一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因ZmADT2及其编码蛋白和应用

一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因zmadt2及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因zmadt2及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.农作物病虫害对作物的产量和品质构成了严重威胁。据统计，在全球范围内有20％-40％的作物因病虫害而使产量遭受损失。预计到2050年，全球对粮食的需求将逐步增加，引发更严重的粮食安全问题。真菌植物病原体可以威胁到农作物的产量，而且可能在采食后引发一些疾病，造成经济损失。玉米瘤黑粉病是玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)感染玉米所导致的病害，它可以感染玉米所有的地上器官，并在感染4-7天后诱导玉米的叶片、茎秆、雄穗和雌穗等器官产生肿瘤，感染14天后形成发育成熟的冬孢子。
4.在我国，玉米瘤黑粉病已成为主要的玉米病害之一，对玉米产量造成严重影响。瘤黑粉病在我国各个玉米种植区都会发生，北方种植区相比于南方种植区的发病情况更为广泛和严重，其中东北、华北和黄淮海地区尤为严重。不同玉米品种对瘤黑粉病的抗性不同，对一些品种的产量统计发现，玉蜀黍黑粉菌对茎秆的感染会导致20％-60％的减产，而对玉米穗部的感染会导致将近80％的减产，严重威胁着我国玉米的产量。
5.在田间，幼苗感染症状很少见，肿瘤通常在雌穗和雄穗上。研究表明水杨酸和木质素在玉米抗黑粉菌侵染中具有重要作用。筛选不同抗病程度的玉米材料，鉴定抗性基因，研究玉米对瘤黑粉病的抗性分子机制尤为重要。但目前在玉米中克隆到的玉米瘤黑粉病抗性基因知之甚少。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因zmadt2及其编码蛋白和应用。本发明通过正向遗传学手段鉴定到一个编码arogenate脱水酶和预苯酸脱水酶的基因zmadt2，并证明该基因突变造成了玉米发育缺陷及对瘤黑粉病抗性减弱的表型。
7.本发明是通过如下技术方案实现的：
8.本发明的第一方面，提供一种调控玉米株型和瘤黑粉病抗性的基因zmadt2，所述基因zmadt2为如下i)或ii)或iii)或iv)所示的核酸分子：
9.i)核苷酸序列是seq id no.1所示的核酸分子；
10.ii)核苷酸序列是seq id no.2所示的核酸分子；
11.iii)与i)或ii)的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且表达相同功能蛋白质
的核酸分子；
12.iv)除ii)以外的编码seq id no.3所示氨基酸序列的核酸分子。
13.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用计算机软件进行评价，例如可采用blast算法测定(altschul et al.1990.journal of molecular biology 215:403-410；karlin and altschul.1993.proceedings of the national academy of sciences 90:5873-5877)。
14.本发明的第二方面，提供一种由上述基因zmadt2编码的蛋白，所述蛋白为如下(a1)-(a3)任一所示的蛋白质：
15.(a1)由序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
16.(a2)将序列表中seq id no.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与玉米株型和瘤黑粉病抗性相关的由seq id no.3衍生的蛋白质；
17.(a3)在(a1)或(a2)中所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
18.其中，为了使(a1)或(a2)中的蛋白质便于纯化，可在(a1)或(a2)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上标签。所述标签可以为poly-arg(通常为6个rrrrr)，poly-his(通常为6个hhhhhh)，flag(dykddddk)，strep-tag ii(wshpqfek)或c-myc(eqkliseedl)。
