德立替尼晶型化合物和用途的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，更特别地，涉及德立替尼的新晶型及其制备方法和用途。


背景技术：

2.肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，als)，又称 lou gehrrig病和渐冻症，是一种运动神经系统退行性疾病，表现为脑干、脊髓和运动皮层区域运动神经元的广泛死亡。
3.运动神经元分为上、下运动神经元两种，上运动神经元从大脑发送信号至脊髓，而后通过下运动神经元将信号传至肌肉，控制自主运动。als 患者由于运动神经元大量死亡，不能将信号传递至肌肉，不能产生自主运动，导致肌肉逐渐萎缩、麻痹和瘫痪。
4.als的临床症状表现为行走困难、日常活动困难、痉挛、肌无力、口齿不清、笨拙、吞咽困难、认知障碍，该病为进行性疾病，患者随着疾病发展和病情恶化，逐渐出现咀嚼、呼吸等方面的困难，最终因无法自主呼吸在发病3-5年内死亡。
5.亚洲占世界人口的50％，为最大的als患者地域。流行病学研究指出， als发病率高达7.4/10万。预计到2040年，全世界将有40万患者被确诊。
[0006] 根据病因是否明确，可以将als分两种类型。其中，10％的患者属于家族遗传型als(fals)，目前已经发现多达36个突变基因与fals发病相关，包括tardna结合蛋白43(tardp-43)、铜/锌超氧化物歧化酶-1 (cu,zn-sod-1)和c9orf72基因等。剩下高达90-95％的als病例为散发病例(sals)。
[0007]
散发型als发病机制错综复杂，目前已知als神经病变可能是由谷氨酸活性过度兴奋、自由基产生、细胞质蛋白聚集的复杂相互作用引起，再加上线粒体功能障碍、神经纤维组织细胞内积累大量聚集体破坏轴突转运过程、小胶质细胞激活导致促炎细胞因子分泌，导致进一步细胞毒性，最终激活钙依赖性酶通路使运动神经元发生病变，但是仍然缺乏明确的病因和诊断标准，严重阻碍着als的治疗研究。
[0008][0009]
至今为止，对于als仍然缺乏有效的治疗方式，临床仍以对症治疗和物理疗法为主。
[0010]
利鲁唑(riluzole)和依达拉奉(edaravone)是目前美国食品药品监督局(food and drug administration，fda)唯二批准的治疗als的药物。
[0011]
其中利鲁唑属于苯并噻唑类化合物，它可以干扰nmda(n-methyl-d
‑ꢀ
aspartate)受体介导的反应，阻断电压门控的钠离子通道，从而减少谷氨酸的突触前释放。利鲁唑一定程度上可以延长患者的生存期，推迟气管切开术和机械通气的使用。此外，利鲁唑的不良反应相对较小，而且大部分在停药后即可恢复。
[0012]
另外一种药物为依达拉奉，依达拉奉原来是作为一种脑保护剂，可抑制脑梗急性期患者梗塞周围局部脑血流量，阻止脑水肿和脑梗塞的进展，缓解神经症状，抑制迟发性神
经元死亡。机理研究提示，依达拉奉可清除自由基，抑制脂质过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤，因而依达拉奉注射液主要用于改善急性脑梗塞所致的神经症状，日常生活活动能力和功能障碍。由于长期用于治疗急性缺血性脑卒中，安全性良好。为新适应症的审批打下了一定的基础。作为一种神经保护剂，可清除游离自由基，保护神经元免受氧化应激和凋亡的损害，临床试验证明其可延缓als患者运动能力的下降。
[0013]
研究表明，在48周的研究时间内，依达拉奉和安慰剂之间的比较显示，依达拉奉治疗组的als frs-r评分的变化明显低于安慰剂组。在第24 周已经观察到依达拉奉和安慰剂之间的显著差异，这些结果表明，在这48 周的治疗过程中，依达拉奉相对于安慰剂的益处得以维持。
[0014]
这两种现有的用于治疗als的药物，从本质上说并未触及als发病的内在机理，只是在一定程度上调节运动神经元之间的兴奋传导，减缓als 病人运动功能的下降，并不能终止或延缓als的恶化进程。所以寻找其他更佳有效的治疗药物是als研究的重要任务。
