5。
[0059]
表5通气量对芽孢率的影响
[0060]
通气量vvm00.511.52芽孢率25.6％48.7％88.3％78.8％65.2％
[0061]
能够看出通气量对芽孢的形成有显著的影响，过高或过低的溶解氧浓度都不利于芽孢的大量形成。
[0062]
实施例4
[0063]
种子培养基：0.3wt％牛肉浸粉，1.0wt％蛋白胨，0.5wt％氯化钠，其余成分为水。ph7.2。
[0064]
发酵培养基：0.2wt％葡萄糖，0.3wt％，蛋白胨1.5wt％，胰蛋白胨0.25wt％，磷酸氢二钾0.1wt％，磷酸二氢钾0.15wt％，氯化镁0.03wt％，酵母提取物0.5wt％，氯化钠0.3wt％，氯化亚铁0.0015wt％，氯化钙0.02wt％和0.03％消泡剂，ph值为7.2。
[0065]
嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的培养方法包括：
[0066]
①
将保存在-80℃下的嗜热脂肪芽孢杆菌菌种经37℃的水浴快速解冻，之后用接种环蘸取一环菌种，将其接种于种子培养液中，活化条件包括：58℃，200转/min震荡18h。
[0067]
②
将步骤
①
制得的种子液接种于经121℃/25min的压力蒸汽灭菌液体培养基的发酵罐中(接种量为5v/v％)。液体发酵的条件为：从接种后开始计算时间，前4h采取仅通气(通气量为0.5vvm)不搅拌静止培养；4～24h采取转速(搅拌转速为50-800转/min,1vvm)关联溶氧的方法设定溶氧为30％，同时将ph控制在7.2-7.6(期间只控制ph上限)。在发酵时间为12h时，加入0.02％的mn
2
(氯化亚锰)，继续发酵至24小时，整个发酵期间取样记录芽孢形成情况，结果如表6。
[0068]
表6实验组芽孢率的记录
[0069]
时间0h4h8h10h12h16h18h20h24h芽孢率02.9％11.2％27.845.6％56.3％78.8％87.2％95.1％
[0070]
作为对比组，发酵中分别控制ph恒定,6.0，6.5，7.0，7.5，测定最终芽孢率的形成，结果如表7。
[0071]
表7实验组芽孢率的记录
[0072]
ph6.06.57.07.58.0芽孢率19.6％28.7％68.4％88.3％87.2％
[0073]
可以看出，ph对芽孢形成有重要影响，酸性环境对芽孢的形成极为不利。
[0074]
实施例5
[0075]
将各实施例和对比例制备获得的发酵液经过3500转/min，20min离心5次，之后用磷酸缓冲溶液pbs7.2稀释(至浓度为1
×
108cfu/ml)，使用磁力搅拌600转/min，搅拌4h获得嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的菌悬液待用。
[0076]
获取的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢稀释到1
×
108cfu/ml.将其滴染在空白载体(长条形滤纸)上制备为生物指示物，之后将其与pp塑料管与装有安瓿瓶的恢复培养基共同组成自含式生物指示剂。
[0077]
安瓿瓶内的恢复培养液成分为1000ml水中含有11g葡萄糖，1g蔗糖，10g蛋白胨2g可溶性淀粉，3g氯化钠，0.5g的l-丙氨酸以及1.6ml的1％的溴甲酚紫水溶液。
[0078]
效果鉴定
[0079]
检测依据：gb 18281.1-2015《医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分：通则》附录d“部分阴性分析法测定d值”。
[0080]
检测方法：随机抽取120支某品牌压力蒸汽灭菌0.5小时极速生物指示剂，分为6时间组进行试验；设定压力蒸汽灭菌抗力检测器温度为121℃，试运行2个循环，然后将各组样本分不同时间组进行灭菌处理。灭菌完毕，将暴露后的生物指示剂置56℃培养箱内按说明书要求培养48h，记录阴性和阳性结果情况。
[0081]
采用lhskp法，按以下公式，计算d值。
[0082][0083]
检测环境温度：21.9℃；相对湿度：49％。
[0084]
三、结果
[0085]
经对某品牌压力蒸汽灭菌0.5小时极速生物指示剂d值进行测定，在设定121℃饱和蒸汽条件下，生物指示物芽孢数减少90％所需要的时间(d值)为4.4min。