一种血栓相关基因芯片的检测方法

1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种血栓相关基因芯片的检测方法。


背景技术：

2.血栓是一种可累及全身各器官系统，涉及临床医学多学科，严重危害人类健康的疾病，具有高发病率，高致死致残率等特点。血栓性疾病多半具有易栓症倾向，易栓症是指由于遗传性因素(凝血、抗凝、纤溶系统遗传性缺陷)或获得性因素(高龄、妊娠及产褥期、恶性肿瘤等)所致的容易发生血栓的病理状态，其中遗传性易栓症往往由于病因不能得到及时确诊，常影响正确的预防及治疗，从而导致严重的血栓事件发生。就亚洲人群常见的遗传性易栓症疾病种类来说，人群中抗凝血酶缺乏者占0.02％，蛋白质c缺陷者占0.3％，蛋白质s缺乏者占1.8％，静脉血栓患者中上述3种缺陷的分布更高，可达1/3-2/5。
3.对血栓性疾病患者进行基因检测，使得人群中易栓症异常基因携带者、家族性易栓症患者，能够在第一时间对血栓事件的发生或复发做好预防工作，从而降低血栓病的发病率、致残率和致死率；同时通过基因检测可为血栓患者的规范化和标准化抗凝治疗提供依据，从而实现个性化精准治疗。
4.人类基因组大小约为3gb，全基因组测序总计约需90gb测序数据；同样，外显子测序能够从基因组范围上寻找致病突变，这两种方法测序数据也大，消耗的计算资源多，一次性获得基因组上万个基因变异，绝大多数变异属于无临床意义的变异，给数据分析增加了难度。然而，一次捕获检测数十个基因上发生的所有突变或绝大多数致病突变，这种成本低，测序深，对突变检测准确性高的方法是可以实现的。
5.因此，开发一款高准确性、高通量、廉价的血栓相关基因芯片的检测方法，对降低血栓的发病率、致残致死率具有重要的意义，如：高效筛查出易栓症异常基因携带者、家族性易栓症患者，从而能够有效的预防血栓事件的发生或复发。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种血栓相关基因芯片的检测方法，旨在解决传统的血栓相关基因芯片的检测方法准确率较低、成本高且检测难度较大的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种血栓相关基因芯片的检测方法，包括以下操作步骤：
9.s1:制备用于特异性识别血栓相关基因致病突变位点的探针；
10.s2:待检测样本前处理：待检测样本经过基因组dna提取，片段化，末端修复，3’端加“a”，接头连接，前pcr扩增，获得200-250bp的待检测的dna片段；
11.s3:血栓相关基因探针捕获文库构建：采用探针来捕获s2中待检测dna片段的血栓相关基因目标区域；
12.s4:血栓相关基因芯片探针捕获文库上机测序：对s3捕获的血栓相关基因目标区域序列进行测定，获得序列信息；
13.s5:血栓相关基因芯片探针捕获文库数据下机分析：基于s4中序列信息来检测血栓相关基因探针对应位点突变情况，进而评估血栓风险。
14.在一种可选方案中：s5中包括基于所述序列信息检测血栓相关基因目标区域的突变。
15.在一种可选方案中：s1中所述探针能够特异性识别下表所示21个基因62种致病突变位点：
16.17.[0018][0019]
在一种可选方案中：s2中待检测样本前处理具体包括以下制备过程：
[0020]
b1:蛋白酶k裂解细胞；
[0021]
b2:离心柱硅基质膜吸附基因组dna；
[0022]
b3:基因组dna漂洗及基因组dna洗脱；
[0023]
b4:基因组dna纯度及浓度测定。
[0024]
在一种可选方案中：所述血栓相关基因探针捕获文库构建用于通过探针来捕获待s2检测样本中的dna片段的血栓相关基因目标区域，其构建过程如下：
[0025]
a1:基因组dna片段化，末端修复、3’端加“a”；
[0026]
a2:片段化基因组dna接头连接及磁珠纯化；
[0027]
a3:加接头片段化基因组dna前pcr扩增及磁珠纯化；
[0028]
a4:加接头片段化基因组dna文库质控；
[0029]
a5:加接头片段化基因组dna文库与血栓相关基因芯片及其探针杂交过夜；
[0030]
a6:血栓相关基因芯片及探针捕获目标区域；
[0031]
a7:血栓相关基因芯片及其探针捕获文库后pcr扩增及磁珠纯化；
[0032]
a8:血栓相关基因芯片及其探针捕获文库质控。
