一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法

1.本发明属于高分子材料技术领域，更具体的说，涉及一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法。


背景技术：

2.细菌在医用材料表面的定植与繁殖是造成医源性感染的主要原因，特别是近年来耐药性细菌（即所谓“超级细菌”）的出现，已成为影响人类健康的一个关键问题。
3.目前，基于表面引发原子转移自由基聚合反应（surface-initiated atom transfer radical polymerization, si-atrp）（以下简称si-atrp）制备的季铵盐型阳离子聚合物刷抗菌表面材料是应用较为广泛的抗菌材料。常通过调控表面引发剂浓度调节功能表面聚合物刷的接枝密度。由于si-atrp对氧气极为敏感，反应条件苛刻，不仅需要严格、复杂的脱氧程序，而且反应体系的金属催化剂极易氧化失活，无法通过原位表征技术对反应过程进行实时监测与精准调控。传统方法采用椭圆偏振或原子力显微镜等传统的非原位表征技术辅助观测接枝厚度或表面形貌，实验步骤耗时长、繁琐，结果精确度不高，尤其对于双功能抗菌刷中两种组分间的相互干扰以及分子链间的空间位阻，只能凭借操作者的个人经验来摸索，不利于聚合物刷表面结构致密化与抗菌性能的进一步提高，严重阻碍了抗菌材料杀菌效果的大幅提升及科研创新的试验效率。


技术实现要素：

4.现有的抗菌材料制备方法，无法通过原位表征技术进行实时监测。为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法，将原位监测装置与葡萄糖氧化酶/葡萄糖/丙酮酸钠还原脱氧体系相结合，实现了对聚合物刷生长过程的实时原位监测。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法，包括以下步骤：（1）在含硅元素的基底表面接枝引发剂，得到中间体；（2）将所述中间体放入原位监测装置的进样反应器；（3）将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、甲醇与水溶剂配备而成的反应液，通入进样反应器；（4）将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、溴化铜、配体、甲醇与水溶剂、聚合物单体配备而成的反应液通入进样反应器；通过原位监测装置实时监测步骤（4）。
6.上述技术方案中的方法，步骤（3）排除进样反应器中的氧气，创造一个初始的无氧环境。步骤4将包含有溴化铜、配体、聚合物单体的反应液通入进样反应器中，聚合物单体聚合接枝到基体表面形成聚合物刷，采用了葡萄糖氧化酶/葡萄糖/丙酮酸钠还原体系，消耗了反应体系中的氧气与副产物过氧化氢，使得反应可以在非密闭的环境下进行，从而实现
了原位监测装置应用于聚合物刷生长过程的实时原位监测，弥补了传统非原位界面表征手段的缺陷，一方面可以在线监测吸附质量、厚度并分析吸附动力学过程，另一方面能够通过测量耗散因子信号的变化推测分子在表界面的结构变化，通过实时记录聚合物刷表面接枝过程的实际质量变化，为下一步聚合物刷表面结构的界面调控过程提供精确指导，实现表面接枝过程的实时监测与精准调控；从而准确高效地调控实验参数，提高聚合物刷的表面接枝密度，进一步提升功能表面的杀菌效率。
7.优选地，所述原位监测装置包括耗散型石英晶体微天平分析仪装置和局域表面等离子共振装置，耗散型石英晶体微天平分析仪装置具有窗口模块，局域表面等离子共振装置具有传感器，所述传感器安装在窗口模块内组装成进样反应器。
8.进一步地，步骤(3)和步骤（4）之间有步骤（a）,步骤（a）为：将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、溴化铜、配体、甲醇与水溶剂配备而成的反应液，通入进样反应器；通过原位监测装置监测步骤（a）和步骤（4）或者步骤（4）。步骤a的反应液中不包含聚合物单体，在步骤（4）之前进行步骤（a）可以排除反应体系中的溶剂影响，获得更稳定的基线。
