一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法与流程

1.本发明属于土壤酶活测定技术领域，尤其涉及一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法。


背景技术：

2.根系分泌物是联系植物-土壤微生物的桥梁。植物生长过程中根系释放的根系分泌物会使得根周围的物质能量交换较为活跃并在根际形成明显的热区，造成土壤中酶活性的分布具有空间异质性，即酶活性随距根的距离增加而降低。原位酶谱技术可以清晰的了解这一过程，其原理是通过对土壤表面覆膜处理，土壤中的活性酶氧化分解膜中携带的由荧光染料和相应底物合成的特定荧光底物，从而产生荧光信号并在聚酰胺膜上显影的过程。
3.原位酶谱作为一种原位测试土壤酶活的技术，其常用于确定种植植物土壤中植物根系周围形成的酶活性热区，但没有种植植物情况下仅通过直接添加根系分泌物至土壤中无法通过使用原位酶谱技术来确定土壤原位酶活性空间分布和根际热区。并且原位酶谱技术作为原位检测技术，需要将植物种植在活动透明根窗的根盒中，从而观察到清晰健壮的根系时即可进行原位酶谱实验，因此原位酶谱往往需要可拆卸的根箱。
4.现有的根箱装置设计为玻璃材质，可拆卸面板与根箱的结合通过螺丝钉连接，但此方案会造成根箱笨重不易挪动，拆卸不便的问题，且面板与根箱拆卸时，土壤颗粒粘连在前面板上，影响实际成像效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种操作简单测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法
6.本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法，所述方法包括如下步骤：
7.s1、在根箱中装填风干土壤后水平放置，将人工根放置于土壤表面后覆盖聚乙烯膜并加盖前面板；
8.s2、加纯水调整土壤含水量，然后进行黑暗培养；
9.s3、利用人工根释放根系分泌物；
10.s4、重复10-15天步骤s3，维持土壤含水量并进行黑暗培养；
11.s5、打开前面板并揭下聚乙烯膜，将携带有荧光标记酶底物的聚酰胺膜覆盖在土壤表面进行培养，然后在避光条件下将聚酰胺膜转移至暗室中，在紫光灯条件下进行酶活性测定。
12.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，土壤含水量为田间持水量的55-65％。本发明控制含水量至田间持水量的55-65％为培养土壤好氧微生物的最适水分，此含水量有助于使土壤微生物保持较强的活性，使土壤酶活性的变化不受土壤含
水量的影响。
13.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，黑暗培养温度为23-28℃。
14.作为优选，步骤s2黑暗培养时间为5-10天。先进行5-10天的黑暗培养可以尽可能恢复土壤的微生物活性。
15.本发明将温度控制在23-28℃是最适应土壤微生物生长的温度，此温度有助于使微生物保持较强的活性，从而保证土壤酶活性的变化不受到温度的影响。
16.步骤s4经过10-15天的重复释放根系分泌物和黑暗培养可以保证输入的根系分泌物在人工根周围形成浓度梯度。
17.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，根系分泌物为浓度180-220μmol c ml-1
的葡萄糖、草酸和酒石酸中的至少一种。
18.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，携带有荧光标记酶底物的聚酰胺膜的制备方法为：将聚酰胺膜浸泡于1-5mm的酶底物溶液中，干燥获得。
19.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，酶底物包括葡萄糖苷酶底物、木聚糖酶底物、磷酸酶底物中的一种。