[0033]
在一种可选方案中：所述探针覆盖权利要求3中21个基因外显子及调控区域，也包括权利要求3任一项表格中的血栓相关基因芯片所对应的致病突变位点的捕获探针。
[0034]
本发明相较于现有技术的优点为：
[0035]
与现有技术相比，本发明提供了一种血栓相关基因芯片的检测方法，具备以下有益效果：本发明能够一次性全面地分析目前已知与血栓相关的21个基因62种致病突变位点，与现今流行的高通量测序及全外显子测序技术相比，具有检测目标明确、覆盖性好、准确性高、检测稳定、周期短、成本低的优势。
附图说明
[0036]
图1为本发明实施的流程示意图；
[0037]
图2为本发明21个血栓相关基因致病突变位点数目分布图；
[0038]
图3为本发明21个血栓相关基因致病突变位点在实施例中的分布图。
具体实施方式
[0039]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明；在附图或说明中，相似或相同的部分使用相同的标号，并且在
实际应用中，各部件的形状、厚度或高度可扩大或缩小。本发明所列举的各实施例仅用以说明本发明，并非用以限制本发明的范围。对本发明所作的任何显而易知的修饰或变更都不脱离本发明的精神与范围。
[0040]
实施例1：
[0041]
如图1、图2、图3所示，为本发明提供的一种血栓相关基因芯片的检测方法，其具体实施例如下：
[0042]
选取特异有效基因集合对血栓相关基因的筛查非常关键，漏选会降低检测敏感度，多选则会增加成本和操作难度；
[0043]
基于上述情况，本发明通过查询大量与血栓相关基因突变的研究文献，对关于血栓形成过程中，凝血、血小板、纤溶等系统通路涉及的相关基因突变进行广泛筛查；同时，也了解与血栓相关基因在clinvar、hgmd、omim等数据库中突变位点的研究进展，汇总所有已报道明确与血栓有关联的基因突变在蛋白功能、家系遗传性、人群变异等方面的研究经验，最终选取与血栓高度关联的21个基因(表1中序号1-22)62种致病突变位点，相关基因及致病突变位点clinvar编号见表1：
[0044]
表1.血栓相关基因及致病突变位点列表
[0045]
[0046][0047]
s1:制备用于特异性识别血栓相关基因致病突变位点的探针：
[0048]
根据上述筛选出的21个基因62种致病突变位点，进行血栓相关基因捕获探针的设计，血栓相关基因芯片根据以上种所列的基因致病突变位点来设计，相应探针根据21个基因的外显子及调控区域(允许基因外显子及调控区两侧各延伸15bp)来设计；
[0049]
血栓相关基因芯片的捕获探针设计是使用艾吉泰康提供的设计网站，对上述21个基因62个致病突变位点、外显子及调控区域进行探针设计，将设计得到的探针进行比对分析，针对覆盖度低的基因增加探针覆盖度，使得覆盖度达到99.9％以上，设计完成的最终血栓相关基因芯片及其探针序列交于艾吉泰康进行合成，合成的血栓相关基因芯片及的探针待捕获使用；
[0050]
s2:待检测样本前处理：
[0051]
采用试剂商生产的血液/细胞/组织基因组dna提取或同类型的产品，按照其说明书来进行操作，下面以天根生产的血液/细胞/组织基因组dna提取(离心柱型)(tianamp genomic dna kit)为例，按照其说明书来提取待测样本(抗凝血液)的基因组dna，其中部分操作根据实际情况有所调整，其具体操作步骤如下：
[0052]
b1.蛋白酶k裂解细胞：取200μl抗凝血液，向其中加入加入20μl蛋白酶k(proteinase k)溶液和200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min(充分裂解后的溶液应变清亮)；
[0053]
b2.离心柱硅基质膜吸附基因组dna：瞬时离心后，加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15sec(此时可能会出现絮状沉淀)，瞬时离心后，将所得溶液和絮状沉淀都加入一个套有收集管的吸附柱cb3中，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中(基因组dna就吸附在离心柱硅基质膜上)；
[0054]
b3.1.基因组dna漂洗：向吸附柱cb3中加入500μl缓冲液gd(已加无水乙醇)漂洗1
