一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.苯丙酮尿症(phenylketonuria,pku)是一种常见的氨基酸代谢障碍性疾病,属常染色体隐性遗传病,该病的主要致病原因是苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，pah)活性的降低或缺失导致苯丙氨酸在肝脏中的代谢紊乱，使得苯丙氨酸不能正常代谢为酪氨酸，在血液中堆积。苯丙酮尿症患者的血液和组织中苯丙氨酸浓度增高，使得苯丙氨酸的旁路代谢途径代偿性增加，神经毒性物质过度积累，导致患者出现发育迟缓、智力障碍、语言障碍、癫痫抽搐、小头畸形、孤独症等不同程度的神经伤害。
3.苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，pah)又称苯丙氨酸-4-单加氧酶，是一种由苯丙氨酸形成的酪氨酸加氧酶，其编码基因位于12号常染色体(参考genbank登陆号：ng_008690.2)。苯丙氨酸羟化酶基因全长171kb，其中包含内含子12个，外显子13个，可编码翻译成451个氨基酸的多肽，经折叠聚合可形成有功能的苯丙氨酸羟化酶。一般认为,pku是由于苯丙氨酸羟化酶基因突变引起pah蛋白功能损坏或丧失而导致的,pah基因中细微的改变都会引起酶蛋白三维结构的改变,并可造成pah活性降低甚至完全丧失,导致在临床上产生pku病患。绝大部分pah缺乏或活性降低的病因在于pah基因的点突变，pah基因的点突变分布广泛，在12个内含子的上下游非编码区和13个外显子区域均有发现，不同点突变可造成不同程度的苯丙酮尿症临床表型，并且pah基因具有突变异质性,不同种族与地区的突变位点及分布有较大差异。
4.目前检测基因点突变的方法有多种，如：溶解曲线法、特异性荧光探针法、测序法、芯片法。其中特异性荧光探针法是利用高特异性探针对目标序列进行检测，在检测单突变位点方面，特异性荧光探针法与其他方法相比具有特异性高、灵敏度高、时间短、操作简单、对检测设备要求不高的优点，但是高灵敏度特性导致该方法容易受到气溶胶的污染。目前临床上尚无使用特异性荧光探针法检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的试剂盒，而使用特异性荧光探针法准确检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的关键需要解决引物与探针的特异性和检测试剂的抗污染能力。因此，建立一套快速、准确、特异、灵敏、方便、稳定的分子检测方法，可以为pku的研究提供快速高效的分子工具，在pku的筛查、早期诊断与治疗方面具有潜在的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、准确、特异、灵敏和/或方便地检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的组合物、试剂和/或试剂盒；苯丙氨酸羟化酶基因突变检测方法、抗气溶胶干扰的方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员
通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的组合物，所述组合物包括：611a上游引物、611g上游引物、611下游引物、728g上游引物、728a上游引物、728下游引物、1068c上游引物、1068a上游引物、1068下游引物、611探针、728探针和1068探针，其中：
7.所述611a上游引物是核苷酸序列是seq id no.1的单链dna；
8.所述611g上游引物是核苷酸序列是seq id no.2的单链dna；
9.所述611下游引物是核苷酸序列是seq id no.3的单链dna；
10.所述728g上游引物是核苷酸序列是seq id no.4的单链dna；
11.所述728a上游引物是核苷酸序列是seq id no.5的单链dna；
12.所述728下游引物是核苷酸序列是seq id no.6的单链dna；
13.所述1068c上游引物是核苷酸序列是seq id no.7的单链dna；
14.所述1068a上游引物是核苷酸序列是seq id no.8的单链dna；
15.所述1068下游引物是核苷酸序列是seq id no.9的单链dna；
16.所述611探针是核苷酸序列是seq id no.10的单链dna；
17.所述728探针是核苷酸序列是seq id no.11的单链dna；
18.所述1068探针是核苷酸序列是seq id no.12的单链dna。
19.所述用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的组合物可为用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点a611g(位于外显子6)、g728a(位于外显子7)和c1068a(位于外显子11)的组合物。
20.所述611a上游引物、611g上游引物、611下游引物和611探针用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点a611g；
