一种防治小麦赤霉病的假单胞菌CXZ8、生防菌剂及其应用

一种防治小麦赤霉病的假单胞菌cxz8、生防菌剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种防治小麦赤霉病的假单胞菌 cxz8、生防菌剂及其应用。


背景技术：

2.小麦赤霉病(fusarium head blight，fhb)在世界范围内广泛分布，是最重要的农作物真菌病害之一。小麦感染小麦赤霉病后不仅产量下降，还会在感病籽粒中大量积累真菌毒素-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)。该毒素具有抑制真核生物蛋白质合成的能力，威胁人畜健康，造成严重的食品安全问题
3.近年来，受到气候变化，田间菌源增多等因素的影响，我国小麦赤霉病发生频次增加，且整体呈现西移北扩的趋势，发生区域遍布我国小麦主产区。
4.由于小麦抗赤霉病品种匮乏，扬花期喷施化学药剂是防控小麦赤霉病的主要手段。然而长期单一使用化学药剂的田块和区域，田间菌株普遍产生抗药性，使得化学药剂效果减弱甚至丧失。生物防治是化学防治的有效补充。目前报道的生防菌或生防制剂多依赖其产生的次生代谢物，通过抑制病原菌的生长而发挥作用，不具有专一性和特异性。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供了一种防治小麦赤霉病的假单胞菌 cxz8、生防菌剂及其应用。
6.一种防治小麦赤霉病的假单胞菌(pseudomonas adaceae)cxz8，于2022 年07月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.25393。
7.一种所述的假单胞菌cxz8在防治小麦赤霉病中的应用。
8.优选的，所述的假单胞菌cxz8用于抑制禾谷镰刀菌。
9.一种包括所述假单胞菌cxz8的生防菌剂。
10.优选的，所述生防菌剂的制备方法为：将假单胞菌cxz8制成种子液后接种至lb培养基中得到活菌总浓度为1
×
10
7-1
×
108cfu/ml以上的产物，即生防菌剂。
11.一种所述的生防菌剂用于防治小麦赤霉病中的应用。
12.优选的，将所述生防菌剂用于处于扬花期的小麦穗上。
13.优选的，将所述生防菌剂用于小麦的根部。
14.优选的，将所述生防菌剂用于浸泡小麦种子。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
16.本发明从田间病穗上的健康籽粒中分离了一株小麦内生的假单胞菌，发现其具有良好的生防效果，该菌株对田间小麦赤霉病的发生抑制率高达87.3％。而且通过电镜观察到该生防菌能够大量吸附于赤霉病菌的侵染结构并抑制其侵染反应。这说明该生防菌通过紧密吸附以发挥抑菌作用，这相比基于次生代谢物的生防菌，具有专一性和特异性的特点。这种生防方式准确作用于病原菌，减少了抑菌物在环境中的释放，不会对环境中有益微生
物产生影响。此外，紧密吸附靶向性明确，可显著减少生防菌的使用量，有望实现对小麦赤霉病的高效精准防控。
17.生物保藏信息说明：
18.生物材料：cxz8，分类学命名：假单胞菌，拉丁名为：pseudomonas adaceae，该菌株于2022年07月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no.25393。
附图说明
19.图1为本发明中分离出的小麦内生假单胞菌cxz8电镜图；
20.图2为本发明中分离出的小麦内生假单胞菌cxz8抑制禾谷镰刀菌侵染小麦的效果对比图(a)，为侵染小麦胚芽鞘的效果图(b)；
21.图3为假单胞菌cxz8紧密吸附禾谷镰刀菌侵染菌丝效果图(a)；假单胞菌cxz8抑制禾谷镰刀菌菌丝在小麦表面上形成侵染结构效果图(b)；
22.图4为假单胞菌cxz8影响禾谷镰刀菌don毒素积累效果图；
23.图5为本发明实施例3中内生假单胞菌cxz-8制成的生防菌剂预处理小麦穗对小麦赤霉病的保护治疗作用效果图。其中，图5(a)为作用直观效果图，图5(b)为统计图，a为对照组，b为处理组；
24.图6为本发明实施例4中内生假单胞菌cxz-8制成的生防菌剂根部处理小麦对小麦赤霉病的保护治疗作用效果图。其中，图6(a)为作用直观效果图，图6(b)为统计图，a为对照组，b为处理组；
25.图7为本发明实施例5中内生假单胞菌cxz-8制成的生防菌剂浸泡小麦种子对小麦赤霉病的保护治疗作用效果图。其中，图7(a)为作用直观效果图，图7(b)为统计图，a为对照组，b为处理组。
具体实施方式