[0015]
德立替尼最初由南京爱德程研发，2008年授权给eospharmaceuticals，2012年后者授权给施维雅(除美国，日本和中国外)。 2013年，施维雅与中科院上海药物所达成在中国研发该化合物的协议。
[0016]
德立替尼为多种酪氨酸激酶的小分子抑制剂，是vegfr和fgfr的双重抑制剂，有效和选择性地抑制vegfr1，vegfr2，vegfr3，fgfr1，fgfr2， ic
50
分别为7nm，25nm，10nm，17.5nm，82.5nm。用于包括结肠癌在内的实体瘤的潜在口服治疗。
[0017]
2021年，该药被列为中国小细胞肺癌的ii期开发药物，开发公司为上海海和药物研究开发有限公司。
[0018]
德立替尼，化学名：6-(((7-((1-氨基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基)氧基)-n-甲基-1-萘酰胺，分子量为：443.5，cas编号： 1058137-84-0，logp＝3.24，室温下在水中的溶解度约为0.00128mg/ml，水溶性较差，化学结构如下：
[0019][0020]
中国专利cn101558055b，公开了作为血管生成抑制剂的螺取代化合物，实施例3给出了上述化合物(德立替尼)的合成方法，如下：
[0021]
6-(7-((1-氨基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-n-甲基-1
‑ꢀ
萘甲酰胺在etoh(30ml)中将实施例1的产品(100mg)与pd/c(10％，40mg)混合，并且在50psi下氢化12小时。将反应物滤过硅藻土并蒸发溶剂，从而给出标题产品。mass：(m 1)，444。
[0022]
将实施例1的产品(100mg)与乙酸(1ml)和33％hbr/乙酸(0.6ml)混合。在室温下将反应搅拌1小时，用etoac/h2o稀释，然后用na2co3进行碱化。对有机层进行干燥、蒸发，用硅胶柱进行纯化，从而给出标题产品。mass：(m 1)，444。
[0023]
所得产品为混晶，在dsc图谱上，在194℃和196.07℃呈现两个吸热峰。
[0024]
中国专利cn104193676a，进一步公开了上述化合物的合成方法。其中实施例7给出
了具体的合成方法，如下：
[0025]
将实施例6的化合物(0.24g，0.42mmol)在2ml40％hbr的乙酸溶液中的混合物在30℃下搅拌3小时，然后加入10ml水并将反应混合物用acoet萃取(2x10ml)。除去有机相。向水溶液中滴加50％naoh溶液以达到ph10。将混合物用dcm(二氯甲烷)萃取(3x20ml)，将合并的有机相干燥并蒸发得到含有6-(7-((1-氨基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-n-甲基-1
‑ꢀ
萘甲酰胺(i)的粗产物，通过lc-ms分析其纯度大于》94％。将该粗产物进一步通过硅胶柱色谱纯化，用dcm/meoh(10：1)洗脱得到6-(7-((1-氨基环丙基)甲氧基)-6-甲氧基喹啉-4-基氧基)-n-甲基-1-萘甲酰胺(i)，通过lc
‑ꢀ
ms分析其纯度大于98％(140mg，收率：76％)。
[0026]
中国专利cn104936946a进一步公开了上述化合物的晶型(暂命名为晶型i)，其中实施例7，给出了化合物的晶型及制备方法，如下：
[0027]
将来自实施例1的粗制的产物(105g)与异丙醇(2.5l)和活性炭(5g)混合，将该混合液加热至回流达0.5小时以溶解所有粗制的产物，随后趁热过滤，然后将滤液再次回流10分钟，在缓慢搅拌条件下将其冷却至室温过夜。将沉淀过滤，并用乙醚(500mlx2)洗涤，在高真空下在80℃进一步干燥，得到纯的产物(85g)，熔点为192℃-196℃。
[0028]
此专利一并公开了所得晶型的x-ray衍射数据，如下：
[0029][0030]
dsc在约193℃-202℃具有最大吸热峰。
[0031]
但是上述专利并未公开此晶型任何有益的技术效果。
[0032]