21.所述728g上游引物、728a上游引物、728下游引物和728探针用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点g728a；
22.所述1068c上游引物、1068a上游引物、1068下游引物和1068探针用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点c1068a。
23.上述组合物中，所述组合物还包括用于检测内参基因的上游引物、用于检测内参基因的下游引物和用于检测内参基因的探针，所述内参基因为人vps29基因(genbank登陆号：nm_016226.5)。
24.所述用于检测内参基因的上游引物名称为vps29上游引物；所述用于检测内参基因的下游引物名称为vps29下游引物；所述用于检测内参基因的探针名称为vps29探针。
25.上述组合物中，所述用于检测内参基因的上游引物是核苷酸序列是seq id no.13的单链dna；所述用于检测内参基因的下游引物是核苷酸序列是seq id no.14的单链dna；所述用于检测内参基因的探针是核苷酸序列是seq id no.15的单链dna。
26.上述组合物中，所述611探针、所述728探针、所述1068探针和所述用于检测内参基因的探针(vps29探针)的5’端可标记荧光基团，3’端可标记淬灭基团。
27.所述荧光基团选自fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red640、lc red705、quasar705或texas red中的至少一种。
28.所述淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。
29.在本发明的一个实施方案中，所述611探针、728探针和1068探针的5’端标记fam，3’端标记bhq1；所述vps29探针的5’端标记vic，3’端标记bhq1。
30.所述组合物中，611a上游引物、611g上游引物、611下游引物、728g上游引物、728a上游引物、728下游引物、1068c上游引物、1068a上游引物、1068下游引物、611探针、728探针和1068探针的物质的量可以相同。
31.本发明还提供了用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的试剂，所述试剂包含所述组合物。
32.进一步地，所述试剂还包含尿嘧啶-n-糖基化酶和dutp。
33.进一步地，所述试剂还包含taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg
2
中的一种或多种。
34.进一步地，所述试剂还包含野生型对照品和突变型对照品，其中野生型对照品可为包含611位点的野生型外显子6dna、包含728位点的野生型外显子7dna和包含1068位点的野生型外显子11dna；突变型对照品可为包含611位点的突变型外显子6dna、包含728位点的突变型外显子7dna和包含1068位点的突变型外显子11dna。
35.所述包含611位点的野生型外显子6dna是包含611位点的核苷酸为a的长度为108079-108275bp的苯丙氨酸羟化酶基因片段，所述611位点是refsnp id为rs62514927的snp(单核苷酸多态性)。所述包含728位点的野生型外显子7dna是包含728位点的核苷酸为g的长度为110461-110609bp的苯丙氨酸羟化酶基因片段，所述728位点是refsnp id为rs62508588的snp(单核苷酸多态性)。所述包含1068位点的野生型外显子11dna是包含1068位点的核苷酸为c的长度为119614-119716bp的苯丙氨酸羟化酶基因片段，所述1068位点是refsnp id为rs62516095的snp(单核苷酸多态性)。
36.所述包含611位点的突变型外显子6dna是包含611位点的核苷酸为g的长度为108079-108275bp的苯丙氨酸羟化酶基因片段，所述包含728位点的突变型外显子7dna是包含728位点的核苷酸为a的长度为110461-110609bp的苯丙氨酸羟化酶基因片段，所述包含1068位点的突变型外显子11dna是包含1068位点的核苷酸为a的长度为119614-119716bp的苯丙氨酸羟化酶基因片段。
37.本发明还提供了含有所述组合物或所述试剂的试剂盒。
38.所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
39.本发明还提供了所述组合物或所述试剂在制备检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的产品(如试剂盒)中的应用。
40.本发明还提供了一种检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的方法，所述方法包括如下步骤：
41.a1)提取待测样品dna；
42.a2)以所述dna为模板，利用所述组合物或所述试剂进行pcr检测；
43.a3)根据检测结果判定丙氨酸羟化酶基因是否发生突变。
44.上述方法中，所述pcr检测的条件可为：20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～30秒，62～65℃，10～40秒，荧光信号采集，35～45个循环。
45.所述待测样品类型可为血液或组织。