26.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
27.以下实施例中所用的培养基如下：
28.lb液体培养基的组分及配比(每1l)为：胰蛋白胨10g、酵母浸膏粉5g、氯化钠5g、去离子水1l，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。
29.lb固体培养基的组分及配比(每1l)为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、琼脂粉17g、去离子水1l，该培养基通过将前述组分混合后在 121℃高温高压灭菌20min得到。
30.r2a固体培养基的组分及配比(每1l)为：r2a琼脂培养基干粉18.1g、去离子水1l，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。
31.pda固体培养基的组分及配比(每1l)为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、去离子水1l，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。
32.cmc培养基的组分及配比(每1l)为：羧甲基纤维素钠15g、硝酸铵1g、磷酸二氢钾
1g、酵母提取物1g、七水和硫酸镁0.5g、去离子水1l，该培养基通过将前述组分混合后在121℃高温高压灭菌20min得到。
33.以下实施例中所用的菌株如下：
34.供试假单胞菌cxz8：由本实验室从田间小麦“绿穗”中分离得到，经鉴定为假单胞菌(pseudomonas sp.)，并命名为cxz8。
35.供试病原菌：小麦赤霉病病原菌禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)野生型菌株ph-1。
36.实施例1
37.小麦内生菌的分离、筛选及鉴定
38.1.小麦内生菌的分离纯化
39.(1)小麦内生菌的分离：将从田间采集的品种为小晏22的“绿穗”及其邻近已经发病而枯黄的小穗表面消毒。无菌水冲洗后用75％的乙醇浸泡3min， 2％naclo浸泡15min去除表面的杂菌。无菌水冲洗3次将表面乙醇、naclo 冲洗干净，切成0.5
×
0.5cm的正方形放入无菌水中，过夜振荡得到含有内生菌的悬浮液。
40.(2)内生菌的纯化分离及保存：将含有内生菌的悬浮液稀释后涂布于r2a 固体培养基上，25℃培养1-2d后根据菌落颜色、形态和大小等多次划线分离纯化。挑取单菌落接种于lb液体培养基中，过夜摇培后用20％甘油于-80℃保存。
41.2.抑制赤霉病发病的关键菌株的筛选
42.通过小麦胚芽鞘接种实验和田间接种实验筛选分离得到10株小麦内生菌，其中能够抑制小麦赤霉病发生的菌株为cxz8。
43.(1)准备细菌-禾谷镰刀菌孢子混合接种液
44.pda平板上25℃培养3d的禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1接种到cmc培养基中，25℃、175rpm摇床摇培3-5d。滤布过滤孢子液，3500rpm离心7min 弃上清，无菌水悬浮后血球计数板调节孢子浓度至1
×
106个/ml，得到禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1孢子液。
45.lb平板划线活化-80℃保存的菌株，25℃培养2d。将长出单菌落接种于 lb培养基中25℃175rpm摇培12-16h，调节浓度至1
×
108cfu/ml，并与上述调好浓度的禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1孢子液混合，得到混合接种液。
46.(2)混合接种液田间接种
47.在小麦扬花期，将10μl混合接种液接种于小麦穗中间偏上一个小穗的外稃和内稃之间，并做好标记，套袋保湿24-36h。接种14d左右收样，拍照并统计发病情况。
48.(3)混合接种液接种胚芽鞘
49.75％乙醇浸泡种子消毒3min，蒸馏水多次冲洗后在蒸馏水中浸泡24h。将浸泡好的种子腹沟朝下平铺在浸润水的滤纸片上，25℃培养1-2d。挑取已经萌发并且生长状态良好的种子摆于培养皿内，保鲜膜覆盖保湿，25℃培养 2-3d，待胚芽鞘长度为3-4cm时接种。将胚芽鞘顶端胚芽剪去2-3mm，将上述制备好的混合孢子悬浮液接种2μl于伤口处，25℃保湿培养，7d左右拍照并统计发病情况。
50.3.抑制赤霉病发病的关键菌株16s测序及鉴定
51.设计一对细菌16s测序引物，具体为：
