一种基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法与流程

技术特征：
1.数字微流控芯片，其特征在于，包括细菌捕获及裂解单元、液滴生成通道、储液池单元和电极接口；所述储液池单元的数量不低于5个，分别存储有裂解试剂a、裂解试剂b、中和液、扩增试剂和菌液；其中，裂解试剂a包括：800～2400u/μl溶菌酶、400～1200mm二硫苏糖醇和2～6mm乙二胺四乙酸；裂解试剂b包括：300～500mm koh、80～120mm二硫苏糖醇和5～15mm乙二胺四乙酸；中和液包括：0.8～1.2m tris-hcl溶液；扩增试剂包括：随机引物、dna聚合酶、dntp、扩增缓冲液和二硫苏糖醇。2.根据权利要求1所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述扩增试剂中的dna聚合酶包括：vent dna聚合酶、t7 dna聚合酶、t4 dna聚合酶、dna聚合酶i、sulfolobus dna聚合酶iv、phi29 dna聚合酶、bst dna聚合酶、equiphi29 dna聚合酶中的任意一种或两种以上的组合。3.根据权利要求1或2所述的数字微流控芯片，其特征在于，还包括荧光染料、填充油和纯化试剂；所述荧光染料选自pi、dapi，syto-9,fm 1-43fx,fm 4-64,fm 4-64fx,bacligh bacterial stains,alexa fluor 647nhs ester,celltracker
tm
红色cmtpx或fm 1-43；所述填充油选自矿物油、氟油、硅烷油、二甲基硅油；所述纯化试剂选自柱纯化试剂或磁珠纯化试剂。4.根据权利要求1～3任一项所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述的裂解试剂a、裂解试剂b、中和液的体积比为1:(1～1.5):(1～1.5)；所述扩增试剂与裂解试剂a、裂解试剂b和中和液的混合液的体积比为1:6.5。5.根据权利要求1所述的数字微流控芯片，所述细菌捕获及裂解单元包括：上极板基底，设置在所述上极板基底下表面的ito涂层，设置于所述ito涂层下表面的上疏水层；下极板基底，设置于所述下极板基底上表面的介质层，嵌设于所述介质层内的电极，设置在所述介质层上表面的下疏水层，支撑于所述下疏水层和所述上疏水层之间的支撑体，所述上疏水层、所述下疏水层和所述支撑体之间形成液滴生成通道，所述下疏水层嵌设有亲水凹槽，所述亲水凹槽的上槽口与所述液滴生成通道相通；所述液滴生成通道的通口与所储液池单元连通；所述电极接口与所述电极相连接。6.根据权利要求5所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述亲水凹槽为中空的圆柱形结构，直径为150～300μm，与每个储液池皆有2个电极以上的距离。7.根据权利要求5所述的数字微流控芯片，其特征在于，所述的储液池尺寸为1mm
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1mm，所述储液池直径与通道直径的比例为(5～8)：1。8.数字微流控装置，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的数字微流控芯片、集成电路和成像系统；所述的集成电路与数字微流控芯片的电极接口相连。9.单细菌基因组测序的方法，其特征在于，包括权利要求1～7任一项所述的数字微流控芯片，和/或权利要求8所述的数字微流控装置进行单细菌的分离捕获、核酸扩增、文库构建和基因组测序。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，具体包括：菌液经染色后，置于数字微流控芯片的储液池中，以填充油封闭芯片后，集成电路控制
电极通断电，使菌液通过液滴生成通道移动至亲水凹槽，分离捕获单个细菌；控制电极通断电，依次使裂解试剂a、裂解试剂b、中和液和扩增试剂通过液滴生成通道进入亲水凹槽，然后进行扩增；将扩增产物经纯化、文库构建后，进行测序。

技术总结
本发明涉及单细菌测序领域，具体涉及一种基于数字微流控技术的单细菌基因组测序方法。本发明开发了基于全自动数字微流控平台(DMF)的适用于单细菌的微型裂解体系、数字微流控芯片及单细菌基因组测序技术，实验结果表明，裂解体系单细菌细胞裂解迅速、基因完整度好、组装效率及基因覆盖度高；同时该裂解体系及基于该裂解体系的微流控芯片与DMF的联用，减少了试剂的损耗，降低了样品污染风险、提高了反应效率、减小了扩增偏差，使之更适用于单细菌基因组测序。因组测序。


技术研发人员：张惠敏 郭俊南 杨朝勇 朱志
受保护的技术使用者：嘉庚创新实验室
技术研发日：2022.08.17
技术公布日：2022/10/18