46.上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
47.本发明还提供了所述组合物或所述试剂盒的下述任一种应用：
48.b1)在检测苯丙氨酸羟化酶基因突变中的应用；
49.b2)在制备用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变的产品中的应用；
50.b3)在制备用于诊断或辅助诊断苯丙酮尿症的产品中的应用；
51.b4)在制备用于苯丙酮尿症筛查的产品中的应用。
52.本发明中，所述苯丙氨酸羟化酶基因突变为611位点突变、728位点突变和/或1068位点突变，所述611位点突变是refsnp id为rs62514927的一个snp(单核苷酸多态性)，所述728位点突变是refsnp id为rs62508588的一个snp(单核苷酸多态性)，所述1068位点突变是refsnp id为rs62516095的一个snp(单核苷酸多态性)。
53.所述611位点突变位于苯丙氨酸羟化酶基因的外显子6中，所述728位点突变位于苯丙氨酸羟化酶基因的外显子7中，所述1068位点突变位于苯丙氨酸羟化酶基因的外显子11中。
54.本发明所述试剂盒使用的酶混合液包含ung酶和taq酶，其中ung酶的浓度为1u/μl，taq酶的浓度为1u/μl。
55.所述试剂盒中还包含野生型对照品和突变型对照品。其中野生型对照品包含浓度均为10ng/μl的611位点的野生型dna、728位点的野生型dna和1068位点的野生型dna；突变型对照品包含浓度均为10ng/μl的611位点的突变型dna、728位点的突变型dna、1068位点的突变型dna。
56.所述试剂盒可包括野生型反应体系和突变型反应体系，所述野生型反应体系包括611a上游引物、611下游引物、728g上游引物、728下游引物、1068c上游引物、1068下游引物、611探针、728探针、1068探针；vps29上游引物、vps29下游引物和vps29探针；
57.所述突变型反应体系包括：611g上游引物、611下游引物、728a上游引物、728下游引物、1068a上游引物、1068下游引物、611探针、728探针和1068探针；vps29上游引物、vps29下游引物和vps29探针。
58.所述试剂盒检测的反应体系为25μl，野生型反应体系中加入20μl的野生型pcr反应液、1μl酶混合液和4μl的样本或野生型对照品，突变型反应体系中加入20μl的突变型pcr反应液、1μl酶混合液和4μl的样本或突变型对照品，同时，每次检测时还需设置野生型反应体系的空白对照和突变型反应体系的空白对照，即野生型pcr反应液和突变型pcr反应液中各加入1μl酶混合液和4μl的超纯水。
59.所述pcr检测的pcr反应程序为：20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～30秒，62～65℃，10～40秒，荧光信号采集，35～45个循环。
60.所述根据检测结果判定丙氨酸羟化酶基因是否发生突变可为根据
△
ct进行判断，标准如下：
61.表1结果判定标准
[0062][0063][0064]
与现有技术相比，本发明涉及的检测试剂盒，有如下有益效果和显著进步：
[0065]
①
准确性高：选用的内参基因和检测基因位于同一条染色体上，保证了染色体复制中的同一性，从源头上降低了核酸提取效率的差异，从而保证了使用
△
ct进行结果判读的准确性；
[0066]
②
抗污染能力强：本试剂盒使用了ung酶/dutp抗污染体系，能够有效地降低气溶胶污染，进而降低假阳性结果的产生；
[0067]
③
检测速度快：本发明提供的试剂盒中的野生型pcr反应液和突变型pcr反应液均为预混反应液，检测时仅需分装至反应管并加入样本或对照品即可。检测单个核酸样本时操作员操作时间不超过5分钟，整个pcr反应过程不超过50分钟，与临床上使用的测序法、芯片法相比大大缩短了检测时间；
[0068]
④
对仪器性能要求低：本发明采用的特异性荧光探针法对仪器的性能要求比溶解曲线法、测序法、芯片法对仪器的性能要求最低。
[0069]
综上所述：本发明提供的检测苯丙氨酸羟化酶基因突变检测试剂盒及其检测方法具有检测结果特异性高、抗污染能力强、检测速度快和对仪器性能要求低的优点。使用该试剂盒，可以在体外准确地检出患者血液样本中苯丙氨酸羟化酶基因的突变。
附图说明
[0070]
图1为实施例3中611位点野生型反应体系的roc曲线。
[0071]
图2为实施例3中611位点突变型反应体系的roc曲线。
[0072]
图3为实施例3中728位点野生型反应体系的roc曲线。
[0073]
图4为实施例3中728位点突变型反应体系的roc曲线。
[0074]
图5为实施例3中1068位点野生型反应体系的roc曲线。
[0075]
图6为实施例3中1068位点突变型反应体系的roc曲线。
[0076]
图7为实施例4中611位点野生型临床样本的扩增曲线。
[0077]
图8为实施例4中611位点纯合突变型临床样本的扩增曲线。
[0078]
图9为实施例4中611位点杂合突变型临床样本的扩增曲线。
[0079]
图10为实施例4中728位点野生型临床样本的扩增曲线。
[0080]
图11为实施例4中728位点纯合突变型临床样本的扩增曲线。
[0081]
图12为实施例4中728位点杂合突变型临床样本的扩增曲线。
[0082]
图13为实施例4中1068位点野生型临床样本的扩增曲线。