作为目前此化合物的国内开发企业，上海海和药物研究开发有限公司同样对于此化合物的晶型做了研究，申请了中国专利cn 110483393 a。
[0033]
在专利中公开了德立替尼二水合物、德立替尼的晶型ii以及德立替尼二盐酸盐二水合物。并公开了制备方法和x-ray衍射数据。
[0034]
其中德立替尼二水合物x-ray衍射数据如下：
[0035]
4.0
°
、8.9
°
、11.2
°
、14.3
°
、15.9
°
、16.4
°
、18.0
°
、18.3
°
、 19.7
°
、21.1
°
、21.8
°
、22.6
°
、23.2
°
、24.5
°
、25.5
°
、26.9
°
、27.1
°
、28.0
°
、28.3
°
、28.9
°
、29.2
°
、30.1
°
、30.4
°
、31.4
°
、 32.2
°
、34.3
°
、37.5
°
、39.1
°
，每个2θ值约有
±
0.2
°
的误差，其中的特征峰为：4.0
°
、8.9
°
、11.2
°
、16.4
°
。
[0036]
德立替尼的晶型ii x-ray衍射数据如下：
[0037]
3.2
°
、8.1
°
、8.5
°
、10.6
°
、12.1
°
、12.7
°
、13.0
°
、14.3
°
、 15.1
°
、16.1
°
、17.4
°
、
18.0
°
、19.0
°
、19.8
°
、20.7
°
、21.4
°
、 22.4
°
、23.1
°
、23.5
°
、23.9
°
、24.3
°
、24.8
°
、25.1
°
、26.1
°
、 26.8
°
、27.4
°
、28.0
°
、29.8
°
、30.2
°
、30.8
°
、31.5
°
、32.1
°
、 32.6
°
、33.1
°
、33.9
°
、35.1
°
、35.8
°
、36.4
°
、38.5
°
，每个2θ值约有
±
0.2
°
的误差，其中的特征峰为10.6
°
、12.7
°
、14.3
°
。
[0038]
德立替尼的二盐酸盐二水合物x-ray衍射数据如下：
[0039]
3.2
°
、5.2
°
、6.8
°
、7.8
°
、8.5
°
、10.9
°
、12.2
°
、12.8
°
、 15.6
°
、16.0
°
、17.4
°
、18.0
°
、18.3
°
、18.7
°
、19.6
°
、19.9
°
、 20.4
°
、20.8
°
、21.0
°
、21.7
°
、22.1
°
、22.9
°
、23.5
°
、23.9
°
、 24.2
°
、24.8
°
、25.1
°
、25.6
°
、26.0
°
、26.9
°
、27.6
°
、28.5
°
、 29.1
°
、29.4
°
、30.1
°
、31.6
°
、32.3
°
、33.2
°
、33.8
°
、35.1
°
、 36.4
°
、37.4
°
、37.9
°
、39.3
°
，每个2θ值约有
±
0.2
°
的误差，其中的特征峰为：5.2
°
、6.8
°
、7.8
°
、10.9
°
。
[0040]
中国专利cn 110483393 a公开上述二水合物，晶型ii和二盐酸盐二水合物具有良好的稳定性，更加适用于肿瘤的治疗。
[0041]
众所周知，如果将化合物开发为药物，则重要的是，提供一种可安全地大规模制备并纯化的化合物(通常称作药品)形式，其在储存时稳定且不降解。该特征通常发现于呈结晶且具有高熔点的药品中，高熔点结晶固体往往易于通过再结晶纯化且在储存时稳定。
[0042]
此外，药品必须适于根据预期给药途径调配为所选择的剂型。对于调配为口服给药的固体制剂而言，原料本身的流动性，稳定性，晶型稳定性等性质尤为重要。在口服给药制剂中，原料药与常规赋形剂(例如，乳糖，淀粉，纤维素，硬脂酸镁)的兼容性是又一个强制性需求。此外，对于难溶性药品将通常需要做进一步处理以达到增加溶出速率，提高生物利用度的目的。简言之，化合物是否适于作为药物而商业化取决于是否能发现具有根据预期给药路径决定的独特组合的性质的化合物的形式。


技术实现要素：

[0043]
本发明提供德立替尼的晶型x：
[0044]
经x射线衍射法(xrpd)确证，在xrpd图谱上2θ角为25.1
