一株分解镰刀菌酸的放线菌FAD02及其应用

一株分解镰刀菌酸的放线菌fad02及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，涉及一株分解镰刀菌酸的放线菌fad02及其应用。


背景技术：

2.香蕉枯萎病是一种典型的土传病害，由尖孢镰刀菌古巴专化型(fusariumoxysporum f.sp.cubense，foc)引起。尖孢镰刀菌侵染香蕉幼根后，在根系进 行定殖后大量繁殖，入侵香蕉的维管束组织从而使香蕉的输导组织造成堵塞，香 蕉不能获得正常生长所需要的水分和营养物质，最后造成香蕉的死亡。香蕉枯萎 病是香蕉的毁灭性病害，导致传统种植区的香蕉栽培面积不断减少，给香蕉产业 带来了重大的经济损失。
3.镰刀菌产生的镰刀菌酸(fusaric acid，fa，5-丁基吡啶-2-羧酸)是病原菌 引起植物发病中最先涉及的真菌代谢物之一，广泛存在于镰刀菌属中，在碱性环 境中可大量产生，是第一个从被侵染寄主中分离出来的非特异性真菌植物毒素， 可引起多种作物的枯萎和腐烂病。据研究表明，人们已经做出很多努力来研究 foc的发病机制和fa的合成途径，但目前尚未弄清楚foc具体的发病机理和fa 具体的合成路径。fa的含量与植物病原菌致病力呈正相关。据研究表明，fa可 作为香蕉枯萎病和番茄枯萎病的致病因子。
4.目前防治香蕉枯萎病病原菌方面仍然是以化学防治和物理防治手段为主，但 是物理防治和化学防治都不能有效地控制香蕉枯萎病的传播，而且化学防治极易 使病菌产生抗药性，同时还会对土壤造成污染，进而影响人类的健康。在近些年 来，低成本、无残留的生物防治逐渐进入了大众的视野里，开始慢慢取代传统的 化学防治。目前生物防治的主要途径是利用生物有机肥、生物菌肥、生防菌株来 增加土壤微生物多样性，从而达到抑制病原菌的繁殖并减少病原菌对于香蕉的侵 染，以此来达到防治的目的。而使用微生物及其微生物代谢物进行防治被认为是 一种可持续发展的策略，具有广阔的应用前景。一些细菌和真菌能够分解fa， 从而使其能在土壤中存活，还能促进植物的生长。例如伯克霍尔德菌双歧杆菌株t16和海链霉菌(treptomyces sp.等。抗fa微生物可以通过离子泵将fa泵出胞 外、对fa进行修饰和通过铁载体螯合fa等方式来进行解毒。
5.m.cosmeticum是一种生长迅速的非结核分枝杆菌(ntm)，最早是由cooksey 等人在美国的乔治亚州亚特兰大市的一家化妆品店的水槽排水沟中发现并命名， 并于2004年11月首次在文章中描述。m.cosmeticum被认为是一种胃肠道病原 体
46.。已有报道显示，一名63岁的女性感染m.cosmeticum病原体而引起腹腔 积液，这种细菌是引起肺部疾病和导管相关菌血症的罪魁祸首。据研究表明，m. cosmeticum菌种中存在dsz操纵子，能通过bth降解途径脱除苯并噻吩苯(bth) 和二苯并噻吩苯(dbt)上的硫分子。到目前为止，尚未见关于m.cosmeticum能 够分解fa的相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种能够分解fa的放线菌。
7.本发明的另一目的是提供该放线菌的应用。
8.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
9.一种放线菌(mycolicibacterium cosmeticum)fad02，2021年11月3日 保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61936，保藏地址 为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
10.所述的放线菌fad02在分解镰刀菌酸中的应用。
11.所述的放线菌fad02在制备分解镰刀菌酸的制剂中的应用。
12.所述的放线菌fad02在制备辅助防治香蕉枯萎病的制剂中的应用。
13.由所述的放线菌fad02制备的发酵上清液。
14.作为本发明的一种优选，所述的发酵上清液是在以镰刀菌酸为唯一碳源的培 养基，或含镰刀菌酸且外加c n源的培养基中发酵权利要求1所述的放线菌 fad02制得的发酵上清液。
15.本发明所述的发酵上清液在分解镰刀菌酸中的应用。
16.本发明所述的发酵上清液在制备分解镰刀菌酸的制剂中的应用。
17.本发明所述的发酵上清液在制备辅助防治香蕉枯萎病的制剂中的应用。
18.有益效果：
19.本发明首次发现并发力出一株能够分解fa的放线菌(mycolicibacteriumcosmeticum)fad02。fad02能够利用fa作为唯一c、n源生长，将fa代谢成无 毒或者低毒化合物，这种特点表明该菌株具有生物防治的潜力，能够被用于制备 分解fa的制剂或者制备辅助防治香蕉枯萎病的制剂。