[0083]
图14为实施例4中1068位点纯合突变型临床样本的扩增曲线。
[0084]
图15为实施例4中1068位点杂合突变型临床样本的扩增曲线。
[0085]
图16为611位点野生型的测序图。
[0086]
图17为611位点纯合突变型的测序图。
[0087]
图18为611位点杂合突变型的测序图。
[0088]
图19为728位点野生型的测序图。
[0089]
图20为728位点纯合突变型的测序图。
[0090]
图21为728位点杂合突变型的测序图。
[0091]
图22为1068位点野生型的测序图。
[0092]
图23为1068位点纯合突变型的测序图。
[0093]
图24为1068位点杂合突变型的测序图。
具体实施方式
[0094]
本发明提供了一种检测苯丙氨酸羟化酶基因点突变的方法：在同一个pcr反应体系中同时扩增靶基因和内参基因，计算靶基因和内参基因的ct值差，即
△
ct＝靶基因的ct值-内参基因的ct值。判断基因是否发生突变，需要综合野生型反应体系的
△
ct值和突变型反应体系的
△
ct值。该方法引入了统一的内参，降低了不加内参基因时使用两个反应管带来的外界因素的干扰，也降低了将野生型引物和探针与突变型引物和探针放于同一个反应体系时引物间的竞争关系导致的假阴性的概率。
[0095]
本发明将我国突变率较高苯丙氨酸羟化酶基因点突变作为靶基因分别设计引物和探针序列。所述靶基因位点位于在外显子6、外显子7和外显子11区域。每个点突变的检测需要3条引物、1条探针。
[0096]
使用人的vps29基因作为内参基因并设计引物和探针序列。所述内参基因为人的管家基因，基因中的部分序列高度保守。临床上可用于检测苯丙氨酸羟化酶基因的样本为血液样本，vps29基因同样位于12号常染色体上，降低了核酸提取过程中因为内参基因位于不同染色体上可能引起的提取效率的差异。
[0097]
本发明中引物和探针合成均为现有技术，其中探针序列3’端标记荧光淬灭基团，如bhq或mgb，探针序列5’端标记荧光报告基团，如fam、joe、vic、hex、rox、cy3或cy5。
[0098]
本发明采用了一种抗气溶胶污染的检测系统，所述系统由尿嘧啶-n-糖基化酶(ung：uracil-n-glycosylase)和dutp组成。所述ung酶是生物体内的一种重要的dna修复酶。该酶能准确识别与胸腺嘧啶只差一个甲基的尿嘧啶，在dna复制过程中识别并切除错配的尿嘧啶，同时在高温下短时间内ung酶即可发生不可逆的失活。正是利用ung酶的以上两种特性，可以有效地消除气溶胶污染。
[0099]
基于本发明的关键技术，本发明提供了一种新的苯丙氨酸羟化酶基因突变检测试剂盒，所述试剂盒的反应组份包括野生型对照品、突变型对照品、酶混合液、611野生型pcr
反应液和611突变型pcr反应液、728野生型pcr反应液和728突变型pcr反应液、1068野生型pcr反应液和1068突变型pcr反应液。所述野生型对照品包含611位点野生型dna、728位点的野生型dna、1068位点野生型dna。所述突变型对照品包含611位点突变型dna、728位点的突变型dna、1068位点突变型dna。所述酶混合液包含taq酶和ung酶。所述pcr反应液含有前述靶位点的上下游引物和探针、vps29基因的上下游引物和探针、datp、dttp、dgtp、dctp、dutp、pcr缓冲液、mgcl2。
[0100]
为实现该目标，本发明以检测苯丙氨酸羟化酶基因突变试剂盒为例，技术方案如下：
[0101]
本试剂盒对728位点设计扩增引物对，参考的苯丙氨酸羟化酶基因的genbank登陆号为：ng_008690.2。引物序列如下：
[0102]
611a上游引物：5
’‑
ttgtataaaacccatgcttgcta-3’(seq id no.1)
[0103]
611g上游引物：5
’‑
ttgtataaaacccatgcttgctg-3’(seq id no.2)
[0104]
611下游引物：5
’‑
tctgcaggaactgagaaacgtc-3’(seq id no.3)
[0105]
728g上游引物：5
’‑
cttgcactggtttccgcctccg-3’(seq id no.4)
[0106]
728a上游引物：5
’‑
cttgcactggtttccgcctcca-3’(seq id no.5)
[0107]
728下游引物：5
’‑
ggacagtactcacggttcgg-3’(seq id no.6)
[0108]
1068c上游引物：5
’‑
ttcacttggggcctacagtac-3’(seq id no.7)
[0109]
1068a上游引物：5
’‑
ttcacttggggcctacagtaa-3’(seq id no.8)
[0110]
1068下游引物：5
’‑
gctggaactccgtgacagtg-3’(seq id no.9)
[0111]
在上、下游引物扩增序列间设计检测用的taqman探针，探针序列如下：
[0112]
611探针：5
’‑
ctgtggcttccatgaagata-3’(seq id no.10)
[0113]
728探针：5
’‑
ctgtggctggcctgcttt-3’(seq id no.11)
[0114]
1068探针：5
’‑
cagagaagccaaagcttc-3’(seq id no.12)
[0115]
