一种酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-CDCA的方法与流程

一种酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法
技术领域
1.本发明属于生物催化领域，尤其涉及一种酶法催化22-ene-cdca生成cdca的方法。


背景技术：

2.鹅去氧胆酸(cdca)，化学名称为3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸，化学式为c
24h40
o4，为有机化合物，无臭，味苦，无色针状结晶。几乎不溶于水，易溶于乙醇、冰乙酸、微溶于氯仿。主要作用是降低胆汁内胆固醇的饱和度，临床常用于胆结石和胆固醇的治疗，也是合成熊去氧胆酸(udca)的原料。
3.鹅去氧胆酸中杂质22-ene-cdca的含量较高，22-ene-cdca与cdca的理化性质非常接近，目前普遍采用分离纯化法或者化学催化法去除cdca中的22-ene-cdca。分离纯化法收率较低，且工艺控制困难；化学催化法采用贵金属催化剂进行催化还原，效果较好，但是催化剂价格昂贵，且利用氢气作为氢源时增加了危险源，存在安全风险。


技术实现要素：

4.本发明针对现有纯化方法的不足，提出一种通过酶法催化22-ene-cdca生成cdca的方法，该方法转化率高且安全环保。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
5.一种酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，包括以下步骤：
6.(1)将待纯化的cdca溶于水后调节ph至弱碱性，得到cdca水溶液；
7.(2)向cdca水溶液内加入nadp 、异丙醇、异丙醇脱氢酶和烯还原酶，搅拌溶解得到反应液；
8.(3)将反应液调节ph值后恒温反应，反应结束后调酸加热将酶灭活。
9.作为优选，步骤(1)中cdca水溶液ph值为7.5-8.0。
10.作为优选，步骤(2)中添加nadp 、异丙醇、异丙醇脱氢酶、烯还原酶与22-ene-cdca的质量比例为(0.001～0.01)：(5～10)：(0.1～0.5)：(0.1～1)：1。
11.作为优选，步骤(3)中反应温度为25℃～37℃。
12.作为优选，步骤(3)中反应ph值7.5～8.0。
13.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
14.本发明通过烯还原酶将cdca中的22-ene-cdca杂质转化成cdca，实现cdca中去除22-ene-cdca杂质的目的，并通过异丙醇脱氢酶实现辅酶nadph的再生。
15.该方法操作简单，可在常温常压下反应，反应条件温和，易于放大生产。无氢气等危险源参与反应，安全系数高。辅酶添加量低，可再生，生产成本低。杂质转化率高，而且生成目的产物，去除杂质的同时提高产品的收率。
附图说明
16.图1为本发明酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的反应原理图；
具体实施方式
17.为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例做具体说明。
18.实施例1：反应体系约1l，先将100g cdca(含22-ene-cdca 10.52g)加入到900ml纯水中，37℃下用5m naoh溶液调节ph至7.5。待ph稳定后加入、0.012gnadp 、52g异丙醇、1.1g异丙醇脱氢酶(山东中京生物科技有限公司生产，标号为zj012)、1.1g烯还原酶，微调ph至7.5，25℃下搅拌反应，反应原理如图1所示。该条件下反应快，酶活力持久。每6h取样并用hplc检测22-ene-cdca的含量，反应24h后转化率达到95％以上，停止反应。用盐酸调ph至4.0，加热至80℃保温1h灭活酶。检测杂质22-ene-cdca的含量，含量为0.41％，指标合格进行下一步提取纯化。
19.实施例2：反应体系约1l，向850ml cdca水溶液(含90.62g cdca和12.40g 22-ene-cdca)中加入0.124g nadp ，37℃下用5m naoh溶液调ph 7.8。待ph稳定后加入124g异丙醇、6.2g异丙醇脱氢酶、12.4g烯还原酶，微调ph至7.8，37℃下搅拌反应。该条件下cdca溶解快，反应速度加快。每3h取样并用hplc检测22-ene-cdca的含量，反应9h后转化率达到95％以上，停止反应。用盐酸调ph至4.0，加热至80℃保温1h灭活酶。检测杂质22-ene-cdca的含量，含量为0.35％，进行下一步提取纯化。
20.本发明通过烯还原酶将cdca中的22-ene-cdca杂质转化成cdca，实现cdca中去除22-ene-cdca杂质的目的，并通过异丙醇脱氢酶实现辅酶nadph的再生。
21.该方法操作简单，可在常温常压下反应，反应条件温和，易于放大生产。无氢气等危险源参与反应，安全系数高。辅酶添加量低，可再生，生产成本低。杂质转化率高，而且生成目的产物，去除杂质的同时提高产品的收率。
22.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。


技术特征：
1.一种酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待纯化的cdca溶于水后调节ph至弱碱性，得到cdca水溶液；(2)向cdca水溶液内加入nadp 、异丙醇、异丙醇脱氢酶和烯还原酶，搅拌溶解得到反应液；(3)将反应液调节ph值后恒温条件下反应，反应结束后调酸加热将酶灭活。2.根据权利要求1所述的酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，其特征在于：步骤(1)中cdca水溶液ph值为7.5-8.0。3.根据权利要求1所述的酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，其特征在于：步骤(2)中添加nadp 、异丙醇、异丙醇脱氢酶、烯还原酶与22-ene-cdca的质量比例为(0.001～0.01)：(5～10)：(0.1～0.5)：(0.1～1)：1。4.根据权利要求1所述的酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，其特征在于：步骤(3)中反应温度为25℃～37℃。5.根据权利要求4所述的酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，其特征在于：步骤(3)中反应ph值7.5～8.0。6.根据权利要求1所述的酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-cdca的方法，其特征在于：步骤(1)中采用naoh溶液调节ph。

技术总结
本发明提出一种酶法去除鹅去氧胆酸中22-ene-CDCA的方法，包括以下步骤：(1)将待纯化的CDCA溶于水后调节pH至弱碱性，得到CDCA水溶液；(2)向CDCA水溶液内加入NADP 、异丙醇、异丙醇脱氢酶和烯还原酶，搅拌溶解得到反应液；(3)将反应液调节PH值后恒温反应，反应结束后调酸加热将酶灭活。本发明通过烯还原酶将CDCA中的22-ene-CDCA杂质转化成CDCA，实现CDCA中去除22-ene-CDCA杂质的目的，并通过异丙醇脱氢酶实现辅酶NADPH的再生，提高了CDCA的收率，且操作简单，反应条件温和，生产成本低，可轻松实现规模化生产。规模化生产。规模化生产。


技术研发人员：丁洪勇 周炜强
受保护的技术使用者：山东中京生物科技有限公司
技术研发日：2022.09.05
技术公布日：2022/10/25