次(12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中)，再向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(已加无水乙醇)漂洗2次(去除非基因组dna成分)；
[0055]
b3.2.基因组dna洗脱：12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3开盖置于室温放置数分钟(以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液)，将吸附柱cb3转入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液te，室温放置2-5min后，12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5ml离心管中(管中即为提取好的样本基因组dna)；
[0056]
b4.基因组dna纯度及浓度测定：采用微量分光光度计(nanodrop)检测基因组dna的纯度，保证基因组dna质量合格(
①
无降解；
②
a260/a280在1.8-2.0间)，再用3.0fluorometer(qubit dsdna hs assay kit)进行基因组dna的浓度测定，记录基因组dna的浓度(下游进行文库构建，基因组dna的浓度不低于10ng/μl)；
[0057]
s3:血栓相关基因探针捕获文库构建：
[0058]
文库构建可以采用试剂商生产的建库和捕获产品，按照其对应说明书操作即可。下面以艾吉泰康生产的建库(enzyme plus library prep kit)和捕获(targetseqkit)为例，按照它的说明书来构建文库，其中部分操作根据实际情况有所调整，具体操作步骤如下：
[0059]
a1.基因组dna片段化，末端修复、3’端加“a”：
[0060]
1)将试剂基因组dna片段化&era酶(fragment&era enzyme mix)、对应缓冲液(fragment&era buffer)于冰盒上融化，按下表格配制反应体系：
[0061][0062]
2)运行pcr程序，设置pcr仪参数如下，当程序运行至4℃后将pcr管从冰盒上拿出放置pcr仪中继续运行程序：热盖温度85℃，4℃孵育1min，37℃孵育15-20min(确保片段在200-250bp间)，65℃孵育30min，最后一直4℃；
[0063]
a2.片段化基因组dna接头连接及磁珠纯化：
[0064]
1)在步骤1反应结束的pcr管中，按照下表在冰盒上配制反应体系：
[0065]
[0066][0067]
2)运行pcr仪程序(关闭热盖)，设置pcr仪参数如下：关闭热盖，22℃孵育15min，最后一直4℃；
[0068]
3)程序结束后，将上述连接产物加入0.8倍体积agencourt ampure xp磁珠静置5min后，进行磁珠纯化：
①
短暂离心，并将pcr管置于磁力架上3min待溶液澄清，去上清，向pcr管内加入200μl 80％乙醇溶液，静置30sec后去上清，再次用80％乙醇溶液清洗一次；
②
室温静置3-5min，使残留乙醇彻底挥发，加入22μl的ddh2o，将pcr管从磁力架取下，吸打混匀后室温静置2min；
③
短暂离心，将pcr管置于磁力架上2min，待溶液澄清后吸取20μl上清液于新pcr管中(置于冰盒上)，做好标记；
[0069]
a3.加接头片段化基因组dna前pcr扩增及磁珠纯化：
[0070]
1)从-20℃冰箱中取出pre pcr酶预混液(pcr master mix)、index扩增引物(采用illumina平台的双端唯一index扩增引物)，按照下表在冰盒上进行配制pcr反应体系，请记录好所使用的index号：
[0071][0072]
2)吸打混匀，瞬时离心后，将样品置于pcr仪上，启动pcr程序：热盖温度105℃，98℃预变性2min，扩增5个循环(98℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec)，72℃终延伸1min，最后一直4℃。
[0073]