探针的5’端荧光修饰基团为fam、joe、vic、hex、rox、cy3或cy5等，3’端淬灭修饰基团为bhq或mgb。
[0116]
选用看家基因人的vps29(genbank登陆号：nm_016226.5)作为内标，设计上下引物和taqman探针，对应序列如下：
[0117]
vps29上游引物：5
’‑
gtgtcccgagataagaatg-3’(seq id no.13)
[0118]
vps29下游引物：5
’‑
ctctggctggtgatgttc-3’(seq id no.14)
[0119]
vps29探针：5
’‑
cttagccctgttgcagaggca-3’(seq id no.15)
[0120]
探针的5’端荧光修饰基团为fam、joe、vic、hex、rox、cy3或cy5等，3’端淬灭修饰基团为bhq或mgb。
[0121]
使用上述引物和探针配制试剂盒中的野生型pcr反应液和突变型pcr反应，其中各组分浓度如下：
[0122]
表2 611位点野生型pcr反应液
[0123][0124]
表3 611位点突变型pcr反应液
[0125][0126][0127]
表4 728位点野生型pcr反应液
[0128][0129]
表5 728位点突变型pcr反应液
[0130][0131]
表6 1068位点野生型pcr反应液
[0132][0133]
表7 1068位点突变型pcr反应液
[0134][0135]
本试剂盒使用的酶混合液包含ung酶和taq酶，其中ung酶的浓度为1u/μl，taq酶的浓度为1u/μl。
[0136]
本试剂盒中还包含野生型对照品和突变型对照品。其中野生型对照品包含浓度均为10ng/μl的611位点的野生型dna、728位点的野生型dna和1068位点的野生型dna；突变型对照品包含浓度均为10ng/μl的611位点的突变型dna、728位点的突变型dna、1068位点的突变型dna。
[0137]
所述试剂盒可包括野生型反应体系和突变型反应体系，所述野生型反应体系包括611a上游引物、611下游引物、728g上游引物、728下游引物、1068c上游引物、1068下游引物、611探针、728探针、1068探针；vps29上游引物、vps29下游引物和vps29探针；
[0138]
所述突变型反应体系包括：611g上游引物、611下游引物、728a上游引物、728下游引物、1068a上游引物、1068下游引物、611探针、728探针和1068探针；vps29上游引物、vps29下游引物和vps29探针。
[0139]
本试剂盒检测的反应体系为25μl，野生型反应体系中加入20μl的野生型pcr反应液、1μl酶混合液和4μl的样本或野生型对照品，突变型反应体系中加入20μl的突变型pcr反应液、1μl酶混合液和4μl的样本或突变型对照品，同时，每次检测时还需设置野生型反应体系的空白对照和突变型反应体系的空白对照，即野生型pcr反应液和突变型pcr反应液中各加入1μl酶混合液和4μl的超纯水。
[0140]
pcr反应程序为：20℃～40℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～10分钟，1个循环；95℃，5～30秒，62～65℃，10～40秒，荧光信号采集，35～45个循环。
[0141]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0142]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0143]
下述实施例中的人edta抗凝血均来源于宁夏医科大学总医院。
[0144]
实施例1引物和探针的设计
[0145]
本实施例通过分析苯丙氨酸羟化酶基因a611g、g728a、c1068a三个突变位点的序列和内参基因vps29的基因序列，利用引物设计软件primeprimer5.0，设计引物和探针，序列如下：
[0146]
611a上游引物：5
’‑
ttgtataaaacccatgcttgcta-3’(seq id no.1)
[0147]
611g上游引物：5
’‑
ttgtataaaacccatgcttgctg-3’(seq id no.2)
[0148]
611下游引物：5
’‑
tctgcaggaactgagaaacgtc-3’(seq id no.3)
[0149]
728g上游引物：5
’‑
cttgcactggttccgcctccg-3’(seq id no.4)
[0150]
728a上游引物：5
’‑
cttgcactggttccgcctcca-3’(seq id no.5)
[0151]
728下游引物：5
’‑
gcaatgaacccaaacctcat-3’(seq id no.6)
[0152]
1068c上游引物：5
’‑
ttcacttggggcctacagtac-3’(seq id no.7)
[0153]
1068a上游引物：5
’‑
ttcacttggggcctacagtaa-3’(seq id no.8)
[0154]
1068下游引物：5
’‑
gctggaactccgtgacagtg-3’(seq id no.9)
[0155]
611探针：5
’‑
ctgtggcttccatgaagata-3’(seq id no.10)，5’端为荧光基团fam，3’端为淬灭基团bhq1。