52.27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’；
53.1492r：5
’‑
tacgacttaaccccaatcgc-3’。
54.将平板上长出单菌落后用上述引物扩增特异性片段，pcr反应体系为： (25μl)：10
×
easytaq buffer 2.5μl，dntps 2μl，模板dna 1.5μl上游引物27f 0.5μl，下游引物1492r 0.5μl，ddh2o 17.7μl。pcr反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s、58℃退火40s、72℃延伸120s，共35个循环；72℃再延伸10min。
55.pcr产物经过1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带大小在1800bp左右。回收pcr产物并送公司测序。根据公司完成拼接的序列结果，在ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中进行序列比对，根据序列的同源性高低鉴定菌株。
56.分离出的小麦内生假单胞菌cxz8电镜图如图1所示，如图2所示，由小麦穗部分离得到的菌株cxz8与ph-1混合接种后几乎不致病(图2a)，而作为对照的丁香假单胞菌dc3000与ph-1混合接种后没有抑制发病的作用，与此一致的是，菌株cxz8与ph-1混合接种小麦胚芽鞘后也几乎不致病，cxz8 菌株单独接种对胚芽鞘的生长过程无影响(图2b)，由此筛选出了有效抑制赤霉病发病的关键菌株cxz8，确定混合接种液为cxz8与禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1孢子液混合液。通过16s测序结果比对鉴定cxz8菌株为假单胞菌(pseudomonas adaceae)。
57.实施例2
58.评价假单胞cxz8对禾谷镰刀菌侵染的影响
59.1.cxz8菌株对禾谷镰刀菌在小麦穗上致病的影响
60.田间接种
61.在小麦扬花期，将10μl假单胞菌cxz8的浓度为1
×
108cfu/ml，禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1孢子浓度为1
×
106个/ml的混合接种液接种到小麦穗中间偏上一个小穗的外稃和内稃之间，并做好标记。套袋保湿24-36h，14d后取样拍照并统计发病情况。
62.2.cxz8菌株对禾谷镰刀菌侵染结构发育的影响
63.(1)将假单胞菌cxz8的浓度为1
×
108cfu/ml，禾谷镰刀菌野生型菌株 ph-1孢子浓度为2
×
105个/ml的混合接种液接种液接种至小麦穗上，全穗均可接种。3d后取下小麦稃片样品，样品经预处理后通过扫描电子显微镜观察细菌处理是否影响禾谷镰刀菌侵染结构的形成或扩展。样品预处理方法如下：
64.小麦稃片样品切小块浸没在质量分数为4％的戊二醛溶液中，真空泵抽真空使样品全部下沉。用1
×
pbs(0.1m，ph＝6.8)洗脱样品上的戊二醛，共漂洗5次，漂洗时间分别为10min、20min、30min、30min、30min。然后对样品进行脱水处理，采用不同浓度的酒精进行洗脱，30％乙醇溶液脱水15min； 50％乙醇溶液脱水15min；70％乙醇溶液脱水过夜；80％乙醇溶液脱水20min； 90％乙醇溶液脱水20min；100％乙醇溶液脱水30min。丙酮溶液脱水2次，每次30min。醋酸异戊酯溶液置换2次，置换时间分别为30min和20min。co2干燥后粘贴于载样台上，喷金粉并用钨灯丝扫描电子显微镜拍照。
65.4.cxz8菌株对禾谷镰刀菌don毒素产生的影响
66.(1)如实施例1中2.(2)的方法接种小麦穗，可在多个小穗上同时接种。
67.(2)提取毒素：取接种14d左右的接种点单籽粒，50℃烘干后称重。将籽粒置于2ml离心管中，并加入2ml乙腈水(乙腈：水＝84：16)研磨打碎后振荡24h。12000rpm离心1min，上清过pe小柱，取1ml滤液转移至新的离心管中，旋转浓缩，加入50μl tms(tmsi:tmcs＝100:
1)硅烷化试剂，振荡10min后加入200μl色谱级异辛烷，颠倒混匀，最后加入200μl超纯水，再次颠倒混匀。
68.(3)静置样品，待上清液全部澄清后，将上清液全部移到上样瓶中。通过shimadzu公司的gcms-qp2010气相色谱-质谱仪进行检测，并根据标准曲线计算毒素含量。计算公式：c＝c0×4×