19.本发明的第三方面，提供含有上述基因zmadt2的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。
20.所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pcambia3300、pcambia3301、pcambia1300、pbi121、pbin19、pcambia2301、pcambia1301-ubin或其它衍生植物表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、泛素基因ubiquitin启动子(pubi)、胁迫诱导型启动子rd29a等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。
21.本发明的第四方面，提供上述基因zmadt2、基因zmadt2编码的蛋白、含有基因zmadt2的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
22.(1)调控植物生长发育；
23.(2)调控植物瘤黑粉病抗性；
24.(3)调控植物水杨酸、赤霉素和木质素的合成；
25.(4)植物育种。
26.上述应用中，所述植物优选为玉米。
27.上述应用中，所述植物育种包括：玉米株型选育、抗病性玉米品种或品系选育。
28.本发明的第五方面，提供一种调整玉米株型的方法，包括以下步骤：
29.以基因zmadt2或基因zmadt2编码的蛋白作为靶标，通过生物技术手段调控基因zmadt2的表达水平，或者改变基因zmadt2编码蛋白的活性。
30.上述方法中，所述生物技术手段包括但不限于：基因编辑、rnai、t-dna插入、过量
表达等。
31.本发明的第六方面，提供一种恢复玉米瘤黑粉病抗性的方法，包括：使玉米中基因zmadt2过表达的步骤。
32.上述方法中，可以通过外源转入基因zmadt2的方法使玉米中基因zmadt2过表达。
33.本发明的第七方面，提供一种抗瘤黑粉病玉米的培育方法，所述培育方法包括：将seq id no.1或seq id no.2所示的基因zmadt2转入玉米中，获得瘤黑粉病抗性恢复的玉米；
34.或者调控玉米基因组中seq id no.1或seq id no.2所示的基因zmadt2的表达，筛选得到瘤黑粉病抗性提高的玉米植株。
35.上述培育方法中，将基因zmadt2转入玉米中的方法包括但不限于：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。
36.上述培育方法中，调节玉米基因组中基因zmadt2的表达的方法包括：导入能够激活、提高或抑制基因zmadt2的转录水平或翻译水平或蛋白活性的dna片段；或者控制特异小rna分子的合成，调控基因zmadt2 mrna的积累。
37.所述特异小rna分子包括：微小rna分子(microrna，mirna)、干扰小rna(small interfering rna，sirna)或人工mirna(artificial microrna，amirna)。
38.虽然玉米瘤黑粉病已成为主要的玉米病害之一，对玉米产量造成严重影响，但是，导致玉米瘤黑粉病的玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)是一种真菌，其诱导产生的瘿瘤富含氨基酸和降低胆固醇的β-葡萄糖。在墨西哥又被成为黑松露，可以作为食品，风味独特且经济价值较高。
39.因此，本发明的第八方面，提供一种生产玉米瘤黑粉瘿瘤的方法，包括以下步骤：
40.将玉米中的基因zmadt2敲除或沉默；或者，使玉米中基因zmadt2编码蛋白的功能缺失，获得玉米材料；
41.从获得的玉米材料上收集玉米瘤黑粉瘿瘤。
42.上述方法中，可以采用crispr-cas9基因编辑技术、vigs技术、t-dna插入或rna干涉技术将玉米中的基因zmadt2敲除或沉默。
43.本发明的有益效果：
44.本发明克隆了一个可以同时调控玉米发育和瘤黑粉病抗性的基因zmadt2，zmadt2基因可以调节植物激素水杨酸和赤霉素的合成，以及木质素的合成，调控细胞大小。本发明提供了zmadt2在玉米株型建成和瘤黑粉病抗性方面的应用。同时该基因突变体株型矮化，雌穗易感瘤黑粉病而产生大量肿瘤，肿瘤可食用且风味独特，可以作为玉米瘤黑粉瘿瘤生产加工的材料。
附图说明
45.图1为野生型(wt)与突变体(dsu)的田间特征。
46.图2为野生型和突变体的发育表型；图中，a.杂合体植株自交果穗；b.野生型(wt)和dsu突变体成熟籽粒纵切；c-d.种植3周后的野生型(c)和dsu突变体(d)的幼苗；e.野生型和dsu突变体的成熟植株；f.野生型和dsu突变体成熟植株节间；g-h.野生型(g)和dsu突变体(h)成熟叶；i.野生型和dsu突变体感病前的雌穗；j.野生型和dsu突变体的雄穗；k.野生