[0156]
728探针：5
’‑
ctgtggctggcctgcttt-3’(seq id no.11)，5’端为荧光基团fam，3’端为淬灭基团bhq1。
[0157]
1068探针：5
’‑
cagagaagccaaagcttc-3’(seq id no.12)，5’端为荧光基团fam，3’端为淬灭基团bhq1。
[0158]
vps29上游引物：5
’‑
gtgtcccgagataagaatg-3’(seq id no.13)
[0159]
vps29下游引物：5
’‑
ctctggctggtgatgttc-3’(seq id no.14)
[0160]
vps29探针：5
’‑
cttagccctgttgcagaggca-3’(seq id no.15)，5’端为荧光基团
vic，3’端为淬灭基团bhq1。
[0161]
上述引物和探针均由takara公司使用现有技术合成。
[0162]
所述611a上游引物、611g上游引物、611下游引物和611探针用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点a611g；
[0163]
所述728g上游引物、728a上游引物、728下游引物和728探针用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点g728a；
[0164]
所述1068c上游引物、1068a上游引物、1068下游引物和1068探针用于检测苯丙氨酸羟化酶基因突变位点c1068a。
[0165]
实施例2多重扩增引物、探针浓度的选择
[0166]
本实施例采用实施例1所示的引物和探针，对多重扩增反应体系中各个位点的引物和探针浓度进行筛选。筛选的组合物的浓度组合如下：
[0167]
表8引物和探针浓度组合
[0168]
组合编号组合1组合2组合3组合4试剂名称浓度浓度浓度浓度611上游引物200nm100nm200nm100nm611下游引物200nm100nm200nm100nm611探针200nm100nm200nm100nm728上游引物200nm100nm200nm100nm728下游引物200nm100nm200nm100nm728探针200nm100nm200nm100nm1068上游引物200nm100nm200nm100nm1068下游引物200nm100nm200nm100nm1068探针200nm100nm200nm100nmvps29上游引物200nm200nm100nm100nmvps29下游引物200nm200nm100nm100nmvps29探针200nm200nm100nm100nm
[0169]
所有组合的多重扩增反应体系中其他组分完全一样，具体信息见下表：
[0170]
表9 pcr体系中的其它组分
[0171][0172]
选用一个611位点、728位点和1068位点发生杂合突变的样本作为检测样本，对所
有组合进行检测验证，使用的pcr反应程序为：30℃，5分钟，1个循环；95℃，5分钟，1个循环；95℃，10秒，62℃，20秒，荧光信号采集，40个循环。样本检测结果如下：
[0173]
表10样本检测结果
[0174][0175]
由上述结果可知，三个位点的组合2、组合3、组合4的扩增效率均小于组合1，表现为组合2、组合3、组合4的ct值均有明显大于组合1的ct值，即部分扩增反应受到抑制。
[0176]
实施例3利用roc曲线获得结果判断标准
[0177]
本实施例选用73例611位点野生型样本(编码为611w001～073，来自携带refsnp id为rs62514927的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因的人)、73例611位点杂合突变型样本(编码为611h001～073，来自携带refsnp id为rs62514927的snp为a和g的苯丙氨酸羟化酶基因的人)和73例611位点纯合突变型样本(编码为611m001～073，来自携带refsnp id为rs62514927的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因的人)作为本实施例611位点的检测样本。选用73例728位点野生型样本(编码为728w001～073，来自携带refsnp id为rs62508588的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因的人)、73例728位点杂合突变型样本(编码为728h001～073，来自携带refsnp id为rs62508588的snp为g和a的苯丙氨酸羟化酶基因的人)和73例728位点纯合突变型样本(编码为728m001～073，来自携带refsnp id为rs62508588的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因的人)作为本实施例728位点的检测样本。选用73例1068位点野生型样本(编码为1068w001～073，来自携带refsnp id为rs62516095的snp为c的苯丙氨酸羟化酶基因的人)、73例1068位点杂合突变型样本(编码为1068h001～073，来自携带refsnp id为rs62516095的snp为c和a的苯丙氨酸羟化酶基因的人)和73例1068位点纯合突变型样本(编