9.在某些实施例中，所述聚合物单体为阳离子两亲聚合物单体1,3-双(n,n,n-二甲基辛烷基溴化铵)-2-丙烯酰氧基丙烷。阳离子两亲聚合物单体属于分子结构较大的geminized型两亲分子，分子之间表现出更强的静电排斥与空间位阻效应，进行si-atrp反应时对氧气更为敏感，反应条件更为苛刻，本专利的一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法，应用于监测阳离子两亲聚合物单体通过si-atrp反应形成聚合物刷的过程，对于geminized两亲聚合物刷的制备具有重大意义，可大幅度提高提高聚合物刷表面接枝密度及抗菌性能，获得结构致密的超高效抗菌功能表面，将杀菌效率提高至99.9%。
10.优选地，反应液通入进样反应器的流速小于等于20μl/min，制备温度为25℃。
11.优选地，所述葡萄糖氧化酶溶液为含100-200mmol/l葡萄糖氧化酶的pbs溶液；所述葡萄糖溶液为含10-50mmol/l葡萄糖的pbs溶液；所述丙酮酸钠溶液为含10-50mmol/l的水溶液；所述溴化铜为固体粉末，加入量为1-5mg/l；所述配体为五甲基二乙烯三胺，浓度为0.5-1mmol/l；所述聚合物单体的浓度为10-20mmol/l。
12.优选地，步骤（1）中，引发剂主要由惰性引发基团和活性引发基团按比例配置而成，引发剂通过浸泡方法接枝到基底的表面。
13.进一步地，所述活性引发基团为3-三甲氧基甲硅烷-2-溴-2-甲基-丙酸甲酯，所述惰性引发基团为甲基三甲氧基硅烷。活性引发基团还可以为其它带溴原子的有机卤化物；惰性引发基团还可以为其它无卤素原子的有机化合物。
14.进一步地，所述惰性引发基团和所述活性引发基团按照3：7的比例修饰在基底表面。当调整惰性引发基团和活性引发基团比例为3:7时，功能表面的接枝密度最高，同时表现出最好的抗菌性能，通过该比例制备的抗菌材料，杀菌效率高达99.9%。
15.本发明的一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法，具有如下有益效果：（1）将原位监测装置与葡萄糖氧化酶/葡萄糖/丙酮酸钠还原脱氧体系相结合，实现了对聚合物刷生长过程的实时原位监测；本方法能够精确分析聚合物刷原位生长曲线，通过实时记录聚合物刷表面接枝过程的实际质量变化，实现对聚合物刷生长过程的实时监
丙烯酰氧基丙烷作为聚合物单体，通过si-atrp反应制备聚合物刷pagc8，使用原位监测装置监测聚合物刷生长过程。
21.具体包含如下步骤：（1）在含硅元素的基底表面接枝引发剂，得到中间体；（2）将所述中间体放入原位监测装置的进样反应器；（3）将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、甲醇与水溶剂配备而成的反应液，通入进样反应器；步骤（a）将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、溴化铜、配体、甲醇与水溶剂配备而成的反应液，通入进样反应器；（4）将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、溴化铜、配体、甲醇与水溶剂、聚合物单体配备而成的反应液通入进样反应器；通过原位监测装置监测步骤（a）和步骤（4）。
22.其中，如图2（a）所示，原位监测装置可以采用耗散型石英晶体微天平分析仪装置1和局域表面等离子共振装置联用装置2，耗散型石英晶体微天平分析仪及其配件可购买于瑞典佰欧林公司，型号q-sense e1。局域表面等离子共振装置及其配件型号为insplorion xnano，可购买于瑞典insplorion ab公司。将局域表面等离子共振装置的传感器（传感器为压电传感器）安装在标准的q-sense窗口模块内组装成进样反应器3。