°
的位置具有最强特征峰，相对强度为100％。
[0045]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型x，在xrpd图谱上2θ角约为 9.6
°
的位置上具有特征峰，相对强度为76.2％。
[0046]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型x，在xrpd图谱上2θ角约为 11.3
°
，12.5
°
，15
°
，15.8
°
，16.2
°
，18.6
°
，19.4
°
，22.6
°
， 23.3
°
，23.8
°
，24.9
°
，25.6
°
，26.4
°
的位置上具有特征峰，相对强度大于20％。
[0047]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型x，在xrpd图谱上2θ角约为 5.7
°
，10.8
°
，14.3
°
，17
°
，19.3
°
，21.8
°
，23.4
°
，25
°
，25.8， 30.3
°
的位置上具有特征峰，相对强度大于10％。
[0048]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型x，在xrpd图谱上2θ角约为 14.8
°
，22
°
，24.8
°
，26.1
°
，27.5
°
，28.8
°
，29.9
°
，33.1
°
， 38.6
°
，42
°
的位置上具有特征峰，相对强度大于5％。
[0049]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型x，具有如附图1所示的 xrpd图谱。
[0050]
本发明所述德立替尼的晶型x的xrpd数据见表1。
[0051]
表1德立替尼的晶型x的xrpd数据如下：
[0052][0053][0054]
由于测量条件的不同，xrpd衍射图上各峰的2θ角和相对强度会有所变动，一般2θ角变化在
±
0.2
°
以内认为是合理误差。
[0055]
本发明提供的德立替尼的晶型x，经差示扫描量热法(dsc)分析，熔点为204℃，纯度99.5％以上。
[0056]
本发明同时提供德立替尼的晶型y：
[0057]
经x射线衍射法(xrpd)确证，在xrpd图谱上2θ角为9.2
°
的位置具有最强特征峰，相对强度为100％。
[0058]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型y，在xrpd图谱上2θ角约为12.4
°
的位置上具有特征峰，相对强度为45.1％。
[0059]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型y，在xrpd图谱上2θ角约为10.5
°
，23.9
°
，25.6
°
的位置上具有特征峰，相对强度大于20％。
[0060]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型y，在xrpd图谱上2θ角约为11.7
°
，14.6
°
，
17.3
°
，21.7
°
，24.4
°
，26.1
°
，27.0
°
， 27.3
°
，27.9
°
的位置上具有特征峰，相对强度大于10％。
[0061]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型y，在xrpd图谱上2θ角约为13.0
°
，15.9
°
，18.5
°
，21.3
°
，25.0
°
，28.7
°
，29.8
°
的位置上具有特征峰，相对强度大于5％。
[0062]
进一步地，本发明所述的德立替尼的晶型y，具有如附图2所示的 xrpd图谱。
[0063]
本发明德立替尼的晶型y的xrpd数据见表2。
[0064]
表2德立替尼的晶型y的xrpd数据如下：
[0065][0066][0067]
由于测量条件的不同，xrpd衍射图上各峰的2θ角和相对强度会有所变动，一般2θ角变化在
±
0.2以内认为是合理误差。