型和dsu突变体的根；l.dsu突变体和野生型的株高统计。m.dsu突变体和野生型的百粒重统计；误差线为标准误差，***代表p《0.001；**代表p《0.05(student’st检验)。图a标尺为1cm，图b标尺为2mm，图c、d、f、g、h、i、j、k标尺为10cm，图e标尺为50cm。
47.图3为突变基因的图位克隆；图中，(a)突变基因的精细定位；(b)zmadt2基因的突变位点，已标出用于做连锁分析和引物位置(f：dsu-jd-f；r：dsu-jd-r)；(c)突变位点与表型的连锁性分析。
48.图4为zmadt2基因回补株系表型；图中，a.对dsu突变体与过表达株系杂交构建的f2代植株的pcr鉴定；us5-1与zmadt2-r引物对用于区分转基因阳性与阴性植株，f1与r1引物对用于区分野生型与突变体基因型；“h2o”和“p”分别为水作阴性对照，载体质粒作阳性对照。b.四种基因型材料植株表型，标尺为50cm；c.四种基因型材料在田间的雌穗感病表型，标尺为10cm。
49.图5为zmadt2基因编辑株系表型；图中，a.用于crispr-cas9敲除系统的基因靶点序列，以及核苷酸序列比对分析2个转基因株系的编辑类型。b.野生型和转基因crispr-cas9系统敲除纯合体成熟植株(zmadt2-ko1、zmadt2-ko2)的表型，标尺为50cm。c.野生型和转基因crispr-cas9系统敲除纯合体成熟植株(zmadt2-ko1、zmadt2-ko2)的雌穗田间感病表型，标尺为10cm。
50.图6为水杨酸含量测定。
51.图7为赤霉素含量测定。
52.图8为木质素含量测定。
具体实施方式
53.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
54.如前所述，玉米瘤黑粉病已成为主要的玉米病害之一，对玉米产量造成严重影响。筛选不同抗病程度的玉米材料，鉴定抗性基因，研究玉米对瘤黑粉病的抗性分子机制尤为重要。但目前在玉米中克隆到的玉米瘤黑粉病抗性基因知之甚少。
55.有鉴于此，发明人从田间筛选到一个矮化且田间极易患瘤黑粉病的玉米突变体，命名为dsu，通过图位克隆，候选基因测序鉴定到玉米第一染色体上的基因zm00001d028712存在72bp缺失，缺失序列如seq id no.4所示，具体如下：
[0056]5’‑
gtgtgactgacgaccaggtgggagggccataaggcctttagcgcggcggcggcaatggcgcccacggcctgc-3’，包含基因翻译起始密码子。
[0057]
进一步通过正向遗传学手段证明该基因(zm00001d028712)为调控dsu表型的基因，该基因编码arogenate脱水酶和预苯酸脱水酶，将其命名为zmadt2。基因zmadt2的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码区(cds)序列如seq id no.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0058]
本发明研究发现，基因zmadt2的突变导致玉米植株发育缺陷，株高严重矮化，且在田间极易感染玉米瘤黑粉病。基因zmadt2还能调控植物中水杨酸、赤霉素和木质素的合成。因此，利用基因zmadt2可以调控玉米株型发育和瘤黑粉病抗性，具有培育抗瘤黑粉病和理
想株型的玉米品种的潜力，也可以构建极易感染瘤黑粉病的玉米突变株，用于玉米瘤黑粉瘿瘤的生产加工，极具生产利用价值，由此提出了本发明。
[0059]
需要说明的是，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的基因zmadt2的非关键位置的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明基因zmadt2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，例如75％、80％、85％、90％、95％或者99％，只要编码的蛋白与seq id no.3所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的基因zmadt2，也应属于本发明的保护范围。
[0060]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
[0061]
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：