23.本实施例中的原位监测装置工作原理如下：耗散型石英晶体微天平分析仪与局域表面等离子共振装置共用同一个传感器，并安装在标准的q-sense窗口模块内，对物质吸附引起的声学（对应“湿”质量）和光学（对应“干”质量）信号变化实现同步监测。利用耗散型石英晶体微天平分析仪与局域表面等离子共振装置联用的原位监测装置对表面引发聚合反应过程进行在线监测，实时记录聚合物单体在固体表面吸附引起的光学、声学信号变化，如图2中图（b）所示获得吸附信号曲线示意图，选择系统中的voigt模型对吸附频率（δf）、耗散（δd）和lspr峰位移（δλmax）曲线进行精确拟合，可获得聚合物刷生长过程中的实际质量变化曲线如图3中（a）所示，和拟合后的干、湿质量变化曲线如图3中图（b）所示。
24.图3（a）中曲线是聚合反应过程中的分子吸附质量的原位变化曲线，而图3（b）中是耗散型石英晶体微天平分析和局域表面等离子共振技术分别拟合计算后得到的“湿”和“干”质量，即聚合物刷含水与不含水状态下的质量，以此来推算聚合物刷实时的含水量变化。聚合物刷的质量可以转化为厚度，将聚合物刷厚度和聚合物分子量分别代入下式即可得到聚合物刷在表面的接枝度：其中，σ为聚合物刷的接枝密度，h为聚合物刷厚度，ρ为聚合物刷的干态密度，约为1.00 g/cm3，na为阿伏伽德罗常数，mn为聚合物的数均分子量。
25.如图1所示，执行步骤（1）需要将引发剂接枝到含硅元素的基底表面，得到中间体。在本实施例中，优选引发剂采用惰性引发基团和活性引发基团按3：7的比例配置而成，惰性引发基团优选使用甲基三甲氧基硅烷，活性引发基团优选使用3-三甲氧基甲硅烷-2-溴-2-甲基-丙酸甲酯，基底优选使用sio2，将基底浸泡在引发剂中，过夜，引发剂中的惰性引发基团和活性引发基团便接枝到基底表面，得到图1中所示的中间体。在其它实施例中，引发剂
可以也可通过配置不同浓度的活性引发基团溶液得到；活性引发基团还可以为其它带溴原子的有机卤化物；惰性引发基团还可以为其它无卤素原子的有机化合物，基底也可使用其它含硅元素基底。
26.需要说明的是，权利要求中步骤（2）和步骤（3）并无先后顺序上的严格要求，先通入反应液，还是先放入中间体均可，均应受到权利要求的保护，本实施例中，选择先将中间体放入进样反应器，然后再通入步骤（3）的反应液。
27.步骤（3）的反应液主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、甲醇与水溶剂配备而成，其中，葡萄糖氧化酶溶液为含200mmol/l葡萄糖氧化酶的pbs溶液，葡萄糖溶液为含50mmol/l葡萄糖的pbs溶液，丙酮酸钠溶液为含50mmol/l的水溶液。在其它的实施例中，葡萄糖氧化酶溶液可以在100-200mmol/l区间进行选择制备；葡萄糖溶液可以在10-50mmol/l区间进行选择制备；丙酮酸钠溶液可以在10-50mmol/l区间进行选择制备。
28.步骤（3）反应液通入进样反应器，将进样反应器中的空气、氧气排出反应器中，中间体浸泡在溶液中，形成一个无氧的环境。在某些实施例中，步骤（3）中的反应液，也可以由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、甲醇与水溶剂，少量溴化铜、配体配备而成，同样可以起到排出氧气的作用。在步骤（3）通入反应液的过程中，因为没有聚合物单体、溴化铜、配体，所以并不会发生si-atrp反应，因此也无需通过原位监测装置进行监测，在该步骤下原位监测装置处于归零的状态。
29.步骤（a）将主要由葡萄糖氧化酶溶液、葡萄糖溶液、丙酮酸钠溶液、溴化铜、配体、甲醇与水溶剂配备而成的反应液，通入进样反应器。可以排除反应体系中的溶剂影响，获得更稳定的基线。在某些实施例中，不采用该步骤的，则不能获得更稳定的基线，效果相对会差一些。有步骤（a）的实施例中可以将步骤（a）和步骤（4）进行原位监测，或者仅监测步骤（4），本实施例中对步骤a进行监测的过程对应为图3（a）的除氧体系加入后的曲线变化。进入步骤（4）加入聚合物单体后，所得曲线为图3（a）聚合体系加入后的曲线变化，即聚合物刷的原始生长曲线，以及图3（b）拟合后的干、湿质量变化曲线。
30.步骤（4）的反应液还包含溴化铜、配体、聚合物单体，其中溴化铜为固体粉末，作为催化剂，加入量可在1-5mg/l间选择，本实施例为5mg/l；配体为五甲基二乙烯三胺，浓度可在0.5-1mmol/l间选择，本实施例为1mmol/l；聚合物单体为阳离子两亲聚合物单体1,3-双(n,n,n-二甲基辛烷基溴化铵)-2-丙烯酰氧基丙烷，浓度可在10-20mmol/l间选择，本实施例为20mmol/l；反应液通入进样反应器的流速应小于等于20μl/min，制备温度为25℃。