[0068]
本发明提供的德立替尼的晶型y，经差示扫描量热法(dsc)分析，熔点为198℃，纯度99.5％以上。
[0069]
本发明进一步提供晶型x，晶型y的制备方法如下：
[0070]
取德立替尼化合物，置于溶剂中，加热回流，冷却至一定温度，结晶，过滤获得结晶
粗品，真空干燥除去残留溶剂后，获得结晶终产品。
[0071]
优选的，在制备晶型x时可以选择的溶剂为正丙醇，甲乙酮，环己烷，乙腈，结晶温度为60-65℃。
[0072]
溶剂优选为正丙醇。
[0073]
优选的在制备晶型y时可以选择的溶剂为四氢呋喃，二异丙醚，结晶温度为40-50℃。
[0074]
溶剂优选为四氢呋喃。
[0075]
本发明最后提供德立替尼用于制备治疗肌萎缩侧索硬化症的用途，尤其是晶型x，晶型y。
[0076]
根据本发明的德立替尼的新型结晶形式x，y可以用于药物组合物的制备中，口服给药，用于治疗肌萎缩侧索硬化症。特别是固体剂型，例如片剂，硬胶囊剂。
[0077]
药物组合物可以包含至少一种选自以下的赋形剂：填充剂(例如乳糖，微晶纤维素，预胶化淀粉)，粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)，崩解剂(例如交联羧甲基纤维素钠)，润滑剂(例如硬脂酸镁)，表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)。此外，药物组合物可以任选地包含选自着色剂，溶剂，抗微生物剂，包衣剂，调味剂和嗅觉调节剂的至少一种其他赋形剂。片剂可以用含有例如聚乙烯醇或聚乙二醇的常规包衣包衣。所述药物组合物可以制备成几乎任何固体剂型，例如片剂，胶囊剂，散剂，丸剂或颗粒剂。优选的剂型是片剂或硬胶囊剂。片剂或硬胶囊剂可优选通过将德立替尼与至少一种药学上可接受的赋形剂混合并将混合物进行压片或装入硬胶囊中，片剂可以进一步包衣。
[0078]
本技术缩略语简表：
[0079]
als：amyotrophic lateral sclerosis，肌萎缩侧索硬化症
[0080]
fals：家族遗传型肌萎缩侧索硬化症
[0081]
tardp-43：tardna结合蛋白43
[0082]
cu,zn-sod-1：铜/锌超氧化物歧化酶-1
[0083]
sals：散发型als
[0084]
riluzole：利鲁唑
[0085]
fda：food and drug administration，美国食品药品监督局
[0086]
nmda：n-methyl-d-aspartate，n-甲基-d-天[门]冬氨酸
[0087]
vegfr：血管内皮生长因子受体
[0088]
fgfr：成纤维细胞生长因子受体
[0089]
etoh：乙醇
[0090]
pd/c：钯/碳
[0091]
psi:磅力/平方英寸,压强单位
[0092]
mass：分子量
[0093]
hbr：氢溴酸
[0094]
etoac：乙酸乙酯
[0095]
h2o：水
[0096]
na2co3：碳酸钠
[0097]
dsc：差式扫描量热分析
[0098]
naoh：氢氧化钠
[0099]
dcm：二氯甲烷
[0100]
lc-ms：液相-质谱联用仪
[0101]
meoh：甲醇
[0102]
x-ray：x射线
[0103]
xrpd：x射线衍射法
[0104]
api：原料药
[0105]
dna：脱氧核糖核酸
[0106]
pcr：polymerase chain reaction聚合酶链反应
[0107]
spf：specific pathogen free，无特定病原体
[0108]
cmc：羧甲基纤维素钠
[0109]
说明书附图简述
[0110]
图1是德立替尼晶型x的xrpd。
[0111]
图2是德立替尼晶型y的xrpd。
具体实施方式
[0112]
通过以下实验进一步说明本发明的有益效果。但并不局限于下述实施例，本领域的技术人员在本发明基础上所作的，不脱离本发明实质内容的等同替代或变换，亦均在本发明的保护范围之内。
[0113]
对比例1：api现有专利的工艺及晶型
[0114]