[0062]
玉米自交系w22、dsu突变体、b73自交系、玉米a188自交系，公众可从申请人处获得，以用于重复本发明。
[0063]
实施例1：玉米发育缺陷及易感瘤黑粉病突变体dsu的表型分析和突变基因克隆
[0064]
一、dsu玉米突变体的表型鉴定
[0065]
在山东农业大学试验田种植的玉米自交系w22背景材料中分离出一个隐性突变体，命名为dsu(dwarf and susceptible to ustilago maydis)。该突变体表型为株高矮化，在雌穗上长出瘤状物，导致雌穗感染玉米瘤黑粉病而不能正常结实(图1)。将遗传背景纯化后的野生型(wt)和dsu突变体种植于大田中，观察发现dsu突变体的株高相对于野生型植株显著降低，同时观察到突变体的雌穗上部呈花瓣状长有大量的瘤状物。dsu突变体与b73自交系杂交获得f1代植株，并将f1代植株自交授粉获得f2代，观察发现f2代植株中存在株高分离的现象，同时矮化的植株雌穗上均感染玉米瘤黑粉病，长有瘤状物。除上述dsu突变体对玉米黑粉菌抗性减弱，容易感染玉米瘤黑粉病外，突变体与野生型相比具有生长发育上的缺陷。突变体幼苗时期已表现出与野生型明显的差异，株高变矮，叶片变短变窄，叶色变浅，根部、雄穗、雌穗变小，籽粒变小，百粒重降低(图2)。
[0066]
二、突变基因的图位克隆
[0067]
利用上述f2群体中分离出的突变体表型材料进行突变基因的图位克隆。通过开发分子标记(引物1-20、1-28、1-47、2-6、2-8、2-20、4-2、4-10、4-16、4-23、z8、z9、z13、z14、2-54、1-55、1-59、1-67、1-70用于图位克隆)，筛选f2中的交换单株，结合基因型与表型的连锁关系，进一步缩小候选区间。
[0068]
结果表明突变基因位于1号染色体上，最终将区间缩小到z8和z13两个分子标记大约120kb的区间内，共包含4个基因(图3a)。将野生型和突变体4个基因的全长分别扩增(引物zm028709用于扩增zm00001d028709；引物zm028710用于扩增zm00001d028710；引物zm028711用于扩增zm00001d028711；zm028712d1、zm028712d2、zm028712d3用于分三段扩增zm00001d028712)，测序比对发现其中一个基因(zm00001d028712)存在72个核苷酸的缺失(图3b)，缺失序列为：
[0069]5’‑
gtgtgactgacgaccaggtgggagggccataaggcctttagcgcggcggcggcaatggcgcccac
ggcctgc-3’，包含基因翻译起始密码子。多个转录本的起始密码子位于缺失区域，同时在缺失位点两侧设计引物(dsu-jd)纯合野生型和突变体的基因型进行鉴定，结果显示野生型植株的基因型为正常的基因型，而突变体的基因型均为突变型(图3c)。
[0070]
由此，将基因(zm00001d028712)命名为zmadt2，基因zmadt2的核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码区(cds)序列如seq id no.2所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0071]
上述图位克隆方法如下所述：
[0072]
(1)玉米dna的提取
[0073]
①
取新鲜玉米材料约200mg，放于装有钢珠的1.5ml离心管中，液氮冷冻1min后使用组织研磨机55hz研磨1min；
[0074]
②
研磨充分后加入500μl pl buffer，充分混匀，65℃孵育25min，期间每隔5min摇匀几次；
[0075]
③
冷却后加入500μl氯仿，放于水平摇床上，110rpm充分摇匀；
[0076]
④
11000rpm离心10min，吸取400μl上层水相至新的1.5ml离心管，加入1ml无水乙醇(-20℃预冷)，轻轻颠倒混匀，此时可见絮状沉淀；
[0077]
⑤
8000rpm离心5min，弃上清，加入750μl 75％乙醇洗涤沉淀；
[0078]
⑥
8000rpm离心3min，充分弃上清，开盖放于室温干燥4h；
[0079]
⑦
干燥后加入200μl至250μl ddh2o，37℃孵育30min后震荡混匀，-20℃保存备用。
[0080]
(2)pcr反应体系及反应条件
[0081]
使用分子标记引物进行pcr扩增，按下表配制20μl体积的pcr反应体系：
[0082][0083]
按如下条件进行pcr扩增反应：
[0084][0085]
(3)pcr产物条带检测
[0086]