20.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，步骤s5培养时间为0.5-1.5h。本发明需要严格控制携带有荧光标记酶底物的聚酰胺膜覆盖在土壤表面进行培养的时间，培养时间过短，土壤中的酶不能充分与聚酰胺膜上的酶底物反应，从而低估了土壤中的酶活性。培养时间过长，土壤中的酶与聚酰胺膜上的酶底物过度反应，导致土壤中的酶活性被过度激发，无法展现出土壤中真实的酶活性空间分布。
21.在上述的一种测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法中，根箱包括：
22.框体，其周缘处上形成有“u”形连接部，所述连接部上设置有若干个第一磁铁；
23.侧板，所述侧板上均匀设置有若干个第二磁铁，所述侧板与所述连接部之间夹设有聚乙烯膜，当所述第二磁铁与所述第一磁铁吸附贴靠时，所述框体、所述连接部、所述聚乙烯膜及所述侧板形成根箱；
24.人工根，其插设于所述根箱，所述人工根上设置有出液口。
25.作为优选，“u”形连接部上均匀开设有若干透气孔。
26.作为优选，框体、所述连接部及所述侧板均为亚克力材质。
27.作为优选，人工根上连接有注射器用于注射根系分泌物。
28.与现有技术相比，本发明试剂盒具有如下优点：
29.本发明根箱可拆卸一侧设计为磁吸式，在原位酶谱实验操作过程中易于拆卸，达到快速覆膜揭膜的目的尽可能避免由于操作时间过长而影响实验结果，并且采用人工根直接输入根系分泌物不仅可以避免由于没有植物种植的情况下土壤难以形成酶活性热区的情况，还能避免植物根系释放的酶对土壤酶活性造成的影响，利用聚乙烯膜防止土壤水分径流，并防止土壤颗粒粘连在前面板上，避免酶谱覆膜过程中污染膜背面，影响实际成像效果；本发明利用特制根箱测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法操作简单适用于基本土壤培养实验。
附图说明
30.图1是实施例1根箱的结构示意图。
31.图中，1、框体；2、连接部；3、第一磁铁；4、侧板；5、第二磁铁；6、聚乙烯膜；7、人工根；8、透气孔；9、注射器。
32.图2为实施例1土壤木聚糖酶的活性空间分布图；
33.图3为实施例2土壤磷酸酶的活性空间分布图；
34.图4为实施例3土壤葡萄糖糖苷酶的活性空间分布图。
具体实施方式
35.以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
36.实施例1：
37.s1、在根箱中装填来自浙江省台州市电子垃圾拆解场周围的农田风干土壤后水平放置，将人工根放置于土壤表面后覆盖聚乙烯膜并加盖前面板；
38.s2、加纯水调整土壤含水量为田间持水量的60％，然后进行在25℃下黑暗预培养7天以复原土壤中微生物的活性；
39.s3、利用人工根释放根系分泌物；根系分泌物为浓度200μmol c ml-1
草酸溶液；
40.s4、重复15天步骤s3并维持土壤含水量在田间持水量的60％在25℃黑暗条件下培养；
41.s5、打开前面板揭下聚乙烯膜后，将携带有荧光标记木聚糖酶底物的聚酰胺膜覆盖在土壤表面进行培养1h，然后在避光条件下转移至暗室中，在紫光灯条件下进行酶活性测定。
42.携带有荧光标记木聚糖酶底物的聚酰胺膜通过将聚酰胺膜浸泡于2mm的木聚糖酶底物溶液中然后干燥获得。
43.实施例2：
44.s1、在根箱中装填来自浙江省台州市电子垃圾拆解场周围的农田风干土壤后水平放置，将人工根放置于土壤表面后覆盖聚乙烯膜并加盖前面板；
45.s2、加纯水调整土壤含水量为田间持水量的60％，然后进行在25℃下黑暗预培养7天以复原土壤中微生物的活性；
46.s3、利用人工根释放根系分泌物；根系分泌物为浓度200μmol c ml-1
酒石酸溶液：
47.s4、重复15天步骤s3并维持土壤含水量在田间持水量的60％在25℃黑暗条件下培养；
48.s5、打开前面板揭下聚乙烯膜后，将携带有荧光标记磷酸酶底物的聚酰胺膜覆盖在土壤表面进行培养1h，然后在避光条件下转移至暗室中，在紫光灯条件下进行酶活性测定。
49.携带有荧光标记磷酸酶底物的聚酰胺膜通过将聚酰胺膜浸泡于2mm的磷酸酶底物溶液中然后干燥获得。
50.实施例3：
51.s1、在根箱中装填来自浙江省台州市电子垃圾拆解场区的风干土壤后水平放置，
将人工根放置于土壤表面后覆盖聚乙烯膜并加盖前面板；
52.s2、加纯水调整土壤含水量为田间持水量的60％，然后进行在25℃下黑暗预培养7天以复原土壤中微生物的活性；