分别根据cn104936946a制备德立替尼晶型i，依据cn 110483393 a 制备德立替尼的晶型ii，二水合物，二盐酸盐二水合物。
[0115]
实施例1晶型x的制备
[0116]
将1g德立替尼样品与10ml正丙醇混合，在磁力搅拌条件下，加热至 85℃，至样品混悬或溶解，保温搅拌8小时，按照10℃/h速度快速降温至 60℃，保温搅拌6h，过滤得到晶型x样品0.95g，纯度为99.6％。
[0117]
所得样品x-ray衍射图谱如附图1所示。
[0118]
实施例2晶型x的制备
[0119]
将1g德立替尼样品与10ml甲乙酮混合，在磁力搅拌条件下，加热至 70℃，至样品混悬或溶解，保温搅拌8小时，按照10℃/h速度快速降温至 60℃，保温搅拌10h，过滤得到晶型x样品0.85g，纯度为99.8％。
[0120]
实施例3晶型x的制备
[0121]
将1g德立替尼样品与10ml环己烷混合，在磁力搅拌条件下，加热至 75℃，至样品混悬或溶解，保温搅拌8小时，按照10℃/h速度快速降温至 65℃，保温搅拌10h，过滤得到晶型x样品0.91g，纯度为99.6％。
[0122]
实施例4晶型x的制备
[0123]
将1g德立替尼样品与10ml乙腈混合，在磁力搅拌条件下，加热至75℃，至样品混悬或溶解，保温搅拌10小时，按照10℃/h速度快速降温至60℃，保温搅拌10h，过滤得到晶型x样品0.93g，纯度为99.7％。
[0124]
实施例5：晶型y的制备
[0125]
将1g德立替尼样品与10ml四氢呋喃混合，在磁力搅拌条件下，加热至 60℃，至样品混悬或溶解，保温搅拌10小时，按照10℃/h速度快速降温至 40℃，保温搅拌10h，过滤得到晶型y样品0.94g，纯度为99.5％。
[0126]
所得样品x-ray衍射图谱如附图2所示。
[0127]
实施例6：晶型y的制备
[0128]
将1g德立替尼样品与10ml二异丙醚混合，在磁力搅拌条件下，加热至 60℃，至样品全部溶解，按照10℃/h速度快速降温至50℃，保温搅拌10h，过滤得到晶型y样品0.85g，纯度为99.5％。
[0129]
实施例7
[0130]
德立替尼晶型x，y以及其他晶型，水合物对于sod1g93a转基因小鼠(als模型小鼠)的保护作用(参照文献施行：周勤明，肌萎缩侧索硬化模型小鼠的神经保护治疗研究)
[0131]
7.1sod1-g93a转基因小鼠的获得
[0132]
sod1*g93a基因为sod1的93号位的甘氨酸突变为丙氨酸，将该突变基因转入小鼠体内即获得sod1-g93a转基因小鼠。该种小鼠在发病后会出现与人类als疾病相似的表型，如肢体瘫痪、肌肉萎缩和运动神经元退化等，是最经典的als小鼠模型，被广泛应用于als疾病的发病机制和治疗研究。
[0133]
sod1-g93a小鼠的繁育方法为：将携带有突变sod1基因的雄鼠与同背景的野生型雌鼠交配获取子代，子代通过剪尾处理提取dna，而后通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction，pcr)进行扩增，之后进行 dna凝胶电泳，根据电泳结果判断子代的基因型，同时表达突变sod1基因和内参基因的为转基因小鼠，只表达内参基因的则为野生型小鼠。也可直接购买获得。小鼠饲养环境为spf级，室温恒定。
[0134]
7.2实验分组和给药
[0135]
实验中所用样品为根据cn104936946a和cn110483393 a制备德立替尼的晶型i，晶型ii，二水合物，二盐酸盐二水合物(对比例1样品)以及依据本技术实施例制备的晶型x和晶型y(实施例样品)。
[0136]
样品制备过程：分别取上述各样品，微粉，粒径控制在不大于20μm，并按1mg/ml混悬于1％cmc水溶液中。
[0137]
对小鼠采用灌胃给药方式，灌胃剂量为0.3ml/10g/d。选择40只 sod1-g93a小鼠，将其随机分为八组(每组五只)：
[0138]
(1)溶媒组(vehicle group，n＝5，为阴性对照组)，按照 0.3ml/10g/d的剂量给予1％cmc水溶液治疗；
[0139]
(2)治疗组(therapy group，n＝5)，按照0.3ml/10g/d的剂量给予各治疗样品(对比例1和实施例)；