在pcr扩增的同时，配制4％琼脂糖凝胶。通过4％琼脂糖凝胶检测条带大小，以dsu突变体、b73自交系和f1材料dna为模版扩增的pcr产物为对照，同时每一排预留一个胶孔加入10μl标准dna marker，用来比较扩增产物的dna大小。
[0087]
(4)候选基因的扩增及测序
[0088]
根据候选基因dna序列设计特异性引物序列，以野生型和突变体dna为模板，采用
phanta evo超高保真dna聚合酶进行pcr扩增，具体反应体系如下表：
[0089][0090]
按如下条件进行pcr扩增反应：
[0091][0092]
将pcr产物通过1％琼脂糖凝胶检测后，回收dna，使用-blunt3 cloning kit构建克隆载体，将载体转化进入e.coli top10大肠杆感受态细胞，筛选阳性克隆进行测序。
[0093]
上述实验所涉及的引物序列：
[0094][0095]
实施例2：转基因植株的获得与鉴定
[0096]
一、过表达植株鉴定与遗传互补
[0097]
使用特异引物扩增了zmadt2基因的蛋白编码区(coding sequence，cds)将其连入改造pcambia3300后的载体中，并通过农杆菌介导的遗传转化技术转化玉米a188自交系幼胚。通过抗性筛选以及pcr(引物对：us5-1/zmadt2-r)鉴定筛选阳性植株，t0代转基因植株中zmadt2基因的表达水平相对于a188自交系基因表达水平显著提高。通过阳性转基因植株与dsu突变体杂交的方法将外源dna序列导入dsu突变体中，通过pcr(引物对：us5-1/zmadt2-r；f1/r1)进行鉴定(图4a)。表型分析表明dsu突变体的表型可以通过转入zmadt2基因的cds而完全恢复(图4b-c)，证明zmadt2基因就是调控该表型的基因。
[0098]
二、敲除株系表型鉴定
[0099]
与此同时，构建了crispr-cas9敲除载体，将分别靶向zmadt2基因的两个靶点的引导序列导入pbue411-2gr表达载体中，并通过农杆菌介导的遗传转化技术转化a188自交系幼胚。通过pcr鉴定及扩增测序，筛选到2个不同编辑类型的株系(zmadt2-ko1、zmadt2-ko2)(图5a)。两个株系的纯合体相比于野生型具有与dsu突变体相似的矮化以及其他器官发育缺陷的表型，同时雌穗在后期的发育过程中也会长出类似于dsu突变体雌穗上所长的肿瘤物，表明zmadt2调控玉米的发育和对瘤黑粉病的抗性(图5b-c)。
[0100]
上述实验方法如下所述：
[0101]
(1)重组表达载体构建
[0102]
1)过表达载体构建
[0103]
①
引物设计：在http://ensembl.gramene.org/zea_mays/info/index网站下载基因的cds序列，根据cds序列中的酶切位点在表达载体质粒多克隆位点中选择合适的酶切位点加在正向和反向扩增引物的5’端。本实验中选用bamhi和scai两个酶切位点，引物对：oe-zmadt2-f；oe-zmadt2-r。
[0104]
②
采用phanta evo超高保真dna聚合酶以野生型玉米的cdna为模板进行pcr扩增，扩增完成后，进行pcr电泳检测及产物回收，连入克隆载体，依次进行大肠杆菌感受态细胞转化、大肠杆菌菌落pcr筛选阳性菌落、菌样测序、质粒提取。
[0105]
④
待质粒提取完成后，用所选酶切位点的限制性内切酶，分别对表达载体质粒和克隆载体质粒进行酶切，随后进行电泳检测和产物回收。
[0106]
⑤
将目的dna片段连入表达载体，依次进行大肠杆菌感受态细胞转化、大肠杆菌菌落pcr筛选阳性菌落、菌样测序、质粒提取。
[0107]
2)crispr/cas9基因编辑载体构建
[0108]
①
引物设计：在http://ensembl.gramene.org/zea_mays/info/index网站下载基因的cds序列和gdna序列，在外显子区域选择5
’‑
ngg-3’pam基序的5’端19bp的碱基作为引导序列，并通过blast工具检测序列的特异性，选择高特异性的序列用于引物合成。
[0109]
②
以pcbc-mt1t2为模板的4引物(mt1t2-bsf、mt1t2-f0、mt1t2-r0
[0110]
mt1t2-bsr)pcr扩增法，将引导序列整合到载体片段中，进行pcr电泳检测及产物回收。将回收的pcr产物与pbue411-2gr载体质粒进行酶切连接，在pcr仪中进行反应，反应条件为37℃，5h；50℃，5min；80℃，10min。
[0111]
体系如下：
[0112][0113]
③
酶切连接反应完成后，依次进行大肠杆菌感受态细胞转化、大肠杆菌菌落pcr筛选阳性菌落、菌样测序、质粒提取。
[0114]
(2)重组农杆菌的获得
[0115]