3)程序运行完成后，加入1倍体积agencourt ampure xp磁珠静置5min后，进行磁珠纯化(同步骤2中磁珠纯化，其中加入ddh2o的体积改为30μl，转移到新pcr管的体积改为28μl)。
[0074]
a4.加接头片段化基因组dna文库质控：
[0075]
1)取1μl样品使用3.0fluorometer(qubit dsdna hs assay kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度(下游进行基因芯片及探针杂交捕获，文库浓度不低于25ng/μ
l)；
[0076]
2)取1μl样品使用qseq100(dna卡夹)进行文库片段长度测定，文库长度在270-320bp间；
[0077]
a5.加接头片段化基因组dna文库与血栓相关基因芯片及其探针杂交过夜：
[0078]
1)每样取500ng加接头片段化基因组dna文库，加入单个pcr管中进行多个文库混合杂交(三杂或四杂，总体系为30μl)，采用真空浓缩离心机浓缩20min即可至干燥状态；
[0079]
2)预先取出targetseqhyb buffer，hyb human block，接头封阻引物(adapter blocker)，rna酶抑制剂(rnase block)，血栓相关基因芯片及探针(target probe)置于冰盒上融化，按下表加入杂交反应体系：
[0080][0081][0082]
轻轻吸打混匀，瞬时离心，将样品置于pcr仪上，启动探针杂交孵育过夜程序：热盖温度85℃，80℃孵育5min，最后一直50℃孵育过夜；
[0083]
a6:血栓相关基因芯片及探针捕获目标区域：
[0084]
1)将步骤5每管杂交过夜的产物迅速转移到50℃预热装有300μl事先清洗重悬cap beads的2ml离心管中，颠倒混匀50℃孵育1min，接着置于旋转混匀仪上结合30min；
[0085]
2)将2ml离心管置于磁力架上2min使溶液澄清，移除上清液后每管加入150μl的wash buffer 1，吸打混匀后置于旋转混匀仪上15min，然后瞬时离心，置于磁力架上2min，移除上清；
[0086]
3)每管加入150μl事先50℃预热的targetseqwash buffer，轻轻吸打混匀，瞬时离心，50℃孵育10min后瞬时离心，放在磁力架上2min，移除上清，后面仍使用50℃预热的targetseqwash buffer再清洗2次；
[0087]
4)清洗cap beads 3次后，每管加入150μl 80％乙醇，静置30sec后彻底移除乙醇，室温晾干后每管加入24μl ddh2o，取下后轻轻吸打重悬待用；
[0088]
a7.血栓相关基因芯片及其探针捕获文库后pcr扩增及磁珠纯化：
[0089]
1)取出post pcr酶预混液(post pcr master mix)、post pcr扩增引物(post pcr primer)，置于冰盒上融化，按下表配制反应体系：
[0090][0091][0092]
2)轻轻吸打混匀，置于pcr仪上运行pcr程序：热盖温度105℃，95℃预变性1min，双杂或三杂扩增13个循环(98℃变性20sec，60℃退火30sec，72℃延伸30sec)，72℃终延伸5min，最后一直4℃；
[0093]
3)pcr程序运行完成后，每管加入1倍体积agencourt ampure xp磁珠静置5min后，进行磁珠纯化(同步骤2中磁珠纯化，其中加入ddh2o的体积改为52μl，最后转移50μl至新的1.5ml离心管中)；
[0094]
a8.血栓相关基因芯片及其探针捕获文库质控：
[0095]
1)取1μl血栓相关基因芯片及其探针捕获文库，使用3.0fluorometer(qubit dsdna hs assay kit进行定量，记录文库浓度，文库浓度在3ng/μl以上即为正常；
[0096]
2)取1μl样品使用qseq100(dna卡夹)进行片段长度测定，血栓相关基因芯片及其探针捕获文库主峰长度范围在270-320bp；
[0097]
s4:血栓相关基因芯片探针捕获文库上机测序：
[0098]
确定血栓相关基因芯片探针及其探针捕获文库数据量后上机测序；
[0099]
根据所测血栓相关基因芯片探针及其捕获文库浓度及主峰长度，再结合目标区域的测序深度，考虑到最佳性价比，确保每个样本每个致病位点最低测序深度在500