附图说明
20.图1菌株fda02革兰氏染色
21.图2基于16s rdna序列的菌株fda02系统发育树
22.图3不同温度下fda02菌株在lb培养基的生长曲线
23.图4fda02菌株在fa作为c源和n源的培养基中生长曲线
24.注：c，以fa为唯一c源；n，以fa为唯一n源；(c n),以fa为唯一c n源； (extra c n)，含fa外加c n源
25.图5番茄苗在不同浓度的镰刀菌酸培养两天后的萎蔫情况
26.图6 fda02菌株代谢fa的产物对番茄苗的毒性测定
27.注：control,无菌水；mm和mmf指相应培养基；c，以fa为唯一c源；n，以 fa为唯一n源；(c n)，以fa为唯一c n源；(extra c n)，fa外加c n源图7 fda02菌株不同发酵上清液fa含量生物材料保藏信息mycolicibacterium cosmeticum fad02，2021年11月3日保藏于广东省微生物 菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no:61936，保藏地址为广州市先烈中路100 号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。
具体实施方式
28.以下实施例中所涉及的材料、试剂和培养基如下： 1实验材料
29.从珠海香蕉园发病土壤中分离出来的一株镰刀菌酸利用菌fad02和广东广 州本地健康的番茄苗，品种为摇钱树。
30.2药品与试剂
[0031][0032]
[0033]
3仪器与设备
[0034][0035]
4培养基
[0036]
4.1 lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，水1l，ph 7.2。 (固体培养基则再加琼脂1.7g)121℃20min。
[0037]
4.2镰刀菌酸配制(100ml)：精密称取0.1792g定溶于18％(v/v)色谱纯甲 醇100ml，用1mol/lnaoh调节ph到6.5。换算的质量浓度(w/v)＝1792μg/ml， 得到10mm标准品fa储存液(1792μg/ml)。
[0038]
4.3 m9基础培养基：na2hpo4.7h2o 6.4g，kh2po
4 1.5g，nacl 0.5g，蒸馏水 100ml。使用时5倍稀释。121℃22min。
[0039]
4.4 mt微量元素储存溶液(1l)：feso4.7h2o 2.78g，mncl2.4h2o 1.98g，coso4.7h2o2.81g，cacl2.2h2o 1.47g，cucl2.2h2o 0.17g，znso4.7h2o 0.29g，上述矿 物盐溶解到1n hcl中储存。
[0040]
4.5以fa为唯一c/n、c n源和外加c n源的细菌分离培养基
[0041]
(1)10mm mgso4母液配置：称0.2465g mgso4.7h2o，定容到100ml蒸馏水中。
[0042]
(2)每100ml液体分离培养基的配置方法(mmf)：20mlm9母液 10ml 10mm fa 母液 0.1ml mt微量元素储存液 1ml 10mm mgso4母液 68.9ml蒸馏水。
[0043]
(3)mm液体培养基(100ml)：20ml m9母液 0.1ml mt微量元素储存液 1ml 10 mm mgso4母液 78.9ml蒸馏水。
[0044]
(4)以fa为唯一c源的培养基(100ml)：20ml m9母液 10ml 10mmfa母液 0.1mlmt微量元素储存液 1ml 10mm mgso4母液 nh4cl 0.5g 68.9ml蒸馏水。121℃ 20min。
[0045]
(5)以fa为唯一n源的培养基(100ml)：20ml m9母液 10ml 10m mfa母液 0.1mlmt微量元素储存液 1ml 10mm mgso4母液 葡萄糖0.5g 68.9ml蒸馏水。121℃ 20min。
[0046]
(6)以fa为唯一c n源的培养基(100ml)：20ml m9母液 10ml 10m mfa母液 0.1ml mt微量元素储存液 1ml 10mm mgso4母液 68.9ml蒸馏水。121℃ 20min。
[0047]
(7)含fa外加c n源的培养基(100ml)：20ml m9母液 10ml 10m mfa母液 0.1mlmt
微量元素储存液 1ml 10mm mgso4母液 nh4cl 0.5g 葡萄糖0.5g 68.9ml 蒸馏水。121℃20min。
[0048]
实施例1菌株fda02的菌种鉴定