将eha105农杆菌感受态细胞(50μl)置于冰上解冻，完全解冻后加入5μl上述重组载体，轻弹混匀。冰浴5min后液氮冷冻8min，随后快速转移至37℃水浴锅中，放置5min。冰浴2min，加入1ml yep液体培养基，28℃200rpm培养3h。取200μl菌液均匀涂布于含卡那霉素(50mg/l)和利福平抗生素(50mg/l)的yep平板上，28℃倒置培养2.5天。菌落pcr筛选阳性菌种。
[0116]
(3)转基因株系的获得与鉴定
[0117]
将上述重组农杆菌在含有卡那霉素和利福平抗生素的yep液体培养基中活化培养，收集适量菌体在含卡那霉素(50mg/l)和利福平抗生素(50mg/l)和乙酰丁香酮(100mg/l)的ab诱导培养基(glucose 20g/l；mes 19.52g/l；nh4cl 1g/l；mgso4·
7h2o 0.3g/l；feso4·
7h2o 2.5mg/l；kcl 150mg/ml；cacl
2 10mg/ml；nah2po
3 0.156g/l)中诱导培养，od
660
调至0.8-1.0，用于侵染授粉后9-11天的玉米幼胚，将侵染后的幼胚弓面朝上铺于共培养培养基(n6 salt；n6 vitamins；thiamin hc1 0.5mg/l；sucrose 30g/l；l-proline 1.38g/l；myo-inositol 0.1g/l；casein hydrolysate 0.1g/l；2,4-d 0.5mg/l；mes0.1g/l；6-ba 0.01mg/l；cys 100mg/l；agarose 6.5g/l)上，于22℃培养箱暗培养20-24h。转移至恢复培养基(ms salt；ms vitamins；sucrose 30g/l；l-proline 0.7g/l；myo-inositol 0.1g/l；casein hydrolysate 0.1g/l；2,4-d 0.5mg/l；mes 0.5g/l；dicamba 0.5mg/l；phytagel 3g/l)中28℃暗培养7天。进一步在新的恢复培养基上继代培养，继而转移到分化培养基(ms salt；ms vitamins；sucrose 60g/l；myo-inositol 100mg/l；agarose 3g/l)上进行分化培养，直至出苗为止。
[0118]
提取上述获得的t0代转基因株系dna，通过在通过特异引物序列(cas9-2测序f、cas9-2测序r)鉴定阳性植株，同时扩增敲除株系包含两个靶点的dna片段，通过测序分析基因编辑情况。
[0119]
上述实验所涉及的引物序列：
[0120][0121]
实施例3：水杨酸、赤霉素和木质素含量的测定
[0122]
取大田种植的野生型与dsu突变体幼穗进行水杨酸含量检测，显示dsu突变体的水杨酸含量显著低于野生型(图6)。对野生型和突变体幼茎的中的赤霉素含量分析，显示dsu突变体的赤霉素含量显著低于野生型(图7)。同时dsu突变体的木质素水平低于野生型(图8)。表明zmadt2基因调控水杨酸、赤霉素和木质素的合成。
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上述实验步骤如下所述：
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(1)水杨酸和赤霉素的测定
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取野生型和突变体幼嫩雌穗，在研钵中用液氮充分研磨，取大约200mg研磨好的粉末在含有[2h4]-sa标准内标的甲醇中过夜提取，粗提物通过oasis max spe进行纯化，通过进一步预处理后用于含量测定。
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取野生型和突变体幼茎，在在研钵中用液氮冷冻后充分研磨，取大约200mg研磨好的粉末有90％的甲醇提取，以需要检测的赤霉素标准品为参照，将粗提物进一步纯化后，通过uplc ms/ms进行定量检测。
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(2)组织染色法木质素含量
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取野生型和突变体同一节间，通过使用震荡切片机将材料切成150μm厚度的薄片。
用95％乙醇配制的2％(w/v)间苯三酚溶液染色2min，随后用50％hcl处理2min，盖上盖玻片，在光学显微镜下观察。
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以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。