码为1068m001～073，来自携带refsnp id为rs62516095的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因的人)作为本实施例1068位点的检测样本。
[0178]
所述样本均为人edta抗凝血，所有样本均使用商业化dna提取试剂盒提取dna，为降低提取残留物对扩增反应的影响，要求提取后的dna纯度od
280/260
的范围为1.80～2.0，浓度不低于10ng/μl。所有样本的基因型均通过一代测序确定，之后使用实施例2中组合1的组合物对样本分别进行611位点野生型pcr检测、611位点突变型pcr检测、728位点野生型pcr检测、728位点突变型pcr检测、1068位点野生型pcr检测和1068位点突变型pcr检测，使用的pcr反应程序均为：30℃，5分钟，1个循环；95℃，5分钟，1个循环；95℃，10秒，62℃，20秒，荧光信号采集，40个循环。分别计算野生型反应体系和突变型反应体系的
△
ct，如果ct值为undetermined或无扩增曲线时，选取最大循环数代替ct值进行
△
ct计算。对结果进行roc分析时，将野生型样本的
△
ct作为一组数据，突变型样本的
△
ct作为一组数据，分别使用软件进行分析，找出约登指数(youden index)最大值的点。
[0179]
上述pcr检测中，pcr反应体系中，表2的611位点野生型pcr反应液、表3的611位点突变型pcr反应液、表4的728位点野生型pcr反应液、表5的728位点突变型pcr反应液、表6的1068位点野生型pcr反应液和表7的1068位点突变型pcr反应液中的各引物探针浓度分别均为200nm，pcr反应液中的其它组分如表9。
[0180]
表11 611位点检测结果及
△
ct值
[0181]
[0182]
[0183]
[0184]
[0185]
[0186][0187]
注：
“‑”
表示无扩增曲线，即undetermined。
[0188]
表12 611位点野生型反应体系roc分析结果
[0189][0190]
表13 611位点突变型反应体系roc分析结果
[0191][0192]
由上述结果可知：611位点野生型反应体系的约登指数最大值为95.89，其对应的
△
ct为1.49；611位点突变型反应体系的约登指数最大值为97.26，其对应的
△
ct为1.49。约登指数是灵敏度与特异度之和减去100。约登指数越大说明检测实验的效果越好，真实性越大。取约登指数最大的点作为
△
ct的最佳阈值点。
[0193]
表14 728位点检测结果及
△
ct值
[0194]
[0195]
[0196]
[0197]
[0198]
[0199][0200]
注：
“‑”
表示无扩增曲线，即undetermined。
[0201]
表15 728位点野生型反应体系roc分析结果
[0202][0203]
表16 728位点突变型反应体系roc分析结果
[0204]
[0205]
由上述结果可知：728位点野生型反应体系的约登指数最大值为97.26，其对应的
△
ct为2.47；728位点突变型反应体系的约登指数最大值为98.63，其对应的
△
ct为2.26。取约登指数最大的点作为
△
ct的最佳阈值点。
[0206]
表17 1068位点检测结果及
△
ct值
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211][0212]
注：
“‑”
表示无扩增曲线，即undetermined。
[0213]
表18 1068位点野生型反应体系roc分析结果
[0214]
[0215][0216]
表19 1068位点突变型反应体系roc分析结果
[0217][0218]
由上述结果可知：1068位点野生型反应体系的约登指数最大值为95.89，其对应的
△
ct为0.97；1068位点突变型反应体系的约登指数最大值为94.52，其对应的
△
ct为1.41。取约登指数最大的点作为
△
ct的最佳阈值点。
[0219]
利用roc曲线获得结果判断标准如下：
[0220]
表20结果判定标准
[0221][0222]
其中，611位点野生型是refsnp id为rs62514927的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因的纯合型，611位点纯合突变是refsnp id为rs62514927的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因的纯合型，611位点杂合突变是refsnp id为rs62514927的snp为a和g的苯丙氨酸羟化酶基因的杂合型；728位点野生型是refsnp id为rs62508588的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因的纯
合型，728位点纯合突变是refsnp id为rs62508588的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因的纯合型，728位点杂合突变是refsnp id为rs62508588的snp为g和a的苯丙氨酸羟化酶基因的杂合型，1068位点野生型是refsnp id为rs62516095的snp为c的苯丙氨酸羟化酶基因的纯合型，1068位点纯合突变是refsnp id为rs62516095的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因的纯合型，1068位点杂合突变是refsnp id为rs62516095的snp为c和a的苯丙氨酸羟化酶基因的杂合型。