×
，按照超过最低测序深度20％来计算数据量，要求每个文库测序数据量为1gb(实际获得的数据量会出现上下浮动5％-10％)；
[0100]
采用illumina高通量测序仪(novaseq500、novaseq6000等)，根据相应机型芯片所测最大数据量以及目的文库所需的数据量，对血栓相关基因芯片探针及其捕获文库进行混样上机测序；
[0101]
s5:血栓相关基因芯片探针捕获文库数据下机分析：
[0102]
测序数据下机后，对下机数据进行生物信息学分析，检测血栓相关基因上的变异。检测过程中要求测序数据量(即原始数据)达到0.8gb以上，分析后每个文库样本每个致病位点测序深度达到500
×
以上，覆盖度高于99％；
[0103]
1)下机质控：对测序仪每条lane产生的每对raw reads使用软件cutadapt去除测序接头和包含大量
‘
n’碱基的reads，得到满足质控的clean reads，再使用软件fastqc统计reads基本信息，包括序列和碱基数量、gc含量和分布、测序错误率和分布、碱基质量分布；
[0104]
2)比对及其预处理：使用软件bwa，把clean reads与人类参考基因组(hg19)比对，得到reads在参考基因组上的比对信息文件bam，再用gatk软件把不同文库、lane产生的bam文件合并一起，按照基因组坐标排序，去除pcr过程中产生的重复序列，校正碱基质量值，得到预处理后的比对文件(clean bam)；
[0105]
3)目标区域捕获效果评估：使用picard软件统计clean bam，得到质控信息，对目标区域捕获芯片的覆盖度、深度、捕获效率、均一性，可比对序列和碱基的数量，插入片段的长度分布等；
[0106]
4)变异检测：使用gatk软件检测基因上的小片段变异，包括单核苷酸多态性(snp)和插入、缺失(indel)，对检测变异进行过滤，对满足过滤条件的变异进行注释，标注出对应的基因、转录本、变异类型、功能、在正常人群中的频率等；统计变异结果，得到变异数量、长度分布、各类型变异数量、人群的比例等；
[0107]
5)关联分析及报告生成：使用gatk合并所有样本的gcvf文件，经过变异检测的过滤条件得到合格的基因突变位点集合；再与目前我们之前筛选的21个血栓相关基因62种致病突变位点集合进行匹配，最终生成相应的血栓风险评估的检测报告；
[0108]
应用实施例：
[0109]
选择华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科实验室近几年提取的428例临床确诊为血栓患者的基因组dna样本作为应用实施例，采用本发明的血栓相关基因芯片及对上述血栓患者的基因组dna进行血栓相关基因突变位点检测，并对血栓相关基因致病突变位点进行统计分析；
[0110]
通过对这428例血栓患者样本进行检测分析，我们发现本发明的血栓相关基因芯片及其所包含的21个基因62种致病突变位点分布在其中157例血栓患者中，具体见附图3；检测到的这157例血栓患者，均提示其自身发生血栓的风险极高，由于是基因突变，遗传给下一代的可能性极高，需要患者自身引起足够的重视；同时也要建议患者对直系亲属做对应基因致病突变位点的检测，提前了解直系家属是否为易栓体质，做好预防，避免养成一些容易导致血栓发生的习惯(久坐不活动，卧床不翻身等)；或者做好干预，在进行大手术(剖宫产术、骨折手术等)前进行抗血栓药物干预；
[0111]
本发明的血栓相关基因芯片及其也存在一定的局限性，上述428例血栓患者中，有211例在这21个基因中未发现基因突变，说明这部分人的血栓症状与其它因素(其它基因致病突变位点引起的，或者由于其它疾病导致的血栓等)有关；同时，我们还发现除了这21个基因62种致病突变位点之外的其它新的突变位点(目前还不能确定该位点突变是否引起血栓症状，需要进一步研究)，随着后期分析血栓病例数的增多，我们会发现这21个血栓相关基因更多新的与血栓形成有关的致病突变位点；相应的，血栓相关基因芯片的致病突变位点数目也会增加，版本也会跟着升级。
[0112]
以上所述，仅为本公开的具体实施方式，但本公开的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本公开的保护范围之内。因此，本公开的保护范围应以权利要求的保护范围为准。