[0049]
1.1菌株革兰氏染色鉴定
[0050]
取一片干净的载玻片，在上面滴一滴0.8％的生理盐水。然后在培养了几天 的lb平板上挑选一个单菌落，用灭菌的牙签蘸取一点，在载玻片上的生理盐水 搅拌均匀。之后用镊子夹住载玻片在酒精灯上将涂片烘干。烘干后，在菌膜上滴 加一滴结晶紫染液，静置1-2min后，用清水冲净，直至排出的水为无色状态。 用碘溶液将剩余的水分用碘溶液冲洗，用碘溶液浸泡1min左右，接着用水冲净， 用过滤器把玻璃杯上的剩余水分吸干。在白色的底子上，用滴管将95％的酒精慢 慢地滴入到细菌的薄膜中，直到没有任何的紫色液体，立即水洗。最后用番红染 液复染约2分钟，并进行水洗后，烘干。
[0051]
将烘干后的载玻片，放置到光学显微镜上进行观察。首先在低倍镜找准物象， 然后在菌膜上滴加一滴香柏油，再把物镜调节至高倍镜。然后转动粗准焦螺旋， 使得镜头与镜油结合在一起。然后转动细准焦螺旋，调节到目镜中能清晰看见物 象为止，然后拍照记录。
[0052]
经过革兰氏染色和显微镜观察，菌株fda02是呈杆状的阳性菌(如图2)
[0053]
1.2菌株分子生物学鉴定
[0054]
然后使用takara公司的minibest bacterial genomic dna extractionkitver.3.0试剂盒进行fda02菌株的16srdna的提取、克隆。(具体步骤参考试 剂盒说明书)将菌落进行pcr扩增后，送到生工生物工程有限公司进行测序。 将测序所得到的基因序列登录ncbi网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)， 进行blast核酸比对，然后从比对结果中选取其中一株菌，在ncbi上选择 genome一项，并输入该菌株的拉丁学名进行搜索。所得到的搜索结果为该种 菌的标准菌株。然后查看该菌株已发表文章中的进化树所选取的外群，选用该 外群作为本次建树的外群。最后将ncbi中查询的结果使用杨成德等的mega x 的neighbor-joining法，构建系统发育进化树。
[0055]
将测序得到的fda02菌株的16s rdna序列在blast中比对后，选择已经发表 菌株的相似序列，然后再从ncbi中选择同一目的外群，最后将所有序列用mega x构建系统发育进化树(图2)，发现菌株fda02的16s rdna序列与分支杆菌 mycobacterium cosmeticum(ay449729)遗传距离最近，相似度有99.86％。综 上所述将菌株fda02鉴定为放线菌分枝杆菌属mycobacterium cosmeticum，并 送交广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为gdmcc no:61936。
[0056]
实施例2菌株fda02最适生长温度的测定
[0057]
2.1菌株活化
[0058]
从超低温冰箱中取出一根镰刀菌酸耐受菌fda02的甘油管。然后采用稀释涂 布法在超净工作台中进行稀释涂布(甘油管一般稀释4-5个梯度)，将涂布后的 平板在37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养，第二天观察。
[0059]
2.2接种
[0060]
在超净工作台中，用移液枪吸取2ml无菌水到5ml的离心管中，然后用接种 环在活化的lb平板中挑选一个单菌落接到离心管中。用振荡器将离心管中的菌 体重复震荡均匀。
[0061]
按千分之一的接种量，在装液量30％的lb液体培养基中，用移液枪吸取离 心管中100μl菌液(吸取前要振荡混匀菌液)，接种到锥形瓶中。(每个温度接 三个锥形瓶)
[0062]
2.3培养
[0063]
将接种好的lb肉汤培养基分别放置到34℃、35℃、36℃、37℃的恒温摇床 中进行培养，每个温度的摇床中各放置3瓶，180rpm进行培养。
[0064]
每隔两小时，将12瓶摇瓶从摇床中取出。在超净工作台中各吸取300μl 到96孔板中，然后使用酶标仪进行od
600nm
的测定并记录数据。
[0065]
最后将所测量的数据使用graphpad prism8.0.1进行处理并绘制出各个温度 的生长曲线。
[0066]
fda02菌株的生长曲线如图3所示，菌株生长对温度很敏感，在34℃、35℃、 36℃、37℃这四个温度的培养条件下，菌株生长的最适温度是36℃。
[0067]
实施例3含镰刀菌酸不同c/n源的生长曲线
[0068]
在平板上，挑取活化的镰刀菌酸耐受菌fda02的单菌落，接种到lb液体培 养基中，待菌液od在0.6-0.8左右，取5ml菌液到灭菌过的离心管中，10,000
×