[0223]
611位点野生型(携带refsnp id为rs62514927的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因)的灵敏度为95.89％、特异度为100％，曲线下面积(auc)为0.995，roc曲线见图1，纯合突变(携带refsnp id为rs62514927的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因)的灵敏度为100％、特异度为97.26％，曲线下面积为0.998，roc曲线见图2；728位点野生型(携带refsnp id为rs62508588的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因)的灵敏度为97.26％、特异度为100％，曲线下面积为0.997，roc曲线见图3，纯合突变(携带refsnp id为rs62508588的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因)的灵敏度为98.63％、特异度为100％，曲线下面积为0.999，roc曲线见图4；1068位点野生型(携带refsnp id为rs62516095的snp为a的苯丙氨酸羟化酶基因)的灵敏度为95.89％、特异度为100％，曲线下面积(auc)为0.998，roc曲线见图5，纯合突变(携带refsnp id为rs62516095的snp为g的苯丙氨酸羟化酶基因)的灵敏度为100％、特异度为94.52％，曲线下面积(auc)为0.997，roc曲线见图6。
[0224]
实施例4临床样本的验证实验
[0225]
本实验对50例已知型别的人临床样本(人edta抗凝血)进行检验验证，编码s01～s50。所有临床样本均由生工生物工程(上海)股份有限公司通过一代测序的方法确定。利用本发明涉及的检测试剂盒按照实施例3的方法进行检测和数据处理方法进行结果判定，检测结果如表21和图7-图24所示：
[0226]
表21本发明提供试剂盒检测临床样本结果
[0227]
[0228]
[0229][0230]
其中，“结果判定”和“测序结果”各位点的野生型、纯合突变和杂合突变的定义同实施例3。
[0231]
由上述结果可知本发明提供的组合物、试剂盒可以准确地检出临床样本611位点、728位点和1068位点的基因型别。
[0232]
对比例1与其他专利内容对比(一)
[0233]
本实施例提供一种与已在专利(公开号：cn111172277a)中提到的实验方法进行对比的实验结果。
[0234]
已公布专利(公开号：cn111172277a)中提到的611位点、728位点、1068位点的引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并按照专利中说明的方法配制相应的反应液。本发明使用的引物和探针也由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。两种方法使用的其他原料成分完全一致。使用两种方法的611位点检测体系检测30例样本(编码611s01～611s30)、728位点检测体系检测30例样本(编码728s01～728s30)、1068位点检测体系检测30例样本(编码1068s01～1068s30)。所述三种体系检测的样本中均包含10例野生型样本、10例杂合型样本、10纯合突变型样本。所述样本的基因型均由生工生物工程(上海)股份有限公司通过一代测序的方法确定。所述本专利的反应体系检测试剂按照实施例2中的组分1配制。为方便进行结果对比，规定两种方法在使用各自反应程序时的反应循环数统一为40个循环。检测结果如下：
[0235]
表22对比检测结果
[0236]
[0237]
[0238][0239]
注：*为结合扩增曲线后的判定结果。
[0240]
由上述结果可知使用本发明提供的检测试剂检测结果好于专利(公开号：cn111172277a)的检测结果，表现为专利(公开号：cn111172277a)检测野生型和纯合突变时偶有非特异性扩增，影响结果判读。
[0241]
对比例2与其他专利内容对比(二)
[0242]
本实施例提供一种与已在专利(公开号：cn111172277a)中提到的实验方法在抗气溶胶干扰方面的对比的实验结果。
[0243]
本对比例采用对比例1使用的反应体系和反应程序。本对比例使用一代测序确定为野生型的样本作为对照样本，同时使用对比例1扩增后的纯合突变样本模拟气溶胶污染制成实验样本。每个位点选用3个野生型对照样本(编号：d01～d03)和对应的3个实验样本(编号：t01～t03)，检测结果如下：
[0244]
表23抗气溶胶污染能力检测结果
[0245][0246]
由上述结果可知使用本发明提供的检测试剂检测样本能很好避免扩增产物形成的气溶胶对后续检测结果的不利影响，使用专利(公开号：cn111172277a)提供的方法无法避免上一次检测结果对后续检测的不利影响。
[0247]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。