[0140]
(3)利鲁唑治疗组(riluzole group，n＝5，为阳性对照组)，将利鲁唑药粉同样微粉，使得粒径不大于20微米，混悬于1％cmc水溶液中。按照0.3ml/10g/d，的剂量给予利鲁唑灌胃治疗。
[0141]
以上转基因小鼠均从60日龄开始进行灌胃给药，每日一次，直至判定死亡。
[0142]
7.3转棒测试(运动功能评价)
[0143]
本实验主要通过转棒测试(rotarod test)来判定sod1-g93a小鼠的发病时间，具体判断方法如下：
[0144]
从63日龄开始(即试验开始第4日)，将小鼠放置于转棒测试仪(直径4cm，转速为20转/min)上，每天训练5min，进行7天的适应性训练； 70日龄开始进行正常测试，每只小鼠每日测试3次，取其中在转棒测试仪上停留最长的时间进行记录；如果某日小鼠的最长停留时间低于5min，则记录该天为小鼠的发病日期，发病日期和出生日期间的时间距离即为发病时间。
[0145]
7.4sod1-g93a转基因小鼠生存期的判断
[0146]
小鼠发病后期时由于肌肉萎缩和肢体瘫痪，无法行动，饮食和进水均受限，按照国际常用的sod1-g93a小鼠的死亡判定方法，将小鼠侧卧放置，如果其无法在30s内将身体翻正，则判断其死亡。生存期则为小鼠出生日期和判定死亡日期之间的时间间隔，以每组动物平均发病日期和平均生存期的差值记为病程。
[0147]
7.5试验结果(n＝5，数据以均值
±
标准差表示)
[0148]
分组发病时间(天)生存期(天)病程(天)阴性对照(1％cmc)90.8
±
3.4126.6
±
3.335.8阳性对照(利鲁唑)101.4
±
3.7138.4
±
4.637.0德立替尼晶型x110.2
±
3.7164.2
±
4.154.0德立替尼晶型y112.6
±
3.3161.8
±
4.249.2德立替尼晶型i94.8
±
3.7136.4
±
4.241.6德立替尼晶型ii93.8
±
3.6136.4
±
4.142.6德立替尼二水合物92.2
±
3.7133.4
±
4.141.2德立替尼二盐酸盐二水合物91.2
±
3.1131.4
±
4.240.2
[0149]
本研究通过转棒疲劳实验来帮助判断sod1-g93a小鼠的发病时间，如上表数据所示，德立替尼晶型i，ii，二水合物和二盐酸盐二水合物比阴性对照组模型动物的发病时间稍晚，但是并无显著差异。而德立替尼晶型 x和晶型y组试验动物的发病时间显著晚于阴性对照组以及阳性对照组(利鲁唑治疗组)。揭示德立替尼晶型x和晶型y可以推迟模型动物发病时间。
[0150]
从生存期角度看，德立替尼晶型i，ii，二水合物和二盐酸盐二水合物治疗组模型动物的发病时间显著晚于阴性对照组。而德立替尼晶型x和晶型y组试验动物的发病时间显著晚于其他各组(包括利鲁唑治疗组)。揭示德立替尼治疗可以延长模型动物生存期，尤其以晶型x和晶型y更佳。
[0151]
从病程角度来看，德立替尼晶型i，ii，二水合物和二盐酸盐二水合物治疗组模型动物的病程均显著长于阴性对照组和阳性对照组，而晶型x 和晶型y治疗组则显著长于其他各试验组。揭示了德立替尼可以显著延长模型动物的病程，尤其以晶型x和晶型y最佳。
[0152]
综上可以看出，德立替尼可以延迟疾病的发病时间(晶型x和晶型 y)，延长病程和生存期(各晶型和盐及水合物)，从而起到对肌萎缩侧索硬化症的治疗作用。
[0153]
以上发明内容和实施例描述了本发明专利申请的基本原理和主要特征及本发明专利申请优点，本领域的技术人员应该了解，本发明专利申请不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明专利申请的最优的技术方案，在不脱离本发明专
利申请精神的前提下，本发明专利申请还会有各种变化和改进，即以德立替尼，尤其是晶型x和晶型y 作为肌萎缩侧索硬化症的治疗药物的主药成分，单独或与其他药物或辅料联合施用，都落入要求保护的本发明专利申请范围内，本发明专利申请要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。