31.将步骤（4）的反应液通入进样反应器中，将引发表面聚合反应，原位监测装置获得原始的吸附频率变化曲线如图2（b），聚合物单体通过si-atrp反应聚合接枝到中间体上形成聚合物刷，反应过程所产生的氧气将与初始反应液里的葡萄糖氧化酶/葡萄糖进行反应被消耗，产生的副产物过氧化氢则与丙酮酸钠进行反应，使得反应可以在非密闭的环境下进行，从而实现了原位监测装置应用于聚合物刷生长过程的实时原位监测，弥补了传统非原位界面表征手段的缺陷，一方面可以在线监测吸附质量、厚度并分析吸附动力学过程，另一方面能够通过测量耗散因子信号的变化推测分子在表界面的结构变化，通过实时记录聚合物刷表面接枝过程的实际质量变化，为下一步聚合物刷表面结构的界面调控过程提供精确指导，实现表面接枝过程的实时监测与精准调控；从而准确高效地调控实验参数，提高聚合物刷的表面接枝密度，进一步提升功能表面的杀菌效率。
32.在研发过程中，研发人员先将惰性引发基团和活性引发基团分别按不同比例调配引发剂，得到接枝有不同比例惰性/活性引发基团的中间体，然后重复试验过程，即可得到最优的引发剂配比，生产过程中可使用该最优反应条件进行生产制备，而无需再进行原位监测。上述实施例中，即是直接选取最优的惰性引发基团和活性引发基团比例。
33.在某些实施例中，分别将惰性引发基团与活性引发基团按照1:0、7:3、5:5、3:7、0:1的比例修饰在sio2基底表面，选用革兰氏阴性菌大肠杆菌作为研究对象，考察功能表面的抗菌性能，利用平板实验计算得到不同表面的杀菌效率；采用扫描电镜测试观察细菌与抗菌表面作用后的细菌形貌变化，考察杀菌性能。按上述不同比例惰性/活性引发基团制得的聚合物刷的接枝密度与杀菌效率如下表所示。
34.表1：惰性/活性引发基团1:07:35:53:70:1接枝密度（分子链/nm2）0.020.270.310.400.13杀菌效率（%）056x�.9B%如表1和图4所示，当调整引发剂比例为3:7时，功能表面的接枝密度最高，同时表现出较好的抗菌性能，细菌明显发生破裂。
35.通过本发明的一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的方法，制备出的聚合物刷pagc8相较于传统非原位表征方法制备出的聚合物刷pagc8，具有更加可控的制备过程，可获得更高的接枝密度（表2），提高杀菌效率（表1）。
36.表2： 接枝密度（分子链/nm2）本实施例制备的pagc80.40传统方法制备的pagc80.28通过本发明的一种基于原位表征技术实时监测制备抗菌材料的制备抗菌材料的方法，可以节省大量实验时间，得出最优的惰性/活性引发基团比例，在其它实施例中，也可以通过改变其它反应条件，来对制备过程进行精确的调控，提高接枝密度和抗菌效率。
37.非脱氧条件下的si-atrp反应过程具有非常严格的制备条件与复杂的液相环境，仅凭非原位表征技术很难获得聚合物刷生长过程的实际变化情况，直接影响聚合物刷表面结构的精确控制与表面性能的提高。本发明中的聚合反应不需要密封环境，反应液中添加的葡萄糖氧化酶/葡萄糖/丙酮酸钠体系作为除氧体系，可实时去除反应容器中的氧气，保证聚合反应在原位监测的过程中实时进行。
38.本发明创新性地采用原位监测装置对聚合物刷生长过程进行实时监测与精确调控，利用葡萄糖氧化酶/葡萄糖/丙酮酸钠还原脱氧体系消耗聚合反应中的氧气和过氧化氢，实现阳离子型两亲聚合物刷表面的可控构建，并且通过调节基底表面引发剂比例进一步调控聚合物刷表面接枝密度，获得结构致密的超高效抗菌功能表面，将杀菌效率提高至99.9%。
39.本发明相较于传统的方法检测制备聚合物刷抗菌材料，具有实现对聚合物刷生长过程的实时监测与精准调控的优点，可以在节约大量实验时间的情况下，得到最优的抗菌材料制备条件，提高了表面接枝密度，提升了聚合物刷功能表面的杀菌效率，在高分子抗菌材料领域，对社会的医疗卫生具有重大的贡献。
40.以上这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。