g 离心1min，弃去上清液，加入2ml的无菌水，用移液枪充分吸打菌泥使之重悬， 再用振荡器使其充分混合均匀。(该过程要在超净工作台中进行)
[0069]
按1
‰
的接种量，分别接种到以fa为唯一碳源、以fa为唯一氮源、以fa 为唯一碳氮源和含fa外加碳氮源的培养基中，设置三个重复。放置到36℃， 180rpm的恒温摇床中进行培养。每隔24h，将摇瓶从摇床中取出，测定每瓶发酵 液od
600nm
的数值并记录。
[0070]
最后将所测量的数据通过graphpad prism8.0.1处理并绘制出不同培养基的 生长曲线。
[0071]
菌株fda02在四种培养基的培养下的生长曲线如图4。fda02可以在fa为唯 一c源、唯一n源、c n源或在外源添加c n的情况下都可以生长，并在生长48 h后开始进入对数期。以fa为唯一c源(c)和以fa为唯一c n源(c n)的生 长曲线在72h左右进入稳定期，而含fa外加c n源(extra c n)和以fa为唯 一n源(n)的生长曲线则是在96h进入稳定期，表现出更好的生长状态。在6 d后，所有培养基汇中的生长都基本结束了。fda02可以以fa为唯一c源生长， 当fa为唯一c源和c n源时，生长较差。
[0072]
实施例4验证菌株fda02对镰刀菌酸的降解能力
[0073]
4.1番茄幼苗对镰刀菌酸的耐受
[0074]
首先用无菌水配制0ppm、25ppm、50ppm、100ppm、150ppm浓度的fa溶液。 然后各取30ml装入到50ml的离心管中，设置三个重复。
[0075]
选取健康无病害的番茄苗，然后剪取大小和形状相似的茎段，插入到不同浓 度的镰刀菌酸溶液中，24h后观察番茄苗的萎蔫程度并拍照记录。
[0076]
番茄苗对fa的耐受情况如图5，在含有fa的清水中培养2d后，通过可以 看出，0ppm、25ppm浓度处理的番茄苗无明显症状，50ppm浓度的fa处理引 起叶片黄化，100ppm和150ppm的fa导致番茄苗出现枯萎现象，150ppm浓度 的fa处理甚至还出现了番茄苗茎断裂的现象。
[0077]
4.2不同发酵上清液对于番茄幼苗的影响
[0078]
实验处理
[0079]
(1)无菌水对照：仅用无菌水培养，10株摇钱树番茄苗浸泡培养。
[0080]
(2)fa处理：mmf培养基培养，10株摇钱树番茄苗浸泡培养。
[0081]
(3)mm培养基处理：mm培养基培养，10株摇钱树番茄苗浸泡培养。
[0082]
(4)四个配方的发酵液处理：将培养了7d的以fa为唯一碳源、以fa为唯 一氮源、以fa为唯一碳氮源和含fa外加碳氮源的镰刀菌酸利用菌fda02发酵液 进行离心，离心后取其上清液用细菌过滤器过滤除菌。各取25ml加入到50ml 的离心管中，选取健壮无害的10株摇钱树番茄苗，插入到离心管中。
[0083]
培养一段时间后进行观察并拍照记录。
[0084]
fda02代谢fa后的产物对番茄的毒性测定结果如图6所示，初始的番茄苗 都很健，但是处理40h后，无菌水对照组中培养的番茄苗无明显变化，mm培养 基中培养的番茄苗则出现轻微的黄化现象，mmf培养基培养的番茄苗出现茎的断 裂和叶片的萎蔫。以fa为唯一c源(c)和含fa外加c n源(extra c n)的发酵上 清液处理组均未见坏死，而以fa为唯一n源(n)发酵上清液处理组出现了轻微的 萎蔫和黄化，以fa为唯一c n源(c n)的发酵上清液处理组出现了轻微的萎蔫。
[0085]
5.3菌株fda02不同发酵上清液镰刀菌酸含量的检测
[0086]
(1)样品提取
[0087]
将上述四种不同培养基的发酵液进行离心后，用0.25μm的滤膜过滤除菌和 未培养的mmf溶液各吸取10ml。然后精确移取液体样品2ml到15ml的离心管中。 然后加入5ml的乙酸乙酯，振荡混匀10min，低温超声15min，5000rpm离心10min， 转移上清液到新的15ml的离心管中。重复萃取3次，合并三次上次上清液。低 温冷冻干燥，然后用0.5ml的色谱级甲醇溶解定容，振荡混匀5min，过0.22μm 滤膜，等待检测。
[0088]
(2)检测条件
[0089]
检测器dadc18色谱柱250
×
4.6mm；0.5μm柱温25℃波长270nm流动相甲醇：0.1％甲酸水＝90：10(v:v)流速1ml/min进样量20μl
[0090]
最后将检测结果通过graphpad prism8.0.1处理作图。
[0091]
将fda02菌株不同发酵上清液通过高效液相色谱检测fa含量(图7)，以fa 为唯一c和n源以及含fa外加c和n源的发酵上清液中未检测到fa的存在。而 以fa为唯一n源和以fa为唯一c源的发酵上清液只检测出少量的fa。综上所 述，说明fda02菌株能利用fa进行生长，并且将其转化成其他物质。