53.s3、利用人工根释放根系分泌物；根系分泌物为浓度200μmol c ml-1
葡萄糖溶液：
54.s4、重复15天步骤s3并维持土壤含水量在田间持水量的60％在25℃黑暗条件下培养；
55.s5、打开前面板揭下聚乙烯膜后，将携带有荧光标记葡萄糖苷酶底物的聚酰胺膜覆盖在土壤表面进行培养1h，然后在避光条件下转移至暗室中，在紫光灯条件下进行酶活性测定。
56.携带有荧光标记葡萄糖苷酶底物的聚酰胺膜通过将聚酰胺膜浸泡于2mm的葡萄糖苷酶底物溶液中然后干燥获得。
57.图1是实施例1根箱的结构示意图，图中，1、框体；2、连接部；3、第一磁铁；4、侧板；5、第二磁铁；6、聚乙烯膜；7、人工根；8、透气孔；9、注射器；如图1所示，本用于测定无植物种植土壤原位酶活性的土壤根箱，包括：框体1，其周缘处上形成有连接部2，连接部2上设置有若干个第一磁铁3；侧板4，侧板4上均匀设置有若干个第二磁铁5，侧板4与连接部2之间夹设有聚乙烯膜6，当第二磁铁5与第一磁铁3吸附贴靠时，框体1、连接部2、聚乙烯膜6及侧板4形成根箱；人工根7，其插设于根箱，人工根7上设置有出液口。
58.人工将聚乙烯膜6放置在连接部2上，侧板4上设置的第二磁铁5与连接部2上设置的第一磁铁3相互磁性吸附，将聚乙烯膜6夹于侧板4与连接部2之间形成一个长宽高为10
×1×
14cm的根箱，聚乙烯膜6与框体1之间形成有测定空间，人工将土壤倒入至测定空间内，将土壤在测定空间内填充高度为11cm，人工根7即土壤溶液采样器的长度为10cm，将人工根7插入土壤中，再对人工根7添加可以根系分泌物，分泌物从人工根7底端设有的出液口流出，进而模拟表层土壤中植物根系的延伸，即原位酶谱实验，培养过程结束后，扳动侧板4，使侧板4上的第二磁铁5与连接部2上的第一磁铁3脱离吸附，将侧板4与连接部2之间夹设的聚乙烯膜6取下，接着对土壤表面快速覆膜揭膜，从而得到实验结果。
59.连接部2呈“u”形。
60.连接部2呈“u”形，框体1通过连接部2及侧板4形成具有测定空间的根箱，将土壤导入至测定空间内即便于后续的原位酶谱实验。
61.连接部2上均匀开设有若干透气孔8。
62.透气孔8为土壤呼吸孔，通气孔的直径为2mm，设置通气孔以保证土壤中的空气含量，即便于后续的原位酶谱实验。
63.框体1、连接部2及侧板4均为亚克力材质。
64.框体1、连接部2及侧板4形成根箱，相比于现有玻璃材质的根箱，这种根箱更加轻巧便捷，防摔防撞，便于搬运。
65.人工根7上连接有注射器9用于注射根系分泌物。
66.注射器9可直接将人工配置的根系分泌物溶液注入人工根7内，人工根7释放至土壤中用以模拟植物生长过程中将根系分泌物释放至土壤的过程。
67.图2为实施例1土壤木聚糖酶的活性空间分布图，从图中可知，其酶活性的空间分布在人工根周围形成梯度分布，表现为随根距离增加酶活性降低。
68.图3为实施例2土壤磷酸酶的活性空间分布图，从图中可知，其酶活性的空间分布在人工根周围形成梯度分布，表现为随根距离增加酶活性降低。
69.图4为实施例3土壤葡萄糖糖苷酶的活性空间分布图，从图中可知，其酶活性的空间分布并未在人工根周围形成梯度分布。
70.综上所述，本发明根箱可拆卸一侧设计为磁吸式，在原位酶谱实验操作过程中易于拆卸，达到快速覆膜揭膜的目的尽可能避免由于操作时间过长而影响实验结果，并且采用人工根直接输入根系分泌物不仅可以避免由于没有植物种植的情况下土壤难以形成酶活性热区的情况，还能避免植物根系释放的酶活对土壤酶活性造成的影响，利用聚乙烯膜防止土壤水分径流，并防止土壤颗粒粘连在前面板上，避免酶谱覆膜过程中污染膜背面，影响实际成像效果；本发明利用特制根箱测定无植物种植的土壤中原位酶活性的方法操作简单适用于基本土壤培养实验。
71.本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内，并且本发明方案所有涉及的参数间如未特别说明，则相互之间不存在不可替换的唯一性组合。
72.本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
73.尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。