10-4/m(mg/g)，其中c是毒素终浓度， c0(mg/l)是gc-ms仪器测定的原始数据浓度，m(g)为籽粒质量。
69.如图3和图4所示，cxz8与禾谷镰刀菌混合接种后能显著抑制小麦穗上小麦赤霉病的发病，接种点单籽粒发病，小麦穗整体保持健康状态。钨灯丝扫描电子显微镜观察稃片发现，cxz8能紧密吸附到禾谷镰刀菌的侵染菌丝上(图 3a)，稃片上侵染结构形成明显减少，不能形成典型的“侵染垫”结构(图3b)，这种紧密吸附抑制了侵染结构的形成。此外，cxz8处理后产don量仅为 34.38
±
9.96g/ml，仅为野生型对照的23.6％(图4)，t检验进行显著性差异分析(p＝0.05)，**表示p《0.01。以上结果表明，cxz8菌株通过对侵染结构的紧密吸附影响了禾谷镰刀菌侵染结构的形成及侵染菌丝在细胞间的穿透能力，降低了don毒素的积累，从而抑制小麦赤霉病的发生。
70.实施例3
71.评价生防菌剂预处理小麦穗对小麦赤霉病的防治效果
72.(1)生防菌剂的制备方法
73.将生防菌株cxz8在lb液体培养基中28℃180rpm振荡培养12h-16h制成种子液。将种子液以1％的接种量接种于lb培养基中，28℃、180rpm振荡培养2-4h，得到浓度为1
×
108cfu/ml的生防菌剂。
74.(2)生防菌剂对小麦穗预处理
75.将上述生防菌剂均匀喷洒在处于扬花期的小麦穗上，套袋保湿48h。
76.(3)ph-1孢子液的制备及接种
77.如实施例1中2.(1)的方法制备浓度为2
×
105个/ml的禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1孢子液。将10μl孢子液接种于每个小麦穗中间偏上一个小穗外稃和内稃之间并做好标记。套袋保湿24-36h，14d后取样拍照并统计发病籽粒数。
78.结果如图5a所示，与未喷施生防菌剂的麦穗相比，喷施生防菌剂后发病明显减弱，接种点单籽粒发病，使用假单胞菌cxz8制得的生防菌剂预处理小麦穗后，小麦幼苗发病长度下降88％(图5b)，t检验进行显著性差异分析 (p＝0.05)，****表示p《0.0001。该结果表明在自然条件下，田间预先施用假单胞菌cxz8制得的生防菌剂对小麦赤霉病有良好的防治效果。
79.实施例4
80.评价假单胞cxz8生防菌剂根部预处理小麦幼苗对禾谷镰刀菌的防治效果
81.(1)生防菌剂对小麦幼苗根部预处理
82.如实施例3中(1)的方法制备假单胞菌cxz8生防菌剂。将假单胞菌cxz8 生防菌剂浇灌在胚芽鞘的根部，保湿培养2d。
83.(2)ph-1孢子液的制备及接种
84.如实施例1方法制备浓度为2
×
105个/ml的禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1 孢子液，并接种2μl孢子液至实施例4.(1)根部预处理后的胚芽鞘上，7d 后统计发病情况。
85.结果如图6所示，与未经过生防菌剂预处理的小麦胚芽鞘相比，使用假单胞菌cxz8制得的生防菌剂根部处理后，禾谷镰刀菌ph-1发病较轻(图6a)，小麦幼苗发病长度下降27％(图6b)，t检验进行显著性差异分析(p＝0.05)， **表示p《0.01。结果表明配合生防菌剂预处理小麦根部对防治小麦赤霉病有一定的效果。
86.实施例5
87.评价假单胞cxz8生防菌剂进行种子预处理的防治效果
88.(1)生防菌剂处理小麦种子
89.如实施例3方法制备假单胞菌cxz8生防菌剂。将种子充分消毒后浸泡至活菌浓度为1
×
108cfu/ml的生防菌剂中，摇台震荡24h后按实施例1的后续步骤准备胚芽鞘，以用蒸馏水泡种作为对照。
90.(2)ph-1孢子液的制备及接种
91.如实施例1方法制备浓度为2
×
105个/ml的禾谷镰刀菌野生型菌株ph-1 孢子液，并接种2μl孢子液至实施例5.(1)生防菌剂处理种子后产生的胚芽鞘，7d后查看发病情况。
92.结果如图7所示，与未经过生防菌剂种子预处理的小麦胚芽鞘相比，使用假单胞菌cxz8制得的生防菌剂进行种子预处理后，禾谷镰刀菌ph-1发病较轻(图7a)，小麦幼苗发病长度下降31％(图7b)，t检验进行显著性差异分析(p＝0.05)，***表示p《0.001。结果表明配合使用生防菌剂进行泡种处理对防治小麦赤霉病有一定的效果。
93.需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
94.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
95.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。